NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC, THIẾT LẬP CHẤT ĐỐI CHIẾU VÀ XÂY DỰNG QUY TRÌNH KIỂM NGHIỆM THÀNH PHẦN ALCALOID VÀ FLAVONOID CHO CÂY TRINH NỮ HOÀNG CUNG

Y GIÁO
TẾ DỤC VÀ ĐÀO TẠO
BỘ

BỘ Y TẾ

ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

NGUYỄN HỮU LẠC THỦY

NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC,
THIẾT LẬP CHẤT ĐỐI CHIẾU VÀ XÂY DỰNG QUY TRÌNH
KIỂM NGHIỆM THÀNH PHẦN ALCALOID VÀ FLAVONOID
CHO CÂY TRINH NỮ HOÀNG CUNG
(Crinum latifolium L., Amaryllidaceae)

Chuyên ngành: Kiểm nghiệm thuốc
Mã số: 62.73.15.01

TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ DƯỢC HỌC

THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH - 2014


DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH NGHIÊN CỨU LIÊN QUAN
ĐẾN LUẬN ÁN ĐÃ ĐƯỢC CÔNG BỐ
Công trình được hoàn thành tại:

1.

Nguyễn Hữu Lạc Thủy, Nguyễn Hồng Thiên Thanh, Võ Thị Bạch Huệ

2.

(2013), Phân lập và xây dựng chất chuẩn crinamidin từ lá TNHC (Crinum
latifolium L. Amaryllidaceae), Tạp chí Dược học, số 441, tr. 38-41.
Nguyễn Hữu Lạc Thủy, Lê Minh Thắng, Kiều Lê Thanh Thảo, Võ Thị Bạch

ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

Huệ (2013), Định lượng đồng thời 6 alcaloid (crinamidin, 6hydroxycrinamidin, 6-hydroxypowellin, 6-hydroxybuphanidrin, undulatin,
6-hydroxyundulatin) từ cao chiết lá TNHC (Crinum latifolium) bằng sắc ký

Người hướng dẫn khoa học:
PGS. TS. VÕ THỊ BẠCH HUỆ
3.

Bạch Huệ (2013), Xác định hàm lượng của astragalin và isoquercitrin trong
lá TNHC (Crinum latifolium) bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao và điện di mao
quản, Tạp chí dược học, số 443, tr. 53-58.

Phản biện 1:
4.

Phản biện 2:

Phản biện 3:

5.

Luận án sẽ được bảo vệ tại Hội đồng chấm luận án cấp Trường

6.

họp tại:

7.

Vào ……. giờ ……. ngày ……. tháng …… năm …….

-

Thư viện Quốc gia Việt Nam
Thư viện khoa học Tổng hợp TPHCM
Thư viện Đại học Y Dược TPHCM

Nguyen Huu Lac Thuy, Vo Thi Bach Hue, Quang Anh Nguyet (2011),
“Influence of pH on the separation of Crinum latifolium alakloids by thin
layer chromatography and column chromatography”, Conference
proceeding, the 2nd analytica Vietnam conference 2011, pp 213-216.
Nguyen Huu Lac Thuy, Nguyen Dang Khoa, Nguyen Thi Ngoc Yen, Vo Thi
Bach Hue (2011), “Extraction and preliminary screening for AChE inhibitor
activity of Crinum latifolium L. leaves extracts”, Conference proceeding, The
2nd Analytica VietNam Conference 201, pp 249-254.
Nguyen Huu Lac Thuy, Vo Thi Bach Hue, Le Quang Hanh Thu (2011),
“Antioxidant activity of extracts from Crinum latifolium L.,
Amaryllidaceae”, Proceeding of The 7th Indochina Conference on
Pharmaceutical Sciences, pp 607-611.

ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

Có thể tìm hiểu luận án tại:

lỏng hiệu năng cao, Tạp chí dược học, số 442, tr. 52-56.
Nguyễn Hữu Lạc Thủy, Trịnh Thị Thanh Nhã, Phan Thanh Dũng, Võ Thị

8.

Nguyen Huu Lac Thuy, Vo Thi Bach Hue, Nguyen Thi Ngoc Yen (2011),
“Isolation and identification of alkaloidal composition from the roots of
Crinum latifolium L. Amaryllidaceae by silica gel coated buffer on
chromatographic column technique”, Proceeding of The 7th Indochina
Conference on Pharmaceutical Sciences, pp 600-603.
Nguyen Huu Lac Thuy, Vo Thi Bach Hue, Nguyen Thi Phuong Trang (2011),
“Isolation and identification of isoquercitrin from the leaves of Crinum
latifolium L., Amaryllidaceae”, Proceeding of The 7th Indochina Conference
on Pharmaceutical Sciences, pp 604-606.


24

1

4. Quy trình định tính - định lượng alcaloid hoặc flavonoid:
- Luận án đã xây dựng 4 quy trình định lượng alcaloid hoặc flavonoid
trong lá TNHC. Trong đó:
- 2 quy trình phân tích đồng thời 6 alcaloid bằng HPLC/ CE
- 2 quy trình phân tích đồng thời 2 flavonoid bằng HPLC/ CE.
- Phương pháp DVT–SKLM và DVT–HPLC: có thể sử dụng đề phân
biệt chống nhầm lẫn dược liệu khi nguồn cung CĐC chưa ổn định.

GIỚI THIỆU LUẬN ÁN

5. Các chỉ tiêu cần thiết để xây dựng tiêu chuẩn kiểm bột lá TNHC:
- Hai chỉ tiêu cần thiết của một tiêu chuẩn kiểm nghiệm dược liệu là
chỉ tiêu định tính bằng phương pháp dấu vân tay và chỉ tiêu định lượng
bằng phương pháp HPLC với các CĐC đánh dấu đặc trưng cho TNHC.

KIẾN NGHỊ
Các kết quả nghiên cứu đạt được là cơ sở khoa học để thực hiện các
nội dung nghiên cứu sâu hơn cho dược liệu TNHC:
1. Từ kết quả các chất đối chiếu đã được thiết lập, các quy trình
phân tích đã được thẩm định và các tiêu chuẩn kiểm nghiệm đã
được báo cáo trong nội dung của luận án là những cơ sở khoa học
để tiến hành xây dựng “Chuyên luận dược liệu TNHC” cho Dược
điển Việt Nam trong lần xuất bản sắp tới.
2. Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng lên hiệu quả chiết xuất bằng
phương pháp SFE trên mẫu bột lá TNHC. Từ đó tiến hành các thử
nghiệm tối ưu hóa các điều kiện chiết để cho hiệu quả chiết xuất
cao nhất.
3. Khảo sát tác dụng sinh học in vitro và in vivo các hợp chất tinh
khiết đã được phân lập để khẳng định thêm công dụng của TNHC
ngoài các công dụng kháng khối u, tăng cường miễn dịch v.v…
đã được công bố trước đây.

1. Đặt vấn đề
- Cây Trinh Nữ Hoàng Cung (Crinum latifolium L. Amaryllidaceae) là
dược liệu đang được sử dụng phổ biến như thực phẩm chức năng, hoặc
dạng bào chế thuốc để điều trị các dạng u xơ tử cung, u tuyến tiền liệt.
- Thành phần hóa học và tác dụng sinh học của cây TNHC được nhiều
tác giả quan tâm và có nhiều công trình đã công bố. Tuy nhiên các
nghiên cứu về lĩnh vực kiểm nghiệm thì hạn chế hơn. DĐVN IV hiện

vẫn chưa có chuyên luận cho cây TNHC. Do đó, công tác đảm bảo
chất lượng của nguyên liệu và các chế phẩm có TNHC vẫn chưa được
thực hiện một cách chặt chẽ. Nguyên nhân chủ yếu là do thành phần
hóa học của dược liệu này vẫn chưa được công bố một cách toàn diện;
chưa có công trình khoa học nào khẳng định chất đánh dấu và hoàn
toàn chưa có bất kỳ chất đối chiếu (CĐC) có nguồn gốc từ dược liệu
này được phân phối bởi hệ thống kiểm nghiệm thuốc quốc gia.
Với mong muốn giải quyết các bất cập hiện tại trong công tác “Đảm
bảo chất lượng” cho nguyên liệu TNHC, chúng tôi tiến hành đề tài:
“Nghiên cứu thành phần hóa học, thiết lập chất đối chiếu và xây dựng
quy trình kiểm nghiệm thành phần alcaloid và flavonoid cho cây Trinh
Nữ Hoàng Cung – Crinum latifolium L., Amaryllidaceae” với các nội
dung nghiên cứu như sau:
1. Chiết xuất cao cồn, các phân đoạn alcaloid, phân đoạn flavonoid
và phân lập hợp chất tinh khiết từ cây Trinh nữ hoàng cung.
2. Thiết lập một số chất đối chiếu hóa học có nguồn gốc từ cây Trinh
nữ hoàng cung.
3. Xây dựng quy trình định tính, định lượng alcaloid và flavonoid
trong lá Trinh nữ hoàng cung bằng phương pháp HPLC và CE.
4. Đề xuất một số chỉ tiêu cần thiết cho việc xây dựng tiêu chuẩn
kiểm nghiệm nguyên liệu bột lá Trinh nữ hoàng cung.


2

23

2. Tính cấp thiết của đề tài: cho đến nay chưa có công trình khoa học
nào xác định toàn diện thành phần hóa học cũng như chưa có tài liệu
xác định các chất đánh dấu và chưa có quy trình định lượng đồng thời

một số chất đánh dấu trong thành phần TNHC. Hệ thống kiểm nghiệm
quốc gia chưa cung cấp bất kỳ CĐC nào có nguồn gốc từ TNHC.
Tuy nhiên, thực tế thì cây TNHC đang được sử dụng rất phổ biến. Vì
vậy các kết quả nghiên cứu của luận án có thể giải quyết được bất cập
trong công tác quản lý và đảm bảo chất lượng của dược liệu cũng như
các sản phẩm có thành phần TNHC.

Đây là ưu điểm của tiêu chuẩn kiểm nghiệm vì HPLC là phương pháp
có độ chính xác cao, được khuyến khích ứng dụng vào kiểm nghiệm
các mẫu đa thành phần như mẫu sinh học hay mẫu từ dược liệu.
Phương pháp dấu vân tay với các chi tiết đặc trưng cho thành phần
hoạt chất của TNHC sẽ góp phần đánh giá chặt chẽ hơn chất lượng của
dược liệu này.

3. Những đóng góp mới của luận án:
Luận án đã đạt được một số kết quả mới, đóng góp vào công trình
nghiên cứu cho cây TNHC như sau:
1. Ứng dụng phương pháp SFE vào chiết alcaloid từ TNHC.
2. Phân lập đươc 17 hoạt chất từ các bộ phận của TNHC.
Trong đó có một alcaloid mới, cấu trúc là 6-ethoxyundulatin. Các hợp
chất esculetin, 6-ethoxybuphanidrin, flazin và isoquercitrin được phân
lập lần đầu tiên từ cây TNHC.
3. Thiết lập 6 CĐC: crinamidin, 6-hydroxycrinamidin, lycorin,
hippadin, astragalin và isoquercitrin. Hiện tại, các CĐC này đều chưa
được phân phối bởi hệ thống kiểm nghiệm thuốc quốc gia.
4. Xây dựng và thẩm định đạt yêu cầu 4 quy trình phân tích
alcaloid hoặc flavonoid bằng HPLC và CE. Các quy trình này đều chưa
được công bố bởi bất cứ công trình nào trong nước và thế giới.
5. Đề xuất một số chỉ tiêu cần thiết để xây dựng tiêu chuẩn
kiểm nghiệm TNHC. Hiện tại DĐVN IV và Dược điển các nước đều

chưa có chuyên luận này.
4. Bố cục luận án: có 120 trang chính: đặt vấn đề (2); chương 1: TQTL
(24); chương 2: PPNC (13); chương 3: KQNC (62), chương 4 BL (16);
kết luận (2); kiến nghị (1). Và danh mục công trình (1); TLTK (12).

KẾT LUẬN
Luận án đã hoàn thành các nội dung nghiên cứu và đạt tất cả các mục
tiêu đề ra ban đầu, tóm tắt các kết quả đạt được như sau:
1. Chiết xuất hoạt chất từ TNHC: xây dựng được 2 quy trình chiết
xuất cao toàn phần từ TNHC.
- Quy trình 1 là quy trình chiết cao cồn, PĐ alcaloid hoặc
flavonoid bằng phương pháp ngấm kiệt với cồn 70%.
- Quy trình 2 có sự kết hợp 2 phương pháp SFE và ngấm kiệt
để chiết cao ban đầu với mục đích phân lập CĐC hoặc khảo sát thành
phần hóa học.
2. Phân lập hợp chất tinh khiết: 17 hợp chất đã được phân lập.
- Trong số này có: 1 alcaloid 6-ethoxyundulatin là hợp chất mới. Và
có 7 chất lần đầu tiên được phân lập từ TNHC: 6-ethoxybuphanidrin,
6-hydroxypowellin, flazin, kaempferol, isoquercitrin, esuletin, phydroxybenzoic.
Các hợp chất còn lại đã được công bố trước đây trong các bộ phận khác
nhau của TNHC.
3. Thiết lập chất đối chiếu:
- 6 hợp chất có nguồn gốc từ cây TNHC đạt yêu cầu CĐC hóa học thứ
cấp với bộ dữ liệu gồm điểm chảy, phổ UV, IR, MS, NMR.
- Gồm 4 alcaloid: crinamidin, 6-hydroxycrinamidin, lycorin, hippadin
và 2 flavonoid: astragalin và isoquercitrin.


22

3

tiến hành đánh giá về quy trình chiết xuất, phân lập để thiết lập CĐC.
Các bước thực hiện theo hướng dẫn của ASEAN, ấn bản về quy trình
thiết lập CĐC hóa học.
- Bên cạnh đó, lycorin và hippadin cũng được thiết lập CĐC do 2 hợp
chất này có độ tinh khiết cao và hiệu suất phân lập lớn. Lycorin là
alcaloid có nhiều hoạt tính sinh học và là chất đại diện cho nhiều loài
trong chi Crinum.
Hiện tại hệ thống kiểm nghiệm quốc gia chưa cung cấp các CĐC này
trên thị trường. Kết quả này có thể đóng góp thêm vào danh mục các
CĐC có nguồn gốc từ dược liệu vốn đang khan hiếm.

NỘI DUNG LUẬN ÁN

4.4 Các quy trình định tính – định lượng alcaloid hoặc flavonoid:
Alcaloid hoặc flavonoid trong lá TNHC có thể được định tính – định
lượng bằng HPLC hoặc CE đều cho kết quả không sai biệt.
- Với quy trình định lượng alcaloid bằng HPLC: nên chú ý pH pha
động ảnh hưởng lớn đến AF và Rs của các pic định lượng. Với mẫu
flavonoid cần chú ý đến ảnh hưởng của dung môi hữu cơ lên độ bất
đối AF của 2 pic cần định lượng, acetonitril hiệu quả hơn methanol.
- Với quy trình định lượng alcaloid CE: cần chú ý mẫu thử alcaloid
nên được pha trong acid, kỹ thuật rửa giải MEKC ảnh hưởng nhiều
đến kết quả phân tích. Trong khi đó mẫu flavonoid chỉ cần kỹ thuật
CZE là đáp ứng các yêu cầu phân tích.
- Phương pháp dấu vân tay: có thể ứng dụng để tiêu chuẩn hóa dược
liệu và sản phẩm từ dược liệu khi nguồn cung cấp CĐC chưa đầy đủ.
4.5 Tiêu chuẩn kiểm nghiệm TNHC
- Chỉ tiêu định tính hai nhóm hoạt chất chính alcaloid hoặc flavonoid

bằng phương pháp dấu vân tay được.
- Chỉ tiêu định lượng hai nhóm hoạt chất chính alcaloid hoặc flavonoid
bằng hương pháp HPLC đã được xây dựng và thẩm định đạt các yêu
cầu của một quy trình phân tích định lượng.

Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
- Thực vật học cây TNHC:
Tên khoa học: Crinum latifolium L., họ Thủy tiên Amaryllidaceae.
Tên thông thường: Trinh nữ hoàng cung, Hoàng cung trinh nữ, Tỏi
lơi lá rộng, Náng lá rộng.
Đặc điểm hình thái: cỏ nhiều năm; thân hành, hình cầu, phía trên có
thân giả ngắn do các bẹ lá ôm sát nhau làm thành. Phiến lá dạng bản,
màu xanh nhạt, mép lượn sóng. Cụm hoa tán, có 10-20 hoa. Hoa đều,
lưỡng tính, màu tím hồng. Nhị 6 rời nhau; màu trắng, bao phấn màu
vàng 2 ô. Bầu hạ, 3 ô. Vòi nhụy dạng sợi.
- Thành phần hóa học và tác dụng sinh học:
Có các nhóm hoạt chất chính là alcaloid (36) và flavonoid (8); ngoài
ra còn có nhóm coumarin, carbohydrat.
Các tác dụng chính là kháng khối u, kháng viêm, kháng oxi hóa và
kích thích miễn dịch.
- Các phương pháp chiết hoạt chất và khảo sát hóa học
Hoạt chất được chiết bằng phương pháp ngấm kiệt, hoặc ngâm; hoặc
đun hồi lưu.
Các hợp chất tinh khiết được phân lập bằng kỹ thuật sắc ký cột hoặc
sắc ký lớp mỏng chế hóa.
Thành phần alcaloid trong TNHC được xác định bằng phương pháp
GC, UV, HPLC.
- Phương pháp thiết lập chất đối chiếu:
Theo hướng dẫn của ASEAN.

4

21

Chương 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1 Đối tượng nghiên cứu:
Đối tượng nghiên cứu là các alcaloid và flavonoid trong cây TNHC.

điều chỉnh, lượng mẫu nhỏ, hiệu suất chiết cao hơn các phương pháp
khác; thời gian, các bước tiến hành và thiết bị phổ biến trong các PTN.
- Chiết cao nguyên liệu từ lá để làm thuốc hoặc thực phẩm chức năng:
nguyên liệu lá được lựa chọn vì năng suất thu hoạch lớn hơn thân hành
hay rễ đồng thời bảo tồn được nguồn giống, phương pháp chiết ngấm
kiệt thông dụng ở qui mô công nghiệp, trang thiết bị và cách vận hành
đơn giản và có thể thiết kế phù hợp để chiết trên nhiều cỡ mẫu.

2.2 Phương pháp nghiên cứu:
2.2.1. Các phương pháp chiết xuất:
- Chiết ngấm kiệt, chiết với sự hỗ trợ của sóng siêu âm: nghiên cứu các
điều kiện dung môi, tỷ lệ dung môi/dược liệu.
- Chiết bằng dung môi lỏng siêu tới hạn (SFE): khảo sát các yếu tố áp
suất, thời gian, tỷ lệ dung môi hỗ trợ.
2.2.2. Phương pháp phân lập chất tinh khiết:
- Sử dụng phương pháp sắc ký cột chân không và sắc ký cột cổ điển.
- Biện giải cấu trúc bằng phương pháp phổ nghiệm UV, IR, MS, NMR.
2.2.3. Phương pháp HPLC, CE và dấu vân tay:
Khảo sát các điều kiện để xây dựng quy trình định tính, định lượng
alcaloid và flavonoid trong cây TNHC. Quy trình phải đạt các yêu cầu
về thẩm định.

- Quy trình xử lý mẫu: khảo sát quy trình chiết alcaloid và flavonoid
từ lá TNHC (dung môi chiết, số lần chiết) và dung môi pha mẫu.
- Phương pháp HPLC: khảo sát thành phần pha động, tỷ lệ và pH pha
động, kỹ thuật rửa giải.
- Phương pháp CE: kỹ thuật điện di, dung dịch đệm (hệ đệm, nồng độ
đệm, pH dung dịch đệm); nồng độ SDS.
- Phương pháp dấu vân tay:
- SKLM: khảo sát các điều kiện phân tích về dung môi và
thuốc thử phát hiện để xác định các đặc trưng cơ bản của DVT– SKLM
của hai nhóm hoạt chất chính alcaloid và flavonoid của TNHC qua hệ
số Rf và màu sắc của các vết đặc trưng.
- HPLC: ứng dụng các điều kiện của phương pháp HPLC vào
phân tích vân tay cho dược liệu TNHC. Ghi nhận thời gian lưu, phổ

4.2 Phân lập hợp chất tinh khiết:
- Luận án sử dụng kỹ thuật chính trong phân lập các hợp chất tinh khiết
là sắc ký cột. Alcaloid của TNHC tập trung nhiều trong nhóm alcaloid
khung crinin, cấu trúc và độ phân cực tương tự nhau. Vì vậy, dung môi
rửa giải phải được điều chỉnh tăng độ phân cực chậm để tránh dồn vết.
- Chất hấp phụ silica gel được tẩm đệm pH thay đổi tùy tính chất của
mẫu; trên cơ sở phương trình Henderson – Hasselbalch với mục tiêu
giảm thiểu tối đa sự kéo đuôi của các vết. Kết quả khảo sát cho thấy,
alcaloid của TNHC thích hợp với silica gel tẩm đệm pH 9; flavonoid
của TNHC phù hợp với silica gel tẩm đệm pH 4.
- Đối với các mẫu có nhiều tạp chất, cần phải kết hợp nhiều kỹ thuật
đồng thời như chiết lỏng- lỏng, sắc ký cột silica gel pha đảo, sắc ký cột
với silica gel pha thuận như trường hợp của 6-ethoxyundulatin và 6ethoxybuphanidirin.
Luận án đã xây dựng được bộ dữ liệu phổ học cho 17 hợp chất từ cây
TNHC, đặc biệt là dữ liệu phổ học của một hợp chất alcaloid mới được
phân lập trong tự nhiên và 11 alcaloid thuộc khung crinin - khung

alcaloid đại diện cho các loài trong chi Crinum.
4.3 Thiết lập chất đối chiếu từ cao chiết TNHC:
- Sau quá trình nghiên cứu, nhận thấy crinamidin, 6-hydroxycrinmidin
là 2 alcaloid; astragalin, isoquercitrin là 2 flavonoid có thể được chọn
làm các chất đánh dấu cho dược liệu TNHC. Vì vậy các chất này được


20

5

Cách tiến hành:
Kiểm tra khả năng thích hợp của hệ thống sắc ký: tiến hành sắc ký đối
với dung dịch đối chiếu. Phép thử chỉ có giá trị khi độ lệch chuẩn tương
đối của thời gian lưu và diện tích pic astragalin và isoquercitrin không
được lớn 2,0%.
Tiến hành sắc ký lần lượt dung dịch thử và dung dịch đối chiếu. Dựa
vào diện tích pic thu được trên sắc ký đồ của dung dịch thử, dung dịch
đối chiếu và nồng độ astragalin (C21H20O11) và isoquercitrin
(C21H20O12) đối chiếu, tính hàm lượng của hai flavonoid astragalin và
isoquercitrin trong dược liệu.
Đánh giá: dược liệu phải chứa ít nhất 250 µg/g astragalin (C21H20O11)
và 100 µg/g isoquercitrin (C21H20O12) tính trên dược liệu khô kiệt.

UV-Vis, % diện tích của các pic đặc trưng. Xác định DVT– HPLC của
hai nhóm hoạt chất chính của TNHC.
2.2.4. Phương pháp thiết lập CĐC:
Thực hiện theo hướng dẫn của ASEAN, ấn bản về quy trình thiết lập
CĐC hóa học thứ cấp.
2.2.5. Đề xuất một số chỉ tiêu cần thiết để xây dựng tiêu chuẩn kiểm

nghiệm dược liệu TNHC:
- Các chỉ tiêu hóa lý thông thường của dược liệu và phương pháp thực
hiện theo hướng dẫn của DĐVN IV.
- Chỉ tiêu định tính bằng bằng phương pháp dấu vân tay được khảo sát
với 6 CĐC alcaloid hoặc 2 CĐC flavonoid đánh dấu.
- Chỉ tiêu định tính và định lượng bằng phương pháp HPLC được khảo
sát với 2 CĐC alcaloid hoặc 2 CĐC flavonoid đánh dấu.

Chương 4: BÀN LUẬN
4.1 Các phương pháp chiết xuất hoạt chất từ TNHC
Hai nhóm hoạt chất chính trong cây TNHC được xác định gồm alcaloid
và flavonoid. Tùy vào mục tiêu sử dụng hay nghiên cứu các thành phần
này mà lựa chọn phương pháp chiết xuất phù hợp.
- Chiết cao TNHC để khảo sát thành phần hóa học và thiết lập CĐC:
Đối với nguyên liệu lá: mục tiêu là khảo sát toàn diện thành phần hóa
học, phương pháp SFE được lựa chọn để chiết hoạt chất ở giai đoạn
đầu và dược liệu sau đó được chiết ngấm kiệt. Cao chiết sẽ đa dạng
hơn về thành phần do dung môi chiết trãi rộng hơn về độ phân cực.
Đối với nguyên liệu rễ hoặc thân hành: kết quả khảo sát cho thấy SFE
cho hiệu quả tương đương với chiết ngấm kiệt. Vì vậy hoạt chất được
chiết bằng phương pháp chiết ngấm kiệt.
- Chiết hoạt chất để phân tích định tính – định lượng: chiết với sự hỗ
trợ của sóng siêu âm được chọn lựa vì các yếu tố ảnh hưởng ít và dễ

Chương 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
3.1 Các quy trình chiết cao cồn, alcaloid và flavonoid từ TNHC
Chiết cao cồn, phân đoạn alcaloid và flavonoid bằng phương pháp
ngấm kiệt:
- Chiết cao cồn: dược liệu được làm ẩm bằng dung môi khoảng 12 giờ.
Cho dung môi ngập dược liệu 1- 2 cm, ngâm khoảng 24 giờ. Rút dịch

chiết đến khi âm tính với TT Dragendorff và TT FeCl3 1%. Tỷ lệ dung
môi/dược liệu là (10 : 1). Gộp dịch chiết, lọc và cô đến cao đặc.
- Chiết flavonoid: cao cồn được siêu âm với HCl 1%. Lắc với ethyl
acetat đến khi âm tính với TT FeCl3 1%. Gộp các dịch chiết ethyl
acetat, thu hồi dung môi đến cao đặc chứa flavonoid.
- Chiết alcaloid: dịch acid sau khi chiết flavonoid được kiềm hóa bằng
amoniac 25% đến pH 9-10. Lắc với cloroform đến khi âm tính với TT
Dragendorff, thu hồi dung môi đến cao đặc chứa alcaloid.


6

19

Chiết alcaloid và flavonoid từ lá TNHC kết hợp 2 phương pháp:
- Chiết alcaloid và flavonoid bằng phương pháp SFE: thiết bị là hệ
thống chiết bằng lưu chất CO2 do Đài loan sản xuất với ba bình chiết
lắp song song, thể tích 20 lít/bình. Điều kiện SFE: áp suất 200 bar,
nhiệt độ 50 oC, thời gian chiết 2 giờ, 15% cồn 96%. Dịch SFE được
thu hồi dung môi (cao L-SFE). Cao L-SFE được hòa tan với HCl 1%.
Dịch acid được chiết flavonoid FL-SFE và alcaloid AL-SFE.
- Chiết alcaloid và flavonoid bằng phương pháp ngấm kiệt: bột lá sau
khi chiết SFE được tiếp tục chiết ngấm kiệt với cồn 70%. Dịch chiết
cồn được chiết flavonoid FL-NK và alcaloid AL-NK.

đối của thời gian lưu và diện tích crinamidin và 6-hydroxycrinamidin
không được lớn 2,0%.
Tiến hành sắc ký lần lượt dung dịch thử và dung dịch đối chiếu. Dựa
vào diện tích pic thu được trên sắc ký đồ của dung dịch thử, dung dịch
đối chiếu và nồng độ crinamidin (C17H19NO5) và 6-hydroxycrinamidin

(C17H19NO6) đối chiếu, tính hàm lượng của hai alcaloid crinamidin và
6-hydroxycrinamidin trong dược liệu.
Đánh giá: dược liệu phải chứa ít nhất 120 µg/g crinamidin
(C17H19NO5) và 100 µg/g 6-hydroxycrinamidin (C17H19NO6) tính trên
dược liệu khô kiệt.

3.2 Phân lập các hợp chất tinh khiết từ cao chiết TNHC
- Các PĐ alcaloid và flavonoid được chiết từ các bộ phận của cây
TNHC, sau đó tách PĐ bằng VLC và phân lập các hợp chất bằng CC.
- Sử dụng chất hấp phụ là silica gel tẩm đệm pH 9 đối với mẫu phân
lập alcaloid; silica gel pH 4 cho mẫu phân lập flavonoid.
- Riêng 6-ethoxyundulatin (2) và 6-ethoxybuphanidirn (3) phải qua 3
giai đoạn: chiết lỏng – lỏng với ether ethylic để tách lấy nhóm kém
phân cực từ PĐ AL-SFE. Sử dụng 2 lần sắc ký cột, lần đầu sử dụng
chất hấp phụ silica gel RP-18 để loại tạp dầu béo, sau đó là silica gel
cỡ hạt nhỏ và rửa giải bằng n–hexan với tốc độ chậm để tránh dồn vết.
Kết quả: phân lập được 17 hợp chất từ các cao TNHC. Trong đó:
- 1 alcaloid mới được công bố lần đầu tiên, cấu trúc được xác
định là 6-ethoxyundulatin.
- 7 hợp chất đã được công bố từ dược liệu khác, lần đầu tiên
được công bố từ TNHC: kaempferol, isoquercitrin, flazin, esuletin, phydroxybenzoic, 6-ethoxybuphanidrin, 6-hydroxypowellin.
- 9 hợp chất đã được công bố trước đây từ TNHC: hippadin,
augustamin, lycorin, undulatin, crinamidin, 6-hydroxybuphanidrin, 6hydroxyundulatin, 6-hydroxycrinamidin và astragalin.

Định lượng flavonoid:
Pha động: methanol – dung dịch acid phosphoric pH 4 (20 : 80).
Dung dịch đối chiếu: hòa tan astragalin và isoquercitrin trong để có
dung dịch đối chiếu có nồng độ lần lượt là 250 µg/ml và 100 µg/ml.
Dung dịch thử: cân chính xác khoảng 10 g bột dược liệu vào cốc có
mỏ 250 ml, thêm 50 ml ethanol 70% (TT), siêu âm trong 30 phút ở

nhiệt độ 50 ± 2 oC (x 3 lần. Cô dịch chiết ethanol đến gần cạn, để nguội,
acid hóa dịch chiết bằng bằng dung dịch acid hydrocloric 1% (TT) đến
pH 3 – 4. Chuyển vào bình lắng gạn, chiết lấy flavonoid bằng cách lắc
hỗn hợp trong bình lắng với 30 ml ethyl acetat (TT) (x 3 lần). Cô dịch
chiết ethyl acetat đến cạn dung môi, thu được cắn flavonoid. Hòa tan
phần cắn này trong bình định mức 10 ml với dung môi là pha động,
thêm dung môi đến vạch, lắc đều. Lọc qua màng lọc 0,45 µm.
Điều kiện sắc ký:Cột thép không gỉ Phenomenex (25 x 4,6 mm) được
nhồi pha tĩnh C8 (5 µm).
Detector: PDA, bước sóng 265 nm.
Rửa giải isocratic.
Tốc độ dòng: 1ml/phút.
Thể tích tiêm: 10 µl.


18

7

B. Phương pháp dấu vân tay sắc ký lỏng hiệu năng cao: các bước tiến
hành và phương pháp đánh giá được thực hiện theo Mục 3.4.6.
Định lượng: định lượng hai nhóm hoạt chất chính là alcaloid và
flavonoid.
Tiến hành phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao.

3.3 Thiết lập chất đối chiếu
- Các hợp chất có độ tinh khiết cao, khối lượng khoảng 500 mg và là
chất đánh dấu của cây TNHC được chọn để thiết lập CĐC.
- 6 nguyên liệu được chọn để thiết lập CĐC: 4 alcaloid là crinamidin,
6-hydroxycrinamidin, lycorin, hippadin; 2 flavonoid là astragalin và

isoquercitrin.
3.3.1 Xây dựng phương pháp đánh giá nguyên liệu thiết lập CĐC
- Xây dựng phương pháp xác định độ tinh khiết bằng HPLC:

Định lượng alcaloid:
Pha động: Dung môi A: methanol
Dung môi B: dung dịch acid phosphoric pH 3 và 0,2% TEA.
Dung dịch đối chiếu: hòa tan crinamidin và 6-hydroxycrinamidin trong
pha động để có dung dịch đối chiếu có nồng độ lần lượt là 150 µg/ml
và 100 µg/ml.
Dung dịch thử: cân chính xác khoảng 10 g bột dược liệu vào cốc có
mỏ 250 ml, thêm 50 ml ethanol 70% (TT), siêu âm trong 30 phút ở
nhiệt độ 50 ± 2 oC (x 3 lần. Cô dịch chiết ethanol đến gần cạn, để nguội,
kiềm hóa dịch chiết bằng bằng dung dịch amoniac 25% (TT) đến pH 9
– 10. Chuyển vào bình lắng gạn, chiết lấy alcaloid bằng cách lắc hỗn
hợp trong bình lắng với 30 ml cloroform (TT) (x 3 lần). Cô dịch chiết
cloroform đến cạn dung môi, thu được cắn alcaloid. Hòa tan phần cắn
này trong bình định mức 10 ml với dung hỗn hợp dung môi A và B (25
: 75), thêm dung môi đến vạch, lắc đều. Lọc qua màng lọc 0,45 µm.
Điều kiện sắc ký: Cột thép không gỉ Phenomenex (25 x 4,6 mm) được
nhồi pha tĩnh C8 (5 µm).
Detector: PDA, bước sóng 214 nm.
Rửa giải gradient.
Tốc độ dòng: 1ml/phút.
Thể tích tiêm: 10 µl.
Cách tiến hành:
Kiểm tra khả năng thích hợp của hệ thống sắc ký: tiến hành sắc ký đối
với dung dịch đối chiếu. Phép thử chỉ có giá trị khi độ lệch chuẩn tương

Điều kiện phân tích: cột: C8 Phenomenex (250 x 4,6 mm; 5 m); nhiệt

độ cột: 40 oC; detector PDA; tốc độ dòng 1 ml/phút.
- Mẫu thử: nguyên liệu CĐC được pha 100 μg/ml trong pha động.
- Thành phần pha động của mỗi chất được trình bày ở Bảng 3.1.
Bảng 3.13 Thành phần pha động của các quy trình xác định độ tinh
khiết của các nguyên liệu CĐC bằng phương pháp HPLC.
Tên chất khảo sát

Thành phần và tỷ lệ pha động

Crinamidin

Methanol – acid phosphoric pH 3 (35 : 65)

6-hydroxycrinamidin

Methanol – acid phosphoric pH 3 (35 : 65)

Lycorin

Methanol – acid phosphoric pH 3 (10 : 90)

Hippadin

Methanol – acid phosphoric pH 3 (70 : 30)

Astragalin

Acetonitril – acid phosphoric pH 4 (25 : 75)

Isoquercitrin

Acetonitril – acid phosphoric pH 4 (25 : 75)

Xác định tính phù hợp hệ thống: các hệ số sắc ký đều đạt yêu cầu, quy
trình đạt tính phù hợp hệ thống.
Thẩm định quy trình:
- Tính đặc hiệu: sắc ký đồ mẫu trắng không có tín hiệu tại vị trí thời
gian lưu của pic chính trên sắc ký đồ mẫu thử.
- Tính tuyến tính: tiêm 6 nồng độ của mỗi chất từ 10  500 (µg/ml).


8

17

Phương trình hồi qui và hệ số tương quan như sau:
Crinamidin:
ŷ = 70299x
R2 = 0,9994
6-hydroxycrinamidin: ŷ = 149967x
R2 = 0,9996
Lycorin:
ŷ = 9088x
R2 = 0,9999
Hippadin:
ŷ = 58426x
R2 = 0,9990
Astragalin:
ŷ = 21716x
R2 = 0,9969

Isoquercitrin:
ŷ = 17244x
R2 = 0,9991
Nhận xét: có sự tương quan tuyến tính giữa nồng độ và diện tích pic
của các CĐC trong khoảng nồng độ khảo sát (R2 > 0,998).
- Độ chính xác:
Kết quả khảo sát được trình bày ở Bảng 3.2. RSD% độ tinh khiết sắc
ký của các pic chính < 2%.
Như vậy, các quy trình xác định độ tinh khiết sắc ký các CĐC đạt yêu
cầu về độ chính xác.
Bảng 3.15 Kết quả độ tinh khiết sắc ký (%) của các CĐC bằng HPLC.
Tên chất đối chiếu

Độ tinh khiết sắc ký (%)

Crinamidin

98,71%

(RSD% = 0,02)

6-hydroxycrinamidin

96,78 %

(RSD% = 0,08)

Lycorin

99,99%

(RSD% = 0,03)

Hippadin

99,92%

(RSD% = 0,02)

Astragalin

98,29%

(RSD% = 0,11)

Isoquercitrin

98,12%

(RSD% = 0,03)

- Độ đúng: chưa thực hiện được vì hệ thống kiểm nghiệm thuốc quốc
gia chưa phân phối các chất đối chiếu gốc này.
3.3.2 Xây dựng tiêu chuẩn đánh giá nguyên liệu đối chiếu
- Tính chất: các alcaloid là bột kết tinh màu trắng, các flavonoid là bột
kết tinh màu vàng.

- DVT– HPLC alcaloid: mẫu thử có ít nhất 6 pic đặc trưng như sau:
Pic
1

2
3
4
5
6

diện
tích (%)
9,0 ± 0,5 (6-hydroxycrinamidin)
21,9
10,5 ± 0,5 (6-hydroxypowelin)
17,8
13,5 ± 0,5 (crinamidin)
13,7
18,0 ± 0,5 (6-hydroxybuphanidrin)
20,8
20,5 ± 0,5 (6-hydroxyundulatin)
18,3
23,5 ± 0,5 (undulatin)
7,6
Thời gian lưu (phút)

Phổ UV-Vis
Các pic alcaloid
đều có phổ UV
tương tự:
λmax = 214 nm
vai ở 281 nm

3.5 Đề xuất một số chỉ tiêu cần thiết để xây dựng tiêu chuẩn kiểm

nghiệm cho bột lá TNHC
Một số chỉ tiêu và phương pháp thử để đánh giá chất lượng bột lá
TNHC như sau:
Một số chỉ tiêu của TCKN lá TNHC
Lá đã phơi hoặc sấy khô của cây Trinh nữ hoàng cung (Crinum
latifolium L.), họ Thủy tiên (Amaryllidaceae).
Mô tả: lá khô có màu từ vàng nâu đến nâu sẫm, dai, mùi hăng đặc biệt,
dài 50 - 90 cm, rộng khoảng 2 - 5 cm. Vị đắng.
Bột: mùi hăng, vị đắng. Mảnh biểu bì mang lỗ khí có tinh thể calci
oxalat hình kim, tế bào hình đa giác thuôn dài. Mảnh mạch xoắn. Hạt
tinh bột riêng lẻ, dạng hình bầu dục, tễ có hình sao. Cuộn sợi nhiều,
sợi vách dày, khoang hẹp.
Độ ẩm: không quá 12% (DĐVN IV - Phụ lục 9.6).
Tro không tan trong acid HCl: ≤ 2% (DĐVN IV - Phụ lục 9.7).
Tro toàn phần: không quá 15% (DĐVN IV - Phụ lục 9.8).
Định tính: định tính hai nhóm hoạt chất alcaloid và flavonoid. Có thể
thực hiện theo một trong hai phương pháp sau:
A. Phương pháp dấu vân tay sắc ký lớp mỏng: các bước tiến hành và
phương pháp đánh giá được thực hiện theo Mục 3.4.6.


16

9

3.4.6 Phương pháp dấu vân tay định tính alcaloid hoặc flavonoid
Mẫu thử: alcaloid AL-SA hoặc flavonoid FL-SA.
Mẫu đối chiếu: các chất đối chiếu như trong phần định lượng alcaloid
và flavonoid bằng phương pháp HPLC.

- Điểm chảy: thực hiện theo hướng dẫn DĐVN IV-Phụ lục 6.7.
- Định tính: bằng các phương pháp phổ nghiệm
Phổ UV-Vis: mẫu được hòa tan trong methanol, nồng độ 10
µg/ml. Quyét phổ trong khoảng bước sóng từ 200 – 800 nm.
Phổ MS: xác định pic cơ bản (m/z).
Phổ IR: dập viên KBr. Xác định các dao động đặc trưng.
Phổ NMR: xác định độ dịch chuyển của proton và carbon.
Dữ liệu phổ của CĐC criamidin:

Phương pháp DVT – SKLM:
Bản sắc ký tráng sẵn silica gel F254; chiều dài 10 cm; chiều rộng giữa
các vết khoảng 1cm; khai triển một lần ở nhiệt độ phòng.
Dung môi:
Mẫu thử alcaloid:
cloroform – methanol – dd amoniac (5 : 1 : 0,05)
Mẫu thử flavonoid:
cloroform – methanol – acid formic (3 : 1 : 1)
Tiến hành: chấm riêng biệt trên bản mỏng khoảng 20 μl dung dịch thử
và đối chiếu. Triển khai sắc ký đến khi dung môi đi được khoảng 10
cm. Quan sát dưới ánh sáng tử ngoại và hiện màu bằng TT Dragendorff
(alcaloid) hoặc TT FeCl31% (flavonoid).
Phát hiện: đèn UV 254 hoặc 365 nm hoặc TT Dragendorff.
Đánh giá: sắc ký đầy DVT – SKLM alcaloid TNHC phải có ít nhất 6
vết có cùng màu sắc và tương đương Rf với vết CĐC tương ứng.
Phương pháp DVT – HPLC
Điều kiện: điều kiện sắc ký, các bước tiến hành xác định DVT alcaloid
như Mục 3.4.2; xác định DVT flavonoid TNHC như Mục 3.4.3.
Đánh giá: chọn các pic có tỷ lệ diện tích ≥ 5% tại λ = 214 nm
(alcaloid); λ = 265 nm (flavonoid) để ghi nhận thời gian lưu tương đối,
% diện tích pic và phổ UV.

- DVT– HPLC flavonoid: mẫu thử có ít nhất 2 pic đặc trưng như sau:
Pic

Thời gian lưu (phút)

1
2

11,5 ± 0,5 (isoquercitrin)
18,5 ± 0,5 (astragalin)

% diện
tích
29,5
70,5

Phổ UV-Vis
λ = 254 và 355 (nm)
λ = 265 và 346 (nm)

- UV/methanol: max (nm) 212 và 286.
- IR (KBr): υmax (cm-1) 3200 (-OH); 1616 (C=C); 1046 (-OCH2O-).
- ESI-MS (+): m/z = 318,46 [M+H]+, M phù hợp với công thức nguyên
C17H19NO5.
- 1H-NMR (500 MHz, CDC13): δH (ppm) 1,59 (2H; m; H-4); 2,02 (1H;
m; H-11); 2,39 (1H; dt; J=6; 11,5 Hz; H-11*); 2,79 (1H; m; H-12);
3,17 (1H; m; H-4a); 3,17 (1H; m; H-12*); 3,27 (1H; t; J = 2,5 Hz; H2); 3,70 (1H; d; J = 17,5 Hz; H-6β); 3,76 (1H; d; J = 3 Hz; H-1); 3,97
(3H; s; H-14); 4,18 (1H; d; J = 17,5 Hz; H-6α); 4,47 (1H; d; J = 2,5
Hz; H-3); 5,87 (2H; dd; J = 6,5; 1,5 Hz; H-13); 6,63 (1H; s; H-10).
- 13C-NMR (125 MHz, CDCl3): δC (ppm) 29,7 (C-4); 39,1 (C-11);

41,7 (C-10b); 52,6 (C-12); 53,8 (C-1); 56,5 (C-2); 58,5 (C-6); 59,1
(C-14); 61,0 (C-4a); 65,2 (C-3); 96,5 (C-10); 100,7 (C-13); 117,5 (C6a); 133,4 (C-8); 138,7 (C-10a); 141,1 (C-7); 148,2 (C-9).
Dữ liệu phổ của CĐC 6-hydroxycriamidin:
- UV/methanol: max (nm) 212 và 286.
- IR (KBr): υmax (cm-1) 3508 (-OH); 1616 (C=C); 1286 (-OCH3); 1037
(-OCH2O-).
- ESI-MS (+): m/z = 334,38 [M+H]+ ]+, M phù hợp với công thức
nguyên C17H19NO6.


10

15

- 1H-NMR (500 MHz, CDCl3+MeOD): δH (ppm) 1,52 (1H; m; H-4β);
1,60 (1H; m; H-4α); 1,77 (1H; m; H-11); 2,35 (1H; m; H-11*); 2,70
(1H; m; H-12); 3,12 (1H; m; H-12*); 3,28 (1H; brt; H-2); 3,68 (1H;
dd; J = 13,5; 10 Hz; H-4a); 3,74 (1H; d; J = 3,5 Hz; H-1); 4,05 (3H; s;
H-14); 4,43(1H; d; J = 2 Hz; H-3); 5,19 (1H; s; H-6); 5,90 (2H; d; J =
1 Hz; H-13); 6,65 (1H; s; H-10).
- 13C-NMR (125 MHz, CDCl3+MeOD): δC (ppm) 28,7 (C-4); 35,5 (C11); 42,1 (C-10b); 46,3 (C-12); 53,7 (C-1); 54,6 (C-4a); 56,4 (C-2);
59,7 (C-14); 64,9 (C-3); 85,2 (C-6); 96,7 (C-10); 101,2 (C-13); 119,3
(C-6a); 134,4 (C-8); 139,2 (C-10a); 142,9 (C-7); 149,8 (C-9).
Dữ liệu phổ của CĐC lycorin:

3.4.5 Quy trình định lượng đồng thời 2 flavonoid bằng CE
- Điều kiện điện di: các điều kiện điện di tương tự quy trình định lượng
alcaloid. Dung dịch điện di dinatri tetraborat 45 mM; điều chỉnh đến
pH 9,0 bằng acid boric, phối hợp với methanol để được dung dịch điện
di nền có 10% methanol.

Kỹ thuật điện di vùng CZE.
Khảo sát tính phù hợp hệ thống: các quy trình đạt yêu cầu.
Thẩm định quy trình phân tích: cả 4 quy trình đều đạt yêu cầu của tính
đặc hiệu; tính tuyến tính (R2 ≥ 0,998); độ chính xác (RSD của
các kết quả định lượng ≤ 5,3%); độ đúng với tỷ lệ phục từ 90 – 107%.

- UV/methanol: max (nm) 238 và 288.
- IR (KBr): υmax (cm-1) 3333 (-OH); 1500 (C=C); 1018 (-OCH2O-).
- ESI-MS (+): m/z = 288,44 [M+H]+, M phù hợp với công thức nguyên
C16H17NO4.
- 1H-NMR (500 MHz, DMSO): δH (ppm) 2,20 (1H; m; H-12); 2,442,50 (2H; m; H-11); 2,49 (1H; overlapped; H-10b); 2,60 (1H; d; J
=10,5 Hz; H-4a); 3,19 (1H; m; H-12*); 3,32 (1H; d; J = 14,5 Hz; H6β); 3,97 (1H; br s; H-2); 4,01 (1H; d; J = 14 Hz; H-6α); 4,27 (1H; brs;
H-1); 4,78 (1H; d; J = 4 Hz; 1-OH); 4,89 (1H; d; J = 6,5 Hz; 2-OH);
5,36 (1H; brt; H-3); 5,94-5,95 (2H; 2d; J = 0,5; 1 Hz; H-12); 6,67 (1H;
s; H-7); 6,80 (1H; s; H-10).
- 13C-NMR (125 MHz): δC (ppm) 28,1 (C-11); 40,2 (C-10b); 53,3 (C12); 56,7 (C-6); 60,8 (C-4a); 70,2 (C-1); 71,7 (C-2); 100,5 (H-12);
105,0 (C-10); 106,9 (C-7); 118,4 (C-3); 129,6 (C-6a); 129,7 (C-10a);
141,7 (C-4); 145,2 (C-8); 145,6 (C-9).
Dữ liệu phổ của CĐC hippadin:
- UV/methanol: max (nm) 247; 297 và 349.

Bảng 3.28 Kết quả định lượng alcaloid trong lá TNHC (n = 6).
Hàm lượng alcaloid trong lá TNHC
(µg/g)
Tên alcaloid
HPLC
CE
µ = 145,3 ± 3,3
µ = 142,7 ± 4,7
Crinamidin

(RSD = 2,16%)
(RSD = 4,07%)
µ = 112,1 ± 3,2
µ = 115,4 ± 4,4
6-hydroxycrinamidin
(RSD = 2,68%)
(RSD = 4,76%)
µ = 345,9 ± 9,5
µ = 339,7 ± 13,1
6-hydroxypowellin
(RSD = 2,63%)
(RSD = 4,81%)
µ = 421,1 ± 9,9
µ = 420,7 ± 14,8
6-hydroxybuphanidrin
(RSD = 2,24%)
(RSD = 4,38%)
µ = 77,6 ± 2,6
µ = 75,7 ± 2,36
Undulatin
(RSD = 3,17%)
(RSD = 3,90%)
µ = 286,4 ± 7,1
µ = 285,3 ± 8,5
6-hydroxyundulatin
(RSD = 2,35%)
(RSD = 3,71%)
Bảng 3.31 Kết quả định lượng flavonoid trong lá TNHC (n = 6).

Astragalin

- IR (KBr): υmax (cm-1) 1675 (C=O); 1620 (C=C); 1036 (C-O).
Isoquercitrin

Hàm lượng flavonoid trong lá TNHC (µg/g)
Phương pháp HPLC
Phương pháp CE
µ = 266,0 ± 6,2
µ = 261,9 ± 9,7
RSD = 2,21%
RSD = 3,56%
µ = 125,9 ± 2,6
µ = 126,0 ± 3,1
RSD = 1,99%
RSD = 2,32%


14

11

3.4.1 Quy trình xử lý mẫu
- Mẫu thử alcaloid: cân 10 g bột lá cho vào cốc, thêm 50 ml cồn 70%,
siêu âm trong 30 phút ở nhiệt độ 50 ± 2 oC (x 3 lần). Toàn bộ dịch chiết
được thu hồi dung môi, kiềm hóa bằng amoniac 25% đến pH 9 – 10.
Chiết với 30 ml cloroform (x3 lần). Gộp toàn bộ dịch cloroform, thu
hồi dung môi đến cắn alcaloid AL-SA.
- Mẫu thử flavonoid: cân 10 g bột lá cho vào cốc 250 ml, thêm 50 ml
cồn 70%, siêu âm trong 30 phút ở nhiệt độ 50 ± 2 oC (x 3 lần). Toàn
bộ dịch chiết được thu hồi dung môi, sau đó acid hóa bằng acid

hydrocloric đến pH 3 – 4. Chiết với 30 ml ethyl acetat (x3 lần). Gộp
toàn bộ dịch ethyl acetat, thu hồi dung môi đến cắn flavonoid FL-SA.
3.4.2 Quy trình định lượng đồng thời 6 alcaloid bằng HPLC

- ESI-MS (+): m/z = 286,31 [M+Na]+, M phù hợp với công thức
nguyên C16H9NO3.
- 1H-NMR (500 MHz, CDCl3): δH (ppm) 6,16 (2H; s; H-12); 6,90 (1H;
d; J = 3,5 Hz; H-4); 7,47 (1H; t; J = 8 Hz; H-2); 7,64 (1H; s; H-11);
7,74 (1H; d; J = 8 Hz; H-3); 7,91 (1H; d; J = 8 Hz; H-1); 7,97 (1H; s;
H-8); 8,04 (1H; d; J = 3,5 Hz; H-5).
- 13C-NMR (125 MHz, CDCl3): δC (ppm) 101,7 (C-11); 102,3 (C-12);
108,4 (C-8); 110,8 (C-4); 116,7 (C-11a); 118,4 (C-1); 122,6 (C-3);
122,6 (C-11b); 123,5 (C-5); 124,0 (C-2); 128,4 (C-3a); 131,0 (C-11c);
131,7 (C-7a); 148,6 (C-10); 152,6 (C-9); 158,2 (C-7).
Dữ liệu phổ của CĐC astragalin:

- Các điều kiện sắc ký: cột C8 Phenomenex C8 (250 x 4,6 mm; 5 m),

- IR (KBr): υmax (cm-1) 3284 (OH); 1654 (C=O); 1068 (C-O).
- ESI-MS (+): m/z = 471,31 [M+Na]+, M phù hợp với công thức
nguyên C21H20O11.
- 1H-NMR (500 MHz, DMSO): δH (ppm) 3,08 (2H; br s; H-3” và H4”); 3,18 (1H; m; H-2”); 3,21 (1H; m; H-5”); 3,32 (1H; m, H-6”a);
3,56 (1H; dd; J = 11,5; 5 Hz, H-6”b); 5,46 (1H; d; J = 7,5 Hz, H-1”);
6,21 (1H; d; J = 2 Hz, H-8); 6,43 (1H; d; J = 2 Hz, H-6); 6,88 (2H; d;
J = 9 Hz, H-3’, H-5’); 8,04 (2H; d; J = 9 Hz, H-2’, H-6’); 10,19 (1H;
s; 4’-OH); 10,87 (1H; s; 7-OH); 12,62 (1H; s; 5-OH).
- 13C-NMR (125 MHz, DMSO): δC (ppm) của phần đường 60,8 (C6”); 69,9 (C-4”); 74,2 (C-2”); 76,4 (C-5”); 77,5 (C-3”); 100,9 (C-1”);
phần aglycon 93,63 (C-8); 98,7 (C-6); 104,0 (C-10); 115,1 (C-3’ và
5’); 120,9 (C-1’); 130,9 (C-2’ và 6’); 133,2 (C-3); 156,3 (C-5); 156,4
(C-2); 159,9 (C-4’); 161,2 (C-9); 164,10 (C-7); 177,46 (C-4).

Dữ liệu phổ của CĐC isoquercitrin:

tốc độ dòng: 1 ml/phút, bước sóng phát hiện: 214 nm, thể tích tiêm: 10
µl, nhiệt độ cột: 40 oC. Rửa giải theo chương trình dung môi, pha động
là methanol; dung dịch acid H3PO4 pH 3 và 0,2% TEA.
3.4.3 Quy trình định lượng đồng thời 2 flavonoid bằng HPLC
- Điều kiện sắc ký: các điều kiện sắc ký tương tự quy trình định lượng
alcaloid. Rửa giải đẳng dòng, pha động là hỗn hợp dung môi acetonitril
– dung dịch acid phosphoric pH 4 (20 : 80), bước sóng 265 nm.
3.4.4 Quy trình định lượng đồng thời 6 alcaloid bằng CE
- Điều kiện điện di: cột mao quản silica nung chảy chiều dài tổng cộng
64,5 cm; chiều dài hiệu quả 56 cm; đường kính trong 50 μm. Thể tích
tiêm mẫu 50 mbar x 5 giây, điện thế 25 kV, nhiệt độ cột 25 oC, sước
sóng phát hiện 214 nm. Dung dịch điện di dinatri tetraborat 25 mM;
SDS 50 mM; điều chỉnh pH 9,5 bằng natri hydroxid 1N, phối hợp để
được dung dịch điện di có 10% methanol.
Kỹ thuật điện di MEKC.

- UV/methanol: max (nm) 265 và 347.

- UV/methanol: max (nm) 255 và 354.
- IR (KBr): υmax (cm-1) 3219 (OH); 1662 (C=O); 1060 (C-O).


12

13

- ESI-MS (+): m/z = 487,33 [M+Na]+, M phù hợp với công thức
nguyên C21H20O12.

- 1H-NMR (500 MHz, DMSO-d6): δH (ppm) 3,08 (2H; overlapped; H3” và H- 4”); 3,24 (1H; overlapped; H-5”); 3,24 (1H; overlapped; H2”); 3,32 (1H; overlapped, H-6”); 3,58 (1H; d; J = 11,5 Hz, H-6”); 5,46
(1H; d; J = 7,5 Hz, H-1”); 6,20 (1H; d; J = 2 Hz, H-6); 6,40 (1H; d; J
= 2 Hz, H-8); 6,84 (1H; d; J = 9 Hz; H-5’); 7,57 (1H; overlapped, H6’); 7,58 (H; overlapped, H-2’);12,62 (1H; s; 5-OH).
- 13C-NMR (125 MHz, DMSO-d6): phần đường δC (ppm) 61,0 (C-6”);
69,9 (C-4”); 74,1 (C-2”); 76,5 (C-5”); 77,5 (C-3”); 100,9 (C-1”); phần
aglycon δC (ppm) (C-5’); 116,2 (C-2’); 121,1 (C-1’); 121,5 (C-6’);
144,8 (C-4’); 148,4 (C-3’); 93,5 (C-8); 98,6 (C-6); 103,9 (C-10);
115,2; 133,3 (C-3); 156,2 (C-5); 156,3 (C-2); 161,2 (C-9); 164,1 (C7); 177,4 (C-4).

Bảng 3.18 Kết quả đánh giá đồng nhất lô của CĐC sau khi đóng gói.

- Xác định độ tinh khiết sắc ký: thực hiện phương pháp HPLC.
Kiểm tra tính phù hợp của hệ thống: các quy trình đều đạt yêu cầu.
Kết quả đánh giá độ tinh khiết sắc ký của các CĐC: kết quả được trình
bày ở Bảng 3.2. Các nguyên liệu CĐC có độ tinh khiết sắc ký ≥ 95%.
3.2.3 Xây dựng tiêu chuẩn đánh giá các CĐC:
Các CĐC khảo sát được xây dựng tiêu chuẩn đánh giá như CĐC hóa
học thứ cấp dùng cho phép thử định lượng.
3.2.4 Đóng gói và đánh giá đồng nhất:
Đóng gói: các CĐC được đóng trong các lọ thủy tinh nâu trong tủ đóng
ống Glove-box. Các ống CĐC được bảo quản ở nhiệt độ 2 - 8 oC.
Đánh giá đồng nhất lô: các lọ CĐC đồng nhất trong quá trình gói.
Đánh giá đồng nhất liên phòng thí nghiệm: độ tinh khiết của các CĐC
không phụ thuộc vào PTN tham gia đánh giá, các lọ CĐC đồng nhất.

TT
1
2
3
4

5
6
7
8
9
10
11
TB %

Độ tinh khiết sắc ký TB giữa 2 lần phân tích (%)
Crina.
6-OHcri. Hippadin Lycorin Astra. Isoquer.
98,69
96,72
99,96
99,99
98,23
98,02
98,70
96,75
99,98
99,99
98,27
98,07
98,67
96,76
99,98
100,00 98,26
98,11
98,72

96,73
99,99
100,00 98,30
98,13
98,73
96,74
99,93
100,00 98,30
98,09
98,76
96,75
99,95
99,99
98,29
98,10
98,70
96,72
99,91
100,00 98,31
98,15
98,74
96,76
99,98
100,00 98,25
98,11
98,71
96,75
99,93
99,99
98,27

98,15
98,69
96,79
99,93
99,99
98,30
98,14
98,70
96,81
99,99
100,00 98,26
98,10
98,71
96,75
99,96
99,99
98,28
98,10

3.2.5 Xác định giá trị ấn định và giá trị công bố:
Bảng 3.25 Giá trị ấn định và giá trị công bố các CĐC.
Tên chất khảo sát
Crinamidin
6-hydroxycrinamidin
Hippadin
Lycorin
Astragalin
Isoquercitrin

x*%

98,74
96,75
99,99
99,98
98,28
98,15

s*
0,023
0,017
0,009
0,020
0,115
0,018

µx
0,007
0,006
0,003
0,006
0,037
0,005

X%
98,74
96,74
99,99
99,98
98,25
98,16

3.4. Xây dựng phương pháp HPLC,CE, dấu vân tay để định tính,
định lượng alcaloid hoặc flavonoid
Mẫu đối chiếu alcaloid: crinamidin (98,71%), 6-hydroxycrinamidin
(96,75%), 6-hydroxypowellin (98,56%), 6-hydroxyundulatin
(99,66%), undulatin (98,50%) và 6-hydroxybuphanidrin (98,65%).
Mẫu đối chiếu flavonoid: astragalin (98,28%), isoquercitrin
(98,15%). Cafein (100,01%) và quercetin (91,4%) là chuẩn nội của
quy trình CE.