Khảo Sát Khả Năng Sinh Enzyme Mannanase Của Vi Khuẩn Bacillus Subtilis

TỔNG LIÊN ĐOÀN LAO ĐỘNG VIỆT NAM
TRƯỜNG ĐẠI HỌC TÔN ĐỨC THẮNG
KHOA KHOA HỌC ỨNG DỤNG
*****************

KHẢO SÁT KHẢ NĂNG SINH ENZYME MANNANASE
CỦA VI KHUẨN Bacillus subtilis

Giảng viên hướng dẫn : Th.s NGUYỄN KHÁNH LINH

Thành phố Hồ Chí Minh
Tháng 12/2009

i


TÓM TẮT
Tên đề tài : Khảo sát khả năng sinh tổng hợp enzyme Mannanase từ Bacillus subtilis
Địa điểm tiến hành luận văn : Phòng Nghiên Cứu Dinh Dưỡng Chăn Nuôi thuộc Viện
Khoa Học Kỹ Thuật Nông Nghiệp Miền Nam
Trong 6 tháng đầu năm 2009, giá thức ăn chăn nuôi tăng 5-8% so với cuối năm 2008
và quý I/ 2009, tuỳ từng loại thức ăn và từng vùng. Để giảm giá thức ăn hỗn hợp, người
nông dân thường trộn các nguyên liệu rẻ tiền như khô cọ, khô dừa, vỏ đậu nành... Các
nguyên liệu này lại giàu -Mannan và một số chất thuộc nhóm polysaccharide không phải
tinh bột gây cản trở sự tiêu hoá thức ăn, ngăn trở chất dinh dưỡng hấp thụ qua niêm mạc
ruột. Để giải quyết vấn đề này, tôi tiến hành nghiên cứu sản xuất ở quy mô phòng thí
nghiệm chế phẩm enzyme Mannanase. Chế phẩm enzyme này có tác dụng phân cắt Mannan, làm giảm độ nhớt dịch ruột, tạo điều kiện cho niêm mạc ruột hấp thu chất dinh
dưỡng được dễ dàng.Bên cạnh đó, -Mannan bị phân cắt thành những mannose
oligosaccharide, chúng giữ vai trò là các prebiotic, có tác dụng loại bỏ vi khuẩn bệnh bám
dính thượng bì ruột, kích thích hệ miễn dịch ruột hoạt động, từ đó giúp tăng cường sức
khoẻ ruột, hạn chế rối loạn tiêu hoá.

Kết quả đạt được :
- Khảo sát khả năng sinh enzyme Mannanase từ các môi trường lỏng và rắn có tỷ
lệ thành phần khác nhau, ta kết luận được môi trường lỏng L1 và môi trường rắn R1 là 2
môi trường tối ưu cho sự sinh tổng hợp enzyme Mannanase từ Bacillus subtilis.
- Từ môi trường tối ưu lỏng L1, tiến hành khảo sát các mốc thời gian xác định, ta
kết luận được thời điểm là 120 giờ là thời điểm tốt nhất để thu nhận chế phẩn enzyme
Mannanase.
- Từ môi trường tối ưu rắn R1, tiến hành khảo sát môi trường này ở các độ ẩm
khác nhau, ta kết luận được môi trường R1 với độ ẩm 65% là tốt nhất cho khả năng sinh
tổng hợp enzyme Mannanase.

-

Từ môi trường tối ưu rắn R1, tiến hành khảo sát các mốc thời gian xác định, ta
kết luận được thời điểm là 120 giờ là thời điểm tốt nhất để thu nhận chế phẩn enzyme
Mannanase.
Nghiên cứu này phục vụ cho người nông dân, giảm chi phí sản xuất, giảm giá thành
thức ăn chăn nuôi, tăng tỷ lệ hấp thụ thức ăn cho gia súc, gia cầm và tăng chất lượng vật
nuôi. Nhờ đó, người nông dân nhanh thu hồi vốn để tái sản suất đầu tư thu lợi nhuận, cải
thiện đời sống.

iii


MỤC LỤC
Trang tựa ......................................................................................................................... i

Lời cảm ơn ............................................................................................................ ii
Tóm tắt ................................................................................................................. iii
Mục lục ................................................................................................................ iv

Danh mục các sơ đồ ............................................................................................ vii
Danh mục các hình .............................................................................................. vii
Danh mục các bảng ............................................................................................ viii
Danh mục các đồ thị ............................................................................................. ix

GIỚI THIỆU ................................................................................................................. 1
Đặt vấn đề ...................................................................................................................... 1
Mục đích và phạm vi đề tài ............................................................................................. 1
Ý nghĩa của đề tài ........................................................................................................... 2
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU .................................................................... 3
1.1.

Giới thiệu về vi khuẩn Bacillus subtilis ................................................................ 4

1.1.1.

Vị trí phân loại ............................................................................................... 7

1.1.2.

Nguồn gốc và sự phân bố ............................................................................... 7

1.1.3.

Đặc điểm hình thái ........................................................................................ 7

1.1.4.

Các yếu tố ảnh hưởng đến sự tồn tại, phát triển của vi khuẩn Bacillus subtilis 8

1.1.5.

Lợi ích của Bacillus subtilis ........................................................................... 8

1.1.6.

Tác hại của Bacillus subtilis ........................................................................... 8

1.2.

Giới thiệu về enzyme Mannanase ......................................................................... 9

1.2.1.

Cấu tạo của enzyme Mannanase ................................................................... 12
iv


1.2.2.

Tính chất của enzyme Mannanase ................................................................ 14

1.2.3.

Nguồn thu nhận enzyme Mannanase ............................................................ 14

1.2.4.

Các phương pháp thu nhận enzyme Mannanase hiện nay ............................. 15

1.2.5.

Ứng dụng của enzyme Mannanase .............................................................. 21

CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ........................... 23
2.1.

Thời gian và địa điểm tiến hành thí nghiệm........................................................ 24

2.2.

Nội dung nghiên cứu ......................................................................................... 24

2.3.

Vật liệu thí nghiệm............................................................................................. 24

2.3.1.

Đối tượng thí nghiệm .................................................................................. 24

2.3.2.

Trang thiết bị thí nghiệm............................................................................. 24

2.3.3.

Hoá chất và môi trường thí nghiệm ............................................................. 25

2.3.4.

Phương pháp ............................................................................................... 27

2.3.4.1. Nhuộm gram ....................................................................................... 27
2.3.4.2. Tiến hành hoạt hoá và tăng sinh vi khuẩn Bacillus subtilis .................. 28
2.3.4.3. Phương pháp nuôi cấy Bacillus subtilis trong môi trường lỏng ............ 28
2.3.4.4. Phương pháp nuôi cấy Bacillus subtilis trong môi trường rắn .............. 29
2.3.4.5. Tiến hành xác định hoạt tính enzyme Mannanase ................................ 30
2.3.4.6. Khảo sát ảnh hưởng của môi trường lên men đến khả năng sinh tổng hợp

enzyme Mannanase của Bacillus subtilis....................................................................... 32
2.3.4.7. Khảo sát ảnh hưởng của thời gian lên men của môi trường lỏng đến khả

năng sinh tổng hợp enzyme Mannanase của Bacillus subtilis ........................................ 33
2.3.4.8. Khảo sát ảnh hưởng của thời gian lên men và độ ẩm môi trường rắn đến

khả năng sinh tổng hợp enzyme Mannanase của Bacillus subtilis ................................. 34

v


2.3.4.9. Tiến hành lên men thử nghiệm sản xuất chế phẩm enzyme ở quy mô

phòng thí nghiệm .......................................................................................................... 35
2.3.4.10. Kiểm tra an toàn sinh học của chế phẩm.............................................. 36
2.3.4.11. Khảo sát ảnh hưởng của thời gian bảo quan và nhiệt độ bảo quản đến độ

bền của chế phẩm enzyme Mannanase .......................................................................... 39
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN .............................................................. 40
3.1.

Kết quả nhuộm gram .......................................................................................... 41

3.2.

Kết quả hoạt hoá và tăng sinh vi khuẩn Bacillus subtilis .................................... 41

3.3.

Kết quả khảo sát ảnh hưởng của môi trường lên men đến khả năng sinh tổng hợp

enzyme Mannanase của Bacillus subtilis....................................................................... 43
3.4.

Kết quả khảo sát ảnh hưởng của thời gian lên men của môi trường lỏng đến khả

năng sinh tổng hợp enzyme Mannanase của Bacillus subtilis ........................................ 46
3.5.

Kết quả khảo sát ảnh hưởng của thời gian lên men và độ ẩm môi trường rắn đến

khả năng sinh tổng hợp enzyme Mannanase từ Bacillus subtilis ................................... 48
3.6.

Tiến hành lên men thử nghiệm sản xuất chế phẩm enzyme ở quy mô phòng thí

nghiệm .......................................................................................................................... 51
3.7.

Kết quả kiểm tra an toàn sinh học của chế phẩm ................................................ 54

3.8.

Kết quả khảo sát ảnh hưởng của thời gian bảo quản và nhiệt độ bảo quản đến độ

bền của chế phẩm enzyme Mannanase .......................................................................... 54
CHƯƠNG 4. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ............................................................ 58
4.1.

Kết luận ............................................................................................................. 59

4.2.

Đề nghị ............................................................................................................. 59

TÀI LIỆU THAM KHẢO .......................................................................................... 60
PHỤ LỤC .................................................................................................................... 62

vi


DANH SÁCH CÁC SƠ ĐỒ
Sơ đồ 1.1. Các chất thuộc nhóm NSP ............................................................................. 9
Sơ đồ 1.2. β-mannase phá vỡ vách tế bào giúp enzyme nội sinh tiếp cận và tiêu hóa chất
dinh dưỡng ................................................................................................................... 10
Sơ đồ 1.3. Beta-mannanase của Hemicell chia nhỏ polymer Beta-mannan thành những
phân đoạn MOS ( Mannose Oligossacharide) ............................................................... 12
Sơ đồ 2.1 : Quy trình sản xuất chế phẩm enzyme ở quy mô phòng thí nghiệm ............. 35
Sơ đồ 2.2. Quy trình định lượng Coliforms, coliform phân và E.coli bằng phương pháp
đếm khuẩn lạc .............................................................................................................. 37

Sơ đồ 2.3. Quy trình phát hiện Salmonella trong thực phẩm ......................................... 39

DANH SÁCH CÁC HÌNH
Hình 1.1. Vi khuẩn Bacillus Subtilis ............................................................................... 7
Hình 1.2. Cơ chế tác dụng của Mannanase. .................................................................. 11
Hình 1.3. Cấu trúc không gian (A) và tâm hoạt động (B) của Mannanase 26A
Pseudomonase cellulose ............................................................................................... 13
Hình 1.4. Nuôi cấy bề mặt trên môi trường lỏng trong các khay ................................... 16
Hình 1.5. Nuôi cấy vi sinh vật trên môi trường đặc ...................................................... 17
Hình 3.1. Kết quả nhuộm gram của Bacillus subtilis .................................................... 41
Hình 3.2.1. Khuẩn lạc của Bacillus subtillis trên môi trường NA ................................. 41
Hình 3.2.2. Kết quả của quá trình tăng sinh Bacillus subtillis ....................................... 42
Hình 3.3. Môi trường lên men rắn và lỏng .................................................................... 43
Hình 3.4. Môi trường lỏng sau lên men ........................................................................ 48
vii


Hình 3.5. Môi trường tối ưu R1 với 4 độ ẩm khác nhau................................................ 48
Hình 3.6.1. Môi trường rắn sau khi sấy ........................................................................ 52
Hình 3.6.2. Môi trường lỏng sau lên men ..................................................................... 53
Hình 3.6.3. Đóng gói chế phẩm .................................................................................... 53

DANH SÁCH CÁC BẢNG
Bảng 1.1. Một số chế phẩm enzyme sản xuất từ Bacillus .................................................. 5
Bảng 1.2. Một số loại kháng sinh sản xuất từ Bacillus ...................................................... 6
Bảng 3.3.1. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của môi trường lên men rắn đến khả năng sinh
tổng hợp enzyme Mannanase của chủng Bacillus subtilis ............................................... 43
Bảng 3.3.2. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của môi trường lên men lỏng đến khả năng sinh
tổng hợp enzyme Mannanase của chủng Bacillus subtilis ............................................... 45
Bảng 3.4. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của thời gian lên men đến khả năng sinh tổng hợp

enzyme Mannanase trong môi trường L1 của chủng Bacillus subtilis ............................. 46
Bảng 3.5. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của thời gian lên men và độ ẩm môi trường rắn
đến khả năng sinh tổng hợp enzyme Mannanase từ Bacillus subtilis ............................... 49
Bảng 3.7. Kết quả kiểm tra an toàn sinh học của chế phẩm............................................. 54
Bảng 3.8. Kết quả khảo sát nhiệt độ bảo quản và thời gian bảo quản ảnh hưởng đến độ
bền enzyme Mannanase .................................................................................................. 55

viii


DANH SÁCH CÁC ĐỒ THỊ
Đồ thị 3.3.1. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của môi trường lên men rắn đến khả năng sinh
enzyme Mannanase từ Bacillus subtilis ........................................................................... 44
Đồ thị 3.3.2 . Kết quả khảo sát ảnh hưởng của môi trường lên men lỏng đến khả năng
sinh enzyme Mannanase từ Bacillus subtilis ................................................................... 45
Đồ thị 3.4. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của thời gian lên men đến khả năng sinh enzyme
Mannanase trong môi trường L1 từ Bacillus subtilis ...................................................... 47
Đồ thị 3.5. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của thời gian lên men và độ ẩm môi trường rắn
đến khả năng sinh enzyme Mannanase từ Bacillus subtilis .............................................. 50
Đồ thị 3.8.1 Kết quả khảo sát ảnh hưởng của thời gian và nhiệt độ bảo quản
của chế phẩm rắn .......................................................................................................... 56
Đồ thị 3.8.2 Kết quả khảo sát ảnh hưởng của thời gian và nhiệt độ bảo quản
của chế phẩm lỏng ......................................................................................................... 56

ix


GIỚI THIỆU

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP

GIỚI THIỆU
 Đặt vấn đề
Theo dự ước của cơ quan chuyên môn, trong 6 tháng đầu năm 2009, sản lượng thức
ăn chăn nuôi đạt 4.55 triệu tấn so với cùng kỳ năm trước tăng 12% (4.2 triệu tấn). Giá
thức ăn chăn nuôi tăng 5-8% so với cuối năm 2008 và quý I/ 2009, tuỳ từng loại thức ăn
và từng vùng.
Để giảm giá thức ăn hỗn hợp, người ta thường trộn các nguyên liệu rẻ tiền như khô
cọ, khô dừa, vỏ đậu nành... Các nguyên liệu này lại giàu -Mannan và một số chất thuộc
nhóm polysaccharide không phải tinh bột gây cản trở sự tiêu hoá thức ăn, ngăn trở chất
dinh dưỡng hấp thụ qua niêm mạc ruột. Vấn đề đặt ra là làm sao để loại bỏ yếu tố kháng
dinh dưỡng này?
Chế phẩm -Mannanase là enzyme phân giải -Mannan. Khi đưa vào hỗn hợp thức
ăn chứa nguyên liệu giàu -Mannan, enzyme này có tác dụng phân cắt -Mannan, làm
giảm độ nhớt dịch ruột, tạo điều kiện cho niêm mạc ruột hấp thu chất dinh dưỡng được dễ
dàng. Bên cạnh đó, -Mannan bị phân cắt thành những đoạn ngắn hơn là những mannose
oligosaccharide, chúng giữ vai trò là các prebiotic, có tác dụng loại bỏ vi khuẩn bệnh bám
dính thượng bì ruột, kích thích hệ miễn dịch ruột hoạt động, từ đó giúp tăng cường sức
khoẻ ruột, hạn chế rối loạn tiêu hoá.
Từ những nhận định trên, tôi thực hiện đề tài “KHẢO SÁT KHẢ NĂNG SINH
ENZYME MANNANASE CỦA VI KHUẨN Bacillus subtilis”.
Đề tài luận văn này là 1 phần trong đề tài nghiên cứu về chế phẩm đa enzyme của
Phòng Nghiên Cứu Dinh Dưỡng Chăn Nuôi thuộc Viện Khoa học Kỹ Thuật Nông Nghiệp
Miền Nam.
 Mục tiêu và phạm vi của đề tài
- Khảo sát môi trường, độ ẩm và thời gian thích hợp cho sự sinh tổng hợp enzyme
Mannanase ở Bacillus subtilis.

1

GIỚI THIỆU

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP

- Xác định được môi trường, độ ẩm, thời gian tối ưu cho sự sinh tổng hợp enzyme
Mannanase của vi khuẩn Bacillus subtilis.
- Đưa vào lên men thử nghiệm sản xuất chế phẩm enzyme Mannanase ở quy mô
phòng thí nghiệm.
 Ý nghĩa của đề tài
- Xác định được môi trường, độ ẩm, thời gian tối ưu cho sự sinh tổng hợp enzyme
Mannanase của chủng Bacillus subtilis.
- Sản xuất chế phẩm enzyme Mannanase ở quy mô phòng thí nghiệm.
- Nghiên cứu phục vụ cho ngành chăn nuôi, chế phẩm enzyme này giúp tăng tỷ lệ
hấp thụ thức ăn, giảm giá thành thức ăn chăn nuôi.

2


CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP

CHƯƠNG 1.

TỔNG QUAN TÀI LIỆU

3

CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1.

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP

Giới thiệu về chủng Bacillus subtilis [9],[12],[14],[17]
Họ Bacillaceae có những đặc điểm sau
Trực khuẩn (tế bào hình que), không tạo chuỗi, có nội bào tử với tế bào sinh dưỡng

bị khúc xạ ánh sáng mạnh hơn, khó nhuộm màu và bền hơn với nhiệt và các yếu tố phá
hủy khác. Bào tử có chứa acid dipicolinic (5-10% so với chất khô), được bao bọc bởi cấu
tạo glycan peptid và vỏ ngoài.
Phần lớn vi khuẩn họ này là gram (+), chuyển động nhờ tiêm mao vị trí bên cạnh
hay xung quanh. Hiếu khí hay yếm khí tùy nghi. Thường tạo các trực khuẩn thẳng hoặc
hầu như thẳng, 0.3 - 2.2 x 1.2 x 7 µm, phần lớn di động tạo nội bào tử bền nhiệt trong mỗi
tế bào. Dị dưỡng cần carbon hữu cơ, trao đổi chất thuộc loại hô hấp tuyệt đối, lên men
tuyệt đối, vừa hô hấp vừa lên men sử dụng các chất hữu cơ lên men khác nhau. Nhân tố
cuối cùng tách điện tử trao đổi chất hô hấp là oxy phân tử ở một số chủng được thay
nitrat. Lượng G+X trong ADN của các dòng được nghiên cứu từ 32-62 mol %.
Lợi ích của Bacillus :
-

Tạo ra các loại chuyển hóa chất azốt và chất không chứa azốt giúp cải tạo đất.

-

Phân giải protid động vật, thực vật trong đất và nước rất mạnh (Bacillus mycoides,
Bacillus mesentericus, Bacillus subtilis).

-

Sản xuất protein vi sinh vật từ dầu mỏ và khí đốt : có nhiều vi sinh vật sống ở các
mỏ dầu, khí đốt, ở đáy các bể chứa dầu, trên mặt đất, và trên mặt đường nhựa,
trong đó có Bacillus. Các loại vi sinh vật này có khả năng oxy hóa hydrocarbon rất
cao. Trong dầu mỏ, parafin chiếm 20%, đây là nguyên liệu vạn năng để nuôi cấy vi
sinh vật, và nguồn nguyên liệu này rất phong phú và lại rẻ tiền.

-

Sản xuất các chế phẩm enzyme từ vi sinh vật.

4


CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP

Bảng 1.1. Một số chế phẩm enzyme sản xuất từ Bacillus
Vi sinh vật
Bacillus amylolique facieus

Loại enzyme
-Amylase
Amylase chịu nhiệt

Bacillus diastaticus

-Amylase, proteinaza

Bacillus stearothermophilus

-Amylase, proteinaza

Bacillus subtilis

Proteinaza

Bacillus allalophilus

Proteinaza

Bacillus thermoproteolyticus

Proteinaza

Bacillus mesentericus

Proteinaza

-

Sinh tổng hợp acid amin từ vi sinh vật.

-

Bacillus có thể tổng hợp các loại acid amin sau : Alanin, acid glutamic, acid
aspartic, Valin, xitrulin, metionin, phenylalanin, tirozin, treonin, izolenin,
tryptophan, lizin.

-

Sinh ra kháng sinh.

5


CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP

Bảng 1.2. Một số loại kháng sinh sản xuất từ Bacillus
Vi sinh vật

-

Loại enzyme

Bacillus subtilis

Bacilizin, micobaxilin, subtilin

Bacillus pumilis

Bacilizin, micobaxilin, subtilin

Bacillus licheniformis

Bacilizin, protixin

Bacillus megatenium

Bacilizin

Làm chế phẩm diệt côn trùng. Ví dụ : Bacillus thuringiensis ở nhiều dạng thương
phẩm khác nhau ở các nước. Ngoài ra, còn sử dụng một số loài khác : Bacillus
morila (Nhật); Bacillus cereus var gallerriaen (Tiệp, Trung Quốc); Cereus var
Juroi (Nhật); Etimorbus ( Mỹ); Entomocidus (Tiệp); Popilliae (Mỹ).
Tác hại của Bacillus :

-

Bacillus anthracis : gây bệnh than ở người (bệnh nhiệt thán).

-

Bacillus cereus : gây tiêu chảy và nôn mửa.

-

Làm hư hỏng nhẹ các loại thực phẩm.

-

Bacillus stearothermopkilis : làm chua các loại rau đóng hộp : ngô, đậu ve, đậu Hà
Lan.

-

Bacillus coagulans : làm chua cà chua đóng hộp.

-

Bacillus : làm nhũn, đen, nhớt đối với rau ngâm giấm.

-

Bacillus licheniformis : làm có ga mứt chuối nghiền.

-

Bacillus subtillis, Bacillus mesentericus, Bacillus megatherium : gây thối rữa thịt
cá, lên men chua.

6


CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP

Chủng đại diện là Bacillus subtilis (Ihrenberg) có một số đặc điểm sau
1.1.1.

Vị trí phân loại
Giới : Bacteria
Ngành : Firmicutes
Lớp : Bacilli
Bộ : Bacillales

Họ : Bacillaceae
Giống : Bacillus
Loài : Bacillus subtillis

1.1.2.

Hình 1.1. Vi khuẩn Bacillus Subtilis

Nguồn gốc và sự phân bố

Bacillus subtilis có mặt hầu hết trong tự nhiên, có nhiều trong rơm rạ nên được gọi
là “trực khuẩn rơm cỏ”, chúng còn phân bố bề mặt các loại hạt, hoa quả, thực phẩm,
truyền thống như : mắm, tương, chao, mẻ...
1.1.3.
-

Đặc điểm hình thái

Là loài trực khuẩn gram (+), hiếu khí, hình que ngắn, các tế bào tồn tại riêng

lẻ hay dính lại với nhau thành chuỗi ngắn.
-

Khi còn non có khả năng di động nhờ tiêm mao, khi về già tiêm mao rụng

nên vi khuẩn mất khả năng di động trong môi trường.
-

Khi gặp điều kiện không thuận lợi của môi trường sống, tế bào sẽ hình thành

bào tử. Kích thước của bào tử không lớn hơn kích thước của tế bào.
-

Khuẩn lạc : mờ, có thể hiện nhiều nếp nhăn, màu kem hoặc nâu, khi phát

triển trong môi trường lỏng thì gắn liền nhau như một lớp màng mỏng và thường ở dạng
đơn bào.

7


CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1.4.

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP

Các yếu tố ảnh hưởng đến sự tồn tại , phát triển của chủng Bacillus

subtilis
Hầu hết là vi khuẩn hoại sinh. Mỗi loại vi khuẩn chỉ tạo ra một bào tử nhằm chống
lại nhiệt độ nóng, lạnh, tia phóng xạ, môi trường khô và chất tẩy uế. Bacillus còn có khả
năng sinh lý cho phép chúng sống trong những điều kiện pH, nhiệt độ và nồng độ muối
mà một vài tổ chức sống khác không thể tồn tại.
1.1.5.

Lợi ích của Bacillus subtilis

1.1.5.1.

Tạo kháng sinh

Từ Bacillus subtilis có thể thu được kháng sinh có ích đối với nhiều loại vi trùng
gây bệnh như : subtilin ( Humfeld và Feustel, 1943), eumycin (Johsnon và Burdon, 1946),
bacillin ( Foster và Woodruff, 1946), bacillomin ( shtikell và Poplavsski, 1995).
Ngoài subtilin từ dịch nuôi cấy Bacillus subtilis có thể thu được nhiều kháng sinh
khác nữa.
1.1.5.2.

Sinh tổng hợp enzyme

Từ Bacillus subtilis có thể sinh tổng hợp được nhiều enzyme: amylase, protease,
Mannanase...
1.1.6. Tác hại của Bacillus subtilis
Do có bào tử chịu nhiệt cao nên Bacillus subtilis có thể gây hư hỏng thực phẩm hộp.
Khi đó, đồ hộp có vị chua, thối, không tạo gas hoặc có thể tạo gas trong môi trường có
dạng đường.
Bacillus subtilis là thủ phạm gây hỏng các sản phẩm sữa, bánh ngọt, socola, kẹo có
nhân, nhất là sản phẩm nói trên khi bảo quản ở nhiệt độ nóng. Bacillus subtilis gây bệnh
chảy nhớt khoai tây và chảy nhớt bánh mì do Laurent phát hiện đầu năm 1885 nên cũng
từ đó nó có tên gọi là “ trực khuẩn khoai tây”.

8


CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.2.

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP

Giới thiệu về enzyme Mannanase [1], [2], [3], [7]
Nguồn thức ăn cung cấp năng lượng cho lợn và gia cầm chủ yếu là ngũ cốc

và phụ phẩm của ngũ cốc. Ngoài protein, lipid, chất dinh dưỡng cung cấp năng lượng
chủ yếu của ngũ cốc và phụ phẩm là carbohydrate.
Tổng carbohydrate thực vật bao gồm: polysaccharide không phải tinh bột (non
starch polysacharide: NSP), lignin và tinh bột.
Nhóm NSP bao gồm cellulose, non-cellulosic polymer và pectic polysaccharide.
Cellulose là một polymer cấu tạo bởi các đơn vị đường glucose, nối với nhau bởi dây nối
β-1,4 glucoside. Non-cellulosic polymer bao gồm các chất: arabinoxylans, β- glucan,
mannan, galactan,

xyloglucan. Pectic polysaccharide bao gồm các chất như

polygalacturonic acid, arabinan, galactan, arabinogalactan.

Nguồn: Ian Partridge,2004
Sơ đồ 1.1. Các chất thuộc nhóm NSP

9


CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP

Nguồn: Hemicell, Bayer Việtnam

Sơ đồ 1.2. β-mannase phá vỡ vách tế bào giúp enzyme nội sinh tiếp cận và
tiêu hóa chất dinh dưỡng

Mannanase ( EC 3.2.1.78) hay còn gọi là endo--1,4-Mannanase; 1.4--D-mannanmannanohydrolase) xúc tác thuỷ phân liên kết -1,4-mannozit của -1,4-mannan
glucomannan và galactomannan, chuyển các polyme dị thể khá phổ biến trong tự nhiên
này thành các mannooligosaccharides ( MOS) và một lượng nhỏ mannose.
Phân huỷ sinh học mannan là sự kết hợp hoạt động của nhiều loại enzyme trong đó
Mannanase thực hiện nhiệm vụ phân cắt mạch chính mannan thành các mannobiose,
mannotriose, và hỗn hợp các oligosaccharides. Các sản phẩm này sau đó lại được phân cắt
bởi -D-mannosidase, -D-glucosidase và acetylesterase.
 -D-mannosidase ( -D-mannosid mannohydrolase, EC 3.2.1.25) thuỷ phân
mannan, mannan dị thể và mannooligosaccharides giải phóng -D- mannose bắt đầu từ
đầu không khử.
 -glucosidase ( -D-glucosid glucohydrolase, EC 3.2.1.21) phân cắt liên kết D-glucosid của cellobiose và cellooligosaccharides bắt đầu từ đầu không khử giải phóng
-D-glucose. Trong nhiều trường hợp, oligosaccharide chứa mannose và glucose ( sản
phẩm thuỷ phân bằng -Mannanase) là cơ chất tốt nhất cho -D-glucosidase.
10


CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP

 -galactosidase ( -D- galactosid galactohydrolase, EC 3.2.1.22), xúc tác thuỷ
phân liên kết galactosid có trong các oligosaccharide chứa galactose cũng như các
polysaccharide phức tạp khác như galactomannan hay galactoglucomannan. Khả năng
thuỷ phân giải phóng galactose từ oligosaccharides khác nhau phụ thuộc nguồn gốc galactosidase.
 Acetylesterase ( acetylgalactoglucomannanesterase) thuỷ phân liên kết ester giải
phóng acid acetic từ acetyl galactoglucomannan.
 Mannanase (endo--1,4-Mannanase; 1.4--D-mannan-mannanohydrolase, EC
3.2.1.78) phân cắt liên kết -1,4-mannozit trong mạch mannan thành mannobiose,
mannotriose . Cơ chế tác dụng của Mannanase được minh hoạ trên hình 1.1

Hình 1.2. Cơ chế tác dụng của Mannanase.

11


CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP

Nguồn: Hemicell, Behn Meyer
Sơ đồ 1.3. Beta-manannase của Hemicell chia nhỏ polymer beta-mannan thành
những phân đoạn MOS ( Mannose Oligossacharide)
1.2.1.

Cấu tạo của enzyme Mannanase

Mannanase của vi khuẩn ưu nhiệt Thermotoga neapolitana 5068 là enzyme một cấu
tử. Mannanase của vi khuẩn Pseudomonas cellulose bao gồm 385 acid amin. Cấu tạo
không gian của Mannanase được chia thành 3 vùng : vùng A từ prolin 44 đến isoleucin
323, vùng B từ leucin 32 đến trytophan 360 và vùng C từ Threonin 392 đến Threonin 419.
Các chuỗi Arg 39 – Lys 43, Arg 324 – Gly 331, Arg 361 – Thr 361 và Leu 420 – Lys 423
có chức năng nối các vùng trên với nhau. Toàn bộ phân tử Mannanase cấu tạo bởi 8 chuỗi
xoắn  và 8 chuỗi xoắn .

12


CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP

Hình 1.3. Cấu trúc không gian (A) và tâm hoạt động (B) của Mannanase 26A
Pseudomonase cellulose
Mannanase của Tricoderma reesei bao gồm 344 acid amin tạo thành 16 chuỗi  và
14 chuỗi  ngắn với 4 cầu disulfit : Cys26 và Cys29 nằm trên chuỗi xoắn 1, Cys 172 và
Cys 175 nằm dọc theo cuộn xoắn 10-7, Cys 265 và Cys 272 nối 11 và cuộn xoắn
11- 13, Cys 284 và Cys 334 nối 11 và cuộn xoắn 11- 13, Cys 284 và Cys 334 nối
12 và 13. Tâm hoạt động của Mannanase từ Tricoderma reesei nằm trong một hốc của
phân tử enzyme và enzyme có ít nhất năm miền tiếp xúc với cơ chất, mỗi miền sẽ gắn với
một đơn vị monomer của chuỗi polysaccharides trong quá trình xúc tác phản ứng. Glu169
và Glu276 nằm trên rãnh dọc theo bề mặt enzyme có vai trò quan trọng trong quá trình
xúc tác.
Tâm hoạt động của Mannanase 26A Pseudomonas cellulose được hình thành từ sự
kết hợp của các nhóm chức của các acid amin nằm ở các chuỗi  là 4, 5, 7 và 8. Đó
là Glu212 và Glu320 lần lượt ở cuối chuỗi 4 và cuối chuỗi 7, His211 và Arg208 trên
chuỗi 4, Asp283, Tyr285 trên chuỗi 5 và Trp360 trên chuỗi 8. Các acid amin này liên
kết với nhau theo liên kết hydro. Glutamic 212 liên kết với Aspartic 283 qua các nhóm
cacboxyl. Nhóm cacboxyl của Glutamic 320 liên kết với nhóm hydroxyl của Tyrosine
285, và nhóm amin của Arginine 208. Trytophan 360 cùng liên kết với Glutamic 320.

13


CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.2.2.

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP

Tính chất của enzyme Mannanase

Mannanase có nguồn gốc khác nhau có đặc tính khác nhau. Nhìn chung, Mannanse
có pH tối ưu tại vùng acid yếu hoặc trung tính. Nhiệt độ tối ưu khá cao, độ bền nhiệt tốt.
Mannanase có kích thước lớn so với xylanase ( trọng lượng phân tử 30-90kDa) và có
điểm đẳng điện trong môi trường acid. Sản phẩm thuỷ phân chủ yếu từ galactomannan và
glucomannan là mannobiose, mannotriose và nhiều loại oligosaccharides hỗn tạp. Hiệu
suất thuỷ phân phụ thuộc vào mức độ thế và sự phân bố của nhóm thế. Tỷ lệ các đơn vị
mắt xích glucose/mannose cũng ảnh hưởng tới quá trình thuỷ phân glucomannan. Một số
Mannanase vừa xúc tác thuỷ phân liên kết 1,4--glycosit giữa các mắt xích đơn vị
mannose vừa làm đứt liên kết giữa mắt xích glucose và mannose.
1.2.3.

Nguồn thu nhận enzyme Mannanase

Nguồn thu Mannanase rất phong phú như :
- Ở động vật : vẹm xanh (Mytilus edulis), sò biển (Littorina brevicula), ốc sên
(Helix lucorum)...
- Ở thực vật : bã cơm dừa, cà chua, cà độc dược, chà là, thuốc lá....
- Hiện nay, nguồn thu Mannanase dồi dào và đang được quan tâm nghiên cứu là từ
các vi sinh vật. Nhiều công trình nghiên cứu cho kết luận rằng cả vi khuẩn, nấm men, nấm
mốc đều có khả năng sinh tổng hợp Mannanase.
- Các chủng vi khuẩn có khả năng tổng hợp Mannanase là : Aeromonas, Bacillus,
Cellulomannan,

Enterococcus,

Casseliflavus,

Pseudomonas,

Streptomyces...

EndoMannanase của vi khuẩn thường được tiết ra ngoài tế bào. Song ở một số loài vi
khuẩn như Sporocytophaga myxococoides, Aerobacter mannanolyticus và Xanthomonas
campestris cũng tồn tại endo Mannanase nội bào hoặc gắn kết với màng tế bào.
- Các chủng nấm mốc gồm : Aspergillus niger, Aspergillus awamori, Fomes
cennosus, Penicillin, Sclerotium, Trichoderma.

14


CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP

- Các chủng xạ khuẩn Streptomyces.
- Chủng nấm men : Talacromyce.
- Một số loài nấm lớn : Tyromyces palustris, Polyporus versicolor và T.terrestris,
Agaricus bisporus, A.aculeatus, Lycopersicon esculentum,...
Tuỳ thuộc vào nhiều yếu tố : thành phần môi trường nuôi cấy, nhiệt độ, pH và
chủng vi sinh vật mà hoạt độ Mannanase thu được là khác nhau. Nhìn chung, vận tốc sinh
tổng hợp Mannanase từ vi khuẩn cao hơn từ nấm mốc. Song đa phần các công trình
nghiên cứu đều cho kết quả là hoạt độ của Mannanase thu được từ nấm mốc cao hơn rất
nhiều so với hoạt độ của Mannanase thu được từ vi khuẩn.Với nồng độ Mannanase cao
trong canh trường nấm mốc sẽ tạo điều kiện thuận lợi và giảm chi phí trong quá trình thu
nhận và làm sạch enzyme.
1.2.4 Các phương pháp thu nhận enzyme Mannanase hiện nay [6], [8],[11]

Về nguyên tắc, có hai phương pháp nuôi cấy vi sinh vật để thu enzyme : phương
pháp nuôi cấy bề mặt và phương pháp nuôi cấy bề sâu hay phương pháp nổi và phương

pháp chìm.
1.2.4.1. Phương pháp nuôi cấy bề mặt

Trong phương pháp nuôi cấy bề mặt người ta sử dụng môi trường lỏng hoặc môi
trường đặc.
(a) Môi trường lỏng
Ở môi trường lỏng, vi sinh vật sẽ phát triển trên bề mặt môi trường, tạo thành khuẩn
lạc ngăn cách pha lỏng (môi trường) và pha khí (không khí). Enzyme ngoại bào sẽ được
tách ra từ sinh khối và hoà lại vào dung dịch môi trường. Enzyme nội bào sẽ nằm trong
sinh khối vi sinh vật.

15


CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP

Sinh khối vi sinh vật
Không khí

Không khí

........................................................
. . . . . . . . . . . . . . . . . . Dung dịch môi trường . . . . . . . . . . . . . .
. . . . . . . . ... . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
.......

Enzyme
ngoại bào

Hình 1.4. Nuôi cấy bề mặt trên môi trường lỏng trong các khay
Phương pháp này thường được tiến hành trong các khay có chiều cao khoảng 12-15
cm, chiều rộng và chiều dài được thiết kế tuỳ theo kích thước phòng nuôi sao cho thuận
tiện trong thao tác.
Ở đây, người ta quan tâm nhiều đến chiều cao môi trường lỏng. Nếu chiều cao môi
trường lỏng quá lớn, vi sinh vật sẽ không có khả năng đồng hoá hết các chất dinh dưỡng ở
phía đáy khay nuôi cấy. Nếu chiều cao môi trường lỏng quá thấp thì sẽ thiếu thành phần
chất dinh dưỡng, hiệu suất thu nhận enzyme không cao.
(b) Môi trường đặc
Phần lớn các nhà máy sản xuất enzyme, khi nuôi cấy vi sinh vật thu nhận enzyme,
người ta thường sử dụng môi trường đặc. Người ta cho vi sinh vật phát triển và bao phủ
trên bề mặt các hạt chất dinh dưỡng rắn, đã được làm ẩm, dùng làm môi trường (cám gạo,
cám mì,...). Đối với một số mục đích đặc biệt, người ta nuôi vi sinh vật trực tiếp trên bề
mặt của hạt gạo, hạt đậu,... đã được hấp chín. Nói chung trong tất cả mọi trường hợp, vi
sinh vật lấy thức ăn từ những chất chứa trong môi trường và sử dụng oxy phân tử để hô
hấp. Môi trường để nuôi cấy nấm mốc và một số vi khuẩn bằng phương pháp bề mặt
thường dùng là cám mì, cám gạo,... vì trong này có chứa nhiều chất dinh dưỡng nhưng
chủ yếu là tạo cho môi trường có được cấu trúc cần thiết ở trong trạng thái ẩm. Để tăng
hoạt độ của enzyme, người ta còn thêm vào cám những vật liệu có chứa những chất cảm
ứng cần thiết. Muốn cho cấu trúc của môi trường được tốt hơn, người ta có thể cho thêm
trấu, mùn cưa,... nhất là khi dùng cám mịn làm môi trường. Thông thường những phụ liệu
này sẽ làm nghèo môi trường đi, do đó nếu thêm vào nhiều hơn 15-20% thì sẽ làm giảm
hoạt độ của các enzyme thuỷ phân trong canh trường bề mặt. Nếu trường hợp lượng chất
16


CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP

dinh dưỡng trong môi trường bị giảm đi do thêm các phụ liệu thì có thể bổ sung thêm
nguồn nitơ vô cơ, phospho cũng như các vật liệu giàu chất hữu cơ quý như malt, nước
chiết ngô, dịch khoai tây,...
Thông thường người ta thường tạo độ ẩm khoảng 55-65% là hợp lý.
Không khí

Sinh khối vi sinh vật
Hạt môi trường

........................................................
..................
Môi trường đặc . . . . . . . . . . . . . .
. . . . . . . . ... . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
.......

vi sinh vật
phát triển
bề mặt hạt môi trường

Hạt
môi trường

Hình 1.5. Nuôi cấy vi sinh vật trên môi trường đặc
Ưu điểm của phương pháp nuôi cấy bề mặt là dễ thực hiện và khi bị nhiễm vi sinh
vật lạ ta rất dễ dàng xử lý.
(c)

Các yếu tố ảnh hưởng đến việc tạo ra enzyme khi nuôi cấy bằng

phương pháp bề mặt
Tính chất lý hoá của cám, cấu trúc của môi trường cũng có một ý nghĩa nhất định.
Hàm lượng tinh bột trong cám bị giảm đi thì hoạt độ của enzyme cũng bị giảm.
Hàm ẩm của môi trường cũng có một ý nghĩa rất quan trọng. Hàm ẩm tối ưu cho
môi trường cám là 58-60%.
Việc tăng nhiệt độ lên do hô hấp trong thời kỳ phát triển mạnh mẽ cũng có ảnh
hưởng đến vi sinh vật.
1.2.4.2. Phương pháp nuôi cấy bề sâu

Khác với phương pháp nuôi cấy bề mặt, trong phương pháp nuôi cấy bề sâu người
ta cho vi sinh vật phát triển trong môi trường lỏng.

17