Phân Lập Và Xác Định Vi Khuẩn Clostridia Sinh Dung Môi ACETONE – BUTANOL – ETHANOL

TỔNG LIÊN ĐOÀN LAO ĐỘNG VIỆT NAM
TRƯỜNG ĐẠI HỌC TÔN ĐỨC THẮNG
KHOA KHOA HỌC ỨNG DỤNG



PHÂN LẬP VÀ XÁC ĐỊNH VI KHUẨN CLOSTRIDIA SINH
DUNG MÔI ACETONE – BUTANOL – ETHANOL

Giảng viên hướng dẫn:
TS. HOÀNG QUỐC KHÁNH

Thành phố Hồ Chí Minh
Tháng 12/2009


TÓM TẮT
PHẠM THỊ PHƯƠNG, Đại học Tôn Đức Thắng, Tp. Hồ Chí Minh. Tháng12/2009.
“PHÂN LẬP VÀ XÁC ĐỊNH VI KHUẨN CLOSTRIDIA SINH DUNG MÔI
ACETONE – BUTANOL – ETHANOL”.
Giảng viên hướng dẫn:
TS. HOÀNG QUỐC KHÁNH
Clostridia đang được nhiều nhà khoa học quan tâm vì chúng có khả năng lên
men sinh dung môi acetone, butanol, ethanol và có tiềm năng rất lớn trong sản xuất
nhiên liệu sinh học. Nghiên cứu liên quan đến việc phân lập clostridia từ 20 mẫu đất,
nước thải và phân bò được thu thập từ nhiều địa điểm khác nhau. Nghiên cứu này
được tiến hành từ tháng 9 đến tháng 12/2009 tại phòng Vi sinh Ứng dụng thuộc Viện
Sinh học Nhiệt đới. Mẫu được xử lý sơ bộ trước khi phân lập sau đó tăng sinh trên môi
trường T6 có bổ sung natri thioglycolate và parafin, ủ 37oC trong vòng 5 ngày. Tiếp
theo, clostridia được phân lập trên môi trường RCM – agar trong điều kiện kị khí. Việc
chọn lọc vi khuẩn kị khí dựa trên thử nghiệm catalase, kết quả thu được 21 chủng vi

khuẩn kị khí. Vi khuẩn sinh dung môi được tuyển chọn dựa vào khả năng sinh acetone.
Qua thử nghiệm này, 21 chủng vi khuẩn kị khí đều có khả năng sinh acetone chứng tỏ
những vi khuẩn này có khả năng sinh dung môi. Quan sát hình thái tế bào vi khuẩn
dưới kính hiển vi cho thấy: 14 chủng vi khuẩn có dạng hình que, gram dương, hình
thành bào tử. Cuối cùng, 6 chủng clostridia đã được chọn lọc dựa trên các tiêu chuẩn:
khả năng đông tụ sữa, lên men một số loại đường, thử nghiệm indol, khả năng khử
sulfite và mẫn cảm với Rifampicin.

ii


MỤC LỤC
CHƯƠNG

TRANG

Trang tựa
Lời cảm tạ .................................................................................................................... i
Tóm tắt ....................................................................................................................... ii
Mục lục ..................................................................................................................... iii
Danh sách các chữ viết tắt........................................................................................... vi
Danh sách các hình .................................................................................................... vii
Danh sách các bảng .................................................................................................... ix
CHƯƠNG I. MỞ ĐẦU .......................................................................................................... 1
CHƯƠNG II. TỔNG QUAN ................................................................................................. 3
2.1. Khái quát về Clostridium ............................................................................................. 3
2.1.1. Phân loại............................................................................................................... 3
2.1.2. Giới thiệu ............................................................................................................. 3
2.1.3. Lịch sử phát hiện .................................................................................................. 4
2.1.4. Điều kiện sinh trưởng ........................................................................................... 5

2.1.5. Cấu trúc tế bào...................................................................................................... 6
2.1.6. Bào tử clostridia ................................................................................................... 7
2.1.6.1. Điều kiện hình thành bào tử ........................................................................... 7
2.1.6.2. Đặc tính của bào tử ........................................................................................ 7
2.1.6.3. Sự nảy mầm bào tử ........................................................................................ 8
2.2. Khái quát về dung môi acetone, butanol, ethanol ......................................................... 9
2.2.1. Acetone ................................................................................................................ 9
2.2.2. Butanol ................................................................................................................. 9
2.2.3. Ethanol ................................................................................................................. 9
2.3. Clostridia lên men sinh dung môi ABE ...................................................................... 10
2.3.1. Cơ chất lên men ABE ......................................................................................... 10
2.3.2. Con đường trao đổi chất lên men ABE ở clostridia ............................................. 11
2.3.3. Mối quan hệ giữa quá trình sinh dung môi và sự phát triển tế bào, hình thành bào
tử ................................................................................................................................. 16
2.4. Ứng dụng của clostridia ............................................................................................. 18
2.4.1. Trong công nghiệp .............................................................................................. 18
2.4.1.1. Acetone ....................................................................................................... 18
iii


2.4.1.2. Ethanol ........................................................................................................ 18
2.4.1.3. Butanol ........................................................................................................ 20
2.4.2. Trong y học ........................................................................................................ 20
2.4.3. Trong nông nghiệp.............................................................................................. 21
CHƯƠNG III. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP ................................................................. 22
3.1. Thời gian và địa điểm nghiên cứu .............................................................................. 22
3.2. Vật liệu và thiết bị ..................................................................................................... 22
3.2.1. Dụng cụ .............................................................................................................. 22
3.2.2. Thiết bị ............................................................................................................... 22
3.2.3. Vật liệu và hóa chất ............................................................................................ 22

3.2.3.1. Đối tượng nghiên cứu .................................................................................. 22
3.2.3.2. Hóa chất ...................................................................................................... 23
3.2.3.3. Thành phần các môi trường .......................................................................... 25
3.3. Phương pháp nghiên cứu ........................................................................................... 27
3.3.1. Quy trình thực hiện ............................................................................................. 27
3.3.2. Phương pháp....................................................................................................... 29
3.3.2.1. Phương pháp lấy mẫu................................................................................... 29
3.3.2.2. Phương pháp phân lập .................................................................................. 29
3.3.2.3. Phương pháp bảo quản chủng phân lập ........................................................ 31
3.3.2.4. Thử nghiệm catalase .................................................................................... 31
3.3.2.5. Phương pháp định tính acetone .................................................................... 31
3.3.2.6. Phương pháp nhuộm Gram .......................................................................... 32
3.3.2.7. Phương pháp nhuộm bào tử.......................................................................... 33
3.2.2.8. Thử nghiệm đông tụ sữa............................................................................... 34
3.2.2.9. Thử nghiệm khả năng lên men đường .......................................................... 34
3.3.2.10. Thử nghiệm indol....................................................................................... 35
3.3.2.11. Thử nghiệm sinh H2S ................................................................................. 36
3.3.2.12.Thử nghiệm Rifampicin .............................................................................. 37
CHƯƠNG IV. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ...................................................................... 38
4.1. Kết quả...................................................................................................................... 38
4.1.1. Phân lập vi sinh vật từ đất, nước thải và phân bò ................................................. 38
4.1.2. Thử nghiệm khả năng lên men sinh acetone ........................................................ 42
4.1.2.1. Khả năng lên men sinh acetone của các mẫu ................................................ 42
4.1.2.2. Khả năng lên men sinh acetone của các chủng ............................................. 42
iv


4.1.3. Nhuộm Gram và nhuộm bào tử ........................................................................... 43
4.1.4. Các thử nghiệm sinh hoá..................................................................................... 45
4.1.4.1. Thử nghiệm đông tụ sữa............................................................................... 45

4.1.4.2. Thử nghiệm khả năng lên men đường .......................................................... 46
4.1.4.3. Thử nghiệm indol......................................................................................... 48
4.1.4.4. Thử nghiệm khử sulphite ............................................................................. 48
4.1.4.5. Thử nghiệm Rifampicin ............................................................................... 49
4.2. Thảo luận .................................................................................................................. 50
CHƯƠNG V. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ........................................................................ 52
5.1. Kết luận..................................................................................................................... 52
5.2. Kiến nghị .................................................................................................................. 52

Tài liệu tham khảo
Phụ lục

v


DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT

Acetyl – CoA

Acetyl – Coenzyme A

ABE

Acetone – butanol – ethanol

ATP

Adenosine triphosphate

Bdh

Butanol dehydrogenase

BC

Trước công nguyên

CPE

Clostridium perfringens enterotoxin

C

Clostridium

DNA

Acid deoxyribonucleic

NAD

Nicotinamide adenine dinucleotide

EMP

Embden – Meyerof - Parnas

PCR

Polymerase chain reaction

p – DMABA

P – Dimethylaminobenzaldehyde

RCM

Reinforced Clostridia Medium

PTS

Phosphotransferase system

SASP

Small acid soluble protein

TNFα

Tumor necrosis factor α

UV

Ultra violet

vi


DANH SÁCH CÁC HÌNH

HÌNH

TRANG

Hình 2.1. Clostridium ................................................................................................. 3
Hình 2.2. Nhà bác học Hippocrates (460 – 370 BC), Louis Pasteur (1882 – 1895),
Prazmowski (1821 – 1885) và Chaim Weizmann (1874 – 1952) ................................. 4
Hình 2.3. Bào tử clostridia ........................................................................................... 7
Hình 2.4. Cấu trúc acetone .......................................................................................... 9
Hình 2.5. Cấu trúc butanol ........................................................................................... 9
Hình 2.6. Cấu trúc ethanol ......................................................................................... 10
Hình 2.7. Cellulose ................................................................................................... 10
Hình 2.8. Con đường trao đổi chất ở C . acetobutylicum ............................................ 11
Hình 2.9. Cơ chế lên men sinh dung môi ABE ở C. acetobutylicum .......................... 12
Hình 2.10. Sự hấp thu và chuyển hóa carbohydrate ở clostridia ................................. 14
Hình 2.11. Quá trình thay đổi hình thái, sinh dung môi kết hợp hình thành bào tử ở C.
acetobutylicum........................................................................................................... 17
Hình 2.12. Cây xăng E85 ở thành phố Lexington, Mỹ .............................................. 19
Hình 2.13. Cây xăng với E10 (10% ethanol) ở California ......................................... 19
Hình 3.1. Quy trình thực hiện .................................................................................... 28
Hình 3.2. Các bước tiến hành nhuộm Gram ............................................................... 33
Hình 3.3. Các bước tiến hành nhuộm bào tử .............................................................. 34
Hình 4.1. Hiện tượng sinh hơi sau khi ủ mẫu 2 ngày trong môi trường T6 có bổ sung
sodium thioglycolate và parafin. ................................................................................ 39
Hình 4.2. Kết quả trải đĩa của mẫu NTV .................................................................... 39
Hình 4.3. Hình thái tế bào của M1 ............................................................................. 41
Hình 4.4. Bảo quản chủng trên thạch nghiêng ............................................................ 41
Hình 4.5. Bảo quản lạnh âm (-20oC) .......................................................................... 41
Hình 4.6. Thử nghiệm khả năng sinh acetone của mẫu phân bò ................................. 42
Hình 4.7. Thử nghiệm khả năng sinh acetone của các chủng vi khuẩn phân lập từ đất

mía và đất trồng lúa. .................................................................................................. 43
vii


Hình 4.8. Vi khuẩn gram dương, hình que M1 ........................................................... 45
Hình 4.9. Bào tử hình thành của mẫu M1 ................................................................... 45
Hình 4.10. Hiện tượng đông tụ sữa ở các chủng chọn lọc........................................... 46
Hình 4.11. Thử nghiệm khả năng lên men đường mannitol của 14 chủng vi khuẩn chọn
lọc.............................................................................................................................. 47
Hình 4.12. Thử nghiệm indol của các chủng vi khuẩn chọn lọc.................................. 48
Hình 4.13. Khuẩn lạc và môi trường màu đen của chủng B2 ...................................... 49
Hình 4.14. Vòng ức chế sự phát triển của chủng B2 ................................................... 49

viii


DANH SÁCH CÁC BẢNG

BẢNG

TRANG

Bảng 2.1. Các enzyme liên quan đến quá trình lên men ABE ở C. acetobutylicum .... 13
Bảng 3.1. Các mẫu phân lập....................................................................................... 23
Bảng 4.1. pH của 4 loại mẫu phân lập ........................................................................ 38
Bảng 4.2. Mô tả hình thái của 21 vi khuẩn kị khí được phân lập từ các mẫu ............. 40
Bảng 4.3. Hình dạng, kích thước và vị trí bào tử ........................................................ 44
Bảng 4.4. Kết quả thử nghiệm khả năng lên men đường ............................................ 47

ix

CHƯƠNG I. MỞ ĐẦU
Nhiên liệu sinh học đang là vấn đề quan tâm của nhiều quốc gia trên thế giới.
Các quặng dầu mỏ, khí đốt trên thế giới ngày càng cạn kiệt, tuy nhiên sự phụ thuộc
của con người vào nó ngày càng gia tăng như phương tiện đi lại, vận chuyển đến
những công việc hàng ngày như nấu ăn cũng không thể thiếu nhiên liệu (ga, xăng,
dầu…). Sử dụng nhiên liệu xăng dầu không chỉ làm cạn kiệt nguồn năng lượng dầu
mỏ mà còn gây ra tình trạng ô nhiễm môi trường nghiêm trọng. Do vậy, việc nghiên
cứu và sản xuất những loại năng lượng mới nhằm thay thế một phần hay toàn bộ
nhiên liệu xăng dầu, không gây ô nhiễm môi trường đang trở thành một vấn đề quan
trọng và là định hướng nghiên cứu cho các nhà khoa học.
Butanol, acetone, ethanol là những loại dung môi có khả năng sử dụng làm
nhiên liệu thay thế cho xăng dầu. Hiện nay, ethanol được sử dụng nhiều, tuy nhiên
người ta chú ý đến butanol hơn vì cấu tạo của nó có bốn nguyên tử carbon nên nặng
hơn dẫn đến ít bay hơi đồng thời nó có khả năng tạo ra năng lượng cao hơn ethanol
và acetone.
Butanol, ethanol và acetone cũng đã phát triển trong suốt chiến tranh thế giới
lần I nhưng nguồn cơ chất lên men là đường mía và củ cải dẫn đến giá thành cao,
không có triển vọng cạnh tranh với công nghiệp hoá dầu.
Gần đây, người ta chú ý đến nguồn phế thải trong nông nghiệp như rơm rạ khô,
chất xơ từ xác thực vật (có chứa cellulose, lignocellulose, hemicellulose) làm nguồn
cơ chất sản xuất dung môi với giá rẻ, mang lại nhiều lợi ích cho nhà sản xuất cũng
như phục vụ cho nhu cầu của người tiêu dùng ngày càng cao.
Những giống vi khuẩn thuộc clostridia đang được các nhà khoa học quan tâm
vì chúng có khả năng lên men sinh dung môi. Các chủng này có khả năng lên men
tạo butanol cao, đặc biệt là một số loài có khả năng sử dụng cellulose làm nguồn cơ
chất lên men. Các chủng Clostridium. acetobutylicum, Clostridium. beijerinckii,
Clostridium. saccharoperbutylacetonicum… là những vi sinh vật tiềm năng nhất.
Để tìm hiểu vi khuẩn clostridia có tiềm năng sản xuất dung môi, đề tài nghiên

cứu này được thực hiện với mục đích: “Phân lập và xác định vi khuẩn clostridia
sinh dung môi acetone – butanol – ethanol”.
1


Nội dung nghiên cứu của đề tài bao gồm:
 Phân lập các chủng vi khuẩn clostridia từ mẫu đất, nước thải và phân bò.
 Chọn lọc các chủng có tiềm năng sinh dung môi.
 Khảo sát đặc điểm hình thái tế bào vi khuẩn.
 Chọn lọc các chủng vi khuẩn clostridia bằng các thử nghiệm sinh hoá.

2


CHƯƠNG II. TỔNG QUAN
2.1. Khái quát về Clostridium
2.1.1. Phân loại
Theo hệ thống phân loại trong Bergey’s Manual of systematic Bacteriology,
Clostridium được phân loại như sau:
 Ngành: Firmicutes
 Lớp: Clostridia
 Bộ: Clostridiales
 Họ: Clostridiaceae
 Giống: Clostridium

Hình 2.1. Clostridium [14]
2.1.2. Giới thiệu
Giống Clostridium là trực khuẩn gram dương, kị khí, sinh nội bào tử, phần lớn
di động nhờ các tiên mao mọc khắp quanh cơ thể, tế bào sinh dưỡng hình que nhưng
vì bào tử có kích thước lớn hơn chiều ngang của tế bào sinh dưỡng nên khi mang bào

tử tế bào sẽ có dạng hình thoi hay hình dùi trống, có thể thủy giải saccharide và
protein. Chúng phân bố rộng rãi trong tự nhiên, thường xuyên hiện diện trong đất,
bùn ruộng, bùn ao, có thể gây bệnh cho người và động vật, gây hư hỏng thực phẩm,
khử sulfite thành sulphur tạo màu đen, gây mùi khó chịu. [2]
Clostridium là một trong những giống vi khuẩn phổ biến, bao gồm hơn 150 loài.
Chúng là một trong những nhóm lớn nhất thuộc giới Prokaryote. Nhiều loài sinh
trưởng như một vi khuẩn kị khí lên men điển hình, năng lượng bắt nguồn từ sự oxy
hóa không hoàn toàn các hợp chất hữu cơ. Tuy nhiên, một số loài sinh trưởng theo
con đường tự dưỡng, một số loài trao đổi chất trong phạm vi cơ chất hẹp với các quá
trình phân giải khác nhau.
Một số loài có tiềm năng lớn trong công nghệ sinh học, sản xuất dung môi
butanol, acetone, ethanol như C. acetobutylicum. Bên cạnh đó, một vài loài lại gây
bệnh nguy hiểm cho người và động vật như C. perfringens gây bệnh đường ruột, C.
difficile gây bệnh tiêu chảy và viêm kết tràng, C. tetani gây bệnh uốn ván, C.
3


botulinum gây ngộ độc thực phẩm… Tuy nhiên, một vài độc tố của chúng được xác
nhận có giá trị trong ứng dụng y khoa và mỹ phẩm. Vì vậy, clostridia thuộc nhóm hữu
ích trong công nghiệp. [11][5]
2.1.3. Lịch sử phát hiện
Hippocrates (460 – 370 BC), một bác sĩ sống ở đảo Greek, Kos, Hy Lạp lần
đầu tiên đã ghi nhận những bệnh ảnh hưởng bởi clostridia. Những dữ liệu của ông mô
tả bệnh hoại tử vết thương gây ra bởi C. histolyticum và bệnh uốn ván gây ra bởi C.
tetani. Tuy nhiên, những nghiên cứu về vi khuẩn này chỉ bắt đầu từ năm 1861 khi nhà
vi sinh vật học nổi tiếng người Pháp, Louis Pasteur khám phá ra sự tồn tại của những
vi sinh vật mà sự sinh trưởng và phát triển của chúng không cần oxy. Ông cho rằng
acetone, butanol, ethanol được hình thành trong suốt quá trình lên men và clostridia
có khả năng tổng hợp được dung môi này.
Điều này được xem như một cuộc cách mạng vào thời điểm đó. Thuật ngữ

“Clostridium” bắt nguồn từ Prazmowski (1880). Loài thuộc giống Clostridium được
biết đến lần đầu tiên là C. butyricum. Năm 1912, Chaim Weizmann cũng đã thành
công trong việc phân lập C. acetobutylicum.

Hình 2.2. Nhà bác học Hippocrates (460 – 370 BC), Louis Pasteur (1882 – 1895),
Prazmowski (1821 – 1885) và Chaim Weizmann (1874 – 1952) [15][16][17][18]
Các nhu cầu cấp thiết của thế chiến I đã kích thích sự ra đời của một số ngành
sản xuất sử dụng kỹ thuật lên men. Thời đó, acetone rất được quan tâm bởi nó là
nguyên liệu để sản xuất thuốc nổ. Nhưng sau đó, butanol và ethanol còn được quan
tâm nhiều hơn bởi nó có thể được sử dụng làm dung môi hòa tan sơn nhanh chóng
phục vụ cho sơn phủ ôtô. Trong những năm 1913 - 1915, Weizmann đã thực hiện
thành công lên men acetone – butanol – ethanol bằng C. acetobutylicum. Chu trình
4


này sau đó được gọi là lên men ABE, chính là viết tắt của acetone – butanol –
ethanol. Đến thế kỷ XX, người ta đã phân lập hơn 100 loài khác nhau. Nó có tác động
to lớn về cả mặt công nghệ sinh học cũng như mặt thương mại.
ABE tiếp tục được nghiên cứu tại Mỹ cho đến năm 1950. Những năm 1950 –
1960, ABE đã đứng khựng lại tại châu Âu và châu Mỹ bởi những hiệu quả kinh tế
mà ngành công nghiệp hóa dầu lúc bấy giờ mang lại. Ở Trung Quốc, ABE được
nghiên cứu bắt đầu từ những năm 1950, đạt đỉnh cao vào những năm 1980 nhưng sau
đó cũng bị ngừng trệ bởi ngành công nghiệp hóa dầu.
Ngày nay, do yêu cầu của người tiêu dùng ngày càng cao trong khi giá dầu thô
lại đang leo thang nên sử dụng nhiên liệu sinh học để thay thế một phần nhiên liệu
truyền thống được cho là một giải pháp tốt. Clostridia sinh dung môi ABE đang được
tập trung nghiên cứu tại Việt Nam. [11]
2.1.4. Điều kiện sinh trưởng
Chủng clostridia rất đa dạng phản ánh bởi các điều kiện sống khác nhau. Đa số
các loài Clostridium kị khí bắt buộc, chỉ có một số loài như C. pectinovorum, C.

histolyticum… kị khí không bắt buộc. Chúng phát triển trong điều kiện không có oxy
hoặc có nồng độ oxy thấp. Trong nghiên cứu ảnh hưởng của oxygen lên sự sinh
trưởng của C. beijerinckii, O’Brien và Morris đã chứng minh oxy thêm vào mẻ nuôi
cấy bằng cách gia tăng điện thế oxy hóa – khử sẽ ức chế sự tăng trưởng.
Những dẫn xuất oxygen như superoxide anion, H2O2 và các chất gốc hydroxyl là
những chất phá hủy cấu trúc phân tử sinh học. Sở dĩ, sự ức chế sinh trưởng xảy ra khi
có sự hiện diện của oxygen là do những chủng vi sinh vật này thiếu các enzyme khử
độc.
Clostridia có pH thích hợp từ 6.5 – 7.0. Tuy nhiên, một số loài có khả năng thích
nghi với pH cao hay thấp hơn tùy theo khả năng trao đổi chất của chúng. Độ pH có
thể ảnh hưởng đến khả năng sử dụng đường của clostridia từ đó dẫn đến những sự
giải thích nhầm lẫn về khả năng sử dụng đường của các vi sinh vật này.
Khoảng nhiệt độ tối ưu của các chủng Clostridium là khác nhau, tùy chủng ưa
nhiệt hay ưa lạnh. Phần lớn clostridia sinh trưởng tốt nhất ở nhiệt độ khoảng 30 –
40oC. Một số loài ưa nhiệt như C. themocellum và C. themosulfurogenes có nhiệt độ
tối thích khoảng 60 – 70 oC. Chúng được tập trung nghiên cứu vì chúng chứa các
enzyme chịu nhiệt và có tiềm năng trong các quá trình lên men. C. themocellum là vi
5


sinh vật mẫu cho nghiên cứu phân giải cellulose. C. themohydrosulfuricum, C.
themosulfurogenes hiện nay được xếp loại thuộc giống themoanaerobacter và
themoanaerobacterium được dùng cho nghiên cứu enzyme phân giải polysaccharide.
Những chủng ưa lạnh có số lượng ít hơn, đại diện là C. estertheticum, C. putrefaciens.
Chúng có thể sinh trưởng thích hợp ở nhiệt độ thấp, khoảng 25oC và không sinh
trưởng ở dưới 22 oC và trên 30 oC.
Phần lớn chủng Clostridium là dị dưỡng. Chúng có khả năng thủy phân
saccharose hay thủy phân protein hoặc cả hai. Môi trường phức chất chứa cao nấm
men, cao thịt peptone với đường có khả năng lên men. Muối, những nguyên tố vi
lượng và vitamin như biotin, thiamine thì có nhu cầu phổ biến, nhưng nhu cầu về

aminoacid, purine và pyrimidine thì khác nhau. Vài chủng như C. bifermentans thì
đặc biệt có nhu cầu khó tính về acid amin. [5][6]
2.1.5. Cấu trúc tế bào
Tế bào clostridia có dạng hình que thẳng hoặc cong, phần đầu có thể nhọn, tù
hoặc tròn, đường kính và chiều dài tùy thuộc vào loài, thời kì phát triển và thành phần
môi trường nuôi cấy (Mitchell, 2001). C. acetobutylicum có kích thước khoảng 0.6 –
0.72 mm, chiều dài 2.6 – 4.7 mm. C. butyricum có kích thước khoảng 0.5 mm, chiều
dài 4 – 12 mm… Đa số chúng có khả năng chuyển động bằng lông roi. Trong điều
kiện môi trường không thích hợp cho sự sinh trưởng, các tế bào sinh dưỡng chuyên
biệt chuyển hóa thành nội bào tử. Nội bào tử không hoạt động mà có thể chịu đựng
khi gặp điều kiện khắc nghiệt. Nội bào tử có hình tròn hay bầu dục, có vị trí ở giữa, ở
một đầu hay gần một đầu của tế bào mẹ tùy loài và chúng thường làm căng phồng tế
bào.
Thành tế bào clostridia chứa peptidoglycan, một vài giống có thể có acid
teichoic, ngoài ra còn chứa các hợp chất phosphate. Dưới kính hiển vi điện tử, người
ta thấy rằng các tế bào này có thành tế bào một lớp, là điển hình của vi khuẩn gram
dương.
Phân tích lớp chất béo trong màng tế bào clostridia, chủ yếu là nhóm C.
butyricum, người ta thấy có sự hiện diện của glycerophospholipids tồn tại cả hai dạng
diacyl và plasmalogen (1-alk-1’– enyl-2-acyl). Những thay đổi nhiệt độ sinh trưởng
kéo theo những thay đổi trong chuỗi acyl, alkyl và thành phần lớp chất béo. Chúng
chống lại ảnh hưởng của dung môi lên cấu trúc tế bào bằng cách gia tăng tỷ lệ những
6


chuỗi acyl bão hòa và không bão hòa. Việc đột biến Clostridium nâng cao nồng độ
acetone, butanol, ethanol tạo thành dẫn đến sự thay đổi thành phần cấu tạo lipid của
màng tế bào để có cơ chế bảo vệ phù hợp. [3][5]
2.1.6. Bào tử clostridia
2.1.6.1. Điều kiện hình thành bào tử

Một trong những đặc điểm quyết định của giống Clostridium là có khả năng tạo
bào tử. Bào tử so với tế bào sinh dưỡng có sức chống chịu cao hơn đối với các điều
kiện bất lợi như nhiệt độ, hóa chất, bức xạ.

Hình 2.3. Bào tử clostridia [19]
Thông thường, sự hình thành bào tử xảy ra khi chất dinh dưỡng bắt đầu cạn kiệt.
Clostridia phát triển đòi hỏi nguồn carbon bên ngoài và năng lượng trong suốt quá
trình. Nguồn nitrogen cũng có thể là yếu tố cần thiết cho sự hình thành bào tử. Những
yếu tố khác cũng có khả năng ảnh hưởng đến sự hình thành bào tử như pH, oxy và
nhiệt độ (Durre, 2005). Sự tăng khả năng tiêu thụ cơ chất thường thấy trong suốt giai
đoạn đầu của quá trình hình thành bào tử trong khi ở một vài giống của C. botulinum,
nguồn carbon dự trữ nội sinh được sử dụng trong suốt quá trình hình thành bào tử.
[5][7][12][13]
2.1.6.2. Đặc tính của bào tử
Bào tử có hình tròn hay bầu dục. Nó có thể hình thành chính giữa tế bào, ở một
đầu hay gần một đầu của tế bào. Khi đường kính của bào tử không lớn hơn đường
kính của tế bào thì vi khuẩn thường thuộc giống Bacillus, còn khi đường kính của bào
tử lớn hơn đường kính của tế bào thì vi khuẩn thuộc giống Clostridium. Trong trường
hợp này, tế bào bị căng phồng ra bởi bào tử.
7


Lớp áo bào tử bao bên ngoài có tính chất là protein giống như ngoại bào tử.
Dưới lớp áo là lớp vỏ chứa một lượng lớn peptidoglycan. Lớp nguyên sinh chất bào
tử bao gồm thành tế bào, một lớp màng và lõi bào tử chứa DNA, ribosome, các
enzyme, acid dipicolinic, các ion Ca2+ và nước. Những protein nhỏ có thể tan trong
acid (SASP) bao quanh DNA và giữ vai trò chính trong sức đề kháng UV của bào tử.
Những nghiên cứu về đặc tính của bào tử clostridia tập trung vào những giống
gây bệnh và những giống có tiềm năng kinh tế quan trọng. Mục đích của việc xử lý
nhiệt trong đóng hộp thức ăn là để bất hoạt bào tử của C. botulinum, thông thường là

7 – 30 phút ở 100 oC và 0.1 – 0.2 phút ở 120oC. Bào tử của một vài giống khác như C.
sporogenes và C. thermosacchrolyticum có sức chịu đựng cao hơn. Những bào tử
được hình thành từ chủng chịu nhiệt thường có sức chịu nhiệt cao hơn những chủng
trung gian và chủng ưa lạnh. Trong một nghiên cứu về ba chủng chịu nhiệt C.
thermocellum, C. thermosulfurogenes và C. thermohydrosulfuricum, Hyun và cộng sự
nhận xét sức chịu nhiệt của bào tử cao hơn phụ thuộc vào độ dày của lớp vỏ bào tử.
Bào tử chịu nhiệt cao nhất là của C. thermohydrosulfuricum có thể chịu được 121 oC
trong 11 phút. Điều đó cho thấy chúng có khả năng sống sót qua quá trình hấp khử
trùng ở 121 oC trong 10 – 15 phút. [5][7][12][13]
2.1.6.3. Sự nảy mầm bào tử
Trong điều kiện thích hợp, bào tử có thể quay về dạng tế bào sinh dưỡng. Sự
biến đổi này được gọi là sự nảy mầm. Quá trình nảy mầm bao gồm ba bước: Sự hoạt
hóa, sự nảy mầm và sự phát triển tăng nhanh số lượng tế bào.
Sự hoạt hóa là gia tăng tỷ lệ và quy mô của sự nảy mầm, có thể được thực hiện
bằng cách gia tăng nhiệt độ dưới ngưỡng gây chết.
Sự nảy mầm của bào tử clostridia có thể được bắt đầu bởi những chất dinh
dưỡng khác nhau gồm các aminoacid (đặc biệt là L – alanine), các loại đường, lactate,
nicotinamide và những hóa chất không phải là chất dinh dưỡng như bicarbonate
nhưng chúng lại bị ức chế bởi oxy.
Trong suốt giai đoạn nảy mầm, các bào tử mất đi tính khúc xạ của chúng và lõi
được biến đổi thành tế bào chất với ribosome và nhân tế bào.
Giai đoạn phát triển tăng nhanh số lượng tế bào được hoàn tất bởi sự tổng hợp
RNA, protein, màng tế bào, thành tế bào và DNA (Durre, 2005).
Giai đoạn nảy mầm và tăng sinh được thực hiện trong túi bào tử và kết quả là tế
8


bào sinh dưỡng được phóng thích ra ngoài. [5][7][12][13]
2.2. Khái quát về dung môi acetone, butanol, ethanol
2.2.1. Acetone

Acetone còn có tên là dimetylcetone (CH3COCH3) là chất lỏng, không màu,
trong với mùi hắc đặc trưng, khó bị oxi hoá, dễ bị khử.
Vì acetone ít độc nên được dùng làm dung môi trong công nghiệp thực phẩm,
dược phẩm và là nguyên liệu để tổng hợp nhiều chất hữu cơ khác nhau.

Hình 2.4. Cấu trúc acetone [20]
2.2.2. Butanol
Butanol hay butyl alcohol là một rượu bậc nhất với cấu trúc 4 carbon (C4H10O).
Đây là một trong những loại rượu đặc biệt với hơn 2 nguyên tử carbon nhưng có thể
hòa tan trong nước. Ở điều kiện thường, nó là một chất lỏng có độ bay hơi vừa, dễ
cháy, trong suốt, không màu, hút ẩm nhẹ, có mùi đặc trưng.
Butanol là một sản phẩm phụ của quá trình lên men đường và các hydrocarbon
khác, có mặt trong nhiều loại thực phẩm và đồ uống cũng như tổng hợp hoá chất.

Hình 2.5. Cấu trúc butanol [21]
2.2.3. Ethanol
Ethanol hay còn gọi là ethyl alcohol (CH3CH2OH) là chất lỏng, không màu,
trong suốt, dễ bay hơi, có mùi thơm đặc trưng, dễ cháy, khi cháy không có khói và
ngọn lửa có màu xanh da trời, hút ẩm, tan trong chloroform, eter, nước.
9


Trong công nghiệp sản xuất đồ uống, người ta sử dụng phương pháp lên men
hoa quả hoặc ngũ cốc để tạo ra đồ uống có chứa cồn. Nó là một trong những hợp chất
hữu cơ có nhiều ứng dụng và đặc biệt là chất trung gian để sản xuất những chất hữu
cơ khác.

Hình 2.6. Cấu trúc ethanol [22][23]
2.3. Clostridia lên men sinh dung môi ABE
2.3.1. Cơ chất lên men ABE

Trong điều kiện lên men thông thường, nguồn carbon được sử dụng là cơ chất
chính. Trước đây, bột bắp, bột mì và mật rỉ là những cơ chất phổ biến cho lên men
thương mại. Tuy nhiên, do giá thành cao nên lên men ABE từ những cơ chất này
không có tính khả thi về mặt kinh tế. Clostridia có khả năng chuyển hóa cơ chất trong
phạm vi khá rộng, bao gồm các loại đường từ monosaccharide đến disaccharide như
glucose, xylose, cellobiose và các phân tử polymer lớn như xylan hay tinh bột. Ngày
nay, người ta chú ý đến nguồn phế thải trong nông nghiệp như rơm rạ khô, chất xơ từ
xác thực vật (có chứa cellulose, lignocellulose, hemicellulose) làm nguồn cơ chất sản
xuất dung môi với giá rẻ, mang lại nhiều lợi ích cho nhà sản xuất cũng như phục vụ
cho nhu cầu của người tiêu dùng ngày càng cao.

Hình 2.7. Cellulose [24]
10


Cellulose được tìm thấy trong thành tế bào thực vật, là những chuỗi nối tiếp
song song β - 1,4 - glucoside. Sự thủy phân cellulose phụ thuộc vào hoạt động phối
hợp của hai loại enzyme cellulase: β - 1,4 - endoglucanase cắt các chuỗi một cách
ngẫu nhiên và β - 1,4 - exoglucanase (cellobiohydrolases) biến đổi các đơn vị
cellobiose từ đầu không khử. Sau đó, β - glucosidase phân giải cellobiose thành
glucose.
Xylan là một polymer nhánh, chủ yếu là β - 1,4 - xylose nhưng cũng chứa
những thành phần khác như arabinose, glucose, galactose... Nó là thành phần chính
của hemicellulose mà cấu thành gần 30% khối lượng thành tế bào thực vật. Xylan
được phân hủy bởi hoạt động phối hợp của endoxylanase và β - xylosidase. Một số
loài thuộc clostridia có khả năng tổng hợp enzyme xylanase.
Tinh bột là một polymer rẻ và phong phú với hai thành phần: amylose và
amylopectin. Sự thủy phân được thực hiện bằng enzyme α - amylase và β - amylase.
Những chủng vi khuẩn có khả năng thủy phân loại này là C. thermohydrosulfuricum
và C. thermosulfurogenes.[5]

2.3.2. Con đường trao đổi chất lên men ABE ở clostridia
C. acetobutylicum lên men sinh dung môi ABE ở 35 – 37 oC. Acetone – butanol
– ethanol thường được tạo ra với tỉ lệ 3: 6: 1. Trong suốt quá trình lên men, C.
acetobutylicum tạo ba sản phẩm chính là acid (acid acetic, acid lactic, acid butyric),
dung môi (acetone, butanol, ethanol) và khí (CO2, H2). Lúc đầu, clostridia lên men
sinh acid với acetate, butyrate… Khi pH môi trường giảm xuống khoảng 4.5, vi
khuẩn mới bắt đầu sinh dung môi ABE.

Hình 2.8. Con đường trao đổi chất ở C . acetobutylicum
11


Hình 2.9. Cơ chế lên men sinh dung môi ABE ở C. acetobutylicum [4]

12


Bảng 2.1. Các enzyme liên quan đến quá trình lên men ABE ở C. acetobutylicum
[4]

Phương trình chung của quá trình lên men ABE:
12 C6H12O6  CH3CH2CH2CH2OH + 4 CH3COCH3 + CH3CH2OH +
CH3CH2CH2COOH + 18 H2 + 28 CO2 + 2H2O + Q.
Vi khuẩn sử dụng một số cơ chế để tích lũy những chất tan có khối lượng phân
tử thấp từ môi trường. Cơ chế nổi bật của sự hấp thu carbohydrate ở clostridia là
phosphoenolpyruvate (PEP) dựa vào hệ thống phosphotransferase (PTS).

13

Hình 2.10. Sự hấp thu và chuyển hóa carbohydrate ở clostridia

Trong sơ đồ chuyển hóa:
(A): khả năng chuyển hóa fructose được tìm thấy ở C. beijerinckii.
(B): khả năng chuyển hóa sucrose ở C. beijerinckii và C. acetobutylicum.
(C): khả năng chuyển hóa glucose ở C. beijerinckii.
(D): khả năng chuyển hóa β - glucoside ở C. longisporum.
(E): khả năng chuyển hóa glucitol ở C. beijerinckii.
(F): khả năng chuyển hóa mannitol ở C. acetobutylicum.
1.

sucrose 6 - phosphate hydrolase

2.

fructokinase

3.

phospho - β - glucosidase

4.

glucitol 6 - phosphate dehydrogenase

5.

mannitol 1 - phosphate dehydrogenase

6.

hexokinase

7.

phosphofructokinase

8.

putative fructose 1 - phosphatekinase

X: Nhóm aglycol của β - glucoside.
14


Với sự chuyển hóa theo con đường tế bào chất, cơ chất carbohydrate được
chuyển hóa thành pyruvate theo con đường EMP. Cách thức lên men này bắt đầu
bằng thuỷ phân hexose với việc chia cắt hexose, chuyển từ 1 mol hexose thành 2 mol
pyruvat, sinh 2 mol ATP và khử 2 mol NADH. Mặt khác, chúng cũng chuyển 3 mol
pentose tạo 5 mol ATP và 5 mol NADH thông qua con đường pentosephosphate.
Pentose được lên men chuyển thành pentose 5 – phosphate nhờ hai enzyme
transketolase và transaldolase. Kết quả của sự khử sẽ tạo ra glucose 6 – phosphate và
glyceraldehyde 3 – phosphate. Sau đó, glucose 6 – phosphate chuyển thành fructose 6
– phosphate cùng glyceraldehyde 3 – phosphate đi vào con đường EMP. Chúng tham
gia các phản ứng tiếp để hình thành pyruvate, sản phẩm trung gian của quá trình lên
men.
Con đường tạo lactate từ pyruvate được xúc tác nhờ enzyme lactate
dehydrogenase. Giai đoạn sinh acid xảy ra ở các enzyme trung gian. Acetate và
butyrate được sinh ra từ acetyl – CoA và butyryl – CoA.
Pyruvat sau đó bị oxy hoá thành acetyl coenzyme A sử dụng cơ chế duy nhất có

sự tham gia của hệ thống enzyme gọi là pyruvat – ferredoxin oxidoreductase. Hai
phân tử CO2 và hai phân tử H2 được tạo thành là phế phẩm của quá trình này. Đây là
chất trung gian hình thành các nhánh của con đường lên men sinh acid và dung môi.
Sau đó, nhóm phosphate thay thế CoA của acetyl – CoA để tạo acetyl phosphate.
Enzyme chịu trách nhiệm cho quá trình này là phosphate acetyltransferase. Cuối
cùng, nhóm phosphate của acetyl phosphate kết hợp với ADP để tạo ra ATP và
acetate với sự tham gia của acetate kinase. Những giống tiêu biểu có khả năng tạo
acetate bao gồm cả chủng ưa lạnh (C. acetium, C. formicoaceticum, C. magnum và C.
mayombei) và chủng ưa nhiệt (C. thermoaceticum và C. thermoautotrophicum).
Acetyl – CoA được chuyển hoá thành acetoacetyl – CoA nhờ enzyme thiolase.
Sau đó, acetoacetyl – CoA nhận H2 nhờ

enzyme β – hydroxybutyryl – CoA

dehydrogenase tạo thành β – hydroxybutyryl CoA. Tiếp theo, sự loại nước của β –
hydroxybutyryl CoA dưới tác dụng của enzyme crotonase tạo thành crotonyl – CoA.
Nhờ enzyme butyryl – CoA dehydrogenase, crotonyl – CoA được chuyển thành
butyryl – CoA. Nhóm phosphate thay thế CoA của butyryl – CoA để tạo butyryl
phosphate. Enzyme chịu trách nhiệm là phosphobutyrylase. Cuối cùng, nhóm

15


phosphate của butyryl phosphate kết hợp với ADP để tạo ra ATP và butyrate với sự
tham gia của butyrate kinase.
Clostridium bắt đầu lên men tạo acid nhưng khi pH thấp hơn 5, chúng chuyển
sang sản xuất dung môi acetone, ethanol và butanol nhằm ngăn chặn sự hạ thấp pH
tiếp theo.
Ethanol được tạo ra từ acetyl – CoA. Enzyme này chuyển nhóm CoA tạo thành
acid acetic đồng thời nhận H2 và tách nhóm CoA tạo thành acetaldehyde. Chất này

sau đó nhận H2 tạo thành ethanol.
Sự thay đổi phương thức xảy ra sau khi hình thành acetoacetyl – CoA. Trung
gian này sau đó chọn một trong hai kiểu có thể:
 Acetoacetyl – CoA  acetoacetate  acetone
Dưới tác dụng của enzyme acetoacetyl – CoA transferase, acetoacetyl – CoA
được chuyển hoá thành acetoacetic. Sự loại bỏ CO2 của acetoacetic khi được xúc tác
bởi enzyme acetoacetic decaboxylase dẫn đến sự tạo acetone. Nó có pH tối ưu khoảng
5. Ở một số chủng C. beijerrinkii đã phát hiện thấy enzyme butanol – ethanol –
isopropanol dehydrogenase, acetone sẽ được khử thành isopropanol nhờ enzyme này.
 Acetoacetyl – CoA  butyryl – CoA  butanal  butanol
Acetoacetyl – CoA chuyển hoá thành β – hydroxybutyryl CoA sau đó chuyển
thành crotonyl – CoA. Nhờ enzyme butyryl – CoA dehydrogenase, crotonyl – CoA
được chuyển thành butyryl – CoA. Butyryl – CoA chuyển nhóm CoA tạo thành
butyric nhờ enzyme butyric transferase. Mặt khác, butyryl – CoA vừa nhận H2 đồng
thời tách nhóm CoA tạo thành butyraldehyde. Chất này sau đó nhận H2 tạo thành
butanol. [4]
2.3.3. Mối quan hệ giữa quá trình sinh dung môi và sự phát triển tế bào,
hình thành bào tử
Những con đường biến dưỡng đầu tiên của chủng clostridia là sự kết hợp chặt
chẽ giữa quá trình tạo dung môi với quá trình hình thành nội bào tử (Paredes etal,
2005; Durre, 2005). Sự hình thành acid của clostridia trong giai đoạn đầu nhằm acid
hóa môi trường. Vi khuẩn kị khí không giữ pH cơ thể ổn định mà nó sẽ giảm song
song với môi trường nhưng kém hơn một đơn vị pH. Trong phạm vi pH môi trường là
4 đến 4.5, acid từ môi trường sẽ khuyếch tán vào tế bào và bị phân giải ở đây. Kết quả
là kênh proton trên màng tế bào sẽ bị gãy và tế bào sẽ chết. Việc biến đổi acid thành
16