Phân lập, tuyển chọn và nghiên cứu hoạt lực của một số chủng vi khuẩn có khả năng phân giải celulose

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT
Chữ viết tắt

Chữ viết đầy đủ

CFU

:

Colonie foriming unit

CMC

:

Carboxyl metyl cellulose

DNS

:

Acid Dinitro-salicylic

CT

:

Công thức

ĐC

:

Đối chứng

VSV

:

Vi sinh vật


MỤC LỤC


PHẦN 1
MỞ ĐẦU
1.1. Đặt vấn đề
Trong quá trình hình thành phát triển và biến đổi của đất, vi sinh vật có vai
trò hết sức quan trọng. Chúng tham gia vào việc tổng hợp mùn, cải thiện kết cấu
của đất, phân giải và chuyển hóa các hợp chất hữu cơ, vô cơ khó tan trong đất,
cải thiện chế độ nước, không khí để cung cấp dinh dưỡng cho cây trồng. Trong
các nhóm sinh vật đất như vi sinh, nguyên sinh động vật, giun đất, ấu trùng…
thì vai trò của vi sinh vật là là rất quan trọng, trong đó có sự đóng góp lớn của
nhóm vi khuẩn.
Vi khuẩn có vai trò rất lớn trong quá trình hình thành đất và tạo độ phì
nhiêu cho đất. Nó đảm nhiệm nhiều chức năng khác nhau trong việc làm màu
mỡ thêm cho đất, tham gia tích cực trong quá trình chuyển hóa và phân giải các
hợp chất hữu cơ phức tạp như cellulose, mùn, kitine, lignin…[1]
Ở nước ta, các phế liệu chứa cellulose rất phong phú bao gồm rơm rạ, trấu,
vỏ lạc, vỏ trái cây, bã mía, lõi ngô, gỗ…phần lớn nó bị đốt đi một cách phí

phạm, một phần nhỏ được bổ sung vào thức ăn chăn nuôi với hiệu quả thấp. Do
vậy, vấn nạn ô nhiễm môi trường nông thôn đang là mối quan tâm lớn của toàn
nhân loại. Rác thải làm ảnh hưởng nghiêm trọng đến sức khỏe con người, môi
trường sinh thái. Vấn đề đặt ra phải ứng dụng kịp thời các tiến bộ khoa học kỹ
thuật nhằm giảm thiểu sự ô nhiễm môi trườngdựa vào quá trình phân hủy rác
thải thành chất hữu cơ phục vụ nông nghiệp. Song hợp chất cellulose chỉ có thể
bị thủy phân bằng acid hoặc enzyme cellulase ngoại bào của một số nhóm vi
sinh vật. Trong đó, vi khuẩn có thể phân giải các chất hữu cơ phức tạp thành các
chất hữu cơ đơn giản, đồng thời vi khuẩn có khả năng phát triển nhanh và có thể
tiết ra một lượng enzyme lớn với đầy đủ thành phần, có hoạt tính mạnh.[5]
Thừa Thiên Huếcũng đang chịu ảnh hưởng xấu của môi trường, nguyên
nhân do rác thải từ nhiều nguồn khác nhau. Trung bình mỗi ngày, toàn tỉnh có
khoảng 200 tấn rác thải sinh hoạt thải ra môi trường. Trong đó, khoảng 50% rác
ở các khu vực trung tâm được thu gom, chủ yếu được xử lý sơ bộ ban đầu như
đốt, chôn lấp, rắc vôi bột ở các bãi rác trung chuyển. Ở nông thôn, ít địa phương
tổ chức thu gom, xử lý rác thải, chủ yếu người dân tự xử lý theo hình thức chôn
lấp, đốt, thậm chí tùy tiện vứt ra môi trường xung quanh. Hiện, toàn tỉnh mới có
1


89/152 (58,5%) các phường, xã, thị trấn đã tổ chức thu gom rác đối với hộ dân
cư. Riêng khu vực nông thôn tỷ lệ này mới đạt 40%. Về nông thôn, chúng ta có
thể dễ dàng bắt gặp những “dòng sông chết” đầy ứ rác thải, xác xúc vật; các bãi
rác tự phát đầy ruồi nhặng khiến ai cũng phải bịt mũi đi cho nhanh; tại kênh
mương, bờ ruộng, các loại bao bì, chai lọ đựng thuốc bảo vệ thực vật bị vứt bỏ
tuỳ tiện, gây nguy hiểm cho chính người dân và ô nhiễm nguồn nước phục vụ
sản xuất. Ngoài ra đặc điểm địa lý Thừa Thiên Huế có nhiều sông ngòi, ao hồ
với hàm lượng bùn đất tích tụ hàng năm cao, số lượng lục bình lớn, hầu như che
kín đang ảnh hưởng đến cảnh quan thẩm mỹ và làm mất cân bằng hệ sinh thái
trong nước. Việc xử lý rác thải ở nông thôn trên địa bàn tỉnh Thừa Thiên - Huế

lâu nay thực hiện chủ yếu theo hình thức chôn lấp, đốt hủy chưa có hệ thống xử
lý nên rất ảnh hưởng đến mạch nước ngầm, ô nhiễm bầu không khí [16].
Do đó, việc phân lập và tuyển chọn những chủng vi khuẩn có khả năng
phân giải cellulose mạnh, thích nghi với điều kiện khí hậu bản địa ở Thừa Thiên
Huế nhằm bổ sung vào phế thải nông nghiệp sẽ góp phần rút ngắn thời gian
phân hủy và thúc đẩy quá trình thủy phân phế thải này đạt hiệu quả tốt hơn.
Xuất phát từ nhu cầu thực tiễn, chúng tôi đã thực hiện đề tài: “Phân lập, tuyển
chọn và nghiên cứu hoạt lực của một số chủng vi khuẩn có khả năng phân
giải celulose”
1.2.Ý nghĩa của đề tài
+ Việc tuyển chọn các chủng vi khuẩn có hoạt tính phân giải cellulose
mạnh thích nghi với điều kiện khí hậu thổ nhưỡng ở Thừa Thiên Huế góp phần
đa dạng hóa nguồn giống vi khuẩn cellulose.
+ Kết quả nghiên cứu này sẽ là cơ sở quan trọng cho những nghiên cứu
tiếp tục xây dựng quy trình tạo chế phẩm sinh học từ vi khuẩn cellulose để xử lý
phế thải nông nghiệp tạo nguồn phân hữu cơ sinh học quan trọng cho cây trồng.
+ Sử dụng vi khuẩn phân giải cellulose xử lý phế thải nông nghiệp góp
phần giảm thiểu vấn nạn ô nhiễm môi trường nông thôn hiện nay trên địa bàn
tỉnh Thừa Thiên Huế.
1.3. Mục đích và yêu cầu của đề tài
*Mục đích
Phân lập, tuyển chọn một số chủng vi khuẩn phân giải cellulose mạnh và
nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình nuôi cấy chúng nhằm ứng dụng
chúng vào việc phân hủy các hợp chất hữu cơ trong nông nghiệp, đông thời
2


chống lại sự ô nhiễm môi trường góp phần tạo ra nguồn phân bón hữu cơ phục
vụ trong nông nghiệp.
*Yêu cầu

+ Phân lập và tuyển chọn ra các chủng vi khuẩn có khả năng phân giải
cellulose từ một số mẫu đất trồng, rác thải, mùn cưa.
+ Tìm hiểu những đặc tính, điều kiện sinh trưởng thích hợp cho chủng vi
khuẩn có khả năng phân giải cellulose mạnh.
+ Đánh giá khả năng phân giải cellulose của những chủng vi khuẩn có
hoạt lực enzyme mạnh nhằm đưa vào ứng dụng thực tế.
+ Nắm được phương pháp nghiên cứu, theo dõi và phân tích số liệu.

3


PHẦN 2
TỔNG QUAN CÁC VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU
2.1. Cellulose và enzyme cellulase
2.2.1. Giới thiệu về cellulose
Cellulose là thành phần cơ bản của thực vật. Ngoài ra người ta còn thấy
chúng có nhiều ở tế bào một số loài vi sinh vật. Ở tế bào thực vật và một số tế
bào vi sinh vật chúng tồn tại ở dạng sợi.[24]

Hình 2.1. Cấu trúc không gian của cellulose
Cellulose không có trong tế bào động vật. Chúng là một homopolimer
mạch thẳng được cấu tạo bởi các β-D-glucose-pyranose. Các thành phần này
liên kết với nhau bởi liên kết glucose, liên kết các glucose này với nhau bằng
liên kết α-1,4glucoside. Các gốc glucose trong cellulose thường lệch nhau một
góc 1800 và có dạng như chiếc ghế bành. Cellulose thường chứa 10.000 - 14.000
gốc đường và được cấu tạo như hình.[24]

Hình 2.2. Cấu trúc phân tử của cellulose
4

Cellulose là chất hữu cơ khó phân hủy. Người và hầu hết các loài động vật
không có khả năng phân hủy cellulose. Do đó, khi thực vật chết hoặc con người
thải các chất hữu cơ có nguồn gốc thực vật đã để lại trong môi trường lượng lớn
rác thải hữu cơ. Tuy nhiên, nhiều chủng vi sinh vật bao gồm nấm, xạ khuẩn, vi
khuẩn có khả năng phân giải cellulose thành các sản phẩm dễ phân hủy nhờ
enzyme cellulase (Trần Đình Khả và cộng sự, 2007).
2.2.2. Enzyme cellulase
Cellulase là phức hệ enzyme thủy phân cellulose tạo thành các phân tử
đường β-glucose. Theo kết quả nghiên cứu của một số tác giả, cellulose bị phân
hủy dưới tác dụng hiệp đồng của cellulase gồm 3 enzyme Exo-β-(1,4)glucananse hay enzyme C1, Endo-β-glucananse hay endocellulase còn gọi là
enzyme CMC-ase hay Cx và β-(1,4)-glucosidae hay cellobioase:
+ Exo-1,4-gluconase (hay cellobiohydrolase, C1 EC 2.3.1.91) giải phóng
cellobiose hoặc glucose từ đầu không khử của cellulose, tác dụng yếu lên CMC
nhưng tác dụng mạnh lên cellulose vô định hình hoặc cellulose đã bị phân giải
một phần. Tác dụng lên cellulose kết tinh không rõ nhưng khi có mặt
endoglucanase thì có tác dụng hiệp đồng rõ rệt.
+ Endo-1,4-glucanase (hay CMC-ase, Cx, EC 3.2.1.4) thủy phân liên kết
β-1,4-glucoside và tác động vào chuỗi cellulose một cách tùy tiện, sản phẩm của
quá trình thủy phân là cellobiose và glucose. Do thủy phân CMC hoặc cellulose
theo kiểu tùy tiện nên endo-1.4- glucanase làm giảm nhanh chiều dài chuỗi
cellulose và tăng chậm các nhóm khử, enzyme tác dụng mạnh lên cellodextrin.
Enzym này hoạt động mạnh ở vùng vô định hình nhưng lại hoạt động yếu ở
vùng kết tinh của cellulose.
+ Β-1,4- glucosidase (hay cellobiase, EC 3.2.1.21) thủy phân cellobiese và
các cellodextrin khác hòa tan trong nước sinh ra, chúng có hoạt tính cao trên
cellobiose, còn cellodextrin thì hoạt tính thấp và giảm khi chiều dài của chuỗi
tăng lên. Chức năng của β-glucosidase có lẽ là điều chỉnh sự tích lũy các chất
cảm ứng của cellulase.
2.2.3. Cơ chế tác dụng của enzyme cellulase

Cellulase là một hệ enzyme phức tạp xúc tác sự thủy phân cellulose thành
cellobiose và cuối cùng thành glucose.
Sự phân giải cellulose dưới tác dụng của hệ enzyme cellulase xảy ra theo 3
giai đoạn chủ yếu sau:
5


Trong giai đoạn thư nhất, dưới tác dụng của tác nhân C 1, cellulose bị thủy
phân thành cellulose hòa tan. Trong giai đoạn thứ 2, cellulose hòa tan sẽ bị thủy
phân dưới tác dụng của hệ enzyme Cx tạo thành đường cellobiose.
Ở giai đoạn cuối cùng, dưới tác dụng của enzyme β-1,4-glucosidase (hay
cellobiase, EC 3.2.1.21), bị thủy phân thành glucose.[24]

Hình 2.3. Sự phối hợp hoạt động của 3 loại enzyme cellulase
Nhiều loài vi khuẩn cũng có khả năng phân hủy cellulose, tuy nhiên cường độ
không mạnh bằng vi nấm. Nguyên nhân là do số lượng enzyme tiết ra môi trường
của vi khuẩn thường nhỏ hơn, thành phần các loại enzyme không đầy đủ. Thường
ở trong đất có ít loài vi khuẩn có khả năng tiết ra đầy đủ 4 loại enzyme trong hệ
cellulase. Nhóm này tiết ra một loại enzyme, nhóm khác tiết ra một loại khác,
chúng phối hợp với nhau để phân giải trong mối quan hệ hỗ sinh. Nhóm vi khuẩn
hiếu khí bao gồm Pseudomonas, Celloulomonas, Achromobacter. Nhóm vi khuẩn
kị khí bao gồm Clostridiumvà đặc biệt là nhóm vi khuẩn sống trong dạ cỏ của động
vật nhai lại. Chính nhờ nhóm vi khuẩn này mà trâu bò có thể sử dụng cellulose có
trong cỏ làm thức ăn. Đó là những cầu khuẩn thuộc chi Ruminococcus có khả năng
phân hủy cellulose thành đường và các acid hữu cơ[7].
Các loài vi sinh vật có khả năng sinh tổng hợp cellulase trong điều kiện tự
nhiên thường bị ảnh hưởng bởi tác động nhiều mặt của các yếu tố ngoại cảnh
nên có loài phát triển mạnh, có loài phát triển yếu. Chính vì thế, việc phân hủy
cellulose trong tự nhiên được tiến hành không đồng bộ, xảy ra rất chậm.

6


Chất hữu cơ là thành phần rất quan trọng trong quá trình hình thành và làm
thay đổi độ phì của đất. Sự chuyển hóa các chất hữu cơ trong đất chủ yếu đi theo
hai hướng là vô cơ hóa các chất hữu cơ và mùn hóa vật chất hữu cơ.
Cenlulose bị vi sinh vật (VSV) phân hủy thành các thành phần có phân tử
lượng nhỏ hơn. Chính những thành phần nhỏ này kết hợp với những thành phần
khác trong đất tạo ra mùn. Khi mùn được tạo thành, VSV lại tiếp tục phân hủy
mùn bằng quá trình amon hóa, sự chuyển háo này giúp đất tích lũy NH 3, quá
trình tạo thành NH3 trong đất xảy ra rất chậm chạm, điều này thì rất có lợi cho
cây trồng vì quá trình này giải phóng từ từ NH3 cho cây hấp thụ:
Chất mùn + O2 + VSV CO2 + H2O + NH3
2.2. Sơ lược về vi khuẩn
Vi khuẩn (tiếng anh và tiếng La Tinh là baterium, số nhiều là bacteria) đôi
khi còn được gọi là vi trùng, là một nhóm vi sinh vật nhân sơ đơn bào có kích
thước rất nhỏ; một số thuộc loại ký sinh trùng. Vi khuẩn là một nhóm sinh vật
đơn bào, có kích thước nhỏ (kích thước hiển vi) và thường có cấu trúc tế bào
đơn giản không có nhân, bộ khung tế bào (cytoskeleton) và các bào quan như ty
thể và lục lạp. Cấu trúc tế bào của vi khuẩn được miêu tả chi tiết trong mục sinh
vật nhân sơ vì vi khuẩn là sinh vật nhân sơ, khác với các sinh vật có cấu trúc tế
bào phức tạp hơn gọi là sinh vật nhân chuẩn[24].
Vi khuẩn là nhóm hiện diện đông đảo nhất trong sinh giới. Chúng hiện diện
khắp nơi trong đất, nước, chất thải phóng xạ, suối nước nóng, và ở dạng cộng
sinh và kí sinh với các sinh vật khác, và được biết là phát triển mạnh mẽ trong
các tàu không gian có người lái. Nhiều tác nhân gây bệnh (pathogen) là vi
khuẩn. Hầu hết vi khuẩn có kích thước nhỏ, thường chỉ khoảng 0.5-5.0 μm, mặc
dù có loài có đường kính đến 0,3mm (Thiomargarita). Chúng thường có vách tế
bào, như ở tế bào thực vật và nấm, nhưng với thành phần cấu tạo rất khác biệt
(peptidoglycan). Nhiều vi khuẩn di chuyển bằng tiên mao (flagellum) có cấu

trúc khác với tiên mao của các nhóm khác [24].
Có khoảng 40 triệu tế bào vi khuẩn trong một gram đất và hàng triệu tế bào
trong một mm nước ngọt. Ước tính có khoảng 5×10 30 vi khuẩn trên Trái Đất, tạo
thành một lượng sinh khối vượt hơn tất cả động vật và thực vật. Vi khuẩn có vai
trò quan trọng trong tái chế chất dinh dưỡng như cố định nitơ từ khí quyển và gây
thối rữa sinh vật khác. Trong vùng dinh dưỡng quanh cách mạch nhiệt dịch và lỗ
phun lạnh, vi khuẩn cung cấp những chất dinh dưỡng cần thiết cho sự sống bằng
cách biến đổi các hợp chất hòa tan như hydro sulphua và metan thành năng lượng,
7


chúng có thể phát triển mạnh ở nơi sâu nhất trên Trái Đất là rãnh Mariana [24].
Vi khuẩn đầu tiên được quan sát bởi Antony van Leeuwenhoek năm 1683
bằng kính hiển vi một tròng do ông tự thiết kế. Tên "vi khuẩn" được đề nghị sau
đó khá lâu bởi Christian Gottfried Ehrenberg vào năm 1828, xuất phát từ chữ
βακτηριον trong tiếng Hy Lạp có nghĩa là "cái que nhỏ". Louis Pasteur (18221895) và Robert Koch (1843-1910) miêu tả vai trò của vi khuẩn là các thể mang
và gây ra bệnh hay tác nhân gây bệnh.
Các vi khuẩn có rất nhiều kiểu trao đổi chất khác nhau. Vi khuẩn dị dưỡng
(heterotroph) phải dựa vào nguồn cacbon hữu cơ bên ngoài, và tất cả các vi khuẩn
gây bệnh đều là các vi khuẩn dị dưỡng. Trong khi các vi khuẩn tự dưỡng
(autotroph) có khả năng tổng hợp chất hữu cơ từ CO 2 và nước. Các vi khuẩn tự
dưỡng thu nhận năng lượng từ phản ứng ôxy hóa các hợp chất hóa học gọi là vi
khuẩn hóa dưỡng (chemotroph), và những nhóm thu năng lượng từ ánh sáng,
thông qua quá trình quang hợp, được gọi là vi khuẩn quang dưỡng (phototroph).
Có nhiều cách khác để gọi hai nhóm theo thuật ngữ tiếng Anh, ví dụ như
chemoautotroph và photosynthesis autotroph, v.v. Ngoài ra, các vi khuẩn còn
được phân biệt nhờ vào nguồn chất khử mà chúng sử dụng. Những nhóm sử dụng
hợp chất vô cơ (như nước, khí hidro, sulfua và ammonia) làm chất khử được gọi
là vi khuẩn vô cơ dưỡng (lithotroph) và những nhóm cần hợp chất hữu cơ (như
đường, axit hữu cơ) được gọi là vi khuẩn hữu cơ dưỡng (organotroph). Những

kiểu trao đổi chất dựa vào nguồn năng lượng (quang dưỡng hay hóa dưỡng),
nguồn chất khử (vô cơ dưỡng hay hữu cơ dưỡng) và nguồn carbon (tự dưỡng hay
dị dưỡng) có thể được kết hợp khác nhau trong từng tế bào, và nhiều loài có thể
thường xuyên chuyển từ kiểu trao đổi chất này sang kiểu trao đổi chất khác[24].
Vi khuẩn có thể có ích hoặc có hại cho môi trường, và động vật, bao gồm
cả con người. Vai trò của vi khuẩn trong gây bệnh và truyền bệnh rất quan
trọng. Một số là tác nhân gây bệnh và gây ra bệnh uốn ván (tetanus), sốt thương
hàn (typhoid fever), giang mai (syphilis), tả (cholera), bệnh lây qua thực phẩm
(foodborne illness) và lao (tuberculosis). Nhiễm khuẩn huyết (sepsis), là hội
chứng nhiễm khuẩn toàn cơ thể gây sốc và giãn mạch, hay nhiễm khuẩn khu trú
(localized infection), gây ra bởi các vi khuẩn như streptococcus, staphylococcus,
hay nhiều loài Gram âm khác. Một số nhiễm khuẩn có thể lan rộng ra khắp cơ
thể và trở thành toàn thân. Ở thực vật, vi khuẩn gây mụn lá, fireblight và héo
cây. Các hình thức lây nhiễm gồm qua tiếp xúc, không khí, thực phẩm, nước và
côn trùng. Kí chủ bị nhiễm khuẩn có thể trị bằng thuốc kháng sinh, được chia
làm hai nhóm là diệt khuẩn (bacteriocide) và kìm khuẩn (bacteriostasis), với liều
8


lượng mà khi phân tán vào dịch cơ thể có thể tiêu diệt hoặc kìm hãm sự phát
triển của vi khuẩn.
Các biện pháp khử khuẩn có thể được thực hiện để ngăn chặn sự lây lan
của vi khuẩn, ví dụ như chùi da bằng cồn trước khi tiêm. Việc vô khuẩn các
dụng cụ phẫu thuật và nha khoa được thực hiện để đảm bảo chúng "vô khuẩn"
(sterile) hay không mang vi khuẩn gây bệnh, để ngăn chặn sự nhiễm khuẩn.
Chất tẩy uế được dùng để diệt vi khuẩn hay các tác nhân gây bệnh để ngăn chặn
sự nhiễm và nguy cơ nhiễm khuẩn.
Trong đất, các vi sinh vật sống trong nốt rễ (rhizosphere) biến nitơ thành
ammoniac bằng các enzyme của chính mình. Một số khác lại dùng phân tử khí
nitơ làm nguồn nitơ cho mình, chuyển nitơ thành các hợp chất của nitơ, quá trình

này gọi là quá trình cố định đạm. Nhiều vi khuẩn được tìm thấy sống cộng sinh
trong cơ thể người hay các sinh vật khác. Ví dụ như sự hiện diện của các vi khuẩn
cộng sinh trong ruột già giúp ngăn cản sự phát triển của các vi sinh vật có hại.
Vi khuẩn có khả năng phân giải các hợp chất hữu cơ một cách đáng kinh
ngạc. Một số nhóm vi sinh "chuyên hóa" đóng một vai trò rất quan trọng trong
việc hình thành các khoáng chất từ một số nhóm hợp chất hữu cơ. Ví dụ, sự
phân giải cellulose, một trong những thành phần chiếm đa số trong mô thực vật,
được thực hiện chủ yếu bởi các vi khuẩn hiếu khí thuộc chi Cytophaga. Khả
năng này cũng được con người ứng dụng trong công nghiệp và trong cải thiện
sinh học. Các vi khuẩn có khả năng phân hủy hydrocarbon trong dầu mỏ thường
được dùng để làm sạch các vết dầu loang.
Vi khuẩn, cùng với nấm men và nấm mốc, được dùng để chế biến các thực
phẩm lên men như phô-mai, dưa chua, nước tương, dưa cải bắp, giấm, rượu, và
yoghurt. Sử dụng công nghệ sinh học, các vi khuẩn có thể được "thiết kế" để sản
xuất thuốc trị bệnh như insulin, hay để cải thiện sinh học đối với các chất thải
độc hại [24].
2.3. Vi sinh vật tổng hợp cellulase
Ngoài vi sinh vật có khả năng cố định nitrogen và phân giải khó tan thì vi
sinh vật phân giải cellulose trong đất giữ vai trò không kém phần quan trọng vào
việc phân hủy xác bã hữu cơ, qua đó góp phần nâng cao độ phì nhiêu cho đất và
có ý nghĩa rất lớn đối với vòng tuần hoàn carbon trong tự nhiên.

9


Vi sinh vật có khả năng phân giải cellulose có thể là kỵ khí hay hiếu khí.
Nhóm vi sinh vật chủ yếu thường gặp chủ yếu là vi khuẩn, xạ khuẩn, nấm mốc.
Các đại diện thường gặp có hoạt lực phân giải cellulose mạnh như vi khuẩn
Sprocytogapha, Cytogapha, Sorangium, Cellvibrio, Bacilius omelianxki,
Clostridum omelanski,…các loài xạ khuẩn như Streptomyces cellulosae, S.

thermovulgaris, Norcadiacellulans…và các nhóm nấm mốc phân giải cellulose
đáng chú ý thường gặp như Aspergillus fumigatus, A. niger, Fusarium
maniliforme, F. solani, Trichoderma,…[1],[4].
Trong điều kiện tự nhiên, cellulose bị phân hủy bởi vi sinh vật cả trong
điều kiện hiếu khí và yếm khí. Các loài vi sinh vật thay phiên nhau phân hủy
cellulose đến sản phẩm cuối cùng là glucose. Số lượng các loài vi sinh vật tham
gia sinh tổng hợp enzyme có trong điều kiện tự nhiên rất phong phú. Chúng
thuộc nấm sợi, xạ khuẩn, vi khuẩn và trong một số trường hợp các nhà khoa học
còn thấy cả nấm men cũng tham gia vào quá trình phân giải này.
Sau đây là một số chủng vi sinh vật được các nhà khoa học nghiên cứu kỹ
nhất [22].
Bảng 2.1. Một số chủng vi sinh vật được các nhà khoa học nghiên cứu kỹ nhất
Nấm sợi

Xạ khuẩn

Vi khuẩn

Aspergillus niger

Actinomyces aureus

Preudomonas

A.oryzae

Act.cellulose Act.diastaticus

Fluorescens

A.terreus

Act.roseus

B.megateroides

A.syndovii

Act.griseus

B.mesnenteroides

A.flavus

Act.melamocylas

Clostridium sp.

Fusarium culmorum

Act.coelicolor

Acetobacter xylinum

Fusarium oxysporum

Act.candidus

Vi khuẩn dạ cỏ

Mucor pusilus

Act.chromogenes

Ruminoccus albus

Pen. Notatum

Act.hygroscopicus

Ruminobacter parum

Penicillium spp

Act.griseofulvin

Bacteroides

Trichoderma lignorum

Act.ochroleucus

Amylophilus sp.

Trichoderma reesei

Act.thermofulcus

Clos.butiricum

Trichoderma viride

Act.xanthostrums

Clos.locheheadil

TRichoderma konongi

Thermonospora curvata

Cellulosemonas
10


2.3.1. Một số dòng vi khuẩn có khả năng phân hủy cellulose
Trong tự nhiên có rất nhiều loài vi sinh vật có khả năng phân hủy cellulose
cả trong điều kiện kỵ khí và hiếu khí, bao gồm vi khuẩn, xạ khuẩn và các loài
nấm. Các vi sinh vật này thay phiên nhau thủy phân cellulose ở từng mắt xích
cho chuỗi chuyển hóa để cuối cùng tạo ra những cấu trúc đơn giản.
Vi khuẩn phân hủy cellulose theo hai kiểu: hiếu khí và kỵ khí. Vi khuẩn
hiếu khí phân hủy cellulose mạnh mẽ thuộc các chi sau: Pseudomonas,
Cellulomonas, Vibrio, Cellvibrio, Bacillus….Vi khuẩn kỵ khí phân hủy
cellulose còn gọi là vi khuẩn lên men cellulose, điển hình là vi khuẩn trong khu
hệ vi sinh vật trong dạ cỏ động vật nhai lại như Ruminococcusflavofaciens,
Ruminococcus
albus,Rminococcusparvum,
Bacteroides
succingenes,
Clostridium cellobioparum, Cillobacteriumcellsolven,…[12].
2.3.1.1.Vi khuẩn Bacillus sp

Hầu hết các vi khuẩn thuộc dòng Bacillus sp. đều có khả năng sinh nội bào
tử hiếu khí, Gram dương. Đặc biệt Bacillussubtilislà một loại vi khuẩn không
gây bệnh, có sức sống cao, dễ nuôi cấy và có khả năng hình thành bào tử chịu
nhiệt cao. Ở điều kiện thích hợp, chúng có khả năng tổng hợp một lượng lớn
enzyme cellulase. Bacillus subtilis còn có vai trò quan trọng trong phân hủy chất
hữu cơ lắng đọng ở đáy ao (thức ăn thừa, phân, bùn đáy) tác động làm giảm
đáng kể lớp bùn và nhớt trong ao. Kết quả, cải thiện được chất lượng nước, giảm
lớp bùn đáy, giảm tỷ lệ mắc bệnh, tăng số lượng vi sinh vật phù du, giảm mùi
hôi và sau cùng tăng sản lượng nuôi [18].

Hình 2.4. Vi khuẩn Bacillus subtilis

11


2.3.1.2.Vi khuẩnAcetobacter sp.
Dòng vi khuẩn Acetobacter sp. là vi khuẩn Gram âm, có dạng hình que, tế
bào đứng riêng lẻ hoặc xếp thành chuỗi và có khả năng tổng hợp enzyme
cellulase. Qua các nghiên cứu, người ta đã thu được 29 dòng vi khuẩn
Acetobacter có khả năng sản sinh cellulase. Phần lớn 29 dòng này đều thuộc loài
Acetobacter xylinum[17].

Hình 2.5. Vi khuẩn Acetobacter xylinum
2.3.1.3. Vi khuẩn Pseudomonas sp.
Dòng vi khuẩn Pseudomonas sp. là vi khuẩn Gram âm, đa số hình que, có
thể chuyển động bằng roi, không sinh bào tử, hô hấp hiếu khí, có sinh độc tố
toxin và có khả năng tổng hợp enzyme cellulase trong môi trường thích hợp.
Một số loài thường gặp là: Pseudomonas aeruginosa, P. putida, P. fluorescens,
P. syringae, P.fluorescens,…[15].

Hình 2.6.Vi khuẩn Pseudomonas putida.
12


2.3.1.4. Vi khuẩn Cellulomonas sp
Là vi khuẩn Gram dương, hình que. Chúng thường phân hủy cellulose bằng
cách tiết raenzyme endoglucanase và exoglucanase. Quá trình trao đổi chất của
chúng là hô hấp, Cellulomonas thường sử dụng glucose và cellulase để làm
nguồn dinh dưỡng sinh ra acid [19].

Hình 2.7.Vi khuẩn Cellulomonas.
2.3.1.5. Vi khuẩn Cytophaga
Các giống vi khuẩn Cytophaga có tế bào đầu nhọn, không sinh vi kén, sống
trong đất ít acid, trung tính và ít kiềm. Cytophaga là vi khuẩn Gram âm, hình
que, sinh trưởng ở điều kiện hiếu khí, có khả năng phân hủy cellulose cao và
nhanh. Vi khuẩn này thường được tìm thấy trong đất[20], [21] .

Hình 2.8. Vi khuẩn Cytophaga
13


2.3.1.6. Vi khuẩn Clostridium sp
Các vi khuẩn phân hủy cellulose trong điều kiện yếm khí phần lớn thuộc
chi Clostridium. Là vi khuẩn Gram dương, kỵ khí bắt buộc, có khả năng hình
thành nha bào và chịu đựng được nhiệt độ cao.Vi khuẩn Clostridium ít mẫn cảm
với môi trường và có tính ổn định với pH, có thể phát triển ở pH 4,5-9, độ ẩm
thích hợp 60%-80%, nhiệt độ 25-30 0C. Về trực khuẩn kỵ khí sinh bào tử có khả
năng phân hủy cellulose trong dạ cỏ cần phải kể đến là Clostridium
cellobioparum. Loại vi khuẩn này được phân lập từ năm 1994. Chúng thuộc loại
vi khuẩn Gram âm, có khả năng lên men cellulose và một số hợp chất carbon

hydrate khác. Sản phẩm của quá trình lên men là acid acetic, acid formic, acid
lactic, ethanol, H2 và CO2 (Nguyễn Lân Dũng et al., 2008) [23].

Hình 2.9. Vi khuẩn Clostridium
2.3.1.7.Một số dòng vi khuẩn phân hủy cellulose khác
Bacteroid succinogeneslà loại trực khuẩn Gram âm, kỵ khí bắt buộc, không
sinh bào tử. Nguồn năng lượng tốt nhất đối với chúng là cellulose và glucose.
Chúng còn có khả năng đồng hóa cả tinh bột, cellobiose, pectin và một số đường
khác. Sản phẩm cuối cùng của quá trình lên men là acid succinic và một lượng
nhỏ acid acetic, acid formic. Để phát triển tốt, chúng đòi hỏi phải có muối amon
và một lượng nhỏ cystein. Chúng cần cả một ít biotin và acid paraaminobenzoic,
một số muối vô cơ và bicarbonat.
Butyrivibrio fibrisolvenslà loại trực khuẩn uốn cong Gram âm, không sinh
bào tử. Ngoài cellulose chúng còn có khảnăng đồng hóa cảtinh bột,
hemicellulose, xilan, glucose, galactose, arabinose, và nhiều hydrat carbon khác.
14


Để sinh trưởng tốt loài vi khuẩn này đòi hỏi phải được cung cấp một số acid
amin (histidine, loxin, isoloxin, methionine, lysine,cystein…) thiếu các chất này
chúng phát triển rất chậm. Chúng còn cần được cung cấp một số chất như biotin,
acid folic và vitamin B6. Loại vi khuẩn này phân bố khá rộng rãi trong tự nhiên,
ngoài sự có mặt trong dạ cỏ bò, người ta còn thấy chúng có mặt trong phân thỏ
và phân ngựa. Cillobacterium cellosolvens là những trực khuẩn kỵ khí, không
sinh bào tử, Gram dương, có khả năng di động[18].
Ngoài cellulose chúng còn có khả năng đồng hóa cả glucose, cellobiose,
maltose, fructose, inulin và xalixin. Sản phẩm chủ yếu sinh ra trên môi trường
chứa cellulose là acid lactic (Nguyễn Lân Dũng et al., 2008). Ngoài ra còn có
một số dòng vi khuẩn, xạ khuẩn có khả năng tổng hợp enzyme cellulase như:
Enterobacter sp., Actinomycessp.,…một số nấm như Trichoderma viride,

Asperillus niger,… (Nguyễn Đức Lượng, 2002).
2.4. Ảnh hưởng của điều kiện ngoại cảnh đến sinh trưởng, phát triển của vi
khuẩn phân giải cellulase
Quá trình sinh tổng hợp cellulose ở vi sinh vật chịu tác động của nhiều yếu
tố: hóa học, vật lý,…trong đó quan trọng nhất là các điều kiện môi trường nuôi
cấy như nguồn carbon, nitrogen, pH, nhiệt độ, độ ẩm đất.
Các yếu tố hóa học ảnh hưởng đến khả năng sinh tổng hợp cellulase là
nguồn carbon, nitrogen, tỷ lệ C/N và nguồn phosphate vô cơ. Sự có mặt của các
nguồn nitrogen, tinh bột, đường rượu, acid hữu cơ có thể làm cho vi khuẩn sản
sinh ra nguồn enzyme cellulase nhiều hơn [13].
2.4.1. Nguồn thức ăn carbon
Sinh tổng hợp cellulase phụ thuộc chặt chẽ vào thành phần môi trường dinh
dưỡng, trước hết là carbon. Nhiều chủng có hoạt tính amylase cao nên nguồn
carbon thích hợp với chúng là tinh bột[6]. Tuy nhiên, phụ thuộc vào từng chủng
mà chọn nguồn carbon thích hợp, các đường đơn như glusose, fructose hay các
đường kép như saccarose, maltose, lactose,…cũng có thể là tinh bột hay các chất
có thành phần không xác định như rỉ đường, đại mạch,…
Nhiều nguồn thức ăn carbon như glucose, cellobiose, acetate, citrate,
oxalate, succinate ức chế quá trình tổng hợp các enzym phân giải cellulose. Khi
nôi cấy trên môi trường chứa giấy lọc và tăng dần nồng độ glucose lên 2 - 3% sẽ
xảy ra ức chế quá trình tổng hợp cellulase. Ngược lại sự hình thành cellulase sẽ
tăng lên nếu lượng glucose giảm thấp[9].
15


Phần lớn các chủng thuộc chi zotobacter được phân lập từ thiên nhiên có
khả năng cố định trên 10mg nitrogen khi tiêu thụ hết 1g các hợp chất carbon.
Một số loài khác trong những điều kiện thích hợp có thể đồng hóa được 30mmg
nitrongen/1g đường. Nhiều nghiên cứu còn cho biết, khi phát triển chung với
một số vi khuẩn khác, Azotobacer sẽ có có hoạt tính cố định nitrogen cao hơn

khi nuôn cấy riêng rẽ [2].
2.4.2. Ảnh hưởng của các nguyên tố khác
Các nguyên tố đa lượng và vi lượng ảnh hưởng đến quá trình tổng hợp
cellulase. Các nguyên tố đa lượng ngoài C, N còn có K, P,…rất cần cho vi sinh
vật vì chúng tham gia vào thành phần cấu tạo nên những cơ quan, những chất
cần thiết cho cơ thể vi sinh vật. Các nguyên tố đa lượng có thể đưa vào môi
trường nuôi cấy dưới dạng các muối vô cơ, nhưng cần tính các lượng nguyên tố
này có sẵn trong các thành phần khác nhau của môi trường. Trong các nguyên tố
này cần lưu ý đến phopho và lưu huỳnh vì chúng tham gia vào cấu tạo nhiều hợp
chất quan trọng, nhất là nucleotide, protein, lipit và vitamin [10].
Nồng độ cần thiết của một số chất muối khoáng đối với vi khuẩn không
giống nhau. Trong môi trường nuôi cấy vi khuẩn MPA cần 5g cao thịt và 10g
peptone/lít.
Ảnh hưởng của các nguyên tố đên sinh tổng hợp enzyme rất quan trọng vì
vậy khi chế biến môi trường nuôi cấy cần xác định cà cung cấp đầy đủ đúng tỷ
lệ các nguyên tố cần thiết cho sự sinh trưởng và phát triển.
2.4.3. Ảnh hưởng của nhiệt độ
Nhiệt độ ảnh hưởng lớn đến sự sinh trưởng, phát triển và tổng hợp enzyme
của vi khuẩn. Ở loài nấm mốc ưa ẩm, nhiệt độ thích hợp là khoảng 28 - 32 0C
Còn đối với vi khuẩn, mỗi loài có một khoảng nhiệt độ thích hợp riêng, nhưng
đa số vi khuẩn phát triển ở nhiệt độ 29 -30oC.
Một số nghiên cứu về vi khuẩn phân giải cellulose trong điều kiện nhiệt độ
cao cũng cho kết quả rất tốt. Chủng vi khuẩn phân giải cellulose Bacellus
sublitis nuôi cấy 30h, nhiệt độ 500C là khoảng nhiệt độ tốt nhất cho quá trình sản
sinh enzyme cellulose [11].
Chủng vi khuẩn BSS2 được phân lập từ bãi chôn lấp rác thải sinh hoạt Nam
Sơn, Hà Nội có khả năng phát triển ở 50 0C. Cũng trong điều kiện nhiệt độ này
chúng có khả năng sinh cellulase cao khi được nuôi cấy trên môi trường rắn và
dịch thể. Hoạt tính enzyme C1 của chủng được lên men rắn là 0,02 U/g và khi
16

được lên men dịch thể là 0,07 U/ml, còn hoạt độ enzyme Cx của chủng lần lượt là
0,073 U/g và 0,138 U/ml khi được nuôi cấy trên môi trường rắn và dịch thể [5].
Trong quá trình nuôi cấy các chủng vi khuẩn phân giải cellulose phân lập
được từ đất, chúng tôi tiến hành nuôi cấy trong khoảng nhiệt độ 28 - 300C.
2.4.4. Ảnh hưởng của pH
Mỗi vi sinh vật đều có một pH thích hợp riêng biệt. Đối với nấm mốc pH
thích hợp môi trường từ khoảng 4 - 5, trong khi đó xạ khuẩn ưa thích pH môi
trường hơi kiềm từ 6 - 7,5 [13].
Vi khuẩn có khả năng sinh trưởng trong dải pH 5 - 9,5. Nhiều nghiên cứu
cho biết, Azotobacter có thể phát triển được trên môi trường có pH trong khoảng
4,5 - 9. Nhìn chung, pH thích hợp nhất cho sinh trưởng của Azotobacter là 7,2 8,2 (G.L. Blinkova, 1951) Azotobacter thường ít thấy trong đất có pH thấp hơn
5,6 - 5,8. Cũng có thể phân lập từ đất chua một số loài Azotobacter nhưng chúng
thường mất khả năng cố định nitrogen phân tử [4].Trong môi trường trung tính
(pH =7) và môi trường kiềm (pH = 8) vi khuẩn Bacillus asublitis sinh tổng hợp
cellulase tốt nhất[11].
Sinh tổng hợp chất kháng sinh phụ thuộc rất nhiều vào pH môi trường. pH
tác động trực tiếp đến tính chất hệ keo của tế bào, đến hoạt lực các enzyme và
tác động gián tiếp qua môi trường. pH thích hợp cho sinh tổng hợp chất kháng
sinh thường là trung tính, pH kiềm hay acid đều ức chế quá trình tổng hợp chất
kháng sinh.Môi trường MPA dùng trong thí nghiệm có pH trong khoảng 6,8.
2.4.5. Ảnh hưởng của độ ẩm
Hầu hết các quá trình sống của vi khuẩn đều có liên quan đến nước. Do đó
độ ẩm là một yếu tố quan trọng của môi trường. Để phát triển thuận lợi, vi
khuẩn đòi hỏi độ ẩm khá cao, khoảng 60 - 90%. Nhu cầu về độ ẩm của vi khuẩn
phân giải cellulose hiếu khí sống tự do trong đất cũng tương tự như nhu cầu của
cây trồng. Tuy vậy, bào xác của nhóm vi khuẩn này vẫn có thể chịu đựng được
rất lâu dài đối với sự khô hạn của đất [3].
2.4.6. Độ thoáng khí

Các loại đất khác nhau có điều kiện dinh dưỡng, độ ẩm, độ thoáng khí, pH
khác nhau. Bởi vậy sự phân bố của vi sinh vật cũng khác nhau. Ở đất lúa nước,
tình trạng ngập nước lâu ngày làm ảnh hưởng đến độ thông khí, chế độ nhiệt,
chất dinh dưỡng ... Chỉ có một lớp mỏng ở trên, khoảng 0 - 3 cm là có quá trình
oxy hoá, ở tầng dưới quá trình khử oxy chiếm ưu thế. Bởi vậy, trong đất lúa
17


nước ác loại vi sinh vật kị khí phát triển mạnh. Ví dụ như vi khuẩn amôn hoá, vi
khuẩn phản nitrat hoá. Ngược lại, các loại vi sinh vật háo khí như vi khuẩn nitrat
hoá, vi khuẩn cố định nitơ, vi nấm và xạ khuẩn đều rất ít. Tỷ lệ giữa vi khuẩn
hiếu khí/ yếm khí luôn luôn nhỏ hơn 1.
Ở đất trồng màu, không khí lưu thông tốt, quá trình ôxy hoá chiếm ưu thế,
bởi thế các loài sinh vật háo khí phát triển mạnh, vi sinh vật yếm khí phát triển
yếu. Tỷ lệ giữa vi khuẩn háo khí và yếm khí thường lớn hơn 1, có trường hợp
đạt tới 4 - 5. Đất màu mỡ, nhiều mùn, tươi xốp luôn có số lượng vi sinh vật tổng
số cao hơn so với đất bạc màu, nghèo dinh dưỡng [25].
Vi khuẩn phân giải cellulose thuộc loại hiếu khí cho nên độ thoáng khí
trong đất rất quan trọng cho sự sinh trưởng, phát triển và tiết enzyme cellulase
của chúng. Tuy nhiên, thông khí quá mạnh hay quá yếu cũng làm ức chế quá
trình tổng hợp cellulase của vi khuẩn.
2.5. Tình hình nghiên cứu và sử dụng phân vi sinh phân giải cellulose
Phân bón vi sinh vật phân giải cellulose (phân vi sinh phân giải cellulose)
là sản phẩm chứa một hay nhiều chủng vi sinh vật sống, đã được tuyển chọn với
mật độ đạt theo tiêu chuẩn hiện hành có khả năng phân giải cellulose, để cung
cấp chất dinh dưỡng cho đất và cây trồng, tạo điều kiện nâng cao năng xuất và
chất lượngnông sản, tăng độ màu mỡ của đất. Phân vi sinh vật phân giải
cellulose và các chủng vi sinh vật này không ảnh hưởng xấu đến người, động
thực vật, môi trường sinh thái và chất lượng nông sản.
Ngày nay, thế giới đang tích cực chiến lược bảo vệ môi trường đồng thời

xây dựng một nền nông nghiệp sạch và bền vững sinh thái. Vì vậy, ngày càng có
nhiều công trình nghiên cứu về phân bón sinh học. Bên cạnh các loại phân lân vi
sinh, phân đạm vi sinh, phân hữu cơ vi sinh đóng vai trò quan trọng nhằm bổ
sung dinh dưỡng cho cây trồng, tận dung phế thải nông nghiệp, cải tạo môi
trường đất.
2.5.1. Nghiên cứu trên thế giới
Trong số những nghiên cứu về khả năng sinh cellulase của vi khuẩn thì
Bacillus là chủng có khả năng sản sinh cellulase ngoại bào với số lượng lớn, và
được quan tâm nghiên cứu nhiều hơn cả, đặc biệt là: B.subtilis (Pack và cộng sự,
1991), B.polymxa, B.cereus (Robson và Chambliss, 1989), B.pumilus
(Christakopoulos và cộng sự, 1999), Bacillus sp. KMS-330 (Ozaki và Ito, 1991)
và KMS-635 (Ito và cộng sự, 1989).
18


Các nghiên cứu gần đây về hệ vi sinh vật và sinh vật nguyên sinh sống
cộng sinh trong ruột mối họ Rhinotermitidae đã cho thấy vi khuẩn nội cộng sinh
trong các sinh vật nguyên sinh có khả năng phân hủy được cellulose trong ruột
mối (Noda et al., 2007). Bên cạnh đó, công trình nghiên cứu “nhận dạng vi
khuẩn phân hủy cellulose được phân lập từ mối (Coptotermes Curvignathus)”
(Ramin et al., 2008) bằng các phương pháp giải trình tự DNA và so sánh các
trình tự này trên NCBI, đã xác định được tên một số vi khuẩn phân lập được từ
mối: Bacillus cereus, Enterobacter aerogenes, Enterobacter cloacae,
Chryseobacterium kwangyangense, Acinetobacter.
Trên thế giới cũng đã có nhiều nghiên cứu về sự tổng hợp enzyme cellulase
của vi sinh vật. Nhiều loài nấm sợi có khả năng sinh ra một lượng lớn cellulase
thuộc giống Alternaria sp., Trichoderma sp., Aspergillus sp., Pinicilliumsp.,…
Trong đó Trichoderm sp. và Aspergillus sp. đã được nhiều nhà khoa học nghiên
cứu để sản xuất cellulase (Mukhopadhyay và Nandi, 1999)[14].
Cellulase là một trong những enzyme đượcnghiên cứu rấtkỹ trong nhiều năm

qua, do enzymenày có ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực, đặc biệt là trong
công nghệ thực phẩm và xử lý môi trường. Cellulase chiếm 20 phần trăm lượng
enzymeđược sản xuất và thương mại hóa trong hơn 30 năm qua. Một sốnghiên cứu
điển hình vềcellulase có thểkểđến bao gồm: Chếphẩm Amano T của hãng
AMANO (cellulase được sản xuất từTrichoderma reesi) có hoạt tính 898 IU/g và
hiệu suất sinh tổng hợp enzymecellulase là 185 IU/g. Sản phẩm BIOENZYMEcó
thành phần gồm: Cellulase, Xylanase, Beta glucanase, Phytase, Pectinase,…
Bên cạnh nấm, vi khuẩn cũng có vai trò quan trọng trong việc phân hủy
cellulose trong thủy vực (Tanaka, 2004). So với nhóm vi khuẩn phân hủy tinh
bột, vi khuẩn dịdưỡng có khảnăng phân hủy cellulose trong môi trường ngâm
ủlá đước có tỷ lệ thấp hơn (Mudryk & Donderski, 1997; Mahasneh, 2001). Vi
khuẩn phân hủy cellulose trên lá nhiều hơn vi khuẩn phân hủy cellulose trong
môi trường nước. Tỷlệvi khuẩn có khảnăng phân hủy cellulose của nhóm vi
khuẩn bám trên lá chiếm từ8,7-12,3 % và trong nước từ7,7 - 9,7% so với tổng
sốvi khuẩntham gia phân hủy lá đước.Clostridium papyrosolvens cũng được
phát hiện có khảnăng tổng hợp cellulase.Clostridium papyrosolvens được nuôi
cấy 48h trong điều kiện kỵkhí ở 350C cho dịch trích có hoạt tính CMCase cao.
CMCase có nhiệt độtối thích là 35 0C và pH tối thích là 6,5 đến 7,5
(Rani.D.Swaroopa, 2004).

19


Yasuo và Yasuhiko (1982) cũng đã tìm thấy nhóm vi khuẩn sống bám trên
các mảnh vụn hữu cơ trong thủy vực có tỷlệvi khuẩn phân hủy cellulose nhiều
hơn so với nhóm vi khuẩn sống tựdo trong nước.Ở độmặn 25‰ trung bình tỷ
lệvi khuẩn có khảnăng phân hủy cellulose là 10,4% cao hơn có ý nghĩa so với
8,9% là tỷlệvi khuẩn phân hủy cellulose ởđộmặn 5‰. Hatami vàmột sốcộng sự
(1990) đã phân lập và khảo sát được những dòng vi khuẩn có khả năng sinh
emzyme cellulase có hoạt tính cao trong việc phân hủy cellulose như:

Cytophaga, Cellulomonas,….
Hiện nay, các nhà khoa học thuộc Viện Nghiên cứu năng lượng sinh học
Mỹđang tiến hành thửnghiệm khảnăng chuyển hóa cellulose thành ethanol trên
100 mẫuvi khuẩn khác nhau trong ruột mối (Trung tâm thông tin khoa học và
Công nghệQuốc gia số11, 2007).
Ngoài ra, trong dịch dạcỏcủa các loài động vật nhai lại, Ramya MuthuKrisnan
(2007) đã tìm thấy một số dòng vi khuẩn có khả năng phân hủy cellulose như các
dòng thuộc Clostridium sp., Cellvibrio sp., Cellulomonas sp.,…[12].
2.5.2. Nghiên cứu trong nước
Đối với chế phẩm vi sinh vật phân giải cellulose, đã có nhiều công trình
nghiên cứu theo hướng sử dụng các chủng có hoạt lực mạnh để phân giải rác
thải thành phân bón cho cây trồng.Ở Việt Nam, có công trình nghiên cứu về vi
sinh vật phân giải cellulose như của Tăng Thị Chính (1999), Nguyễn Lan Hương
(1999), Phạm Thị Ngọc Lan (1999). Điển hình như nghiên cứu của Nguyễn
Phượng Hải và Nguyễn Đức Lượng đã sử dụng 3 loài vi sinh vật Trichoderma
viride, Bacillus disollven và Actinomyces diastaticus để xử lý chất thải chứa
cellulose. Kết quả cho thấy lượng cellulose của than bùn giảm xuống từ 7%
xuống còn 3%, hàm lượng mùn tăng 20% và giảm lượng rác từ 19% xuống còn
12%, rút ngắn thời gian ủ từ 6 tháng xuống còn 1,5 tháng, đảm bảo ổn định sản
phẩm phân bón từ bãi rác Hooc Môn của thành phố [13].
Ngoài ra, các vi khuẩn Bacillus sp.có nhiều ứng dụng nổi bật và được quan
tâm nghiên cứu. Viện Vacxin cơ sở II Đà Lạt và Viện Vacxin Nha Trang – Đà
Lạt đã sử dụng Bacillus sp. Trong một chế phẩm sinh học hay còn gọi là
probiotic, chứa các vi sinh vật sống có công dụng kích thích sinh trưởng của
tôm, cải thiện môi trường nước, giúp ổn định hệ vi sinh vật có lợi trong đường
ruột, ức chế vi khuẩn gây thối, ổn định môi trường nước, làm sạch ao hồ, phân
hủy các chất hữu cơ lắng đọng, tăng hàm lượng oxy hòa tan trong nước và duy
trì màu nước (Lê Văn Hiệp et al., 2001).
20

Nghiên cứu của Lê Hồng Mẫn và cộng sự (1997) ở Viện Lúa đồng bằng
sông Cửu Long cho thấy, sử dụng nấm mốc Trichoderma sp. xử lý rơm rạ sau
30 – 45 ngày và trộn với phân lân sinh học cho hiệu quả trên nền đất sét nặng,
năng suất giống lúa (IR60) tăng 18,6% khi kết hợp bón 50% phân vô cơ và 50%
phân sinh học. Kết quả cũng cho thấy khả năng chống chịu sâu bệnh của lúa cao
hơn và quần thể vi sinh vật đất được cải thiện. Việc sử dụng trực tiếp các vi sinh
vật này như một dạng phân vi sinh vật sử dụng vào đất thì ít có tài liệu nào đề
cập tới.
Một số nghiên cứu về vi sinh vật phân hủy cellulose và cellulase như Đặng
Minh Hằng, (1999); Hoàng Quốc Khánh và cộng sự, (2003); Trịnh Đình Khá và
cộng sự, (2007); Nghiêm Ngọc Minh và cộng sự, (2006). Những nghiên cứu này
chủ yếu đề cập vấn đề phân lập các chủng vi sinh vật và đánh giá ảnh hưởng của
một số ảnh hưởng của một số yếu tố môi trường đến khả năng sinh tổng hợp
cellulase.
Ngoài ra đã có rất nhiều đề tài và nghiên cứu khoa học về ứng dụng của vi
khuẩn phân giải cellulose như đề tài phân lập tuyển chọn và vi khuẩn phân hủy
cellulose từ bã mía để xử lý cơ chất trồng nấm linh chi; Phân lập và tuyển chọn
một số dòng vi khuẩn phân hủy cellulose từ dịch rác thải; Phân lập một số dòng
vi khuẩn có khả năng phân giải cellulose trong bã trấu đang hoa mục, 2012 của
Đại học Cần Thơ; Phân lập và nhận diện vi khuẩn phân giải cellulose, của Võ
Văn Phước Quệ và Cao Ngọc Điệp; Tìm hiểu khả năng phân giải cellulose của
vi sinh vật phân lập từ chất thải rắn của nhà máy FOCOCEV của Nguyễn Ngọc
Trúc Ngân & Phạm Thị Ngọc Lan năm 2014; Phân lập một số chủng vi sinh vật
ứng dụng xử lý lục bình làm phân vi sinh của Bùi Anh Võ và cs Đại học Tôn
Đức Thắng, TP Hồ Chí Minh[14], [12].

21

PHẦN 3
ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.1. Đối tượng nghiên cứu
Các chủng vi khuẩn được phân lập từ các bãi rác, xưởng mùn cưa, rơm rạ
mục, lá cây mục và một số vùng đất canh tác khác nhau ở Thừa Thiên Huế và và
Quảng Nam.
3.2. Địa điểm và thời gian nghiên cứu
3.2.1. Địa điểm
Thí nghiệm được tiến hành tại phòng thí nghiệm vi sinh vật thuộc bộ môn
Công nghệ Sinh học, khoa nông học, trường Đại Học Nông Lâm Huế.
3.2.2. Thời gian
Thí nghiệm được tiến hành trong khoảng thời gian từ 9/2014 đến tháng 5/ 2015.
3.3. Thiết bị, dụng cụ và môi trường thí nghiệm
3.3.1.Thiết bị, dụng cụ thí nghiệm
- Thiết bị thí nghiệm: Buồng cấy, tủ ấm, tủ khử trùng dụng cụ, máy lắc, cân
điện tử, nồi hấp áp lực, máy đo mật độ quang, máy đo pH, máy li tâm, tủ lạnh.
- Dụng cụ thí nghiệm: Bình tam giác (100,250, 500ml), đĩa petri, ống
nghiệm, que cấy, que phân lập.
3.3.2. Môi trường được sử dụng trong thí nghiệm
* Môi trường phân lập
Môi trường MPA và Vinografski được sử dụng để phân lập các chủng vi
khuẩn, có thành phần như sau:
- Môi trường MPA (1 lít môi trường lỏng):
- Cao thịt : 5g
- Peptone : 10g
- Agar: 20g
- Nước cất: 1 lít
- pH: 6,8

22

* Môi trường thử hoạt tính phân giải cellulose của các chủng vi khuẩn
Sử dụng môi trường Vinografski có bổ sung nguồn carbon bằngCMC
(carboxyl methyl cellulose) để đánh giá hoạt tính phân giải cellulose của các
chủng vi khuẩn.
- Môi trường Vinografski (1 lít môi trường lỏng)
- CMC: 10g
- (NH4)SO4 : 1g
- K2HPO4:1g
- MgSO4.7H2O: 0.5g
- NaCl : 0,001g
- Agar : 20g
- Nước cất : 1 lít
- pH : 7,0
* Môi trường thu nhận enzyme cellulase của các chủng vi khuẩn
Để nuôi cấy thu dịch chiết enzyme cellulase ngoại bào chúng tôi sử dụng cả
hai loại môi trường lỏng và xốp. Môi trường lỏng là môi trường Vinogradskivới
nguồn cơ chất là CMC nhưng không có thạch agar. Môi trường xốp bao gồm cơ
chất là cám gạo:bột bắp với tỉ lệ 1:1. Đây cũng là môi trường dùng để nhân sinh
khối vi khuẩn cho các thí nghiệm xử lý nguyên liệu sau này.
3.4. Nội dung và phương pháp nghiên cứu
3.4.1. Nội dung nghiên cứu
- Phân lập các chủng vi khuẩn từ các mẫu đất, rơm rạ, lá cây mục ở các bãi
rác, xưởng mùn cưa, và các vùng đất canh tác khác nhau của các tỉnh Thừa
Thiên Huế, Quảng Nam, Đắc lắc.
- Tuyển chọn các chủng vi khuẩn có khả năng phân giải cellulose mạnh.
- Xác định hoạt độ của enzyme cellulase bằng phương pháp khuyếch tán
trên thạch đĩa và phương pháp định lượng đường khử thông qua phản ứng tạo
màu giữa đường khử với thuốc thử acid dinitrosalicylic(DNS).

- Xác định thời gian và nguồn carbon nuôi cấy thích hợp cho việc sinh tổng
hợp enzyme cellulase của vi khuẩn được tuyển chọn.

23