Tài liệu Thí nghiệm vi sinh vật

Thí nghiệm vi sinh thực phẩm

BUỔI 1 :HƯỚNG DẪN SỬ DỤNG THIẾT BỊ, DỤNG CỤ PHÒNG THÍ
NGHIỆM VI SINH VÀ KỸ THUẬT LÀM NÚT BÔNG, BAO GÓI CÁC DỤNG
CỤ HẤP KHỬ TRÙNG
MỤC TIÊU
Sau khi học xong bài này, sinh viên có khả năng:
- Chuẩn bị trang thiết bị cần thiết của một phòng thí nghiệm vi sinh vật.
- Vận dụng được các quy tắc an toàn trong phòng thí nghiệm vi sinh vật.
- Áp dụng được các phương pháp tiệt trùng môi trường, dụng cụ.
- Bao gói dụng cụ.
1.1 Giới thiệu và hướng dẫn sử dụng các loại dụng cụ và thiết bị trong phòng thí
nghiệm vi sinh vật.
1.1.1 Hướng dẫn thực hiện nôi quy và các thao tác an toàn.
- Hiểu đúng nguyên tắc, phương pháp làm việc với vi sinh vật(VSV).
- Thao tác an toàn trên đối tượng VSV ở mật độ cao.
- Không ăn uống , hút thuốc trong phòng thí nghiệm(PTN) VSV.
- Mặc áo blouse trong thời gian thực hành.
- Không dùng miệng hút bằng ống hút (pipette) để định lượng VSV hoặc hóa chất mà
phải dùng quả bóp cao su khi thao tác bằng ống hút.
- Hộp petri đã đổ môi trường hoặc sau nuôi cấy VSV, không mở nắp, dùng tay để sờ và
dùng mũi để ngửi.
- Khi lỡ tay làm đồ VSV ra nơi làm việc, dùng khăn tay hay giấy tẩm cồn 700 để lau và
lau sạch lại bằng khăn hay giấy tầm cồn 70 0 khác.
- Khi sử dụng que cấy để gieo cấy VSV cần phải được khử trùng bằng cách đốt trên
ngọn lửa đèn cồn tránh vương vãi ra xung quanh.
- Trước và sau khi thao tác trên VSV cần lau tay kĩ bằng cồn 70 0. Khi thực hiện thao
tác này cần tránh xa ngọn lửa đèn cồn khi tay còn ướt.
- Cần ghi chú tên chủng VSV và ngày tháng thí nghiệm lên các dụng cụ chứa môi trườn
nuôi cấy VSV.
- Tất cả các chất thải và môi trường chứa hoặc nhiễm VSV cần được hấp khử trùng

trước khi đem đổ vào thùng rác. Các dụng cụ nhiễm VSV cần được ngâm trong dung
dịch sát khuẩn trước khi rửa.
- Không đổ thạch vào bồn rửa và ống thoát nước.

THỨ 5,7 TIẾT 7-11

Page 1


Thí nghiệm vi sinh thực phẩm
1.1.2 Hướng dẫn sử dụng các loại dụng cụ chuyên dụng trong phòng thí nghiệm vi
sinh.
1.1.2.1 Dụng cụ
a. Ống nghiệm: được dùng để chứa môi trường nuôi cấy và nuôi cấy VSV. Môi trường có thể
ở dạng lỏng hay rắn. Miệng ống nghiệm có thể được đậy bằng nút bông không thấm nước,
bằng silicon, giấy nhôm hay nắp vặn.. khi phân tích VSV sử dụng giấy nhôm hay silicon để
hạn chế sự nhiễm VSV.

b. Đĩa Petri (petri dishes): Gồm nắp lớn đậy lên nắp nhỏ có hình tròn, đường kính 6,8,10,12
cm. Đĩa Petri được gói lại bằng giấy trước khi đem hấp tiệt trùng bằng nhiệt ẩm hay sấy
bằng nhiệt khô. Mục đích của bao gói nhằm ngăn ngừa VSV nhiễm vào môi trường trước và
sau khi cấy đồng thời để gọn hơn và tránh vỡ dụng cụ khi đưa vào nồi hấp và quá trình
thao tác.

THỨ 5,7 TIẾT 7-11

Page 2


Thí nghiệm vi sinh thực phẩm

c. Bình tam giác (bình nón): thường sử dụng để chuẩn độ, chứa đựng môi trường, dung
dịch, nuôi cấy vi sinh vật, thực hiện các phản ứng, bình cầu còn thích hợp cho các phản ứng
cần xúc tác nhiệt độ...
Bình tam giác, bình cầu thường có thể tích từ 50ml đến 10 lít tùy theo dung dịch chứa
để chọn loại bình thích hợp.
Tương tự Petri bình tam giác được làm nút bông và gói lại bằng giấy phần đầu trước
khi đem hấp tiệt trùng. Giúp ngăn ngừa VSV nhiễm vào môi trường trước vào sau nuôi cấy,
tránh cho hơi nước trong quá trình hấp lọt vào bình, VSV xâm nhập khi đã hấp xong nên
cần làm nút bông cũng như bọc giấy bên ngoài.

d. đèn cồn : là loại đèn được đốt bằng cồn 900, mục đích nhằm tỏa nhiệt tạo một vùng xung
quanh vô trùng hạn chế VSV khác xâm nhập môi trường nuôi cấy VSV. Đèn cồn có thể được
dùng để khử trùng loại que cấy bằng cách hơ hay đốt trên ngọ lửa đèn cồn.

THỨ 5,7 TIẾT 7-11

Page 3


Thí nghiệm vi sinh thực phẩm

e. Phiến kính(lame) và lá kính (lamelle):
- Phiến kính là miếng thủy tinh hình chữ nhật, có độ trong suốt cao, dày 2mm dùng để chứa
giọt VSV ở trạng thái sống hay nhuộm màu khi quan sát chúng bằng kính hiểm vi.
- Lá kính: là miếng thủy tinh hình vuông, có độ trong suốt cao dày 0.1-0.2 mm dung để đậy
lên giọt VSV trên phiến kính để quan sát trạng thái sống của tế bào VSV.
f. Các loại que cấy
- Que cấy thẳng: dùng để cấy điểm vsv. Những vsv cần cấy sâu.
- Que cấy vòng : dùng cấy ria trên mặt thạch hay phân lập VSV trên bề mặt thạch hoặc cấy
chuyền trên môi trường lỏng.

- Que cấy móc : dùng để cấy các loại nấm mốc hay xạ khuẩn.
- Que trang: dùng để trải giọt sinh khối VSV trên bề mặt thạch.
g. Micropipette
Là loại ống hút máy có độ chính xác cao dùng để định lượng một thể tích chính xác dung
dịch VSV, môi trường nuôi cấy (lỏng) hay trong dung dịch hóa chất.
Mỗi loại micropipette đều có loại đầu tip tương ứng để hút. Khi hút các loại nồng độ khác
nhau hay hóa chất khác nhau phải thay đổi đầu típ để tránh nhiễm hóa chất hoặc vsv nồng
độ khác ảnh hưởng đến kết quả phân tích.
Trên micropipette có thể điều chỉnh thể tích hút bằng cách vặn số tương ứng.

THỨ 5,7 TIẾT 7-11

Page 4


Thí nghiệm vi sinh thực phẩm

Cách hút mấu:
 Vặn nút xoay điều chỉnh số µl hút nhất định.Trong bài báo cáo sắp tới có 2 chỉ số:
0.1ml= 100µl và 1ml=1000 µl. Gắn ống típ tương ứng với mỗi nồng độ chất cần hút
khác nhau.
 Nhấn và giữ nút phía trên để hút thể tích tương ứng. Sau khi hút nhả nút ra.
 Khi nhả chất cần hút ra ống nghiệm.., thì nhấn nút nấc 1 sau đó nhấn thêm 1 lần nữa
là nấc 2 để nhả hết chất cần hút ra. Sở dĩ có 2 nấc vì sau khi bấm nấc 1 thể tích có thể
vẫn còn trên đầu típ, mũi típ nên nhấn nấc 2 giúp thể tích hút xuống hết kết quả thí
nghiệm chính xác hơn.
 Làm sạch đầu típ và cất micropipette
Lưu ý:Thay đổi đầu típ sạch đã hấp khử trùng khi cần hút nhiều nồng độ khác nhau hay
hóa chất khác nhau. vì nút vặn điều chỉnh thể tích dễ hư nên cần thao tác cẩn thận tránh
vặn đi vặn lại nhiều lần.

1.1.2.2 Hướng dẫn sử dụng các loại thiết bị chuyên dụng trong phòng thí nghiệm vi
sinh.
a. Nồi hấp : là thiết bị bắt buộc phải có trong PTN vi sinh cho phép tiêu diệt tất cả các dạng
sống của VSV(tế bào sinh dưỡng, bào tử). Nồi hấp có cấu tạo 2 lớp vỏ nên có khả năng chịu
được áp suất cao. Buồng khử trùng có gắn valve thoát khí, áp kế, nhiệt kế.
- Khi sử dụng phải dùng nước cất châm vào thùng, tránh bị đóng cạn. Nước phải được
châm đến mức quy định.
- Nhiệt độ hấp 1210C trong 15 phút (thường để 20-30 phút vì lúc này nhiệt độ mới lên tới
mức 1210C lúc này mới là thời gian thanh trùng, tiệt trùng cho dụng cụ).
- Chỉ mở nắp và lấy giỏ dụng cụ hấp ra khi nhiệt độ dưới 100 0C và áp suất bằng 0.

THỨ 5,7 TIẾT 7-11

Page 5


Thí nghiệm vi sinh thực phẩm

* Cách vận hành nồi hấp
 Bước 1: Mở nắp nồi hấp, lấy hai giỏ inox ra ngoài.
 Bước 2: Cho nước cất vào nồi hấp đến khi ngập con ốc cảm ứng khoảng 1-2 cm.
 Bước 3: Cho dụng cụ và môi trường cần hấp khử trùng vào giỏ rồi đưa vào nồi
hấp.
 Bước 4: Đóng nắp và khóa van
 Bước 5: Bật công tắt ở bên hông, cài đặt thông số nhiệt độ,áp suất, thời
gian, bấm lần lượt các nút “set” và “start”. Hấp ở nhiệt độ 1210C. Trong thời
gian 30 phút.
 Bước 5: Khi đã có tín hiệu thì mở nồi hấp ra, mặt hiển thị báo nhiệt độ dưới
1000 và có đèn báo “ complete” chớp chớp màu đỏ, chờ 1 phút cho bớt nóng và lấy
dụng cụ môi trường ra. mở nồi hấp ở điều kiện áp suất bằng 0 và nhiệt độ dưới

1000C. Để đảm bảo an toàn và tránh nổ nồi hấp.

b. Máy lắc: Máy lắc nhằm đảo trộn môi trường nuôi cấy VSV, tăng cường oxi tan trong môi
trường. Được dùng để nuôi VSV hiếu khí trong môi trường lỏng.

* Thao tác sử dụng máy lắc
THỨ 5,7 TIẾT 7-11

Page 6


Thí nghiệm vi sinh thực phẩm
- Cắm điện.
- Đặt ống nghiệm lên phần núm đen .
+ Bật công tắc lên nếu muốn sử dụng chế độ lắc gián đoạn(Manual). Nhấn nhẹ và
giữ chặt ống nghiệm trong vài giây rồi nhấc ống nghiệm ra.
+ Bật công tắc xuống nếu muốn sử dụng chế độ lắc liên tục(Continuous).

1.2 Kỹ thuật làm nút bông ống nghiệm, bình tam giác
Nhằm ngăn nhiễm VSV từ ngoài vào môi trường trước và sau khi cấy VSV.
Bước 1. Dùng tay xé một miếng lớn bông hình chữ nhật, gấp các rìa miếng bông vào trong
cho gọn không bị xù.
Bước 2: Cuốn chặt lại thành nút sao cho vừa khít ống nghiệm hoặc bình tam giác (không
quá chặt cũng như không quá lỏng). Nút bông không quá dài cũng không quá ngắn để
thuận tiện cho quá trình thao tác.
Sau khi làm nút bông xong bao gói và hấp khử trùng.
1.3 Kỹ thuật bao gói dụng cụ
Mục đích là ngăn ngừa VSV nhiễm vào môi trường trước và sau khi cấy, để tránh vỡ dụng
cụ thủy tinh trong quá trình thao tác. Dùng giấy không thấm nước. Vì giấy thấm nước dễ bị
rách trong quá trình thao tác sau khi hấp khử trùng. Trong phòng thí nghiệm VSV, người ta

thường bao gói trên nhiều dụng cụ:
-

-

Bao gói ống nghiệm : tùy theo mục đích nuôi cấy mà nên cuốn theo từng kiểu cho phù
hợp:
 Mục đích là giữ giống: Người ta cuốn giấy tạo thành như một nắp chụp có thể
lấy ra và chụp vào dễ dàng. Vì nắp chụp này sẽ được dùng đi dùng lại nhiều
lần sau mỗi lần lấy giống trong thí nghiệm ra. Mép cuốn sau cùng nên gấp
nhét cho gọn.
 Mục đích là phân tích: nắp giấy ống nghiệm sử dụng một lần rồi bỏ. Nên ta có
thể cuốn đơn giản hơn. Mép giấy được gấp nhét hoặc cột thun
Gói giấy đĩa Petri:
Bước 1. Đặt 2,3 cái đĩa trên một tờ giấy hình chữ nhật đã được cắt phù hợp.
Bước 2. Túm lấy 2 cạnh nhỏ của hình chữ nhật gấp cuộn mép 2-3 lần cho chặt vừa
cái đĩa.

THỨ 5,7 TIẾT 7-11

Page 7


Thí nghiệm vi sinh thực phẩm

-

-

Bước 3. Sau đó ấn 2 đầu mép còn lại xuống và gấp mép hình tam giác nhọn ở giữa

như gói quà.
Bước 4. Gấp ngược hai hình tam giác đó xuống để chồng đĩa đè lên giữ nếp gấp.
Cuốn giấy bó ống nghiệm có chứa môi trường. Bó ống nghiệm thường từ 4-6 ống sẽ
được cuốn xung quanh đáy ống thí nghiệm. Chiều cao giấy từ đáy lên 1/3 ống
nghiệm và được cột lại bằng một sợi thun. Phần trên miệng ống nghiệm cũng cuốn
tương tự như ở phần đáy và để hở phần giữa của bó óng thí nghiệm. Cần để đáy ống
nghiệm phía dưới tránh để lộn sẽ khiến môi trương sau khi hấp bị đầy hết ra ngoài
do áp lực tăng khi gia nhiệt trong quá trình hấp.
Cuốn giấy bình tam giác: Bình tam giác được cuốn như phần miệng ống nghiệm.
Cuốn giấy dụng cụ khác: Các dụng cụ được cuốn giấy như: pipette, cốc thủy tinh, que
cấy

Một số câu hỏi:
1. Tại sao phải làm nút bông và bao gói dụng cụ?
VSV là loài sinh trưởng và phát triển khá nhanh vì vậy trong quá trình thực hành việc
hạn chế mức thấp nhất sự xâm nhập của VSV bên ngoài vào môi trường nuôi cấy là rất
cần thiết nó ảnh hưởng đến kết quả nuôi cấy vì vây thí nghiệm không có độ tin cậy cao.
Ống nghiệm và bình tam giác được làm nút bông nhằm hạn chế sự xâm nhập của vi khuẩn
vào dụng cụ, ảnh hưởng đến kết quả nuôi cấy. Đồng thời một số quá trình thao tác cần nút
bông để hạn chế bay hơi và nhiễm VSV bên ngoài khi đổ môi trường nuôi cấy.
Bao gói dụng cụ mục đích nhằm ngăn ngừa vi sinh vật nhiễm vào môi trường trước và sau
khi cấy. Tránh vỡ dụng cụ bằng thủy tinh trong quá trình thao tác. Quá trình hấp và ủ dụng
cụ hiệu quả hơn.
2. Tại sao phải hấp khử trùng ?
Dụng cụ thí nghiệm thường được sử dung đi sử dụng lạ nhiều lần đồng thời sự xâm nhập
của vsv từ môi trường bên ngoài nên sẽ không hoàn toàn sạch mà có thể chứa VSV khác bên
trong. Vì vậy trước khi nuôi cấy phải rửa sạch và hấp khử trùng để tạo không gian vô trùng
tiêu diệt VSV bên trong cũng như xung quanh thành dụng cụ giúp kết quả nuôi cấy về sau
không bị nhiễm VSV không mong muốn làm ảnh hưởng kết quả.

3. Tại sao hấp một số dụng cụ nên dùng giấy bạc, một số khác lại dùng bông?
Vì giấy bạc khi đậy ống nghiệm dễ dàng nhưng đối với các dụng cụ chỉ thao tác 1 lần rồi
bỏ như nước cất thì nên dùng giấy bạc, còn đối với các dụng cụ thí nghiệm được sử dụng
đi sử dụng lại hiều lần thì không nên dùng giấy bạc vì giấy bạc có nhược điểm là dễ rách
THỨ 5,7 TIẾT 7-11

Page 8


Thí nghiệm vi sinh thực phẩm
đồng thời khi bao lại lần 2,3 thì nhăn và không kín được dẫn đến vsv dễ xâm nhập, với
lại bao giấy bạc tốn kém hơn, quá trình thao tác thí nghiệm sẽ nhanh hơn khi dùng nút
bông.
4. Tại sao đĩa petri lại có nắp lớn, nắp nhỏ ?
Việc nắp lớn đạy lên nắp nhỏ có ý nghĩa rất lớn. Thứ nhất nó giúp cho tuyệt đối kín được
nắp dưới tránh vsv bên ngoài xâm nhập. Thứ 2 trong quá trình thí nghiêm thao tác cần
nhanh để tránh vsv bên ngoài xâm nhập.. nên nắp lớn phía trên giúp mở và đậy lạ dễ
dàng.

Buổi 2: PHA MÔI TRƯỜNG VÀ QUAN SÁT KÍNH HIỂM
2.1 Chuẫn bị
Mỗi sinh viên:
• 1 đĩa Petri/30ml.
• 1 ống nghiệm/10ml.
Môi trường:
• PCA: 22.5 g/l pha 1.2l
• DRBC: 32 g/l pha 1.2l
Tính chất và thành phần của PCA và DRBC:
PCA (Plate Count Agar): môi trường tổng hợp.
Thành phần

Peptone
Yeast extract
Glucose
Agar

Số lượng
5
2.5
1
15

Đơn vị
g
g
g
g

Tính chất: đếm tổng số vi sinh vật hiếu khí
DRBC(Dichoran Rose Bengal Chloramphenicol): môi trường chọn lọc.
Thành phần
Glucose
Pepton
K2HPO4
MgSO4
Rose Bengal (5%w/v)
Dichloran (0,2% w/v trong
THỨ 5,7 TIẾT 7-11

Số lượng
10

5
1
0,5
0,5
1

Page 9

Đơn vị
g
g
g
g
ml
ml


Thí nghiệm vi sinh thực phẩm
ethanol)
Chloramphenicol
Agar
Nước cất
pH cuối (25 o C)

0,1
15
1000
7,00,2

g

g
ml

Chloramphenicol để nguội đến 50oC mới bổ sung vào.
Tiệt trường môi trường ở 121oC trong thời gian 15 phút.
Chú ý:
 Môi trường có chứa dichloran và rose Bengal nên ức chế sự kéo dài khuẩn ty nấm
mốc mọc nhanh, vì thế cho phép phát hiện những nấm mốc mọc chậm.
 Rose Bengal là chất dễ bị phân huỷ trong ánh sáng, nên cần giữ môi trường trong tối.
 Choloramphenicol thường có tác dụng kìm khuẩn, nhưng có thể diệt khuẩn ở
nồng độ cao hoặc đối với vi khuẩn nhạy cảm cao. Chloramphenicol ức chế
tổng hợp protein của những vi khuẩn nhạy cảm bằng cách gắn vào tiểu thể
50S của ribosom.
 Rose Bengal thường được sử dụng là những tác nhân ức chế vi khuẩn.
SPW (SaltPepton Water): môi trường tăng sinh.
Thành phần
Số lượng
Đơn vị
NaCl
85
g
Pepton
10
g
Nước cất
1000
ml
o
Tiệt trùng môi trường ở 121 C trong thời gian 15 phút.
Lưu ý khi pha: do thành phần của PCA và DRBC có agar nên khi pha môi trường phải kết

hợp với gia nhiệt để cho agar hoà tan đồng đều.
Sau khi pha xong:
• PCA: màu vàng.
• DRBC: màu đỏ.
• SPW: màu vàng.
2.2 Phân loại môi trường:
2.2.1 Phân loại môi trường nuôi cấy vi sinh vật theo cấu trúc:
a Môi trường lỏng:
Thường dung để tăng sinh hoá, nhân giống thứ cấp, lên men,…của VSV. Môi
trường lỏng không chứa chất làm đặc môi trường, như: agar, getalin….
b Môi trường rắn
Ngoài các thành phần dinh dưỡng, môi trường rắn là môi trường có thêm
thành phần làm đặc (agar, gelatin….). người ta thường dung loại môi trường này
phân lập VSV, quan sát khuẩn lạc, định lượng VSV (trong phân tích các chỉ tiêu tổng
số vi khuẩn hiếu khí, tổng số nấm men, nấm mốc…), hay nghiên cứu những đặc tính
khác của VSV.
c Môi trường bán rắn
THỨ 5,7 TIẾT 7-11

Page 10


Thí nghiệm vi sinh thực phẩm
Giống như môi trường bán rắn có hàm lượng chất làm đặc ít hơn nên cấu trúc
của môi trường mềm và xốp hơn. Người ta thường dung nó trong việc xác định khả
năng chuyển động của VSV.
2.2.2 Phân loại môi trường nuôi cấy VSV theo thành phần:
a Môi trường tổng hợp: (nấm men, nấm mốc…)
Là loại môi trường có thành phấn hoá học xác định, được pha chế từ những
hoá chất tinh khiết.

Vd: môi trường nuôi cấy nấm men, nấm mốc Czapek-dox (được thay bằng
DRBC).
b Môi trường tự nhiên
Là loại môi trường chứa các thành phần có nguồn gốc từ tự nhiên, không có
thành phần hoá học rõ rang.
c Môi trường bán tổng hợp:
Là loại môi trường vừa có một số thành phần hoá học xác định vừa có một số
thành phần có nguồn gốc tự nhiên gồm những hỗn hợp chất chưa xác định rõ.
2.2.3 Phân loại môi trường nuôi cấy VSV theo công dụng:
a Môi trường tiền tăng sinh:
Là môi trường lỏng dùng để tăng sinh không có tính chọn lọc, làm giàu mật độ
của các VSV hiện diện trong mẫu. Loại môi trường này giàu dinh dưỡng không có các
chất ức chế tăng trưởng chọn lọc, có tác dụng phục hồi và giúp sự tăng trưởng đồng
thời của nhiều loại VSV hiện diện trong thực phẩm nhưng ít nhiều bị tổn thương
trong quá trình chế biến và bảo quản thực phẩm.
b Môi trường tăng sinh
Là môi trường lỏng dùng để tăng sinh chọn lọc đối tượng VSV cần kiểm
nghiệm và ức chế sự tăng trưởng của các loại VSV khác do có chứa các chất ức chế
tăng trưởng đặc hiệu.
c Môi trường chọn lọc
Là môi trường rắn dùng để phân lập các khuẩn lạc đơn của đối tượng cho VSV
mục tiêu. Thông thường để phân lập và xác định VSV, người ta sử dụng môi trường
có mức chọn lọc khác nhau. Các môi trường phân lập khác nhau có mức chọn lọc
khác nhau. Mức độ chọn lọc có thể kiểm soát bằng các chất ức chế tăng trưởng,
thành phần môi trường, nhiệt độ, oxi…
d Môi trường phân biệt
Là môi trường rắn có chỉ thị giúp cho sự phát hiện dễ dàng đối tượng VSV mục
tiêu.
e Môi trường chọn lọc – phân biệt
Là môi trường kết hợp giữa công dụng chọn lọc và phân biệt nhờ sử dụng kết

hợp các hoá chất khác nhau.
f Môi trường thử nghiệm sinh hoá

THỨ 5,7 TIẾT 7-11

Page 11


Thí nghiệm vi sinh thực phẩm
Là môi trường dùng để xác định một hoặc một vài đặc điểm sinh hoá của
chủng VSV đã được phân lập và làm thuần, tạo cơ sở để định danh chủng phân lập.
g Môi trường đông khô thương phẩm
Là môi trường được pha chế sẵn (có thể là tổng hợp hoặc bán tổng hợp) dạng
khô với các thành phần được định sẵn bởi nhà sản xuất. Cho nên, các loại môi trường
đông khô này hạn chế sự biến động các thành phần của môi trường. Người ta
thường dung những loại môi trường này để phân tích VSV.

2.3 Phân phối môi trường vào ống nghiệm, và bình tam giác:
 Cho 90ml mỗi loại môi trường PCA, DRBC, SPW vào bình tam giác,sau đó đậy nút
bông không thấm nước và nắp bình tam giác.
 Cho 10ml mỗi loại môi trường PCA, DRBC, SPW vào bình ống nghiệm,sau đó đậy nút
bông và nắp ống nghiệm. Chú ý khi phân phối vào ống nghiệm phải làm nhanh vì
cho dung dịch vào với thể tích ít dung dịch sẽ mau đông.
 Sau đó đem ống nghiệm chứa PCA, DRBC đi hấp tiệt trùng.
 Sau khi hấp xong ta đặt ống nghiêm chứa PDA, DRBC nghiêng <25 0 (để tạo bề
mặt rộng hơn cho việc nuôi cấy vi sinh vật) và một số ống để bình thường. Khi
nghiêng ống môi trường dâng lên cách miệng ống 2 – 3 cm tức là 2/3 ống
nghiệm. Không được để môi trường chảy gần nút bông và miệng ống.
Thạch đặt nghiêng
 Nhúng nước vào bông thấm nước, đắp lên ống nghiệm đã được đặt nghiêng để môi

trường mau đông.

THỨ 5,7 TIẾT 7-11

Page 12


Thí nghiệm vi sinh thực phẩm

2.3 Quan sát kính hiển vi:
2.3.2 Nắm rõ cấu tạo của kính hiển vi:

Cấu tạo kính hiển vi

Cấu tạo:
- Thị kính: nơi đặt mắt nhìn.
- Vật kính: nơi kề sát với mẫu quan sát, tiếp nhận ánh sang từ mẫu vật đi qua.
- Bàn mẫu: nơi chứa phiến kính có chứa mẫu cần quan sát.
- Tụ quang: nơi tiếp nhận ánh sang từ nguồn sang (đèn) để hội tụ lại thành chùm
sáng hẹp.
- Ốc tụ quang: điều chỉnh tụ quang lên hay xuống khi quan sát mẫu nhuộm màu
hay mẫu sống.
- Ốc chỉnh thô (ốc thứ cấp): nâng lên hay xuống khi quan sát mẫu nhuộm hay mẫu
sống.
- Ốc chỉnh tinh (ốc vi cấp): giống như ốc chỉnh thô nhưng thay đổi tiêu cự ở tốc độ
vi cấp cho phép nhìn được ảnh nét hơn.
2.3.2 Cách cho tiêu bản sống lên lame:
 Rửa sạch lame và lamelle bằng cồn 70o, sau đó lau sạch.
 Nhiễu một giọt tiêu bản sống lên lame,
 Đậy lamelle lên tiêu bản sống: đặt lamelle nghiêng 1 góc 45 0 so với lame, hạ lamelle

từ từ xuống lame.
THỨ 5,7 TIẾT 7-11

Page 13


Thí nghiệm vi sinh thực phẩm
 Đặt lame lên bàn mang vật rồi điều chỉnh kinh hiển vi cho đến khi thấy được nấm
men.

Hình ảnh quan sát được trên kính hiển vi.

Câu hỏi 1: Môi trường DRBC là môi trường gì? Tại sao môi trường DRBC lại ức chế
vi khuẩn?
Môi trường DRBC là môi trường chọn lọc (chọn lọc nấm men, nấm mốc ức chế ci
khuẩn)
Trả lời: Vì trong thành phần của DRBC có chứa Chloramphenicol và Rose Bengal.
 Choloramphenicol thường có tác dụng kìm khuẩn, nhưng có thể diệt khuẩn ở nồng
độ cao hoặc đối với vi khuẩn nhạy cảm cao. Chloramphenicol ức chế tổng hợp
protein của những vi khuẩn nhạy cảm bằng cách gắn vào tiểu thể 50S của ribosom.
 Rose Bengal thường được sử dụng là những tác nhân ức chế vi khuẩn.
Câu hỏi 2: Trong kỹ thuật nuôi cấy VSV, mỗi loài hoặc mỗi nhóm VSV khác
nhau, tại sao cần phải pha chế các loại chất khác nhau và hàm lượng cũng khác
nhau?
Trả lời: Vì môi trường dinh dưỡng của vi sinh vật gồm nhiều thành phần dinh dưỡng cần
thiết khác nhau, các vi sinh vật khác nhau có những yêu cầu không giống nhau về các chất
dinh dưỡng (tuỳ thuộc vào nhu cầu của từng loại vi sinh vật) cho nên có rất nhiều công
thức pha chế môi trường nuôi cấy với các loại chất khác nhau và thành phần cũng khác
nhau.

THỨ 5,7 TIẾT 7-11

Page 14


Thí nghiệm vi sinh thực phẩm

BUỔI 3. KỸ THUẬT GIEO CẤY VÀ PHÂN LOẠI VI SINH VẬT
3.1 Kỹ thuật gieo cấy:
3.1.1 Mục tiêu:
• Thực hiện được thí nghiệm lấy mẫu phân tích.
• Thực hiện được kỹ thuật pha loãng bậc 10.
• Thực hiện được kỹ thuật hộp trãi và hộp đổ.
3.1.2 Nguyên tắc nuôi cấy vi sinh vật:
• Mọi thao tác nuôi cấy đều phải thực hiện trong điều kiện vô trùng để tránh tạp
nhiễm vi sinh vật không mong muốn từ môi trường ngoài.
• Môi trường và dụng cụ cấy đều phải được khử trùng triệt để.
3.2 Kỹ thuật pha loãng mẫu:
0.1 ml

THỨ 5,7 TIẾT 7-11

Page 15


Thí nghiệm vi sinh thực phẩm

10
m
l

n
ư
ớc

1 ml

1 ml

1 ml

90
m
l
S
P

9
m
l
S
P

9
m
l
S
P

9
m

l
S
P
W

Đĩa petri

 Dùng pipetteman với đầu tip vô trùng hoặc pipette 1ml vô trùng hút 1ml dịch mẫu
vào ống nghiệm để được các ống nghiệm tiếp theo. Sử dụng các đầu típ khác nhau
khi hút ở các nồng độ khác nhau vì khi hút có thể có 1 lượng vsv trên thành típ mà
mắt thường không nhìn thấy được ảnh hưởng đến kết quả cấy.
 Thay vì dùng nước cất ta có thể sử dụng môi trường tăng sinh để pha loãng.

3.3 Các phương phấp cấy:
Các loại môi trường gieo cấy:

THỨ 5,7 TIẾT 7-11

Page 16


Thí nghiệm vi sinh thực phẩm

 Đối với những ống nghiệm chứa thạch đứng thường dùng để cấy sâu đối với các vi
sinh vật kị khí.

THỨ 5,7 TIẾT 7-11

Page 17

Thí nghiệm vi sinh thực phẩm

3.4 Quy trình cấy:
3.4.1 Dụng cụ và dung dịch cần chuẩn bị:
• Bếp cồn
• Quay trang
• Cồn 98o
• Cồn 70o
• Pipetteman với đầu tip vô trùng.

3.4.2 Đổ đĩa:
Chuẩn bị :
• Cồn 70 o
• Đèn cồn
• Bình chứa môi trường đã được hấp.
• Đĩa petri đã vô trùng.
3.4.3 Tiến hành đổ đĩa:
Bước 1: Vô trùng bàn đặt dụng cụ và tay bằng cồn 70o
Bước 2:Một tay cầm bình chứa môi trường thạch từ từ xoay tròn và mở nắp
bình rồi nung nhẹ trước ngọn đèn cồn (450C-500 C)cho thạch tan ra.
Bước 3: Tay còn lại cầm đĩa petri trong điều kiện vô trùng( hoặc gần ngọn đèn cồn) từ
từ mở hé nắp petri rồi rót nhẹ dung dịch thạch từ bình vào petri, tạo trên bề mặt petri 1
lớp môi trường thạch lỏng (thực hiện trong điều kiện vô trùng).
Bước 4: Đậy nắp petri và bảo quản cho đến khi thạch đông lại.
Lưu ý:
THỨ 5,7 TIẾT 7-11

Page 18

Thí nghiệm vi sinh thực phẩm
 Lúc đang đổ đĩa không được nói để tránh bị lây nhiễm từ ngoài vào mẫu cấy.
 Đánh dấu môi trường được đỗ vào từng đĩa tránh nhầm lẫn về sau.
3.4.4 Tiến hành cấy:
• Lấy các đĩa Petri chứa môi trường ra.
• Dùng cồn 70o triệt trùng tay và xung quanh khu vực đặt dụng cụ cấy.
• Triệt trùng quay trang bằng cách dùng cồn 90 o đổ ra cốc nhỏ rồi ngâm quay trang
vào.
Bước 1: Dùng micropipette và đầu tip vô trùng hút 0,1 ml dịch VSV lên bề mặt môi
trường thạch đĩa petri trong không gian vô trùng (hoặc gần ngọn đèn cồn).
Bước 2: Lấy đầu quqy trang trong cốc chứa cồn ra đốt trên ngọn đèn cồn làm đi làm lại
3 lần để triệt trùng quay trang, để dầu quay trang nguội trong môi trường vô trùng…
Bước 3: Sau đó từ từ mở đĩa petri ra đưa đầu quay trang vào,dùng quay trang gạt đều,
xoay tròn và nhè nhẹ giọt VSV khắp mặt thạch tránh làm vỡ mặt thạch.
Bước 4: Rút quay trang ra khỏi đĩa, đậy đĩa, gói giấy , đánh dấu nhóm VSV được nuôi
cấy để tránh nhầm lẫn nồng độ dung dịch VSV, môi trươg và đi bảo lưu ở nhiệt độ và
thời gian thích hợp với VSV được nuôi cấy.

THỨ 5,7 TIẾT 7-11

Page 19


Thí nghiệm vi sinh thực phẩm

Lưu ý:
Lúc đang cấy không được nói để tránh bị lây nhiễm từ ngoài vào mẫu cấy.
Đánh dấu mẫu vật được nuôi cấy trước khi đi bảo lưu để tránh nhầm lẫn về sau.
3.5 Định lượng VSV (Phương phápđếm khuẩn lạc):

3.5.1 Phương pháp đếm khuẩn lạc:
− Bước 1: Lấy kết quả từ các đĩa đã cấy trãi, chịn đếm đĩa Petri.
− Bước 2: Dùng viết long hoặc máy đếm khuẩn lạc.
− Bước 3: Mỗi khuẩn lạc đếm được đánh dấu một chấm mực bằng bút đếm khuẩn lạc.
− Bước 4: Khi có tổng số khuẩn lạc ở các đĩa Petri thì dùng công thức sau suy ra số lượng
VSV có trong một đơn vị trọng lượng hay thể tích thực phẩm.
Mật độ tổng vi khuẩn hiếu khí trên 1g mẫu được tính như sau:

A(CFU/g)=
Trong đó: A là số tế bào vi khuẩn /1g mẫu
THỨ 5,7 TIẾT 7-11

Page 20


Thí nghiệm vi sinh thực phẩm
N là tổng số khuẩn lạc trên các đĩa đã chọn
là số lượng đĩa cấy tại 1 độ pha loãng
V là thể tích dịch cấy vào Petri.
là độ pha loãng tương ứng.
3.6 Kết quả thực nghiệm :

Độ pha loãng

Độ pha
loãng
Độ pha loãng ()
Đĩa số 1

335

60
 Áp dụng công thức
ta có kết quả:
= (CFU/g)

=(CFU/g)
 Nhận xét:
Độ pha loãng càng lớn mật độ khuẩn lạc càng thưa dần.
4 Câu hỏi:
1 Tại sao lại dùng cồn 70o để triệt trùng môi trường và tay trước khi cấy mà không
dùng cồn 98o?
 Trả lời: có 3 lí do nên dùng cồn 700:
- Môi trường cấy là môi trường vô trùng và người ta có thể thực hiện quá trình cấy
gần ngọn đèn cồn nếu dùng cồn 98o để triệt trùng dụng cụ và tay có thể phực lửa gây
cháy nguy hiểm cho người cấy và phòng thí nghiệm và có thể làm hại đến VSV cần
nuôi cấy.

THỨ 5,7 TIẾT 7-11

Page 21


Thí nghiệm vi sinh thực phẩm
- Cồn 700 có thể tạo không gian vô trùng cho bàn cấy và tay người. Nếu dùng cồn
980 tay có cảm giác nóng khó chịu.
- Tiết kiệm được nguồn nguyên liệu vì có thể dùng cồn 98 0 để pha cồn 700 với thể
tích lớn hơn.
2. Tại sao nên đổ thạch ở nhiệt độ 40-50 0? Đĩa petri khi đổ môi trường (đã đông) nên
đặt úp hay đặt ngửa mặt thạch? Vì sao?

 Trả lời:
Nên đổ thạch ở nhiệt độ thích hợp. Nếu đổ nóng quá sẽ khó khăn cho quá trình cầm đĩa
thao tác làm nguy hiểm đồng thời thạch lâu đông. Nếu đổ quá nguội thạch sẽ dễ đông
làm bề măt thạch không đồng đều.
Khi đổ môi trường nên đặt ngửa vì:
Quá trình đổ thạch nóng làm bốc hơi nước và hơi nước tích tụ trên bề mặt nắp lớn. Viêc
để úp(nắp lớn trên, nắp nhỏ dưới) sẽ làm cho hơi nước tích tụ trên nắp lớn rớt xuống tạo
điều kiện cho vsv khác phát triển khi chưa cấy VSV làm ảnh hưởng kết quả cấy. Vì vậy
nên để ngửa
Khi đã cấy xong có thể để úp vì lúc đó đã có vsv có thể dùng nước đó để phát triển tốt
hơn.
2 Tại sao phải dùng đèn cồn để vô trùng bàn và dụng cụ cấy cũng như trong suốt
quá trình thao tác?
Trong quá trình đổ môi trường và cấy giống thì những vsv bên ngoài rất dễ xâm nhập làm
ảnh hưởng kết quả vì vậy không những phải khử vô trùng cho dụng cụ cấy mà bàn cấy, que
cấy cũng phải vô trùng, đồng thời khi cấy cần đặt miệng ống nghiệm, bình tam giác gần kế
bên đèn cồn vì nhiệt độ cao đèn cồn đã khử được vsv xung quanh môi trường vì thế vsv bên
ngoài không bị nhiễm.

BUỔI 4: LÊN MEN LACTIC
4.1 Lên men lactic
Lên men latic là quá trình chuyển hóa kỵ khí đường với sự tích lũy acid lactic trong môi
trường. Con người đã biết ứng dụng hiện tượng này từ lâu để chế biến các loại thức ăn chua
( sữa chua, muối dưa, muối cà,…), ủ chua thức ăn cho gia súc hay sản xuất acid lactic phục vụ
cho ngành công nghiệp thuộc da, dệt nhuộm, công nghệ thực phẩm,…

THỨ 5,7 TIẾT 7-11

Page 22

Thí nghiệm vi sinh thực phẩm
Các vi khuẩn lactic được xếp chung vào họ Lactobacteriaceae. Mặc dù các loại vi khuẩn này
không đồng nhất với nhau về mặt hình thái( hình que ngắn, dài, hình cầu), song về mặt sinh lí
chúng lại tương đối đồng nhất. Tất cả đều là những vi khuẩn gram +, không tạo bào tử và hầu
hết không di động. Thu nhận năng lượng từ việc phân giải hydrocacbon và tiết ra acid lactic.
4.2 Cơ chế lên men lactic
Khi thủy phân đường trong điều kiện kỵ khí, VSV lactic chuyển hydro từ NADH sang
Pyruvate tạo thành acid lactic để tái tạo NAD+
NAD
H
C6H12O6

CH3COOH

NAD
+
CH3-CHOH-COOH + Q

Căn cứ vào sản phẩm sinh ra, quá trình lên men lactic được chia làm 2 kiểu:
∗ Lên men lactic đồng hình
Các vi khuẩn lactic đồng hình chuyển hóa đường tạo thành sản phẩm chủ yếu là acid lactic
(95%)
VSV lên men lactic đồng hình:
Giống Streptococus: S. cremoris, S. lactic, S.thermophillus…
Giống Lactobacillus: L. Bulgaricus, L. acidophilus, L.platarum…
∗ Lên men lactic dị hình
Khi lên men các vi khuẩn chỉ tạo ra 60% acid lactic phần còn lại là acid acetic, rượu etanol,
Glyxerin và một số sản phẩm khác.
VSV lên men lactic dị hình: Lactobacillus brasiacar fermentatae, Leuconostoc

memsenterioides, Escherichia Coli,…

4.3 Qui trình làm sữa chua
Nguyên liệu
– 1 bịch sữa tươi
– Sữa đặc có đường: 1 hộp
– 2 hộp sữa chua giống dùng để gây men.
– Các bao nhỏ để đựng sữa chua.
Cách bước làm sữa chua:
THỨ 5,7 TIẾT 7-11

Page 23


Thí nghiệm vi sinh thực phẩm
–
+
+
+
+

Bước 1
Đun sôi nước
Cho 1 hộp sữa đặc có đường
Dùng lại lon sữa bò đã khui, đong 3 lon nước sôi và khuấy đều theo một chiều.
Cho tiếp bịch sữa tươi vào khuấy

Hình 3.1 Rót nước sôi, sữa tươi vào trộn đều

- Bước 2

+ Khi hỗn hợp đạt đến nhiệt độ khoảng 30– 35 độ C, cho 2 hộp sữa chua vào, để tránh
nóng quá làm chết vi khuẩn lên men
+ Tiếp tục khuấy đều cho đến khi hỗn hợp đều (không để sôi) thì nhắc nồi xuống khỏi
bếp.

– Bước 3
+ Đổ sữa chua vào các bao nhỏ chuẩn bị sẵn, bọc kín các lọ này lại.
Cách làm này có tác dụng giữ vệ sinh và ủ sữa chua được kín thì sữa chua mới lên
men tốt được.

THỨ 5,7 TIẾT 7-11

Page 24


Thí nghiệm vi sinh thực phẩm

Hình 3.2 Sữa chua
– Bước 4
+ Đun một nồi nước ấm
+ Đặt các bao sữa chua này vào nồi nước
+ Dùng nắp đậy nồi này lại để ủ sữa chua khoảng 4 – 10 giờ đồng hồ.
– Bước 5
Khi nào thấy các sữa chua sệt sệt
+ Lấy sữa chua ra và bỏ vào ngăn mát tủ lạnh khoảng 4 giờ là có thể sử dụng được.
Chú ý:
Đo pH trước và sau khi lên men để xem sữa chua có sự thay đổi nồng độ acid hay
không.
4.4 Qui trình làm cơm rượu
Nguyên liệu

– 2kg nếp
– Men ngọt
– Hủ nhựa có nắp
Cách bước làm cơm rượu:
– Bước 1
+ Ngâm nếp
+ Nấu nếp: không đổ nước nhiều làm nhão xôi hoặc quá ít sẽ khô không vò viên được.
Nấu phải thật khéo: xôi nát ,rượu sẽ chua ; xôi khô, cơm rượu sẽ sượng.
+ Bới xôi ra mâm, khay... trải mỏng xôi ra cho xôi mau nguội.
– Bước 2
+ Giã nhuyễn viên men
+ Khi xôi nguội thì rây men đều lên mặt cơm nếp. Lưu ý là xôi phải nguội, nếu xôi
còn nóng thì men sẽ bị "chết", không thành rượu được.

THỨ 5,7 TIẾT 7-11

Page 25