Nghiên cứu ảnh hưởng của chất kích kháng thực vật methyl jasmonate lên khả năng tích lũy asiaticoside trong nuôi cấy huyền phù tế bào rau má (centella asiatica l )
Bạn đang xem bản rút gọn của tài liệu. Xem và tải ngay bản đầy đủ của tài liệu tại đây (2.76 MB, 55 trang )
1
ĐẠI HỌC HUẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM
======
TRÀ THỊ KHÁNH NHI
NGHIÃN CÆÏU AÍNH HÆÅÍNG CUÍA METHYL
JASMONATE
LÃN KHAÍ NÀNG TÊCH LUÎY ASIATICOSIDE
TRONG NUÄI CÁÚY HUYÃÖN PHUÌ TÃÚ BAÌO
RAU MAÏ (Centella asiatica L.)
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
NGÀNH: SINH HỌC
GIẢNG VIÊN HƯỚNG DẪN:
PGS. TS. TRẦN QUỐC DUNG
ThS. NGUYỄN THANH GIANG
HUẾ, KHÓA HỌC 2011 - 2015
2
LỜI CẢM ƠN
Trong suốt thời gian học tập và hoàn thành khóa luận, tôi đã nhận
được rất nhiều sự giúp đỡ các thầy cô giáo Khoa Sinh học, Trường Đại
học Sư phạm Huế. Tôi xin chân thành cảm ơn sự giúp đỡ quý giá đó.
Đặc biệt, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành và lời cảm ơn sâu
sắc nhất đến PGS.TS. Trần Quốc Dung và ThS. Nguyễn Thanh Giang,
hai thầy giáo đã tận tình hướng dẫn, chỉ bảo và tạo mọi điều kiện thuận
lợi nhất cho tôi trong suốt quá trình thực hiện khóa luận này.
Tôi xin gửi lời cảm ơn đến các thầy cô lãnh đạo Viện Công nghệ
sinh học, Đại học Huế, các cán bộ của Viện, đặc biệt là TS. Hoàng Tấn
Quảng, và KS. Trịnh Hữu Tấn đã có nhiều sự giúp đở quý báu cho tôi
trong quá trình thực hiện khóa luận này.
Cuối cùng tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến những người thân
trong gia đình, bạn bè đã động viên, giúp đỡ tôi trong suốt thời gian học
tập cho đến khi hoàn thành khóa luận này.
Một lần nữa tôi xin chân thành cảm ơn!
Huế, tháng 5 năm 2015
Tác giả
Trà Thị Khánh Nhi
3
DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT
2,4-D
: 2,4-dichlorophenoxyacetic acid
BAP
: 6 - benzylamino purine
cs
: cộng sự
g/L
: gam/lít
HCTC
: hợp chất thứ cấp
HPLC
: high performance liquid chromatography (sắc ký lỏng hiệu năng cao)
KIN
: kinetin
MeJA
: methyl jasmonate
MS
: Murashige và Skoog (1962)
mg/L
: miligam/lít
mg/g
: miligam/gam
NAA
:
Nxb
: nhà xuất bản
SA
: salicylic acid
YE
: yeast extract (dịch chiết nấm men)
ĐHST
: điều hòa sinh trưởng
MS
: môi trường nuôi cấy cơ bản
µM
: micromol
naphthaleneacetic acid
4
DANH MỤC CÁC BẢNG
Số hiệu
Tên bảng
Trang
Sản phẩm thứ cấp từ nuôi cấy tế bào thực vật so với cây tự
nhiên.
Các hợp chất thứ cấp đã được sản xuất từ nuôi cấy mô và tế
Bảng 1.2
bào thực vật (Mulbagal and Tsay 2004).
Một số chất kích kháng sinh học được sử dụng để cải thiện
Bảng 1.3
hiệu suất của các hợp chất thứ cấp.
13
Bảng 3.1 Sinh khối tế bào thu được sau 24 ngày nuôi cấy (g).
27
Bảng 1.1
Bảng 3.2
Bảng 3.3
Bảng 3.4
Bảng 3.5
Bảng 3.6
Bảng 3.7
Bảng 3.8
Sinh khối tươi thu được sau khi bổ sung MeJA ở các nồng
độ khác nhau (g).
Sinh khối khô thu được sau khi bổ sung MeJA ở các nồng
độ khác nhau (g).
Tỷ lệ khối lượng sinh khối sau khi bổ sung MeJA so với
đối chứng (%).
Ảnh hưởng của nồng độ MeJA lên khả năng tích lũy
asiaticoside của tế bào (g).
Sinh khối tươi thu được sau khi bổ sung 100 µM MeJA ở
các nồng độ khác nhau (g).
Sinh khối khô thu được sau khi bổ sung 100 µM MeJA ở
các nồng độ khác nhau (g).
Ảnh hưởng của thời điểm bổ sung MeJA lên khả năng tích
lũy asiaticoside của tế bào rau má.
9
15
30
32
32
33
37
38
40
5
DANH MỤC CÁC BIỂU ĐỒ
Số hiệu
Tên biểu đồ
Biểu đồ thể hiện sinh khối khô tươi của tế bào rau má
sau khi bổ sung MeJA vào các nồng độ khác nhau.
Biểu đồ thể hiện sinh khối tưoi của tế bào rau má sau
Biểu đồ 3.2
khi bổ sung MeJA vào các nồng độ khác nhau.
Biểu đồ thể hiện sinh khối khô tươi của tế bào rau má
Biểu đồ 3.3 sau khi bổ sung 100 µM MeJA vào các thời điểm khác
nhau.
Biểu đồ thể hiện sinh khối khô của tế bào rau má sau
Biểu đồ 3.4 khi bổ sung 100 µM MeJA vào các thời điểm khác
nhau.
Biểu đồ 3.1
Trang
31
32
38
39
6
DANH MỤC CÁC HÌNH
Số hiệu
Tên bảng
Trang
Hình 3.1
Các loại callus sau 21 ngày nuôi cấy.
26
Hình 3.2
Huyền phù tế bào rau má sau 24 ngày nuôi.
27
Hình 3.3
Phổ HPLC chuẩn 1mg/mL.
29
Hình 3.4
Phổ HPLC đối chứng.
29
Phổ HPLC của asiaticoside khi bổ sung vào môi trường
nuôi cấy 50 µM MeJA.
Phổ HPLC của asiaticoside khi bổ sung vào môi trường
Hình 3.6
nuôi cấy 100 µM MeJA.
Phổ HPLC của asiaticoside khi bổ sung vào môi trường
Hình 3.7
nuôi cấy 150 µM MeJA.
Phổ HPLC của asiaticoside khi bổ sung vào môi trường
Hình 3.8
nuôi cấy 200 µM MeJA.
Phổ HPLC của dịch chiết asiaticoside từ tế bào nuôi trên
Hình 3.9
môi trường bổ sung 100 µM MeJA ở thời điểm 5 ngày.
Phổ HPLC của dịch chiết asiaticoside từ tế bào nuôi trên
Hình 3.10
môi trường bổ sung 100 µM MeJA ở thời điểm 10 ngày.
Phổ HPLC của dịch chiết asiaticoside từ tế bào nuôi trên
Hình 3.11
môi trường bổ sung 100 µM MeJA ở thời điểm 15 ngày.
Hình 3.5
35
35
36
36
41
41
40
7
PHẦN 1. MỞ ĐẦU
1. Tính cấp thiết của đề tài
Hiện nay, con người đang chống chọi với một loạt các bệnh tật mang
tính thời đại như béo phì, tiểu đường, tim mạch, ung thư, HIV/AIDS… Công
nghệ sản xuất dược phẩm cũng vì vậy mà được quan tâm đầu tư nhiều hơn.
Vấn đề quan trọng nhất ảnh hưởng trực tiếp đến chất lượng dược phẩm là
nguồn cung cấp nguyên liệu thiên nhiên sạch, đủ và an toàn. Một trong những
đối tượng cung cấp nguyên liệu hiệu quả nhất là thực vật. Có khoảng hơn
30.000 hợp chất được chiết xuất từ thực vật như alkaloid; terpenoid; phenolic;
được biết đến như là các hợp chất thứ cấp. Các hợp chất này thường chỉ được
tạo ra ở một số loại tế bào nhất định với hàm lượng rất nhỏ [6]. Mặc dù, hóa
học tổng hợp các chất hữu cơ đạt nhiều thành tựu quan trọng tuy nhiên nhiều
hợp chất có hoạt tính sinh học vẫn còn khó tổng hợp hoặc có thể tổng hợp
được nhưng chi phí rất đắt. Trên thế giới, vào cuối thế kỷ XIX, con người đã
sử dụng kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật sản xuất các chất có hoạt tính
sinh học đã giải quyết được vấn đề nan giải trên.
Trong đời sống của thực vật, hợp chất thứ cấp là sản phẩm của các phản
ứng hóa học của nó với môi trường hoặc là sự bảo vệ hóa học chống lại vi
sinh vật và động vật gây bệnh [4]. Chất kích kháng bảo vệ thực vật (elicitor)
báo hiệu việc hình thành các hợp chất thứ cấp. Vì vậy để tăng quá trình sản
xuất hợp chất thứ cấp thì giải pháp tối ưu nhất là sử dụng các chất kích kháng
của bộ máy bảo vệ cây. Đã có nhiều công trình nghiên cứu vấn đề trên như
nghiên cứu tăng sản xuất silymarin trong nuôi cấy tế bào của Silybum
marianum bằng các chất kích kháng thực vật dịch chiết nấm men (YE) và
methyl jasmonate (MeJA) [23].
Rau má (Centella asiatica L.) là cây thân thảo, thường được dùng để
thanh nhiệt, lợi thấp, giải độ, điều trị các bệnh ở gan, tì và thận, chữa lành vết
thương, kháng viêm, tổn thương ở niêm mạc da… [3]. Một số thành phần hóa
học quan trọng có trong nó như nhóm triterpens chứa asiatic acid, madecassic
8
acid, madecassoside, chất chống oxi hóa phenolic và đặc biệt là asiaticoside.
Asiaticoside có tác dụng lớn trong việc chống suy nhược cơ thể, liền vết bỏng
và vết thương tổn ở niêm mạc da, có hoạt tính diệt bào ngăn chặn được sự
phát triển của một số dòng tế bào ung thư [3].
Từ trước đến nay, rau má được khai thác chủ yếu từ nguồn hoang dại,
thô sơ, mang tính riêng lẻ, nên nguồn nguyên liệu cung cấp để chiết xuất các
hợp chất thứ cấp cho việc sản xuất dược liệu còn hạn chế vì thế cần tìm ra các
phương pháp để cải thiện. Nuôi cấy tế bào rau má có bổ sung chất kích kháng
thực vật là một trong những phương pháp tối ưu nhất [11].
Xuất phát từ ý nghĩa trên, tôi tiến hành đề tài: Nghiên cứu ảnh hưởng
của chất kích kháng thực vật methyl jasmonate lên khả năng tích lũy
asiaticoside trong nuôi cấy huyền phù tế bào rau má (Centella asiatica L.).
Nhằm ứng dụng kỹ thuật nuôi cấy tế bào thực vật để tăng nhanh quá trình sản
xuất asiaticoside, từ đó cung cấp nguồn dược chất tự nhiên cho các nghiên cứu
trong lĩnh vực y học. Kết quả của đề tài sẽ làm cơ sở cho việc hoàn chỉnh quy
trình sản xuất asiaticoside từ sinh khối tế bào để ứng dụng trong lĩnh vực dược
phẩm sau này.
2. Mục tiêu của đề tài
Tăng cường khả năng tích lũy asiaticoside trong quá trình nuôi cấy
huyền phù tế bào rau má bằng cách bổ sung chất kích kháng MeJA.
9
PHẦN 2. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU
Chương I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Nuôi cấy mô, tế bào thực vật
1.1.1. Cơ sở khoa học của việc nuôi cấy mô, tế bào thực vật
1.1.1.1. Nuôi cấy mô, tế bào thực vật là gì?
Nuôi cấy mô, tế bào thực vật (plant tissue culture) là kỹ thuật đưa một bộ
phận, mô hoặc tế bào của thực vật vào trong một hệ thống vô trùng có thể
kiểm soát về thành phần chất khoáng, điều hòa sinh trưởng, các chất hữu cơ
cung cấp cho sự sống của cây, các yếu tố ánh sáng, nhiệt độ, độ ẩm, độ pH…
để điều khiển sự phát sinh hình thái của tế bào thực vật một cách có định
hướng. Kỹ thuật này dựa vào hai nguyên tắc chính là tính toàn năng của tế bào
và khả năng biệt hóa và phản biệt hóa của tế bào [7].
1.1.1.2. Tính toàn năng của tế bào
Mỗi tế bào bất kì nào trong cơ thể thực vật đều mang đầy đủ thông tin di
truyền của cơ thể và có khả năng phát triển thành một cơ thể hoàn chỉnh khi
gặp điều kiện thuận lợi [1].
1.1.1.3. Sự biệt hóa và phản biệt hóa của tế bào
Một cơ thể thực vật bao gồm rất nhiều loại tế bào, chúng cấu tạo nên
các bộ phận khác nhau của cơ thể với những chức năng đặc trưng riêng.
Toàn bộ các tế bào này đều bắt nguồn từ một tế bào ban đầu (tế bào hợp tử).
Ở giai đoạn đầu, tế bào hợp tử phân chia thành nhiều tế bào phôi sinh chưa
mang riêng biệt (chuyên hóa). Sau đó các tế bào phôi này tiếp tục được biến
đổi thành các tế bào chuyên hóa đặc hiệu riêng cho các mô, cơ quan khác
nhau. Đó chính là sự biệt hóa tế bào. Tuy nhiên, khi tế bào đã phân hóa
thành các tế bào có chức năng chuyên biệt, chúng không hoàn toàn mất đi
khả năng biến đổi này của mình. Trong điều kiện thích hợp chúng có thể trở
về dạng tế bào phôi sinh và phân chia mạnh mẽ. Quá trình đó gọi là quá trình
phản biệt hóa tế bào.
10
Dựa vào hai đặc tính trên, con người đã ứng dụng vào khoa học thực tiễn
vào tạo nên kỹ thuật nuôi cấy tế bào thực vật.
1.1.2. Quy trình nuôi cấy mô, tế bào thực vật
Từ việc hiểu biết về các nguyên tắc của nuôi cấy tế bào thực vật trong
điều kiện hoàn toàn sạch vi sinh vật, vô trùng, trên môi trường dinh dưỡng
nhân tạo, con người đã hình thành nên nhiều lĩnh vực ứng dụng quan trọng.
Trong đó, nhân giống vô tính cây trồng in vitro hay vi nhân giống
(micropropagation) là một lĩnh vực ứng dụng hiệu quả nhất. Nó bao gồm:
- Nuôi cấy cây non và cây trưởng thành
- Nuôi cấy cơ quan: rễ, thân, lá, hoa, quả, bao phấn, noãn chưa thụ tinh.
- Nuôi cấy phôi: phôi non và phôi trưởng thành
- Nuôi cấy mô sẹo (callus)
- Nuôi cấy huyền phù tế bào
- Nuôi cấy tế bào trần
Trong đề tài nghiên cứu này, chúng sử dụng hai quy trình nuôi cấy mô,
tế bào đó là nuôi cấy mô sẹo và huyền phù tế bào rau má.
1.1.2.1. Nuôi cấy mô sẹo (callus)
Nuôi cấy callus cho phép các khối tế bào không có hình dạng nhất định
tăng lên từ sinh trưởng không phân hóa của mẫu vật trên môi trường dinh
dưỡng rắn vô trùng [7]. Môi trường nuôi cấy là môi trường dinh dưỡng cơ bản
có chất làm rắn là agar. Môi trường dinh dưỡng cơ bản này chứa các chất dinh
dưỡng khoáng đa lượng, vi lượng, nguồn carbon và nhiều loại chất ĐHST
thực vật như: auxin, cytokinin, giberelin… Để đạt được hiệu quả nuôi cấy
callus tối đa, cần đánh giá chính xác các ảnh hưởng của thành phần môi
trường dinh dưỡng hoặc loại, nồng độ chất ĐHST. Các thông số phổ biến nhất
dùng trong đánh giá sinh trưởng trong nuôi cấy callus bao gồm khối lượng
tươi, khối lượng khô và chỉ số sinh trưởng.
Mẫu vật thường là cơ quan nhỏ hoặc mẫu mô. Các khối tế bào này không
tương ứng với bất kì một mô đặc trưng nào của cây hoàn chỉnh [13].
11
1.1.2.2. Nuôi cấy huyền phù tế bào
Nuôi cấy huyền phù tế bào nuôi cấy các tế bào hay khối tế bào, sinh
trưởng phân tán trong môi trưởng lỏng, ở điều kiện vô trùng,( hình 3). Thường
được khởi đầu bằng cách đặt các khối mô callus dễ vỡ vụn trong môi trường
lỏng chuyển động (lắc hoặc khuấy), vì thế quy trình phải thực hiện theo thứ tự
thực vật đến mẫu vật, tới callus, và cuối cùng tới huyền phù. Trong quá trình
nuôi cấy, các tế bào sẽ dần dần tách ra khỏi mẫu do những chuyển động xoáy
của môi trường. Sau một thời gian ngắn trong dịch huyền phù sẽ có các tế bào
đơn, các cụm tế bào với kích thước khác nhau, các mẫu nuôi cấy còn thừa
chưa phát triển và các tế bào chết. Ở đây, có sự biến đổi màu sắc môi trường
nuôi cấy, từ trong trở nên đục do sự xuất hiện của các tế bào đơn. Mức độ sinh
trưởng và mức độ tách rời tế bào phụ thuộc vào khả năng tạo nhiều tế bào vỡ
vụn (friability) và được điều khiển bởi thành phần môi trường, đặc biệt là các
chất điều hoà sinh trưởng [4]. Các bình chứa mẫu được đặt trên máy lắc với
tốc độ 50-200 vòng/phút hoặc có thể nuôi cấy trong hệ lên men có hệ thống
khuấy và sục khí có tác dụng tạo thuận lợi cho sự trao đổi khí, sự lưu thông
của môi trường dinh dưỡng trong bình nuôi cũng như gia tăng sự tiếp xúc giữa
tế bào nuôi cấy với môi trường [4].
1.1.3. Môi trường nuôi cấy
Tương ứng với mỗi loại nhóm thực vật, sẽ có các nhu cầu thành phần
chất dinh dưỡng đặc trưng riêng, nhưng để nuôi cấy mô, tế bào thực vật đều
cần xuất phát chung từ môi trường cơ bản MS (Phụ lục 2.1). Các nguyên tố đa
lượng bao gồm các loại muối của nitrogen, potassium, calcium, phosphorus,
magnesium, sulfus. Các nguyên tố vi lượng bao gồm các loại muối của sắt,
kẽm, mangan, boron, copper, acid, pyridoxine, các amino acid, các phụ gia
hữu cơ (dịch chiết nấm men, dịch thủy phân casein…). Các chất kích thích
sinh trưởng thực vật chủ yếu là các chất ĐHST như các auxin (2,4 D,
NAA…), các cytokinin ( BAP, KIN…).
12
Nguồn carbon sucrose chính là chất thay thế cho nguồn cacbon được
thực vật cố định từ khí quyển bằng quang hợp. Ngoài ra glucose cũng thường
được đưa vào môi trường và cho hiệu quả mong muốn cao. Chất làm rắn môi
trường thường được sử dụng là agar.
1.2. Hợp chất thứ cấp, ứng dụng nuôi cấy tế bào để sản xuất hợp chất thứ cấp
1.2.1. Hợp chất thứ cấp là gì?
Khi thực vật chống lại với các tác nhân gây hại từ môi trường chẳng hạn
như sự tấn công của động vật, vi sinh vật, stress do thay đổi điều kiện môi
trường sống…chúng sẽ tạo nên các hợp chất có hoạt tính sinh học được gọi là
hợp chất thứ cấp. Thường thì thực vật sản xuất chúng với nồng độ rất nhỏ và
chức năng trao đổi chưa biết được đầy đủ [14].
Những nghiên cứu về hợp chất thứ cấp (HCTC) của thực vật phát triển từ
những năm 1950. Có khoảng hơn 30.000 hợp chất được chiết xuất từ thực vật
có hoạt tính và rất có giá trị đối với cuộc sống. Những hợp chất này có thể xếp
trong ba nhóm chính là alkaloid, tinh dầu và glycoside [7].
1.2.1.1. Các alkaloid
Có dạng tinh thể là các hợp chất chứa nitrogen, có hoạt tính sinh lý trên
tất cả động vật và được sử dụng trong công nghiệp dược. Họ alkaloid bao gồm
codein, nicotine, caffeine và morphine. Một số loài thực vật chứa nhiều
alkaloid như: cây thuốc phiện, thuốc lá, cà độc dược…Hoạt tính sinh học của
chúng rất đặc biết tác dụng lên hệ thần kinh (caffein), tác dụng lên cơ
(veratin), mạch máu (hydastrin)…[8].
1.2.1.2. Các tinh dầu
Các tinh dầu thường là hỗn hợp của nhiều terpenoid, được sử dụng như
chất mùi, chất thơm và dung môi [8].
1.2.1.3. Các glycoside
Bao gồm các hợp chất phenol và flavonoid, saponin và các cyanogenic
glycoside, một số trong chúng được sử dụng làm thuốc nhuộm, chất mùi thực
phẩm và dược phẩm [8].
13
1.2.2. Ứng dụng nuôi cấy tế bào thực vật để sản xuất hợp chất thứ cấp
Những năm gần đây, những nghiên cứu về tác dụng của các HCTC tách
chiết từ thực vật được tiến hành rộng rãi và đạt nhiều thành quả cao. Con
người đang dần thay thế nguồn nguyên liệu dược phẩm là các chất hóa học
nhân tạo bằng những HCTC. Tuy nhiên, nguồn cung cấp HCTC tách chiết
trong quá trình sinh trưởng của thực vật lại cho năng suất không cao và tốn
kém nhiều thời gian. Ngoài ra, các nhóm sinh vật khác như vi sinh vật, động
vật lại không thể tạo nên các HCTC này. Vì vậy, cần tìm ra giải pháp khắc
phục các tình trạng trên, kỹ thuật nuôi cấy tế bào thực vật để sản xuất hợp chất
thứ cấp là tiêu biểu cho việc cải thiện chất và lượng của HCTC ứng dụng
trong y dược, gia vị, hương liệu.
Ưu thế về mặt nguyên lý của kỹ thuật nuôi cấy tế bào thực vật là có thể
cung cấp liên tục nguồn nguyên liệu để tách chiết một tỷ lệ lớn lượng hoạt
chất từ tế bào thực vật nuôi cấy [10]. Bằng nhiều nghiên cứu, người ta đã kết
luận được rằng, nồng độ sản xuất hợp chất thứ cấp tăng lên trong suốt quá
trình phân hóa tế bào, vì thế chúng được tìm thấy trong các mô có khả năng
phân hóa cao như rễ, lá và hoa. Do sự phân hóa hình thái và sự trưởng thành
không xuất hiện trong nuôi cấy tế bào nên các chất thứ cấp có khuynh hướng
ngưng tạo thành trong quá trình nuôi cấy. Vì vậy, giài pháp trong nuôi cấy
huyền phù tế bào là tăng sự tiếp xúc của khối tế bào ở giữa với môi trường
bên ngoài, dẫn đến sự phân hóa sẽ xuất hiện tới một mức độ nào đó trong khối
để tạo thành các chất thứ cấp [10]. Bên cạnh nuôi cấy tế bào huyền phù, nuôi
cấy callus có ưu điểm là thao tác thí nghiệm đơn giản, dễ vận chuyển mẫu
nhưng nhược điểm là thể tích nuôi cấy bé nên khó phát triển ở quy mô công
nghiệp, mẫu nuôi cấy chỉ tiếp xúc được một mặt với nguồn dinh dưỡng,
những sản phẩm do mẫu nuôi cấy tạo ra trong quá trình trao đổi chất sẽ tích tụ
xung quanh dẫn đến làm chậm sự sinh trưởng của tế bào. Vì thế, nuôi cấy tế
bào huyền phù thích hợp hơn cho việc sản xuất sinh khối tế bào thực vật vì có
thể duy trì và thao tác tương tự với các hệ thống lên men vi sinh vật ngập
chìm trong môi trường lỏng.
14
1.2.2.1. Sự tích lũy hợp chất thứ cấp trong tế bào nuôi cấy
Nuôi cấy tế bào thực vật được nghiên cứu từ năm 1960, có rất nhiều
thuận lợi, và được xem như là một phương pháp để sản xuất các hợp chất thứ
cấp ở thực vật hiệu quả nhất. Một số chất khó tổng hợp bằng phương pháp hóa
học, hoặc khó thu được lượng sản phẩm lớn bằng vi sinh vật thì có thể sử
dụng bằng phương pháp nuôi cấy tế bào thực vật như caffein, morphine… Sở
dĩ, phương pháp này được đánh giá cao vì nó không bị giới hạn bởi yếu tố
ngoại cảnh như môi trường, sự thay đổi thời tiết… so với khi trồng một cá thể
thực vật ở ngoài điều kiện thường [10]. Ta có thể so sánh dễ dàng từ bảng 1.2.
Cải thiện hiệu suất, chất lượng các sản phẩm có hoạt tính sinh học là một
trong những hướng đang được ứng dụng của kỹ thuật nuôi cấy tế bào thực vật.
Ưu điểm của chúng bao gồm:
- Con người điều khiển các yếu tố của môi trường nuôi cấy một cách chủ
động trong quá trình tổng hợp các hợp chất thứ cấp. Điều này có ý nghĩa rất
quan trọng tạo môi trường tối ưu nhất, đánh giá quá trình ảnh hưởng của các
yếu tố môi trường một cách cụ thể.
- Loại đi hay hạn chế ảnh hưởng sinh học (vi sinh vật và côn trùng) đến
các sản phẩm là hợp chất thứ cấp trong tự nhiên.
- Tùy thuộc vào tính chất sản phẩm và nồng độ sản xuất HCTC mà con
người chủ động tìm kiếm các loài thực vật phù hợp nhất.
- Chủ động tăng nồng độ các chất đang được sản xuất tùy theo mục đích
sử dụng.
- Thời gian, năng xuất và chất lượng sản phẩm cao và để dàng đưa vào
quy mô sản xuất công nghiệp.
Trong tất cả các ngành công nghiệp, mục tiêu quan trọng nhất là giảm
giá thành sản phẩm nhưng chất lượng vẫn không thay đổi hoặc tăng lên. Tất
nhiên, ngành công nghiệp sản xuất nguyên liệu dược phẩm, mỹ phẩm cũng
không ngoại lệ. Sự phát triển công nghệ nuôi cấy tế bào mà ở đó chúng sản
xuất các sản phẩm thứ cấp với giá thành rẻ hơn với chất lượng cao đã đem lại
15
nhiều thành quả đáng tự hào. Một số HCTC đang được sản xuất theo phương
pháp này như taxol từ cây thông đỏ, curcumin ở cây nghệ đen, bilobalit từ
cây bạch quả. Người ta mong đợi nhiều hợp chất có giá trị sử dụng với giá
thành thấp và các sản phẩm nuôi cấy in vitro được thương mại hóa trong thời
gian tới [12].
Bảng 1.1. Sản phẩm thứ cấp từ nuôi cấy tế bào thực vật so với cây tự nhiên
Sản phẩm
Anthocyanin
Anthraquinone
Berberine
Loài thực vật
Vitis sp.
Euphorbia milli
Perilla frutescens
Morinda
citrifolia
Coptis japonica
Thalictrum minor
Sản lượng
(% khối lượng khô)
Cây tự
Tế bào
nhiên
16
10
4
0,3
24
1,5
Tỷ lệ sản
lượng
1,6
13,3
16
18
2,2
8
13
10
4
0,01
3,3
1000
Rosmarinic acid
Coleus blumei
27,0
3,0
9
Shikonin
Lithospermum
erythrorhizon
14
1,5
9,5
1.1.2.2. Các yếu tố ảnh hưởng đến sự tích lũy hợp chất thứ cấp của tế bào
nuôi cấy
Nguyên tắc sản xuất một hợp chất hóa học nào từ bất kì quá trình sinh
học nào đều cần phải hiểu rõ các con đường sinh tổng hợp và các yếu tố ảnh
hưởng đến nó. Từ đó, con người đã nghiên cứu và tìm ra các hướng cải thiện
năng suất sản xuất của các HCTC từ nuôi cấy tế bào [8]. HCTC chỉ được tích
lũy với nồng độ cao và khi thỏa mãn những điều kiện nuôi cấy như sau:
- Chọn lựa đúng và đủ thành phần môi trường và điều kiện nuôi cấy
thích hợp.
- Các dòng tế bào nuôi cấy phải có năng suất cao.
- Luôn bổ sung tiền chất nuôi cấy và các chất kích kháng thực vật.
a. Tối ưu hóa điều kiện nuôi cấy
16
Một vài sản phẩm tích lũy trong tế bào ở mức cao hơn so với ở trong cây
trồng tự nhiên khi được nuôi cấy ở điều kiện tối ưu (ví dụ ginsenoside từ cây
nhân sâm P. ginseng, bilobalit từ cây bạch quả…). Thông số của các nhân tố
hóa họ và vật lý như thành phần môi trường, chất kích thích sinh trưởng, pH,
nhiệt độ nuôi cấy, sự thông khí, sự lắc hoặc khuấy, và ánh sáng ảnh hưởng
đến hàm lượng các hợp chất thứ cấp đã được nghiên cứu nhiều [15]. Chẳng
hạn khi nuôi cấy callus rau má, độ pH của môi trường ban đầu là 5.8; cây
nghệ đen là 5.9 [9]. Tốc độ lắc của nuôi cấy huyền phù tế bào rau má là 120
vòng/ phút nhưng với nghệ đen là 150 vòng/ phút [13].
b. Chọn lọc các dòng tế bào cho năng suất cao
Kỹ thuật chọn dòng tế bào đã ra đời rất sớm trong nghiên cứu vi sinh vật.
Nhưng ở thực vật bậc cao, kỹ thuật này mới được ứng dụng cách đây khoảng
hơn 20 năm. Người ta có thể tiến hành xử lý và chọn lọc tế bào thực vật ở ba
mức độ chính
- Mô sẹo (callus).
- Tế bào đơn (single cell).
- Tế bào trần (protoplast).
Mục đích chọn lọc in vitro có thể khái quát ở những điểm sau:
- Chọn dòng tế bào chống chịu các điều kiện bất lợi của ngoại cảnh, ví
dụ chống chịu nóng, lạnh, phèn, mặn, khô hạn...
- Chọn dòng tế bào kháng các độc tố ví dụ kháng độc tố do nấm bệnh
tiết ra, các loại kháng sinh.
- Chọn dòng tế bào sản xuất dư thừa (over production) các loại sản
phẩm chủyếu là amino acid.
- Chọn các đặc điểm chỉ thị để nghiên cứu di truyền (genetic markers)... [8].
Năm 1985, Berlin và Sasse đã công bố thành quả việc chọn lọc tế bào
dựa vào khả năng tổng hợp một vài chất có giá trị cao trong nuôi cấy tế bào
thực vật. Cụ thể, một dòng tế bào của cây bát tiên (Euphorbia milli) sau 24 lần
17
chọn lọc đã tích lũy gấp khoảng 7 lần lượng anthocyanin được tích luỹ từ nuôi
cấy tế bào bố mẹ [8].
18
c. Sử dụng kích kháng bảo vệ thực vật
Sử dụng chất kích kháng bảo vệ thực vật có hiệu quả trong việc tăng
cường sự tổng hợp các hợp chất trao đổi trong một số trường hợp, như trong
sản xuất paclitaxel bằng nuôi cấy tế bào Taxus và sản xuất tropane alkaloid
bằng nuôi cấy tế bào Datura stramonium. Sử dụng các chất kích kháng kết
hợp với loại bỏ các sản phẩm cuối và sự tích lũy trong pha tách chiết, đã được
chứng minh là một hướng rất thành công để gia tăng hiệu suất chuyển hóa.
Ví dụ môi trường lỏng có sử dụng chất điều hòa sinh trưởng 2,4-D với
nồng độ 0,01 mg/L hoặc trong số các cytokinin thử nghiệm (TDZ, BAP,
zeatin, và kinetin), TDZ là chất bổ sung tốt nhất cho việc thúc đẩy nhanh quá
trình tổng hợp asiaticoside [8].
Yu và cs (2005) đã nghiên cứu sự tích luỹ jaceosidin và siringin trong
nuôi cấy tế bào của Saussurea medusa bằng chất kích kháng thực vật là SA,
kết quả thu được jaceosidin (95 mg/L) cao gấp 2,5 lần và siringin (631 mg/L)
cao gấp 2,7 lần so với mẫu không bổ sung SA [26] và còn rất nhiều những
nghiên cứu khác.
1.2.2.3. Một số công trình nghiên cứu sản xuất hợp chất thứ cấp bằng nuôi
cấy tế bào
Sản xuất hợp chất bằng nuôi cấy tế bào là một hướng nghiên cứu đầy
triển vọng trong việc cung cấp các hợp chất thứ cấp trong công nghiệp sản
xuất dược phẩm, mỹ phẩm và thực phẩm. Trên thế giới đã có nhiều công trình
nghiên cứu sản xuất hợp chất thứ cấp bằng nuôi cấy tế bào.
Điển hình như việc sản xuất taxol bằng nuôi cấy tế bào các loài Taxus đã
trở thành một trong những ứng dụng rộng rãi của nuôi cấy tế bào thực vật và
đang tạo ra các giá trị thương mại to lớn. Sở dĩ, taxol có thể được sử dụng
điều trị các trường hợp ung thư buồng trứng và ung thư vú. Ngoài ra, taxol
cũng có tác dụng đối với các bệnh nhân có khối u ác tính, ung thư phổi và các
dạng u bướu khác và nó được xem như là chất đầu tiên của một nhóm mới
trong hóa trị liệu ung thư [9].
19
FettNeto và cs (1994) đã nghiên cứu ảnh hưởng của các chất dinh dưỡng
và một số yếu tố khác lên sự tích lũy taxol trong nuôi cấy tế bào Taxus
cuspidata. Srinivasan và cs (1995) nghiên cứu quá trình sản xuất taxol bằng
nuôi cấy tế bào của T. baccata. Lee và cs (1995) đã nghiên cứu sản xuất taxol
bằng nuôi cấy tế bào huyền phù của cây T. mairei, một loài được tìm thấy tại
Đài Loan ở độ cao 2000 m so với mực nước biển. Các dòng tế bào thu được từ
callus có nguồn gốc thân và lá, và một trong những dòng này sau khi được bổ
sung các tiền chất vào môi trường nuôi cấy, thì sau 6 tuần cứ một lít dịch
huyền phù tế bào sẽ có khoảng 200 mg taxol [7].
Imperatorin được xem là thành phần hoạt động chính trong điều trị các
bệnh về da. Nếu sản xuất cây Angelica dahurica var. formosana bằng phương
pháp nhân giống truyền thống sẽ mất một thời gian dài mới có thể đáp ứng
được nhu cầu. Vì vậy, phương pháp nuôi cấy tế bào huyền phù sản xuất
imperatorin đã được chọn lựa sử dụng. Nghiên cứu đã cho thấy, sử dụng
Benzylamino purine ở nồng độ từ 0,5-1,0 mg/L đã kích thích tổng hợp
imperatorin, một tỷ lệ thích hợp ammonium nitrate và nitrate (2:1) cũng như
tăng nồng độ phosphate từ 1-2 mM sẽ làm tăng lượng impertatorin. Bổ sung
vanadyl sulphate ở nồng độ 30 mg/L vào môi trường đã cho hiệu quả tốt nhất
sau 10 ngày nuôi cấy. Hoặc bổ sung 20 g/L chất hấp phụ amberlite XAD-7
vào môi trường, quá trình tổng hợp imperatorin cũng tăng mạnh ở ngày nuôi
cấy thứ 10. Hàm lượng imperatorin sản xuất bởi phương thức này đạt 46,0
mg/L, cao hơn đối chứng 140 lần [10].
Berberine chloride luôn được biết đến với công dụng chữa bệnh rối loạn
tiêu hóa. Nó là một isoquinoline alkaloid có trong hệ rễ của cây Coptis
japonica và vỏ của cây Phellondendron amurense.. Để thu được nguyên liệu
thô từ rễ cây C. japonica phải mất 5-6 năm. Yamada và Sato (1981) đã
nghiên cứu thành công quy trình tách chiết berberine bằng nuôi cấy huyền phù
tế bào C. japonica. Sau đó, công ty hóa dầu Mitsui (Nhật Bản) đã cải thiện
được năng suất bằng cách thêm 10 -8mM gibberellic acid vào môi trường nuôi
cấy, hiệu suất cao hơn tới 1,66 g/L [7].
20
Bảng 1.2. Các hợp chất thứ cấp đã được sản xuất từ nuôi cấy mô và tế bào thực vật
(Mulbagal and Tsay 2004)
Hợp chất thứ cấp
Tên loài
Tác giả
Alkaloids
Canthinonealkaloids
Rosmarinic acid
Capsaicin
Capsicum annuum L.
al. 1990
Anthraquinones
Catharanthine
Catharanthus roseus
Zhao et al. 2001
Taxol
1.3. Ứng dụng chất kích kháng để cải thiện hiệu suất của hợp chất thứ cấp
1.3.1. Chất kích kháng
Thực vật sản xuất các hợp chất thứ cấp trong tự nhiên như một bộ máy bảo
vệ chống lại các yếu tố gây bệnh. Chất kích kháng bảo vệ thực vật (elicitor) báo
hiệu việc hình thành các hợp chất thứ cấp. Sử dụng các chất kích kháng của bộ
máy bảo vệ cây, tức là sự kích kháng bảo vệ thực vật, là phương thức để thu
được các sản phẩm hợp chất thứ cấp có hoạt tính sinh học một cách hiệu quả
nhất. Dựa vào nguồn gốc, chất kích kháng thực vật gồm hai loại là chất kích
kháng sinh học (biotic) và chất kích kháng phi sinh học (abiotic) [9].
Chất kích kháng sinh học bao gồm những chất kích kháng có nguồn gốc
từ cơ thể sinh vật, được phân thành hai loại,chất kích kháng có nguồn gốc nội
sinh và chất kích kháng có nguồn gốc ngoại sinh. Những chất kích kháng có
trong tế bào thực vật là các polysaccharides như pectin, pectic acid, cellulose.
Các chất kích kháng có nguồn gốc từ thành tế bào vi sinh vật như chitin,
chitosan và glucans.
Chất kích kháng phi sinh học bao gồm các hợp chất được tổng hợp bằng
phương pháp hóa học như MeJA, jasmonic acid, salicylic acid (SA),
arachidonic acid, Al3+, Cu2+, Mn2+… và một số tác nhân vật lý như sóng
siêu âm [9].
21
Trên thế giới đã có rất nhiều công trình nghiên cứu sử dụng các chất kích
kháng trong nuôi cấy tế bào thực vật (Bảng 1.3), đã cho thấy vai trò quan
trọng của chất kích kháng đối với mục đích tăng khả năng tích lũy hợp chất
thứ cấp trong nuôi cấy tế bào [9], [15].
Thời gian bổ sung chất kích kháng vào môi trường nuôi cấy ảnh hưởng
đến khả năng tích lũy hợp chất thứ cấp trong nuôi cấy tế bào. Tuy nhiên, để
đạt được mục đích nuôi cấy, việc lựa chọn thời điểm bổ sung chất kích kháng
đòi hỏi phải có sự hiểu biết về con đường sinh tổng hợp các hợp chất thứ cấp
mong muốn. Chong và cs (2005) cho rằng, mẫu tế bào Morinda elliptica nuôi
cấy có bổ sung 50µM jasmonic acid tại thời điểm giữa pha log của chu kỳ
sinh trưởng tế bào, thu mẫu sau 3 ngày, hàm lượng anthraquinone thu được
39,6 mg/g khối lượng khô gấp 2,1 lần so với mẫu đối chứng và hai mẫu được
bổ sung cùng nồng độ jasmonic acid ở đầu pha log và pha ổn định. Mẫu tế bào
có bổ sung 100µM jasmonic acid ở đầu và giữa pha log, sau 5 ngày thu mẫu,
hàm lượng anthraquinone đạt 26,6 và 21,9 mg/g khối lượng khô cao gấp 2,9
và 1,4 lần so với mẫu không bổ sung jasmonic acid [16].
1.3.2. Vai trò chất kích kháng trong nuôi cấy tế bào thực vật
Sử dụng chất kích kháng trong nuôi cấy tế bào thực vật để cải thiện hiệu
suất tích lũy các hợp chất thứ cấp là một hướng đi phù hợp trong việc sản xuất
các tiền chất cho y học, thực phẩm và mỹ phẩm. Hầu hết những nghiên cứu
cho thấy khi bổ sung chất kích kháng vào môi trường nuôi cấy tế bào thực vật
đều làm tăng hàm lượng hợp chất thứ cấp tích lũy được.
Janusz Malarz và cs (2007) đã nghiên cứu ảnh hưởng của MeJA và SA
vào sự tích lũy sesquiterpene lactone trong lông hút ở rễ cây rau diếp xoăn
Cichorium intybus. Kết luận bổ sung 100 µM MeJA sau 72 giờ làm tăng gấp
đôi lượng sesquiterpene lactone tích lũy trong tế bào lông hút ở rễ cây rau
diếp xoắn so với thí nghiệm đối chứng [23].
Seung- Mi- Kang và cs (2008) đã nghiên cứu sự ảnh hưởng của MeJA và
(SA) đến quá trình sản xuất hoạt chất Bilobalit và Ginkgolides trong tế bào
22
cây Ginkgo biloba. Kết quả bổ sung 0.01mM MeJA , mức độ sản xuất
ginkgolides tăng 4.3- và 8,2 lần, bổ sung 0.01 mM SA, mức độ sản xuất
ginkgolides trong tế bào tăng lên 5,4 lần so với thí nghiệm đối chứng [25].
Nguyễn Hoàng Lộc và cs (2012) đã nghiên cứu ảnh hưởng của một số
chất kích kháng thực vật lên khả năng tích lũy asiaticoside của tế bào rau má
nuôi cấy in vitro, kết luân nồng độ và thời điểm bổ sung tối ưu nhất của YE và
SA để tăng quá trình sản xuất CAS lần lượt là 4 g/L, 100 µM sau 10 ngày
nuôi cấy huyền phù tế bào rau má [4].
Bảng 1.3. Vai trò của các chất kích kháng lên việc sản xuất hợp chất thứ cấp
tương ứng ở thực vật (Mulbagal and Tsay 2004)
Loài thực vật
Chất kích kháng
Hợp chất thứ cấp
Arabidopsis
Bidens pilosa
Brugmansia
candida
Capsicum annuum
Datura stramonium
Glycine max
Medicago sativa
Papaver
somniferum
1.4. Khái quát về cây rau má
1.4.1. Phân loại rau má (Centella asiatica L.)
Rau má, hay còn gọi là tích tuyết thảo hoặc lôi công thảo, là loài cây một
năm thân thảo trong họ Hoa tán (Apiaceae) [3].
1.4.2. Phân bố và đặc điểm hình thái
1.4.2.1. Phân bố
Rau má có nguồn gốc từ Australia, Ấn Độ và các đảo Thái Bình
Dương… Rau má là loài thực vật thân thảo phổ biến được sử dụng trong y tế,
thức ăn và trong công nghiệp mỹ phẩm. Ở Việt Nam, rau má mọc hoang khắp
23
nơi, thường gặp ở các bãi cỏ, bờ ruộng, ven suối, sườn đồi, quanh các làng
bản, những vùng ẩm ướt [8].
1.4.2.2. Đặc điểm hình thái
Thân cây rau má gầy và nhẵn, là loại thân bò lan, màu xanh lục hay llục
ánh đỏ, có rễ ở các mấu. Nó có các lá hình thận, màu xanh với cuống dài và
phần đỉnh lá tròn, kết cấu trơn nhẵn với các gân lá dạng lưới hình chân vịt.
Các lá mọc ra từ cuống dài khoảng 5–20 cm. Bộ rễ bao gồm các thân rễ, mọc
thẳng đứng. Chúng có màu trắng kem và được che phủ bằng các lông tơ ở rễ.
Hoa rau má có màu trắng hoặc phớt đỏ , mọc thành các tán nhỏ, tròn gần
mặt đất. Mỗi hoa được bao phủ một phần trong 2 lá bắc màu xanh. Các hoa
lưỡng tính này khá nhỏ (nhỏ hơn 3 mm), với 5-6 thùy tràng hoa. Hoa có 5 nhị
và 2 vòi nhụy. Quả có hình mắt lưới dày dặc, đây là điểm phân biệt nó với các
loài trong chi Hydrocotyle có quả với bề mặt trơn, sọc hay giống như mụn
cơm. Quả của nó chín sau 3 tháng và toàn bộ cây, bao gồm cả rễ, được thu hái
thủ công.
1.4.3. Thành phần hóa học
Các phân tích cho thấy thành phần hóa học của rau má gồm: nước
88,2%, protein 3,2%, carbohydrate 1,8%, cellulose 4,5%; theo mg%: calcium
2,29%, phosphorus 2%, iron 3,1%, β-caroten 1,3%, vitamin B1 0,15% và
vitamin C 37% [8], [19].
Trong cây rau má chứa tinh dầu, dầu béo. Chất béo chủ yếu là glyceride
của các acid: oleic, linolic, linolenic, lignoceric, palmitic và stearic. Trong rau
má còn chứa một lượng alkaloid hydrocotylin, chất đắng vellarin và đặc biệt
là glucoside asiaticoside. Lượng asiaticoside này khi thủy phân cho asiatic
acid và glucose, rhamnose.
Ngoài ra, còn có vitamin B và C. Thành phần asiaticoside trong mô rau
má chiếm các tỷ lệ như sau: trong lá chiếm 82,6%, trong cuống chiếm 15,9%,
trong rễ chiếm 1,5%.
24
1.4.4. Tác dụng dược lý và công dụng của rau má
Đối với các bệnh về tim mạch ở người, rau má có thể giúp giảm sưng và
cải thiện lưu thông trong cơ thể, nhất là với các bệnh liên quan đến tĩnh mạch
như giãn tĩnh mạch và suy tĩnh mạch. [3], [4].
Với các vết thương, rau má có chứa hóa chất được gọi là triterpenoidscó
công dụng tăng tốc độ chữa lành vết thương, tăng cường chất chống oxy hóa
tại vị trí vết thương, tăng cường da và tăng cung cấp máu cho khu vực bị
thương, điều này đã được thử nghiệm trên chuột. [3], [4].
Triterpenoids trong rau má cũng có thể làm giảm sự lo lắng và tăng
cường chức năng tâm thần trong một số cá nhân. Theo một nghiên cứu, xuất
bản trong tạp chí Journal of Clinical Psychopharmacology năm 2000, những
người tiêu thụ rau má có thể giảm sự giật mình đi rất nhiều. [3], [4].
Ngoài ra, rau má còn có rất nhiều công dụng khác. Từ xa xưa, các thầy
lang đã biết dùng rau má để điều trị cho các bệnh như bệnh vẩy nến, eczema,
nhiễm trùng hô hấp, viêm loét, cảm lạnh, viêm gan, động kinh, mệt mỏi, sốt,
hen suyễn và bệnh giang mai...
Trong y học Trung Quốc, rau má cũng được biết đến là loại thảo dược
"nguồn mạch sự sống" bởi vì nó giúp làm tăng tuổi thọ. Mặc dù nghiên cứu
khoa học vẫn chưa chứng minh hiệu quả của của loại thảo dược này đối với
các rối loạn trong cơ thể, nhưng người ta cũng không phủ nhận tác dụng của
rau má trong việc điều trị chứng mất ngủ, xơ cứng bì, ung thư, rối loạn tuần
hoàn, tăng huyết áp, mất trí nhớ, liền sẹo và giảm nốt cục trên da cellulite. [3],
[4]. Một số bài thuốc từ rau má điều trị các bệnh như: chữa mụn nhọt, chữa
vàng da, kiết lỵ, chảy máu cam.
1.5. Khái quát asiaticoside
1.5.1 Khái niệm
Một trong số hoạt chất chiết xuất từ rau má là asiaticoside, công thức
phân tử là C48 H78O19. Tên gọi hóa học đầy đủ là:
[6-[[3,4-Dihydroxy-6-(hydroxymethyl)-5-(3,4,5-trihydroxy-6-methyloxan2-yl) oxyoxan-2-yl]oxymethyl]-3, 4, 5-trihydroxy-oxan-2-yl](1S, 2R, 4aS,
6aS, 6bR, 9S, 10R, 11R, 12aS, 14bR)-10, 11-dihydroxy-9-(hydroxymethyl) 1, 2,
25
6a, 6b, 9, 12 ahexa-methyl 2,3,4,5,6,6a,7,8,8a,10,11,12,13,14b-tetradecahydro1H-picene4a-carbo-xylate [19].
1.5.2. Tính chất lý hóa của asiaticoside
Asiaticoside tan tốt trong cồn, sản phẩm tinh thể hình kim màu trắng,
nhiệt độ nóng chảy là 230 đến 2330C [19].
1.5.3. Tác dụng dược lý của asiaticoside
Từ những năm 1940, y học hiện đại bắt đầu nghiên cứu những tác dụng
của rau má. Những hợp chất chính có giá trị ở rau má là asiaticoside,
madecassoside và asiatic acid đã được phát hiện, nghiên cứu và ứng dụng.
Trong đó, asiaticoside là một triterpene glycoside và phân loại như một kháng
sinh. Asiaticoside là 1-O-acyl-D-glucose pyranose được tìm thấy trong tự
nhiên, nó là trisacharide ester của acid asiatic. Người ta cho rằng, trong cơ thể
asiaticoside thủy phân thành đường và asiatic acid- sản phẩm trao ñổi chất
chịu trách nhiệm trong việc chữa bệnh. Asiaticoside có khả năng kháng
khuẩn và hoạt tính diệt nấm chống lại được mầm bệnh và nấm.
Asiaticoside giúp chữa lành vết thương nhanh chóng nhờ vào cơ chế kích
thích tạo collagen và sự tổng hợp glycosaminoglycan.
Hoạt chất asiaticoside cũng đã được ứng dụng trong điều trị bệnh phong
và bệnh lao. Người ta cho rằng trong những bệnh này, vi khuẩn được bao phủ
bởi một màng ngoài giống như sáp khiến cho hệ kháng nhiễm của cơ thể
không thể tiếp cận. Chất asiaticoside trong dịch chiết rau má có thể làm tan
lớp màng bao này để hệ thống miễn dịch của cơ thể tiêu diệt chúng.
Maquart và cs (1990) đã công bố công trình nghiên cứu về khả năng làm
lành vết thương bị lở loét của asiaticoside. Dược tính đáng kể của hoạt chất này
là giảm bớt kích thước của vùng vết thương trên da ở lưng chuột sau 9 ngày thử
nghiệm. Theo nghiên cứu của Inhee và cộng sự (1999) cho thấy, các dẫn xuất
của chất asiaticoside có khả năng bảo vệ thần kinh, chống lại độc tố βamyloid
gây hại ñối với nơtron thần kinh…Asiaticoside giúp tế bào da chống oxy hóa,
phát triển mô liên kết, nên làm mạnh tế bào da, mô da căng trẻ, và giúp cho vết
mổ, vết loét mau lành. Asiaticoside có trong dịch chiết đã làm giảm bớt bàn
