Bài tiểu luận Ứng dụng của Emzym Lipase trong sản xuất bột giặt

BỘ CÔNG THƯƠNG

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP THỰC PHẨM TP. HCM
KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC VÀ KỸ THUẬT MÔI TRƯỜNG

 oOo 

Đề tài:

ỨNG DỤNG CỦA EMZYM LIPASE TRONG
SẢN XUẤT BỘT GIẶT.
BÀI TIỂU LUẬN NHÓM
Môn: Công nghệ emzym.

Giảng viên hướng dẫn: Ths. Đỗ Thị Hiền

TP.HCM, Tháng 2 năm 2016


BỘ CÔNG THƯƠNG

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP THỰC PHẨM TP. HCM
KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC VÀ KỸ THUẬT MÔI TRƯỜNG

 oOo 

Đề tài:

ỨNG DỤNG CỦA EMZYM LIPASE TRONG
SẢN XUẤT BỘT GIẶT.
BÀI TIỂU LUẬN NHÓM

Môn: Công nghệ emzym.

Giảng viên hướng dẫn: Ths. Đỗ Thị Hiền.
Nhóm sinh viên thực hiện:
1. Huỳnh Ngọc Quang
2. Bùi Văn Sự
3. Hà Nguyễn Thanh Nguyên
4. Trần Minh Quan

3008140018
3008140170
3008140486
3008140207

TP.HCM, Tháng 2 năm 2016


LỜI CẢM ƠN
Chúng tôi xin trân thành cảm ơn Ths. Đỗ Thị Hiền đã tận tình chỉ bảo, hướng
dẫn và giúp đỡ chúng tôi trong suốt thời gian học tập. Một lần nữa nhóm chúng tôi xin
trân thành cảm ơn cô.
Mặc dù bài tiểu luận đã hoàn thành nhưng khó tránh những sai sót. Mong rằng sẽ
nhận được đóng góp ý kiến của thầy cô và các bạn để bài tiểu luận hoàn thiện hơn. Từ
đó, chúng tôi sẽ có thêm nhiều kinh nghiệm để thực hiện những bài tiều luận tiếp theo
cũng như đồ án sau này và nghề nghiệp tương lai.
Sau cùng chúng tôi xin chúc Ths. Đỗ Thị Hiền và toàn thể các thầy cô trong
Khoa thật dồi dào sức khỏe, niềm vui để tiếp tục thực hiện sứ mệnh cao đẹp của mình
là truyền đạt kiến thức của mình cho thế hệ mai sau.

Trân trọng cảm ơn!

NHỮNG NGƯỜI THỰC HIỆN

3


LỜI CAM ĐOAN
Chúng tôi những người thực hiện bài tiểu luận này xin cam đoan:
Bài tiểu luận do các thành viên trong nhóm cùng chung tay làm việc, có sự phân
công rõ ràng và công bằng giữa các thành viên trong nhóm. Đồng thời, không sao chép
bất cứ bài tiểu luận của bất kì ai. Các nội dung trong đây đã được tham khảo kỉ lưỡng
trước khi đưa vào bài tiều luận. Chúng tôi sẽ chịu hoàn toàn trách nhiệm trước cô và
Khoa về những cam đoan này.

TP.HCM, ngày 29 tháng 2 năm 2016
NHỮNG NGƯỜI THỰC HIỆN

4


DANH MỤC CÁC BẢNG
STT
1
2
3
4

Tên bảng
Bảng 1.1: So sánh giữa chất xúc tác hữu cơ (E) và chất
xúc tác vô cơ.
Bảng 1.2: Phân loại emzym theo cơ chế phản ứng.

Bảng 3.1: Kết quả chọn lọc sơ bộ bằng tributyrin 0,1% và
rhodamine B 0,001%
Bảng 5.1: Một số loại E được sử dụng trong nghành tẩy
rửa.

5

Số trang
2
4
10
22


DANH MỤC CÁC SƠ ĐỒ VÀ HÌNH ẢNH
STT
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14

15
16
17
18
19
20
21
22

Tên hình ảnh
Hình 1.1: Hình E. Pyruvate decarboxylase (bên trái) và E.
Monooxygenase (bên phải)
Hình 1.2: Mô hình cấu trúc một E
Hình 1.3: Mô hình của Fischer (hình a) và Koshland (hình
b) .
Hình 2.1: Lipase ở tuyến tụy của lợn (hình bên trái) và lipase
của vi khuẩn Candida albicans (hình bên phải)
Hình 2.2: Một số sản phẩm từ lipase
Hình 2.3: Trình tự acid amin của lipase thu được từ nấm
men Candida rugosa
Hình 2.4: Cấu trúc không gian của nấm men Candida rugosa.
Hình 3.1: Hoạt tính lipase của 7 chủng Bacillus
Hình 3.2: Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy lên khả năng
sinh tổng hợp lipase.
Hình 3.3: Ảnh hưởng pH lên khả năng sinh tổng hợp lipase
Hình 3.4: Ảnh hưởng của nồng độ cơ chất lên khả năng sinh
tổng hợp lipase
Hình 3.5: Ảnh hưởng của ion và chất tẩy rửa khác lên hoạt
tính chế phẩm lipase
Hình 3.6: Ảnh hưởng của pH đến hoạt tính chế phẩm lipase

(: đệm Tris –Cl; : đệm carbonate)
Hình 3.7: Ảnh hưởng của pH đến độ bền của chế phẩm lipase
(T: đệm Tris –Cl; C: đệm carbonate).
Hình 3.8: Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt tính chế phẩm
lipase
Hình 3.9: Sắc ký đồ biểu diễn các phân đoạn lọc gel Sephadex
G – 75.
Hình 3.10: Diễn biến quá trình dịch mã tạo chuổi polypeptid.
Hình 3.11 : Qúa trình thủy phân Tryacyglyxerol
Hình 3.12: Cơ chế phản ứng của lipase theo 5 giai đoạn.
Hình 3.13: Các chất tẩy rữa từ lipase
Hình 4.1: Hoạt độ của lipase từ Baccilus đặc hiệu cho từng cơ
chất.
Hình 4.2: Ảnh hưởng của nhiệt độ và thời gian ủ đến hoạt
tính của E.

6

Số
trang
2
4
5
6
8
9
9
10
11
11

12
12
13
13
14
15
16
17
18
19
20
20


23

Hình 4.3: Ảnh hưởng của pH đến hoạt tính của E

7

21


MỤC LỤC


LỜI MỞ ĐẦU
Emzym là chất xúc tác sinh học không chỉ có ý nghĩa trong quá trình sinh trưởng,
sinh sản của mọi sinh vật mà nó còn đóng vai trò rất quan trọng trong công nghệ chế
biến thực phẩm, y dược, trong kỹ thuật phân tích, trong công nghệ gen, trong ngành

môi trường cùng như là trong nông nghiệp và nhiều ngành công nghiệp khác.
Việc nghiên cứu, ứng dụng và sản xuất các chế phẩm từ emzym được phát triển
rất mạnh từ đầu thế kỉ XX đến nay. Việt Nam là một trong những nước có rất nhiều
nghiên cứu và ứng dụng của emzym vào trong thực tiển đời sống. Tuy nhiên, nền công
nghiệp emzym của chúng ta chưa thật sự phát triển các chế phẩm, công nghệ sản xuất
đa phân đều nhập khẩu hoặc nhận chuyển giao công nghệ từ các nước.
Bài báo có này trình bày một trong những ứng dụng của công nghệ emzym trong
sản xuất công nghiệp. Đó là nghành công nghiệp sản xuất chất tẩy rữa một trong lĩnh
vực mà nền công nghiệp Việt Nam chưa đáp ứng được. Emzym được ứng dụng trong
lĩnh vực này đa phần là các emzym thủy phân như protedase, xellulase, lipase,…Do
điều kiện hạn chế nhóm chỉ chọn một loại emzym nhất định để tìm hiểu đó là Emzym
Lipase. Chính vì lẽ đó mà đề tài của nhóm là “Ứng dụng của emzym Lipase trong
công nghiệp sản xuất bột giặt hay chất tẩy rữa”
Nội dung bài luận này được chia làm 5 phần cụ thể như sau:

 Phần I: Giới thiệu về emzym. Ở phần này chúng tôi sẽ trình bày khái quát một
số đặc điểm liên quan tới Enzym.

 Phần II: Emzym Lipase. Phần này nhóm chúng tôi sẽ tìm hiểu sơ nét về một số
đặc trưng của emzym Lipase.
 Phần III: Emzym Lipase trong sản xuất công nghiệp. Phần này sẽ đi vào tìm
hiểu quá trình sản xuất, khảo sát một số các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính của
Emzym,…
 Phần IV: Các thông số của Emzym. Tìm hiểu các thông số ảnh hưởng đến hoạt
động của emzym.
 Phần cuối: Phần kết luận.
Biển học là vô bờ, do đó còn nhiều điều còn chưa đề cập đến hay còn sai sót chắc
chắn là không thể tránh khỏi. Rất mong nhận được sự đóng góp từ Ths. Đỗ Thị Hiền
cũng như các thầy cô trong Khoa, để các bài báo cáo, luận sau này có thể hoàn thiện
hơn tránh những sai lầm không đáng có.

Cuối cùng, xin chúc Ths. Đỗ Thị Hiền và quý thầy cô thật dồi dào sức khỏe và
luôn thành công trong công việc.
Xin trân thành cảm ơn !
NHỮNG NGƯỜI THỰC HIỆN

9


I. Giới thiệu về emzym
1.1 Emzym.
1.1.1 Khái niệm.
Enzym (E) là một chất xúc tác sinh học nó là những sản phẩm của sinh vật, do tế
bào sản xuất ra với những lượng nhỏ, có tác dụng làm tăng nhanh các phản ứng hóa
sinh và khi kết thúc phản ứng E vẫn không thay đổi so với trạng thái ban đầu. Bản
thân nó không tham gia phản ứng nhưng giúp tăng tốc độ của phản ứng bằng cách làm
giảm mức năng lượng hoạt hóa cần thiết.
Enzym là một phân tử rất lớn với hàng trăm axit amin, nhưng chỉ có một số thành
phần nhỏ trong nó có chức năng xúc tác cho các phản ứng sinh hóa.

Hình 1.1: Hình E. Pyruvate decarboxylase (bên trái) và E. Monooxygenase
(bên phải)
Enzym có khả năng xúc tác nó có khả năng làm tăng tốc độ phản ứng hàng triệu
lần.
Emzym có tính đặc hiệu cao nghĩa là mỗi E sẽ xúc tác một phản ứng nhất định có
cơ chất tương ứng nhất định. Ví dụ saccrase chỉ thủy phân saccrose,…
Dưới đây là bảng so sánh giữa chất xúc tác hữu cơ (E) và chất xúc tác vô cơ.
Bảng 1.1: So sánh giữa chất xúc tác hữu cơ (E) và chất xúc tác vô cơ.
Đặc điểm
Bản chất hóa học
Tốc độ phản ứng

Các điều kiện:
• Nhiệt độ thích hợp

Chất xúc tác vô cơ
Phân tử nhỏ gồm một vài
nguyên tố (Pt, HCl,..)
102 – 106 lần

• Cao ( 1000 oC )
10

Chất xúc tác hữu cơ
Đại phân tử protein
106 – 1011 lần

• Thấp ( 36- 45 oC)


• pH thích hợp
• Áp suất

• Acid hoặc kiềm mạnh
• Cao ( vài amotphe)

Thay đổi cấu trúc
Tính đặc hiệu

Không
Thấp ( thí dụ thủy phân
glucosid, peptid,…)

• pH sinh lí 7.4
• Áp suất khí quyển
Có thay đổi nhưng trở lại
cấu trúc ban đầu sau không
kết thúc phản ứng.
Cao ( mỗi phản ứng cần
một emzym tương ứng).

1.1.2 Đặc điểm chung của Emzym
Tất cả các E đều có bản chất là protein. Enzym là một loại protein được sinh vật
tổng hợp nên, và tham gia vào các phản ứng sinh học. Tuy Enzym có thể nói nó là một
protein, nhưng không phải tất cả các protein đều là enzym mà chỉ những protein có
khả năng tham gia xúc tác vào phản ứng sinh hóa.
Enzym có những dạng cấu trúc sau:

•
•
•
•

Cấu trúc bậc I: Một chuổi polypeptid với khoảng 20 axit amin khác nhau.
Cấu trúc bậc II: Các chuỗi axit amin xoắn.
Cấu trúc bậc III: Các mạch axit amin xoắn và gấp khúc.
Cấu trúc bậc IV: Cấu trúc không gian ba chiều.

Theo điều kiện hoạt động người ta chia E thành hai loại:

•
•

E không cần cộng tố (cofactor): là nhóm các E có bản chất là protein như
amylase, trysin,…
E cần cộng tố gồm hai phần: Phần protein gọi là apoemzym và phần cộng tố có
bản chất khác protein. Apoemzym kết hợp với phần cộng tố tạo thành một E hoàn
chỉnh ( holoemzym) có hoạt tính xúc tác. Cộng tố thường là kim loại (Zn 2+, Mg2+,
…hay chất hữu cơ. Trường hợp cộng tố là chất hữu cơ thì ta gọi đó là Coemzym.
Apoemzym là protein nó quyết định tính đặc hiệu của E.

Hình 1.2: Mô hình cấu trúc một E

11


Hoạt tính của enzym phụ thuộc vào những điều kiện như độ pH, nhiệt độ, nồng
độ ion và nồng độ trong dung dịch. Mỗi loại enzym có các điều kiện hoạt động tối ưu
khác nhau.

1.1.3 Phân loại và danh pháp.
Dựa vào loại phản ứng mà emzym xúc tác mà người ta chia E thành 6 loại (theo
đúng trình tự từ 1- 6).
Bảng 1.2: Phân loại emzym theo cơ chế phản ứng.
Loại
emzym

Tên emzym.

1

Oxydoreductase

2

Transferase

3

Hydrolase

4

Lyase

5

Isomerase
Lygase ( bao gồm
Synthetase và
Synthase)

6

Cơ chế phản ứng
xúc tác.
Oxi hóa khử (cho
nhận điện tử
hydro và oxy
Chuyển nhóm
hóa học (amin,
glucosyl,…)

Thủy phân (cắt
liên kết este,
glucosid,…)
Phân cắt (không
có nước tham gia)
Đồng phân hóa
Tổng hợp

Phương trình phản ứng tổng
quát.
Ak + Box

Aox + Bk

AB + CD

AC + BD

R1R2 + HOH

R1H + R2OH

AB

A + B

A

B

A + B

AB

Trong 6 loại trên mỗi loại được chia làm nhiều nhóm; mỗi nhóm chia làm nhiều
phân nhóm; nhiều phân nhóm gồm nhiều emzym.
Việc gọi tên các E tuân theo nguyên tắc quốc tế được ghi như sau:
EC (Emzym committee) : Số thứ 1 (chỉ loại). Số thứ 2 (chỉ nhóm). Số thứ 3 (chỉ phân
nhóm). Số thứ 4(chỉ thứ tự của emzym trong nhóm).
Ví dụ: E. Lactat dehydrogenase : EC: 1.1.1.27
E. Creatin Kinase: EC: 2.7.3.2.

1.2 Trung tâm hoạt động của emzym.
Trung tâm hoạt động là một phận nhỏ của E là nơi kết hợp với cộng tố (nếu có)
và với cơ chất. Nó gồm những nhóm hóa học trực tiếp tham gia tạo thành hoặc cắt đứt
các liên kết của cơ chất. Trung tâm hoạt động của emzym gồm một số acid amin
thường là Ser, Try, Cys,…Những acid amin này thường ở vị trí khác nhau trong một
chuổi polypeptid thường ở vị trí xa nhau.

12


Trong quá trình phản ứng E kết hợp với cơ chất một cách đặc hiệu có sự ăn khớp
về mặt cấu trúc giữa trung tâm hoạt động của E và cơ chất .
Có hai thuyết về sự ăn khớp này:

 Mô hình “chìa khóa” và “ ổ khóa” của Fischer (cơ chất được ví như chìa khóa
và trung tâm hoạt động ví như ồ khóa).
 Mô hình cảm ứng của Koshland ( giữa cơ chất và trung tâm hoạt động không
phù hợp về mặt cấu trúc không gian khi cơ chất tiếp xúc với trung tâm hoạt

động thì trung tâm hoạt động cảm ứng và thay đổi phù hợp với cơ chất).

Hình 1.3: Mô hình của Fischer (hình a) và Koshland (hình b) .
Emzym nào cũng có trung tâm hoạt động , một số emzym có thể có hai trung tâm
hoạt động( ví dụ như alcol dehydrogennase,…)
Sử dụng enzyme trong các ngành công nghiệp, y dược, … đang là xu hướng
chung của cả thế giới. Việc sản xuất các chất tẩy rữa, bột giặt sinh học cũng không
nằm ngoài xu hướng đó. Các chất giặt rửa chứa enzym là ví dụ điển hình của những xu
hướng công nghệ mới trên ngưỡng cửa thế kỷ 21- đó là sự kết hợp giữa các ngành hóa
học và sinh học, mà kết quả là những sản phẩm được ứng dụng rộng rãi trên toàn thế
giới. Hiện nay bột giặt chứa enzym đang được sử dụng phổ biến. Nhờ enzym nên bột
giặt có tính năng giặt rửa cao hơn ở nhiệt độ thấp hơn và có thể bị phân hủy sinh học,
do đó giúp tiết kiệm năng lượng và góp phần đáng kể giảm ô nhiễm môi trường.
Một trong những E được ứng dụng trong lĩnh vực này không thể không nhắc đến
Lipase chính vì vậy khi nhóm được giao đề tài về “ Ứng dụng của Emzym trong
công nghiệp sản xuất bột giặt” nhóm đã không ngừng ngại chọn Lipase để tìm hiểu.

13


II. Emzym Lipase.
2.1 Giới thiệu.
2.1.1 Lipase.
Lipase (EC 3.1.1.3) thuộc nhóm phụ enzyme thủy phân có serine ở trung tâm
hoạt động của tổng họ thủy phân α/β, xúc tác cho nhiều phản ứng khác nhau: thủy
phân các liên kết carboxylester trong glyceride, chuyển ester hóa. Trong môi trường
khan nước lipase có khả năng ester hóa rượu, đường, thiol và amin tạo những ester có
cấu trúc lập thể đặc trưng. Ngoài ra, lipase hiện diện rộng rãi và tham gia vào sự
chuyển hóa sinh học của lipid trong tự nhiên.
Trong những năm gần đây, lipase giữ một vị trí quan trọng trên thị trường

enzyme thương mại do khả năng xúc tác các phản ứng bề mặt phân cách giữa pha
nước và các pha khác ở điều kiện bình thường và không tạo ra sản phẩm phụ. Lipase
chiếm 5% thị trường enzyme thương mại, chỉ sau protease và carbohydratase. Chúng
được sử dụng trong công nghiệp sản xuất chất tẩy rửa, thực phẩm, mỹ phẩm, y học,
nhiên liệu sinh học, xử lý môi trường và các chế phẩm sinh học khác.
Lipase có thể thu nhận từ nhiều nguồn khác nhau như:

• Động vật
• Thực vật
• Vi sinh vật

Hình 2.1: Lipase ở tuyến tụy của lợn (hình bên trái) và lipase của vi khuẩn
Candida albicans (hình bên phải)
Đặc hiệu vị trí:

• Những enzyme không đặc hiệu với vị trí hoặc cấu trúc gốc acyl trên mạch
triglyceride (C.rugosa).
• Xúc tác đặc hiệu vị trí 1,3 trên phân tử triacylglycerol (A.niger).

14


• Chỉ xúc tác đặc hiệu 1 số acid béo nhất định (Geotrichum candidum).
Đặc hiệu cơ chất: cơ chất có khả năng kết hợp vào trung tâm hoạt động của
enzyme và bị chuyển hóa dưới tác dụng của enzyme. (C.rugosa, A.niger, M.miehei …)

2.1.2 Các nguồn cung cấp Lipase.
Lipase được phân bố rộng rãi trong các loài vi sinh vật, động vật và cả ở thực vật.

 Ở người và động vật có xương sống, nhiều Lipase kiểm soát sự thủy phân, hấp

thụ, sự tạo thành chất béo và chuyển hóa lipoprotein. Lipase động vật chia làm 3
nhóm dựa trên vị trí và hoạt động của chúng: lipase thực phẩm, lipase mô và
lipase sữa.
 Ở thực vật, lipase được tìm thấy ở mô dự trữ của hạt dầu, hạt ngũ cốc trong qua
trình nảy mầm của hạt. Hầu hết các lipase không hoạt động trong thời kì ngủ
đông ( trừ hạt đậu caston).
 Lượng lớn lipase trong công nghiệp được sản xuất từ các loại vi sinh vật: vi
khuẩn, nấm móc, nấm men.
• Ở vi khuẩn: Sản xuất từ lipase ngoại bào của S. rimous R6554W (một vi
khuẩn Gram +) được tách từ dịch lọc canh trường bằng sắc kí cột. Ngoài ra,
người ta cũng tìm thấy lipase trong một số loại vi khuẩn khác như
Pseudomomas cepacia hay các chủng Baccilus.
• Nấm mốc: Lipase tìm thấy ở một số loải như Aspargillus, Rhizopus (tách từ
quả dừa), Rhizopus oryzae (phân lập từ dầu dừa),….
• Nấm men: Nấm men Candida rugose là một nguồn sản xuất lipase quan
trọng.

2.1.3 Ứng dụng.
Lipase được ứng dụng rộng rãi trong công nghiệp sản xuất bột giặt, tổng hợp các
chất hữu cơ, trong công nghiệp chế biến sữa sản xuất phomat, công nghiệp sản xuất
dược phẩm, mĩ phẩm và các nghành công nghiệp khác. Ngoài ra nó còn được ứng
dụng rộng rãi trong các hoạt động biến đổ sinh học trong quá trình thủy phân cũng như
là quá trình tổng hợp và kiểm soát được các bước trong công nghiệp giấy và bột giấy.

15


Hình 2.2: Một số sản phẩm từ lipase

 Trong công nghiệp sản xuất chất tẩy rữa: Ngày nay nó được ứng dụng để thủy







phân các vết dầu mỡ. Một lượng lipase ở dạng thương phẩm đã được sử dụng
trong nghành thuốc tẩy như: Lipase humicola của Novo Nordisk, lipolase hay
lipase P. glumace của Unilever. Những lipase làm bột giặt trong hộ gia đình giúp
giữ ồn định các protease và hoạt động có hiệu quả trong môi trường kiềm. (phần
này sẽ được nghiên cứu cụ thể ở phần III).
Trong công nghiệp thực phẩm: Sử dụng lipase dùng để cải biến các
triacyglycerol, nâng cao chất lượng các loại dầu thực vật rẻ tiền, chất lượng thấp
bằng cách thay thế các acid béo no bằng các acid béo không no trong dung môi
kị nước.
Trong công nghiệp dược và hóa chất: Sản xuất một số loại thuốc và dùng trực
tiếp để chữa một số loại bệnh. Trong nông nghiệp ứng dụng trong sản xuất các
loại thuốc trừ sâu, trừ cỏ,…
Trong công nghiệ thuộc da: Sử dụng lipase kết hợp với các E thủy phân khác để
loại bỏ lớp chất béo dưới da.
Trong công nghiệp mĩ phẩm: Dùng để sản xuất các chất hoạt động bề mặt và các
hỗn hợp chất thơm, xúc tác các phản ứng este hóa glyxerol trong việc điều chế
nước hoa,…

2.2 Cấu tạo.
2.2.1 Trình tự các acid amin.
Thành phần acid amin của lipase từ các nguồn khác nhau cũng khác nhau, nhưng
nhiều trình tự acid amin được suy ra từ trình tự của lipase tách dòng, từ đó cho thấy có
những điểm tương đồng với cấu trúc không gian của lipase.

Nói chung rất ít những trình tự giống nhau hoàn toàn, ngoại trừ những trình tự
quanh trung tâm hoạt động.

16


Hình 2.3: Trình tự acid amin của lipase thu được từ nấm men Candida rugosa.

2.2.2 Cấu trúc không gian.
Dùng phương pháp tia X đã phát hiện cấu trúc α/β. Liên kết β song song làm cầu
nối với cấu trúc xoắn ốc α để hình thành nên một cấu trúc phức tạp. Các cầu disunfua
được tìm thấy có lẽ nhằm làm ổn định cấu trúc gấp nếp của E.

Hình 2.4: Cấu trúc không gian của nấm men Candida rugosa.

17


Nhóm quan trọng nhất tạo thành trung tâm hoạt động của lipase là bộ ba acid
amin Asp…His…Ser. Trung tâm hoạt động của mội lipase đều có Asp, His và Ser hay
Glu và hoàn toàn bị che khuất bởi một chuổi hay hai chuổi xoắn.

III. Emzym Lipase trong đời sống.
Có nhiều nguồn sản xuất ra lipase có thể thu từ động vật, thực vật hay từ các loài
vi sinh vật. Theo nhiều tài liệu nhóm sẽ chọn vi khuẩn Bacillus làm đối tượng nghiên
cứu trong việc sản xuất lipase.

3.1 Nghiên cứu, khảo sát.
3.1.1 Quy trình tiến hành.
Chọn lọc chủng có khả năng sinh lipase cao: Chọn nhanh chủng sinh lipase cao

bằng so sánh vòng phân giải. Bằng phương pháp nuôi cấy trên đĩa thạch với cơ chất là
tributyrin 0,1% và phương pháp đục lỗ thạch có bổ sung chất phát huỳnh quang
rhodamine B 0,001% chọn được 7 chủng có vòng phân giải lớn là: B1, Ba1, BL1,
BL2, BST1, BST2, BS7.
Bảng 3.1: Kết quả chọn lọc sơ bộ bằng tributyrin 0,1% và rhodamine B 0,001%
Chủng

B1

Ba1

BL1 BL2

BL14
1
-

BST
1
+++

BST
2
+++

BS3 BS6

BS7

Trybutyrin +++ ++++ ++ +++

+
++++
Rhodamin
+
+
+
+
+
+
+
+
eB
Chú thích: “+” dương tính; “-“ âm tính; số lượng dấu “+” tỉ lệ với độ lớn vòng phân
giải.
Tiếp theo 7 chủng sẽ được nuôi cấy lỏng trong môi trường cảm ứng sinh lipase.
Hoạt tính lipase được xác định để chọn chủng có hoạt tính lipase cao nhất.

18


Hình 3.1: Hoạt tính lipase của 7 chủng Bacillus
Kết quả ở hình 1 cho thấy chủng Bacillus subtilis OII (BS7) sinh lipase cao nhất
là 1,8 UI/ml ở pH = 7,0; nồng độ cơ chất 1,2% sau 3 ngày nuôi cấy. Chế phẩm lipase
thu nhận được có pHopt 10,0; topt 60oC. [1]

3.1.2 Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình nuôi cấy
Khảo sát thời gian nuôi cấy chủng BS7: Nuôi cấy chủng BS7 trong môi trường
sinh tổng hợp lipase. Xác định hoạt tính sau 2, 3, 4, 5 ngày nuôi cấy.

Hình 3.2: Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy lên khả năng sinh tổng hợp lipase.

Qua Hình 3.2 nhận thấy, hoạt tính lipase tăng từ ngày thứ 2 cho đến ngày thứ 3
và đạt giá trị cao nhất ở 3 ngày nuôi cấy.
Khảo sát pH môi trường nuôi cấy chủng BS7: pH môi trường là một thông số
quan trọng có ảnh hưởng rất lớn đến hoạt động biến dưỡng của vi sinh vật.

Hình 3.3: Ảnh hưởng pH lên khả năng sinh tổng hợp lipase

19


Từ kết quả trong Hình 3.3 cho thấy BS7 có khả năng sinh tổng hợp lipase ở pH
6,0 đến 8,0; ở pH 7,0, lipase được tạo ra có hoạt tính cao nhất.
Khảo sát nồng độ cơ chất ảnh hưởng sinh tổng hợp lipase:

Hình 3.4: Ảnh hưởng của nồng độ cơ chất lên khả năng sinh tổng hợp lipase.
Hình 3.4 cho thấy khả năng sinh tổng hợp lipase tốt nhất ở nồng độ cơ chất từ 1,0 –
1,2%.

3.1.3 Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính của E .
Lipase được ứng dụng trong ngành công nghiệp sản xuất bột giặt, chất tẩy nên
khả năng giữ được hoạt tính khi có mặt các ion và chất khác trong hỗn hợp rất quan
trọng. Tùy vào nồng độ và loại ion, chất tẩy khác nhau mà sẽ làm tăng, giữ tốt hoạt
tính hay giảm.
Khảo sát ảnh hưởng của một số ion kim loại và chất tẩy rửa đến hoạt tính của chế
phẩm lipase.

20


Hình 3.5: Ảnh hưởng của ion và chất tẩy rửa khác lên hoạt tính chế phẩm lipase

Sau khi ủ 1 giờ ở 4oC với các tác nhân trên, chế phẩm lipase từ chủng BS7 bị kìm
hãm đối với ion Zn2+ và Cu2+ . Các ion Ca2+ và Mg2+ hầu như không ảnh hưởng ñến
hoạt tính, ion Mg2+ giữ được hoạt tính tốt nhất. Dung dịch SDS
0,2% làm giảm gần 95% hoạt tính, bột giặt Omo 0,2% làm hoạt tính giảm 76,57%.
Khảo sát ảnh hưởng của pH lên hoạt tính và độ bền chế phẩm lipase.

Hình 3.6: Ảnh hưởng của pH đến hoạt tính chế phẩm lipase (: đệm Tris –Cl; :
đệm carbonate)
Kết quả ở Hình 3.6 cho thấy chế phẩm lipase thu nhận từ BS7 hoạt động thích
hợp ở pH 10,0 ở đệm Tris – Cl và đệm carbonate. Như vậy lipase thu nhận từ BS7 là
lipase kiềm.

Hình 3.7: Ảnh hưởng của pH đến độ bền của chế phẩm lipase (T: đệm Tris –Cl;
C: đệm carbonate).
Hình 3.7 cho thấy chế phẩm lipase của BS7 giữ được hoạt tính cao nhất sau 24
giờ bảo quản trong dung dịch đệm pH 10,0 ở 4oC .

21


Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ lên hoạt tính của chế phẩm lipase
Nhiệt độ cũng là một thông số quan trọng ảnh hưởng đến vận tốc phản ứng của
enzyme. Khi nhiệt độ tăng lên sẽ dẫn đến vận tốc phản ứng enzyme tăng, nhưng đến
một mức nào đó nhiệt độ tăng sẽ ức chế hoạt động của enzyme và có thể bất hoạt
enzyme.

Hình 3.8: Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt tính chế phẩm lipase
Qua Hình 3.8 cho thấy chế phẩm lipase của BS7 có thể hoạt động ở nhiệt độ 50
–60 C, topt là 60 oC.
o

3.1.4 Tinh sạch và thu Lipase.
Tiến hành tinh sạch được lipase của BS7 bằng phương pháp lọc gel Sephadex G75 thu được lipase có trọng lượng phân tử khoảng 23,8 kDa.
Dưới đây là kết quả chạy sắc kí và đo OD 280:

22


Hình 3.9: Sắc ký đồ biểu diễn các phân đoạn lọc gel Sephadex G – 75.
Các thông số thu được từ quá trình sản xuất phù hợp với các công trình nghiên
cứu đã thực hiện trước đó. Chế phẩm lipase thu nhận từ BS7 có khả năng chịu kiềm
(pHopt 10,0), chịu nhiệt (topt 60oC), có vị trí cắt 1 và 3 trên phân tử triglyceride. Trọng
lượng phân tử lipase thu nhận được khoảng 23,8 kDa.

3.2 Cơ chế.
3.2.1 Cơ chế sinh tổng hợp lipase.
Giống như sự tổng hợp protein, lipase sẽ được hình thành khi trải qua các quá
trình phiên mã, dịch mã và sau dịch mã. Tất cả các quá trình được thực hiện trong tế
bào chất của vi sinh vật.
Đầu tiên là sự phiên mã. Quá trình chỉ xảy ra khi đoạn gen tổng hợp nên lipase
phải được hoạt hóa trước bằng chất cảm ứng. Chất này sẽ giúp giải phóng enzyme
RNA polymerase thoát khỏi sự kìm hãm của chất ức chế bằng cách kết hợp với chính
chất ức chế đó. Bản chất của chất cảm ứng chính là cơ chất chịu sự xúc tác của lipase.
Kết thúc quá trình phiên mã diễn ra trong nhân tế bào sản phẩm sẽ là phân tử
mRNA, nhưng phân tử này rất dễ bị thủy phân trong môi trường tế bào chất. Bên cạnh
đó những nghiên cứu gần đây cho thấy phân tử siRNA (short interference RNA) được
hình thành trong quá trình phiên mã có tác động kìm hãm sự dịch mã hoặc thúc đẩy sự
phân hủy những phân tử mARN. Vì vậy số lượng enzyme tổng hợp sẽ giảm đi đáng
kể.
Tiếp theo, quá trình dịch mã sẽ sử dụng thông tin mã hóa trong mARN để tạo

thành mạch protein có thứ tự acid amin chính xác. Tuy nhiên, chuỗi polypeptide này
rất dễ bị thủy phân bởi enzyme peptidase. Quá trình này cần một loại protein chuyển

23


giao để tái sử dụng các acid amin của protein có cấu trúc gấp khúc mà không còn sử
dụng được nữa.

Hình 3.10: Diễn biến quá trình dịch mã tạo chuổi polypeptid.
Khi những polypeptide enzyme đã được tổng hợp khá nhiều thì những
polypeptide ở gần nhau sẽ tương tác với nhau tạo thành cấu trúc gấp khúc làm cho
khối enzyme trở nên không tan. Điều này đã làm cho enzyme mất đi hoạt tính sinh
học.
Hoạt tính của enzyme còn phu thuộc vào cofactor là những ion kim loại. Sự cung
cấp không đủ những ion này trong tế bào sẽ làm giảm đi hoạt tính của enzyme. Vì vậy,
phải đảm bảo nồng độ bão hòa của các ion đối với enzyme phải thấp hơn nồng độ các
ion đó trong tế bào chất.
Sau khi được vận chuyển qua màng membrane, enzyme ngoại bào vẫn có thể bị
phân hủy bởi enzyme peptidase trong không gian chu chất. Trong giai đoạn này
proenzyme, là enzyme ngoại bào trong không gian chu chất chưa có cấu trúc hoàn
thiện, vẫn tiếp tục hoàn thiện cấu trúc của nó nhờ những phản ứng thủy phân.

24


3.2.2 Cơ chế xúc tác phản ứng.
Cơ chế xúc tác Hoạt tính đạt cực đại khi nó được phân tán vào giữa bề mặt phân
pha dầu-nước => quá trình hoạt hóa phân pha.
Lipase xúc tác cho nhiều phản ứng khác nhau bao gồm: phản ứng thủy phân,

phản ứng tổng hợp ester, phản ứng chuyển ester và phản ứng amin hóa (aminolysis) .
Các phản ứng do lipase xúc tác đều là các phản ứng thuận nghịch và chiều hướng
của phản ứng phụ thuộc vào lượng nước tham gia vào phản ứng.

Hình 3.11 : Qúa trình thủy phân Tryacyglyxerol
Phản ứng thủy phân được thực hiện nhờ bộ ba Ser, His và Asp trải qua năm giai đoạn:

 E kết hợp với cơ chất tạo thành phức chất hoạt động.
 Nhóm chức hoạt động _OH của Ser tấn công vào gốc acyl của cơ chất tạo liên kết
đồng hóa trị hình thành hợp chất trung gian. Giai đoạn này được hỗ trợ bởi hoạt
tính xúc tác của His trong bộ ba xúc tác.
 Tạo thành Acyl E và tách khỏi phản ứng oxi hóa của liên kết este (R1OH).
 Tách gốc acyl còn lại ra khỏi trung tâm hoạt động bởi nhóm chức hoạt động của
His, có sự tham gia của phân tử nước và hình thành hợp chất trung gian có cấu
trúc tứ diện.
 Giải phóng acid cacboxylic.

25