Tài liệu Đề tài: ỨNG DỤNG VI SINH VẬT TRONG SẢN XUẤT RƯỢU VANG doc

1
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH
KHOA MÔI TRƯỜNG VÀ TÀINGUYÊN
  
MÔN: VI SINH VẬT MÔI
TRƯỜNG
BÁO CÁO CHUYÊN ĐỀ
VI SINH VẬT TRONG SẢN XUẤT RƯỢU
VANG
GV: ThS NGUYỄN NGỌC TÂM HUYÊN
NHÓM: LỚP
DH10QM
1/ LÊ VĂN ĐỒNG
(10149045)
2/ NGUYỄN VŨ LINH
(10149099)
3/ HỒNG HẢI VINH
(10149248)
4/ LÊ THỊ HỘI
(10149070)
5/ BÙI KIM THÀNH
(10149175)
DH10QM Ứng dụng của vsv trong sản xuất rượu vang1
2
MỤC LỤC TRANG
CHƯƠNG I: ĐẶT VẤN ĐỀ 3
I.1.Tình hình chung 3
I.2. Lịch sử hình thành và phát triển của rượu vang 3
I.3. Giới thiệu về công nghệ lên men 4
I.4. Mục tiêu 4
CHƯƠNG II ỨNG DỤNG VSV TRONG SẢN XUẤT RƯỢU VANG 12

II.1. Sơ lược về quá trình lên men 5
II.2. Nguyên liệu 12
II.3. Vi Sinh Vật Trong Quá Trình Sản Xuất Rượu Vang 17
II.4. Môt số tiêu chuẩn chọn và theo dõi quá trình lên men 26
II.5. Một số yếu tố ảnh hưởng tới nấm men trong quá trình sản xuất rượu vang.
28
II.6. Phân loại rượu vang và tác dụng của rượu vang 29
II.7. Bảo quản rượu vang 34
CHƯƠNG IV: KẾT LUẬN 37
TÀI LIỆU THAM KHẢO 38

DH10QM Ứng dụng của vsv trong sản xuất rượu vang2
3
CHƯƠNG I: ĐẶT VẤN ĐỀ
I.1.Tình hình chung
Ngày nay, khi nền kinh tế ngày càng phát triển, mức sống con người
được nâng cao thì nhu cầu ăn uống của con người ngày càng được quan tâm
và đòi hỏi các mặt hàng không những phải đa dạng phong phú mà còn phải
có tính dược phẩm, dinh dưỡng.
Hiện nay, các thức uống chế biến từ các loại trái cây đang có xu
hướng tiêu thụ ngày càng cao trên thế giới. Do nó có nhiều ưu điểm so với
các loại nước uống khác: chứa nhiều vitamin, muối khoáng, các dạng đường
đơn giản dễ tiêu hóa, có hương vị thơm ngon tự nhiên hấp dẫn; vừa có giá tri
dinh dưỡng cao vừa có tác dụng chữa bệnh, có thể chống ngô độc, chống
ung thư,…
Thức uống trái cây có nhiều dạng khác nhau về tính chất sản phẩm và
công nghệ chế biến như nước trái cây tự nhiên, necta quả, nước quả cô đặc,
sirô quả, rượu vang,… Trong đó rượu vang nho là loại thứ uống rất được ưa
chộng với hương vị thơm ngon và tính giải khát. Đây là nước uống lên men
từ một phần dịch trái cây. Nó có độ cồn thấp, giàu chất dinh dưỡng. Việc chế

biến rượu vang từ nho được thực hiện rất lâu đời ở nhiều nơi trên thế giới
nhất là các nước Châu Âu đặc biệt là Pháp. Nhưng ở nước ta, sản phẩm rượu
vang vẫn chưa được quan tâm nhiều, qui mô sản xuất chủ yếu dưới dạng thủ
công, lên men tự nhiên chưa có cơ sở khoa học cũng như phương pháp hợp
lí dẫn đến năng suất cũng như chất lượng sản phẩm chưa cao.
I.2. Lịch sử hình thành và phát triển của rượu vang
•Các nhà khảo cổ học cho rằng, rượu vang có xuất xứ từ khu vực
Capcazơ và Trung Đông khoảng 8000 năm về trước.
•Khoảng năm 2000 TCN, sản xuất rượu vang du nhập tới Hy Lạp và sau
đó truyền bá khắp Địa Trung Hải bởi đế chế La Mã.
•Đầu thế kỉ XVI, các nhà thám hiểm Châu Âu đã mang nho tới Châu Mỹ.
• Năm 1530, những người Tây Ban Nha xâm chiếm Trung và
Nam Mỹ bắt đầu trồng nho ở Mexico, Argentina, Peru và Chile.
• Năm 1655, nho được người Hà Lan trồng trọt trên thuộc địa của
mình tại Mũi Hảo Vọng (Nam Phi).
DH10QM Ứng dụng của vsv trong sản xuất rượu vang3
4
• Việc trồng nho ở Úc và New Zealand được tiến hành vào năm
1813.
Ngành sản xuất rượu vang được phát triển ở tất cả các nơi mà thực
dân Châu Âu đặt chân tới.
Danh từ rượu vang được dùng để chỉ loại rượu lên men từ dịch ép trái
cây (nho, dâu, thơm, táo, lê,…) với một số chủng nấm men. Rượu vang thu
được không qua chưng cất, có hương vị thơm ngon của trái cây tự nhiên, có
độ cồn nhẹ (10-15%) là loại nước giải khát thơm ngon giàu chất bổ dưỡng.
Rượu vang là loại rượu không chưng cất có truyền thống lâu đời được
sản xuất nhờ sự lên men bởi chủng tự nhiên S.cerevisiae hay do các loại nấm
men tự nhiên như Saccharomyces sp, Zygosaccharomyces sp,…
Ngoài ra còn có các loại rượu khác như sake, rượu cần, rượu cognac,
rượu đế,rượu nếp than …

I.3. Giới thiệu về công nghệ lên men
1.3.1. Công nghệ lên men
Việc nuôi cấy vi sinh vật với quy mô lớn (trong khoảng 10lít đến
1.000.000lít) thường được gọi là lên men công nghiệp (industrial
fermentation). Công nghệ lên men công nghiệp được hình thành từ cuối thể
kỉ XIX và phát triển mạnh trong nửa cuối thế kỉ XX với hàng loạt thương
phẩm.
 Các công đoạn chính của quá trình lên men:
- Trước khi lên men: Xử lí, chế biến, phối trộn và khử trùng nguyên liệu
ban đầu.
- Lên men: trong bioreactor được thông khí tốt (cần phá bọt), trong dịch
lên men diễn ra quá trình nguyên khối, truyền nhiệt, tăng sinh khối tế bào và
điều chỉnh hoạt sinh học để tạo nhiều sản phẩm mục tiêu.
- Sau lên men: Tách tế bào bằng ly tâm hay lọc, phải phá vỡ tế bào để giải
phóng chất nội bào; tủa, tinh sạch các chất; thực hiện phản ứng bổ sung tạo
đúng thương phẩm; tinh chế; sấy; thương phẩm ở dạng hoàn chỉnh được
bảo quản; tận dụng phụ phế phẩm.
I.3.2. Ứng dụng của quá trình lên men
Công nghệ lên men có ứng dụng rất rộng rãi thể hiện ở việc có rất
nhiều sản phẩm được tạo ra từ công nghệ lên men. Sau đây là một số sản
phẩm từ công nghệ lên men.
DH10QM Ứng dụng của vsv trong sản xuất rượu vang4
5
1/ Trong sản xuất sinh khối nhờ vi sinh vật
2/ Sản xuất men bánh mì
3/ Sản xuất phân vi sinh
4/Chế phẩm diệt côn trùng (Insecticides)
5/ Chế phẩm trợ sinh
6/Trong công nghiệp vaccine
7/ Công nghệ sản xuất nhiên liệu

8/ Sản xuất Metabolite sơ cấp
9/Sản xuất thuốc kháng sinh
10/Sản xuất các biopolymer và biosurfeactan
11/Công nghệ sinh học khai khoáng
12/Sản xuất các biopolymer và biosurfeactant
13/Công nghiệp rượu bia và cồn nhiên liệu
Hình 1: Nhà máy sản xuất ethanol quy mô nhỏ.

I.4. Mục tiêu
Thông qua chuyên đề này, chúng ta sẽ tìm hiểu khái quát về công
nghệ lên men, cơ chế của quá trình lên men, những ứng dụng trong thực tế
đời sống,… Qua đó, hiểu rõ hơn về rượu vang, quá trình sản xuất cũng như
thành phần và giá trị dinh dưỡng của rượu vang - một trong những ứng dụng
của công nghệ lên men.
DH10QM Ứng dụng của vsv trong sản xuất rượu vang5
6
CHƯƠNG II ỨNG DỤNG VSV TRONG SẢN XUẤT RƯỢU VANG
II.1. Sơ lược về quá trình lên men
a/Khái niệm
Lên men là một quá trình trao đổi chất dưới tác dụng của các enzyme
tương ứng gọi là chất xúc tác sinh học. Tùy theo sản phẩm tích tụ sau quá
trình lên men mà người ta chia làm nhiều kiểu lên men khác nhau. Tuy nhiên
có hai hình thức lên men chính là lên men yếm khí và lên men hiếu khí.
b/Quá trình lên men.
Các giai đoạn chính trong quá trình lên men
Một số khâu chính trong quy trình
 Giống vi sinh vật
Trong lên men công nghệ, bên cạnh có một quy trình hợp lý, thì vấn
đề giống là khâu quan trọng, quyết định giá trị kinh tế của quy trình sản
xuất. Người ta sử dụng rộng rãi một phổ rộng gồm nhiều loại vi sinh vật

DH10QM Ứng dụng của vsv trong sản xuất rượu vang6
Nhân giống
(cấp 1, 2, 3…)
Lên men
Kiểm tra sự tạo
thành sản phẩm
Thu hồi sản phẩm
Khử trùng môi trường
Chế tạo môi trường
Giống vi
sinh vật
7
thuộc nhóm Procaryote (vi khuẩn, xạ khuẩn,…) và Eucaryote (nấm men, tảo,
…).
- Tiêu chuẩn chọn giống
+ Năng suất sinh tổng hợp một chất nào đó hay tạo sinh khối với
hiệu suất cao.
+ Có khả năng sử dụng được các nguyên liệu rẻ tiền, dễ kiếm.
+ Trong quá trình lên men không tạo sản phẩm phụ không mong
muốn.
+ Ít mẫn cảm đối với sự tập nhiễm do vi sinh vật khác và phage.
+ Có sản phẩm hay sinh khối có thể tách dễ dàng ra khỏi môi trường
dinh dưỡng.
- Các phương pháp giữ giống chính
+ Bảo quản trên môi trường thạch, định kỳ cấy chuyền.
+ Giữ giống trong cát hoặc đất sét vô trùng.
+ Giữ giống bằng phương pháp lạnh đông.
+ Giữ giống bằng phương pháp đông khô.
 Nhân giống vi sinh vật
- Giống là tế bào sinh dưỡng: sử dụng phương pháp nuôi cấy dịch thể

(nuôi cấy chìm).
- Giống là bào tử (đối với xạ khuẩn và nấm mốc): Thông thường
người ta thực hiện nhân giống thu bào tử trên môi trường đặc (nuôi cấy bán
rắn có cám, bột bắp, thóc, trấu,…).
 Lên men
Đây là khâu quyết định kết quả của một quá trình lên men. Để thực
hiện lên men, người ta thường sử dụng hai phương pháp chủ yếu sau: lên
men bề mặt và lên men chìm.
- Lên men bề mặt: thực hiện nuôi cấy vi sinh vật trên bề mặt môi
trường dịch thể hoặc môi trường bán rắn.
+ Nuôi cấy bề mặt sử dụng môi trường dịch thể (dùng cho vi sinh
vật hiếu khí): Phương pháp lên men này yêu cầu thiết bị đơn giản, nhưng đòi
hỏi diện tích sử dụng lớn, khó tự động hóa quy trình sản xuất nên ít được sử
dụng.
DH10QM Ứng dụng của vsv trong sản xuất rượu vang7
8
+ Nuôi cấy bề mặt sử dụng môi trường bán rắn hay lên men bán rắn
(có thề dùng cho vi sinh vật hiếu khí và kị khí). Phương pháp này được các
nước đang phát triển sử dụng nhiều.
 Nguyên liệu: các loại hạt, các loại phế liệu,…
 Phương pháp này sử dụng để: sản xuất kháng sinh, sản xuất
enzym từ nấm mốc, đường hóa tinh bột để sản xuất rượu ethanol từ nấm
men.
- Lên men chìm
+ Dùng cho cả vi sinh vật hiếu khí và kị khí.
+ Trong quá trình lên men, liên tục theo dõi và thực hiện một số
công việc sau
 Thực hiện quá trình khuấy đảo và sục khí.
 Theo dõi sự tạo bọt trong lên men và có biện pháp phá bọt.
 Điều chỉnh pH của môi trường lên men.

 Theo dõi và điểu chỉnh nhiệt độ của môi trường lên men.
 Tiếp thêm nguyên liệu và bổ sung các chất tiền thể.
 Thu hồi sản phẩm
Các sản phẩm của quá trình tổng hợp vi sinh vật thường được tích lũy
hoặc bên trong tế bào hoặc ở trong pha lỏng của dịch nuôi cấy. Cũng có
trường hợp sản phẩm vừa nằm trong tế bào, vừa nằm trong pha lõng của
dịch nuôi cấy.
Việc đầu tiên sau khi kết thúc lên men là tìm cách tách tế bào vi sinh
vật ra khỏi pha lõng của dịch lên men.
- Nếu là các vi sinh vật có cấu tạo sợi như nấm, tảo…dùng phương
pháp lọc, vớt.
- Nếu là các vi sinh vật đơn bào, có kích thước tế bào nhỏ như nấm
men, vi khuẩn…dùng phương pháp li tâm thường hay li tâm tốc độ cao…
Bản chất hóa học của sản phẩm quyết định phương pháp xử lý tiếp
theo. Thông thường người ta sử dụng các phương pháp sau: chiết rút, hấp
phụ, kết tủa, kết tinh, điện di,…
c/ Quá trình lên men rượu
Lên men rượu là quá trình lên men yếm khí với sự có mặt của nấm men,
chúng sẽ chuyển hóa đường lên men thành ethanol và CO
2
.
DH10QM Ứng dụng của vsv trong sản xuất rượu vang8
9
Quá trình lên men rượu chia làm 2 thời kỳ chính:
- Thời kỳ phát triển sinh khối
- Thời kỳ lên men chuyển đường thành rượu và CO
2

Glucose
Hexokinaza

Glucose – 6 – phosphat
Photphoglucoza isomeraza
Fructose – 6 – phosphat
PhosphoFructokinaza
Fructose – 1,6 – diphosphat
Aldolaza
Triophosphat izomeraza
Glyceraldehyd – 3 – phosphat Dihydro aceton
phosphat
Glyceraldehyd phosphatdehydrogenaza
Acid – 1,3 – diphosphoglyceric
Phosphoglyceratkinaza
Acid – 3 – phosphoglyceric
Phosphoglycerat-mutaza
Acid – 2 – phosphoglyceric
Enoiaza
Acid phosphoenolpyruvic
Pyruvat kinaza
Acid – enol – pyruvic
Acid pyruvic
Pyruvate – decarboxylaza
Ethanal
DH10QM Ứng dụng của vsv trong sản xuất rượu vang9
10
Aldodeshydrogenaza
Ethanol
Hình 2: Cơ chế phân hủy đường trong tế bào nấm men
d/Quá trình sản xuất rượu vang
Hình 3: Công nghệ lên men rượu vang
DH10QM Ứng dụng của vsv trong sản xuất rượu vang10

11
DH10QM Ứng dụng của vsv trong sản xuất rượu vang11
12
II.2. Nguyên liệu
II.2.1. Nho
Trong sản xuất rượu vang, nho là một nguyên liệu truyền thống rất
được ưa thích và có giá trị dinh dưỡng cao. Nho được trồng nhiều ở các
nước Châu Âu nhất là ở Pháp và Mĩ. Ở nước ta nho cũng đã được trồng ở
một số tỉnh miền Trung như Ninh Thuận(chiếm sản lương nhiều nhất)và
đang phát triển nghề trồng nho với đầy triển vọng phía trước.
Trên quả nho có rất nhiều loại nấm men có mặt một cách tự nhiên là
nhân tố chính tham gia vào quá trình sản xuất rượu vang nho lên men tự
nhiên truyền thống.
Quả nho ép được 85 – 95% dịch quả. Nước nho lên men tạo ra một
loại rượu vang có giá trị dinh dưỡng cao, hương vị đặc trưng, thơm ngon và
màu sắc rất đẹp.
Nho có thành phần hóa học trung bình như sau:
- Nước: 70 – 80%
- Đường: 10 – 25% (trong đó chủ yếu là glucose, fructose và
saccharose)
- Acid hữu cơ: 0,5 – 1,7% (chủ yếu là acid malic và factoric)
- Protein: 0,1 – 0,9%
- Pectin: 0,1 – 0,3%
- Khoáng: 0,1 – 0,5%
- Vitamin: C, B
1
, B
2
, PP
- Các hợp chất màu: màu chính là anthocyanin.

- Các hợp chất thơm và một số hợp chất khác.
Nho là loại quả lí tưởng nhất để lên men chế biến rượu vang vì:
- Quả nho có chất lượng, giá trị dinh dưỡng cao, tạo hương vị đậm đà,
đặc trưng.
- Thành phần hóa học trong dịch nho rất thích hợp cho nấm men phát
triển.
- Tỉ lệ dịch nước ép được cao.
DH10QM Ứng dụng của vsv trong sản xuất rượu vang12
13
Bảng 1: Thành phần chủ chốt trong dịch quả nho
Thành phần Nồng độ, đặc điểm
Nguồn cacbon
Glucose
Fructose
Sucrose
Pentose
Pectins
75 – 150 g/l
75 – 150 g/l
Vết
Không lên men được bởi Saccharomyces cerevisiae
Lượng nhỏ
Nguồn nitơ
Acid amin tư do
Ion ammoni
Protein
0,2 – 2,5 g/l
Lượng nhỏ thường thiếu cho nấm men
Lượng nhỏ
Acid hữu cơ

Acid tartaric
Acid malic
2 – 10 g/l: nấm men rượu vang không dùng được
1 -8 g/l: có thể sử dụng một phần bởi nấm men
Khoáng chất
P, K, Mg, S, nguyên tố vi
lượng
Các yếu tố đa lượng và vi lượng đều đầy đủ
Vitamin Nồng độ thấp nhưng đủ cho nấm men
Những thành phần khác Nồng độ Sulphite thường cao
Acid decanoic và octanoic có thể ức chế nấm men
Sterol và acid béo không no có thể là yếu tố hạn chế
DH10QM Ứng dụng của vsv trong sản xuất rượu vang13
14
Bảng 2: Thành phần vitamin của nước nho tươi và của rượu vang nho
II.2.2. Nấm men
Nấm men là tên chung chỉ nhóm nấm men có cấu tạo và sinh sản bằng
cách nảy chồi và phân cắt. Chúng phân bố rộng rãi khắp nơi. Đặc biệt chúng
có mặt nhiều ở đất trồng nho và các nơi trồng hoa quả. Ngoài ra thấy chúng
có mặt trên trái cây chín, trong nhụy hoa, trong không khí và cả nơi sản xuất
rượu vang.
a. Hình dạng và kích thước
 Hình dạng tế bào nấm men
Nấm men thường có hình dạng khác nhau, thường có hình cầu, hình
elip, hình trứng, hình bầu dục và cả hình dài. Một số loài nấm men có tế bào
hình dài nối với nhau thành những dạng sợi gọi là khuẩn ty (Mycelium) hay
khuẩn ty giả (Pseudo mycelium). Tuy nhiên hình dạng của chúng không ổn
định, phụ thuộc vào tuổi của nấm men và điều kiện nuôi cấy.
 Kích thước tế bào nấm men
DH10QM Ứng dụng của vsv trong sản xuất rượu vang14

Vitamin Nước nho
Rượu vang
Trắng, lên men
không xác quả
Đỏ, lên men
có xác quả
Thiamine (B1) – microgram
Riboflavine (B2) – microgram
Acid pantothenic – miligram
Pyridoxine (B6) – miligram
Nicotinamide (PP) – miligram
Biotin (H) – microgram
Cobalamine (B12) – microgram
Acid P-aminobenzoic – microgram
Cholin - miligram
160 – 450
3 – 60
0,5 – 1,4
0,16 – 0,5
0,68 – 2,6
1,5 – 4,2
0
15 – 92
19 – 39
2 – 58
8 – 133
0,55 – 1,2
0,12 – 0,67
0,44 – 1,3
1 – 3,6

0 – 0,16
15 – 133
19 – 27
103 – 245
0,47 – 1,9
0,12 – 0,68
0,13 – 0,68
0,79 – 1,7
0,6 – 4,6
0,04 – 0,1
15 – 133
20 - 43
15
Tế bào nấm men thường có kích thước rất lớn gấp từ 5 – 10 lần tế bào
vi khuẩn.
Kích thước trung bình
- Chiều dài: 9 – 10
µ
m
- Chiều rộng: 2 – 7
µ
m
Kích thước cũng thay đổi, không đồng đều ở các loài khác nhau, ở các
lứa tuổi khác nhau và điều kiện nuôi cấy khác nhau.
b. Cấu tạo tế bào nấm men
Tế bào nấm men cũng như nhiều loại tế bào khác được cấu tạo chủ
yếu từ các phần cơ bản như sau
- Thành tế bào: cấu tạo từ nhiều thành phần khác nhau. Trong đó chủ
yếu là: glucan, manan, protein, lipid và một số thành phần nhỏ khác như
kitin, volutin,…

- Màng nguyên sinh chất: gồm các hợp chất phức tạp như protein,
phospholipit enzyme permeaza…
- Chất nguyên sinh: thành phần cấu tạo chủ yếu là nước, protit, gluxit,
lipit và các muối khoáng, enzyme và có các cơ quan trong đó.
- Nhân tế bào
- Những thành phần – cơ quan con khác: không bào, ty lạp thể,
riboxom,…
c. Sự sinh sản của nấm men
Nấm men có một số hình thức sinh sản sau:
- Sinh sản bằng cách nảy chồi.
- Sinh sản bằng cách phân đôi.
- Sinh sản bằng bào tử và sự hình thành bào tử.
+ Tiếp hợp đẳng giao
+ Tiếp hợp dị giao
+ Sinh sản đơn tính
d. Phân loại nấm men
Chủ yếu có hai lớp: nấm men thật (Ascomyces) và lợp nấm men giả
(Fungi imporfecti)
DH10QM Ứng dụng của vsv trong sản xuất rượu vang15
16
- Lớp nấm men thật (lớp Ascomyces – lợp nấm túi):
+ Phần lớn nấm men dùng trong công nghiệp thuộc lớp
Ascomyces, đa số thuộc giống Saccharomyces.
+ Giống Endomyces
+ Giống Schizosaccharomyces
- Lớp nấm men giả (Fungi imporfecti – nấm men bất toàn)
+ Crytococus (toscula, tornlopsis)
+ Mycoderma
+ Eandida
+ Geotrichum (đã được xếp vào lớp nấm mốc)

+ Rhodotorula
* Quá trình sinh trưởng và phát triển
- Sự sinh trưởng
Trong quá trình nuôi cấy, trong điều kiện dinh dưỡng đầy đủ, tế bào
nấm men tăng nhanh về kích thước và đồng thời sinh khối được tích lũy
nhiều.
- Sự phát triển
Các nấm men sinh sản bằng phương pháp nhân đôi thường cho lượng
sinh khối rất lớn sau một thời gian ngắn. Trong trường hợp sinh sản theo
phương pháp này thì trong dịch nuôi cấy sẽ không có tế bào già. Vì rằng tế
bào được phân chia thành hai cứ như vậy tế bào lúc nào cũng ở trạng thái
đang phát triển. Tế bào chỉ già khi môi trường thiếu chất dinh dưỡng và tế
bào không có khả năng sinh sản nữa.
Tuy nhiên đa số nấm men sinh sản bằng phương pháp nảy chồi nên
hiện tượng phát hiện tế bào già rất rõ. Khi chồi non tách khỏi tế bào mẹ để
sống độc lập thì nơi tách đó trên tế bào mẹ tạo thành một vết sẹo. Vết sẹo
này sẽ không có khả năng tạo ra chồi mới. Cứ như vậy tế bào mẹ sẽ chuyển
thành tế bào già theo thời gian.
Để xác định số lượng tế bào nấm men phát triển theo thời gian hiện
nay người ta dùng nhiều phương pháp khác nhau như:
+ Xác định số lượng tế bào bằng phương pháp đếm trực tiếp trên
kính hiển vi hay gián tiếp trên mặt thạch.
DH10QM Ứng dụng của vsv trong sản xuất rượu vang16
17
+ Đo độ đục của tế bào trong dung dịch nuôi cấy trên cơ sở xây
dựng một đồ thị chuẩn của mật độ tế bào…
Quá trình sinh trưởng của nấm men trong dịch lên men tĩnh có thể
chia làm 5 giai đoạn
N
t

Hình: Quá trình sinh trưởng và phát triển của nấm men
- Giai đoạn tiềm phát: giai đoạn này tế bào làm quen với môi trường,
sinh khối chưa tăng nhiều.( pha lag)
- Giai đoạn logarit: đây là giai đoạn phát triển rất nhanh, sinh khối
tăng ào ạt, kèm theo sự thay đổi mạnh mẽ của dịch lên men.(log)
- Giai đoạn chậm dần: tốc độ sinh trưởng nấm men giảm dần, thành
phần dịch lên men còn lại ít, các sản phẩm lên men được tích tụ nhiều.
- Giai đoạn ổn định: số lượng tế bào nấm men không tăng nữa, tốc độ
sinh sản bằng tốc độ chết.
- Giai đoạn chết: tốc độ chết tăng nhanh, tốc độ sinh sản rất ít do đó số
lượng tế bào nấm men giảm dần.
II.3. Vi Sinh Vật Trong Quá Trình Sản Xuất Rượu Vang
II.3.1.Khái quát về vi sinh vật trong quá trình sản xuất rượi Vang
Trong nước nho tươi có những nhóm vi sinh vật khác nhau từ môi
trường xung quanh, có chủ yếu ở vỏ quả, thân, cuống và thiết bị. Phần lớn
trong phức hệ này là nấm mốc (76 – 90%), nấm men (9 – 22%), số còn lại
chiếm tỷ lệ thấp là vi khuẩn không sinh bào tử hoặc có bào tử, xạ khuẩn và
Micobacter.
Độ acid của nước nho khá cao (pH = 2,7 – 3,8) là điều kiện không
thuận lợi cho các vi sinh vật phát triển.
DH10QM Ứng dụng của vsv trong sản xuất rượu vang17
18
Ở môi trường có độ chua lớn thường chỉ thích hợp với nấm mốc và
nấm men. Nấm men trong nước quả tươi thường ít hơn nấm mốc, nhưng
nấm men lại có khả năng phát triển và tăng sinh khối nhanh trong điều kiện
thiếu oxy hoặc kỵ khí, đồng thời lên men tích tụ cồn. Điều kiện kỵ khí và
trong dung dịch có cồn làm ức chế nấm mốc. Chính trong điều kiện này nấm
men đã cạnh tranh và phát triển chiếm ưu thế trong quá trình lên men tự
nhiên.
Trong các loài nấm men cũng cạnh tranh nhau chỉ có các loài có khả

năng đồng hóa đường nhanh tạo độ cồn cao mới dần dần chiếm ưu thế ở giai
đoạn lên men chính và lên men phụ.
Hệ nấm men trong giai đoạn đầu lên men nước nho là kloeckera–nấm
men có dạng hình chùy chiếm phần lớn và hoạt động tích tụ được 2 – 4 độ
cồn rồi ngừng hoạt động và chết dần, sau đó là nấm men rượu vang thực thụ
(Saccharomyces cerevisiae và Saccharomyces oviformics) phát triển và đóng
vai trò chủ yếu trong lên men chính và lên men phụ.
Vi sinh vật đóng vai trò rất quan trọng trong quá trình lên men rượu
vang. Cả nấm men và vi khuẩn đều có thể đóng vai trò tích cực và tiêu cực
trong sản xuất.
Mật độ tế bào vi sinh vật trên quả nho trung bình vào khoảng 10
3
–
10
5
cfu/g.
Vi sinh vật liên quan tới rượu vang có thể được chia làm hai dạng:
dạng nội sinh (từ quả nho, bề mặt thiết bị) và dạng đưa vào (các chủng giống
khởi động phục vụ lên men).
Trong lên men truyền thống, người ta chỉ sử dụng nhóm vi sinh vật
nội sinh, tức nhóm có sẵn trong nguyên liệu nho và quan trọng hơn là nhóm
vi sinh vật trên bề mặt thiết bị (với thành phần chủ chốt là Saccharomyces
cerevisiae). Những vi sinh vật chính có trên bề mặt quả nho bao gồm:
+ Nấm men: chủ yếu là Kloeckera/Hanseniaspora, và một lưọng
nhỏ các đại diện như Candida, Metchnikowia, Cryptococcus, Pichia,
Kluyveromyces và một lượng rất nhỏ Saccharomyces cerevisiae.
+ Vi khuẩn lactic: Lactobacillus, Leuconostoc, Pediococcus.
+ Vi khuẩn sinh acid acetic: Gluconobacter, Acetobacter.
DH10QM Ứng dụng của vsv trong sản xuất rượu vang18
19

+ Nấm mốc: Botrytis, Penicillium, Aspergillus, Mucor, Rhizopus,
Alternaria, Ucinula và Cladosporium.
Dạng đưa vào:
Để lên men rượu vang, người ta có thể sử dụng hai nguồn giống sau:
- Nguồn giống đã được chuẩn bị sẵn dưới các dạng sau
+ Dịch men giống: cấy từ ống giống thuần khiết qua khâu nhân
giống các cấp, cấy vào dịch men với tỉ lệ giống cấy từ 3 – 10%.
+ Bánh men khô: cấy vào dịch men với tỉ lệ 15 – 20g/l dịch lên
men.
+ Dịch lên men đang ở giai đoạn lên men mạnh tỉ lệ 1/3 – 1/5 thể
tích nồi lên men (lấy từ lần lên men truớc).
Ví dụ: lên men dịch đường từ tinh bột thường dùng nòi khác với khi
lên men rỉ đường.
Các nòi lên men rượu có những tính chất sau:
+ Có sức phát triển mạnh trong dịch đường lên men.
+ Có khả năng tiết ra hệ enzym zyma để lên men nhanh chóng và hoàn
toàn.
+ Có thể lên men được ở nhiệt độ tương đối cao.
+ Có khả năng chịu được độ cồn cao trong quá trình lên men.
+ Chịu được môi trường có độ axit cao.
- Hình dạng: nhiều hình dạng. Kích thước: dài 9 - 10 µm, rộng 2 - 7
µm
Nhiệt độ thích hợp đối với sinh trưởng của nấm men trong khoảng 25
0
C –
30
0
C, còn nhiệt tối thiểu khoảng 2
0
C – 3

0
C. Ở 40
0
C, sinh trưởng ngừng lại và
men bị chết.
Trong môi trường có nồng độ đường cao nấm men ngừng các quá trình
sống. Các nòi men khác nhau thì nồng độ đường thích hợp cũng hkác nhau.
II.3.2 Vai trò của một số loại nấm trong sản xuất rượi vang
a.Vi sinh vật có lợi
Nấm men thuộc nhóm cơ thể đơn bào, chúng phân bố rộng rãi trong
thiên nhiên, đặc biệt chúng có nhiều ở vùng đất trồng nho và các nơi trồng
hoa quả. Nhiều loài nấm men có khả năng lên men rượu.
DH10QM Ứng dụng của vsv trong sản xuất rượu vang19
20
Nấm men sinh sôi nhanh, tế bào lại chứa nhiều vitamin, acid amin
không thay thế, hàm lượng protein chiếm tới 50% trọng lượng khô của tế
bào.
Trong sản xuất rượu vang, người ta thường dùng những nòi nấm men
thuộc giống Saccharomyces cerevisiae. Các nòi men này được chia làm 2 loại:
Men chìm và Men nổi.
Men nổi là các chủng nấm men khi lên men hay phát triển trong dịch nuôi
cấy, chúng tạo thành từng đám với lớp bọt tương đối dày và duy trì trong suốt
thời gian lên men. Sau khi kết thúc chúng mới lắng dần xuống đáy và tạo thành
một lớp xác men không chặt chẽ. Tế bào nấm men mẹ và con sau nảy chồi
thường dính lại với nhau tạo thành như chuỗi các tế bào nấm men còn hình dạng
chủ yếu hình cầu hoặc ovan với kích thước 7 – 10 µm.
Men chìm khi phát triển trong dung dịch nuôi cấy và lên men không
tạo thành lớp bọt dày trên bề mặt dịch và các tế bào lắng dần xuống đáy
thùng tạo thành lớp cặn men khá chặt chẽ. Đặt biệt nổi bật của men chìm là
lắng nhanh tạo cho dịch lên men chóng có độ trong sáng và các nòi men có

enzym
α
-galactozidaza nên có thể dùng hoàn toàn đường rafinoza cho lên
men, còn các nòi men nổi chỉ có một số là đồng hoá được 1/3 rafinoza thành
rượu và CO
2
. Hầu hết các tế bào khi quan sát thì nảy chồi đứng riêng lẻ hoặc
cặp đôi. Hình dạng chủ yếu là hình cầu.
Sự khác nhau giữa nấm men nổi và nấm men chìm là khả năng lên
men các loại đường trisacarit, ví dụ raffinoza. Trong nấm men chìm có
enzym có thể sử dụng hoàn toàn đường raffinoza trong khi đó nấm men nổi
chỉ sử dụng được 1/3 đường sacaroza.
Ngoài ra chúng còn khác nhau về khả năng hô hấp, khả năng trao đổi
chất khi lên men và khả năng hình thành bào tử. Quá trình trao đổi chất của
nấm men chìm chủ yếu xảy ra trong quá trình lên men, còn của nấm men nổi
xảy ra mạnh trong quá trình hô hấp, vì vậy sinh khối nấm men nổi thu được
nhiều hơn nấm men chìm.Nấm men chìm có nồng độ enzym thấp hơn nấm
men nổi. Khả năng tạo bào tử của nấm men chìm lâu hơn và hạn chế hơn
nấm men nổi.
DH10QM Ứng dụng của vsv trong sản xuất rượu vang20
21
Saccharomyces cerevisiae
Saccharomyces cerevisiae phổ biến trong quá trình lên men nước quả
chiếm tới 80% trong tổng số Saccharomyces có trong nước quả khi lên men.
Khả năng kết lắng của nó phụ thuộc vào từng nòi: các tế bào dạng bụi hoặc
dạng bông. Nguồn dinh dưỡng cacbon của loại này là đường, cồn và acid
hữu cơ, những tác nhân sinh trưởng là acid pantotinic, biotin, mezoinozit,
thiamin và piridoxin.
Chúng chuyển hoá glucose thành ethanol có thể được diễn giải trong
phương trình sau:

C
6
H
12
O
6
+ 2Pi + 2ADP + 2H
+
 2C
2
H
5
OH + 2CO
2
+ 2ATP
Ngoài ethanol và CO
2
, còn một sản phẩm quan trọng nữa của quá
trình lên men là glycerol. Nồng độ rượu glycerol trong rượu vang có thể thay
đổi trong khoảng từ 2 – 10g/l, tuỳ thuộc vào chủng loại nấm men và điều
kiện lên men. Glycerol được tạo ra trong phản ứng sau:
NADH –H
+
NAD
+

Dihydroxyacetone phosphate
DHAP
reductese
Pi

DH10QM Ứng dụng của vsv trong sản xuất rượu vang21
22
Glycerol 3-phosphate Glycerol
Glycerol
phosphatase
Mặc dù glycolysis là quá trình cơ bản trong đồng hoá nguồn carbon, một số
chu trình khác cũng xảy ra trong quá trình lên men dịch nho. Trong số đó
phải nhắc tới con đường pentose phosphate và chu trình acid citric. Hoạt
động tương đối hạn chế của chu trình acid citric cũng tạo ra một nồng độ
đáng kể acid succinic trong rượu vang (khoảng 0,5g/l). Quá trình đồng hóa
các hợp chất chứa nitơ,lưu huỳnh cùng với các quá trình cơ bản kể trên tạo
ra hàng trăm những hợp chất bay hơi, không bay hơi và sản phẩm phụ. Tổng
thể tác dụng của những chất này tạo nên hương vị của rượu vang. Chúng bao
gồm những nhóm:
- Cồn bậc cao: isoamy alcohol, amyl alcohol, isobutanol, propanol, 2-
phenylethanol.
- Ester: ethyl acetate, ethyl lactate, phenylethyl acetate, isoamyl
acetate, ethyl octanoate, ethyl hexanotate.
- Acid hữu cơ: succinic, tartaric, malic, lactic, acetic, citric.
- Aldehyde và ketone: acetaldehyde, diacetyl, acetoin.
- Hợp chất chứa lưu huỳnh: H
2
S, SO
2
, dimethyl sulphide.
Nồng độ tương đối của những thành phần kể trên phụ thuộc vào
chủng giống nâm men sử dụng và điều kiện lên men, đặc biệt là nhiệt độ.
Lên men vang trắng thông thường đuợc tiến hành ở nhiệt độ 10 – 18
o
C

(trong 7-14 ngày hoặc dài hơn), còn vang đỏ thường ở 20 – 30
o
C( trong
vòng khoảng 7 ngày).
Ở giai đoạn cuối lên men Saccharomyces cerevisiae kết lắng nhanh và
làm trong dịch rượu.
Ở nòi của giống này có đặc tính riêng về khả năng tạo cồn, chịu
sunfit, tổng hợp các cấu tử bay hơi và các sản phẩm thứ cấp tạo ra cho vang
có mùi vị đặc trưng riêng biệt.
Giai đoạn cuối cùng của quá trình lên men các tế bào Saccharomyces
cerevisiae thường bị già, không tiếp tục chuyển đường thành cồn và bị chết
rất nhanh.
DH10QM Ứng dụng của vsv trong sản xuất rượu vang22
23
Saccharomyces oviformics
S.oviformis có hình dáng giống như Saccharomyces cerevisiae và có
thể tạo thành 18% rượu trong quá trình lên men, giống này tạo thành màng
trên dịch quả. S.oviformis lên men được glucose, fructose, mantose,
saccarose, maltose và 1/3 rafinose, không lên men được lactose, pentose.
Điều khác nhau cơ bản của S.oviformis với S.vini là: S.oviformis không lên
men được galactose và men nổi lên bề mặt dịch lên men tạo thành màng.
Giống thuần chủng phát triển tốt trong nước nho và các loại nước quả
khác, có khả năng chịu được đường cao, cồn cao, lên men kiệt đường và tạo
thành tới 18
0
cồn.
Các yếu tố sinh trưởng của loại này giống như Sacch.vini và có khả
năng chịu được cồn cao. Dùng các nòi thuần chủng của giống này lên men
dịch quả có hàm lượng đường cao để chế vang khô cho kết quả tốt.
Hai giống sản xuất rượu vang này (S.vini và S.oviformis) có nhiều nòi

được dùng trong sản xuất.
DH10QM Ứng dụng của vsv trong sản xuất rượu vang23
24
Saccharomyces uvarum
Saccharomyces uvarum được tách từ nước nho, rượu lên men tự
nhiên. Về hình thái nó không khác với các loài khác. Khả năng sinh bào tử
khá mạnh trên môi trường thạch – malt. Các nòi của loài này có thể lên men
12 – 13
0
cồn trong dung dịch nước nho. Một vài nòi được dùng trong sản
xuất rượu vang.
Saccharomyces chevalieri
Theo Lodder là Saccharomyces chevalieri Guilliermond. Nấm men
này được tách từ nước nho lên men tự nhiên, từ rượu vang non được gây
men nước dừa hoặc nước cọ. Saccharomyces chevalieri thuần chủng lên
men nước nho có thể tạo 16
0
cồn. Nó thường lẫn với Saccharomyces
cerevisiae.
Hanseniaspora apiculate – Kloeckera apiculata
Kloeckera apiculata có kích thước tương đối nhỏ, có hình ovan – elip
hoặc hình quả chanh, tế bào có một đầu nhỏ người ta thường gọi là men hình
chùy. Sinh sản bằng nảy chồi, rất phổ biến ở vỏ quả và nhiễm vào nước quả
chiếm đến 90% tổng số men khi bắt đầu lên men. Nó có thể lên men tạo
thành 6 – 7
0
cồn, nhưng tạo ra một loạt các acid bay hơi cũng như các este
của chúng làm cho dịch có mùi tạp và nó còn kìm hãm các loài nấm men
chính trong lên men, K.apiculata nhạy cảm với SO
2

.
Trong nghề làm rượu vang người ta không mong muốn loài men này
phát triển, nếu có thì chỉ cần có trong giai đoạn đầu tạo được 3 – 4
0
cồn.
DH10QM Ứng dụng của vsv trong sản xuất rượu vang24
25
b.Vi sinh vật có hại
Ngoài một số vi sinh vật giúp ích cho quá trình lên men rượu vang
còn có nhiều vi sinh vật gây hỏng hoặc giảm chất lượng của của rượu vang.
Bảng: Vi sinh vật làm hỏng hoặc giảm chất lượng rượu vang
Vi sinh vật Hiệu ứng gây hỏng
Nấm men nội sinh
-Biến chất theo hướng ester, tạo quá nhiều ethyl
acetate (> 200mg/l) và methylbutyl acetate (gây ra
chủ yếu bởi Hanseniaspora spp ).
-Tạo màng trên bề mặt và làm hỏng hương
(Candida, Pichia và Metchnikowia).
Nấm men từ bên ngoài
Zygosaccharomyces bailii
Brettanomyces spp
Schizosaccharomyces pombe
Saccharomyces cerevisiae
Phát triển và lên men đường sót trong vang tàng
trữ, gây đục và mất hương.
Gây đục, mùi acid, tạo mùi hôi khó chịu trong
vang tàng trữ. Đôi khi gây nổ chai vang bởi khí
CO
2
.

Nấm men chịu áp suất thẩm thấu cao, gây đục
rượu bảo quản.
Tái lên men đưòng sót
DH10QM Ứng dụng của vsv trong sản xuất rượu vang25