Tách dòng và biểu hiện gen mã hóa cho l lactate oxidase của chủng lactococcus lactis subsp lactis VLSH 12 trong escherichia coli

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM
VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGHUYÊN SINH VẬT
---------------oOo--------------

LẠI THỊ HỒNG NHUNG

TÁCH DÒNG VÀ BIỂU HIỆN GEN MÃ HÓA CHO L-LACTATE
OXIDASE CỦA CHỦNG LACTOCOCCUS LACTIS SUBSP. LACTIS VLSH12 TRONG ESCHERICHIA COLI

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

Hà Nội, Tháng 12/2013

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu

/>

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM
VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGHUYÊN SINH VẬT
---------------oOo--------------

LẠI THỊ HỒNG NHUNG

TÁCH DÒNG VÀ BIỂU HIỆN GEN MÃ HÓA CHO L-LACTATE
OXIDASE CỦA CHỦNG LACTOCOCCUS LACTIS SUBSP. LACTIS VLSH12 TRONG ESCHERICHIA COLI

Chuyên ngành Vi sinh vật
Mã số: 60420103

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

Hướng dẫn khoa học:
TS. Nguyễn Kim Thoa

Hà Nội, Tháng 12/2013

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu

/>

MỤC LỤC

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu

/>

DANH MỤC BẢNG
Bảng 3.1: Kết quả phân lập các chủng vi khuẩn lactic từ các sản phẩm lên men
truyền thống...............................................................................................................
Bảng 3.2: Đặc điểm sinh học của hai chủng vi khuẩn lactic VLSH-12

25

và VLSH-18..............................................................................................................
Bảng 3.3: Khả năng sử dụng các cơ chất trong Kit API 50 CHL của hai chủng vi

28

khuẩn lactic VLSH-12 và VLSH-12.........................................................................
Bảng 3.4: Kết quả so sánh trình tự gen Lox của chủng L. lactis subsp. lactis

30

VLSH-12 với các trình tự đã công bố trên Genbank................................................

34

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu

/>

DANH MỤC HÌNH ẢNH
Hình 1.1: Cấu trúc tổng thể của L-lactate oxidase của chủng A. viridans...............
Hình 1.2: Vị trí ion Zn giữa hai tetramer của L-lactate oxidase...............................
Hình 1.3: Cấu tạo một biosensor…………………………………………………..
Hình 2.1: Sơ đồ tái tổ hợp gen Lox và promoter của gen α-amylase của chủng B.

8
9
10

subtilis 168M bằng phương pháp Megarprimer.......................................................
Hình 3.1: Xác định vi khuẩn lactic nhờ vòng phân giải CaCO3...............................
Hình 3.2: Hoạt tính L-lactate oxidase của các chủng vi khuẩn lactic phân lập từ

22
25

các mẫu thực phẩm lên men truyền thống................................................................
Hình 3.3: Hình dạng tế bào của chủng vi khuẩn lactic VLSH-12 (trái) và chủng

27

VLSH-18 (phải) trên kính hiển vi điện tử quét.........................................................
Hình 3.4: Sản phẩm PCR đoạn gen 16S rRNA của hai chủng vi khuẩn lactic

29

VLSH-12 (1) và VLSH-18 (2)..................................................................................
Hình 3.5: Cây phát sinh chủng loại chủng vi khuẩn lactic VLSH-12......................
Hình 3.6: Cây phát sinh chủng loại chủng vi khuẩn lactic VLSH-18......................
Hình 3.7. Sản phẩm đoạn gen Lox khuếch đại từ chủng L. lactic subsp. lactic ......
Hình 3.8: Plasmid pTZ57R/T mang đoạn gen ngoại lai Lox từ chủng L. lactis

31
32
32
33

subsp. lactis VLSH-12 được cắt kiểm tra bằng enzyme giới hạn HindIII và EcoRI
Hình 3.9: Trình tự gen và protein LOX từ chủng L. lactic subsp. lactic

34

VLSH-12...................................................................................................................
Hình 3.10: Sản phẩm của PCR1a...............................................................................
Hình 3.11: Sản phẩm PCR của quá trình nhân gen PCR1b và PCR2...................................
Hình 3.12: Plasmid pTZ57R/T[Bspr.Lox] được cắt bằng HindIII và EcoRI để

35
36

38

kiểm tra đoạn DNA ngoại lai ...................................................................................
Hình 3.13: Plasmid pHV33 mang tổ hợp [Bspr.Lox] được cắt kiểm tra bằng

38

EcoRI và HindIII.......................................................................................................
Hình 3.14. Bản đồ giới hạn gen Lox tái tổ hợp với vector pHV33...........................
Hình 3.15: Ảnh hưởng của nồng độ glucose lên quá trình biểu hiện L-lactate

40
40

oxidase.......................................................................................................................
Hình 3.16: Ảnh hưởng của nhiệt độ lên quá trình biểu hiện L-lactate oxidase.........
Hình 3.17: Ảnh hưởng của tốc độ lắc lên quá trình biểu hiện L-lactate oxidase......
Hình 3.18: Sản phẩm của các quá trình tinh sạch protein L-lactate oxidase.............

42
43
44
45

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu

/>

MỞ ĐẦU
Lactate là một chỉ tiêu phân tích quan trọng trong nhiều lĩnh vực như y tế, thể

thao, công nghiệp thực phẩm, sản xuất rượu vang... Trong cơ thể người và động vật có
vú, gen L-lactate oxidase có chức năng mã hóa cho enzyme tương ứng nhằm điều hòa
nồng độ lactate trong cơ thể. Tuy nhiên, do nhiều nguyên nhân khác nhau, hoạt động
của gen này bị kìm hãm dẫn đến rối loạn chuyển hóa lactate trong cơ thể gây ra các
bệnh lý liên quan đến cường lactate hay các bệnh lý do thiếu hụt oxy như suy tim, suy
hô hấp, suy thận, thiếu máu cấp, nhồi máu cơ tim… Bởi vậy, trong y học chỉ số lactate
máu thường được dùng để phát hiện hoặc đánh giá tình trạng các bệnh. Vì vậy, việc
kiểm soát nồng độ lactate là một trong những chỉ số sinh hóa đóng vai trò vô cùng
quan trọng. Sự tích lũy của lactate trong cơ thể có thể do nhiều lí do khác nhau như quá
trình chuyển hóa axit pyruvic sinh ra trong quá trình đường phân của tế bào hoặc từ
thức ăn, đặc biệt là các sản phẩm thực phẩm lên men. Cơ thể người chỉ đồng hóa được
L-lactate trong giới hạn nhất định, còn D-lactate thì không đồng hóa được và bị đào
thải qua nước tiểu. Việc đào thải lactate qua nước tiểu là nguyên nhân tích đọng trong
thận, gây bệnh sỏi thận.
L-lactate oxidase từ lâu đã được ứng dụng làm các kit sinh hóa, các biosensor để
phát hiện lactate trong chẩn đoán lâm sàng và sản xuất công nghiệp. Hơn nữa, enzyme
này còn có khả năng làm giảm nồng độ lactate, nên nó có tiềm năng ứng dụng trong
điều trị các bệnh có liên quan đến rối loạn lactate trong cơ thể. Hiện nay trên thế giới,
L-lactate oxidase đã được tinh chế và thương mại hóa bởi các công ty hóa chất như
Sigma, Genzyme Diagnostic… Tuy nhiên, ở Việt Nam vẫn chưa có nghiên cứu nào về
L-lactate oxidase cũng như lactate biosensor. Chính vì vậy, chúng tôi đã tiến hành
nghiên cứu đề tài: “Tách dòng và biểu hiện gen mã hóa cho L-lactate oxidase của
chủng Lactococcus lactis subsp. lactis VLSH-12 trong Escherichia coli” với các nội
dung nghiên cứu sau:

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu

/>

-

Phân lập và tuyển chọn các chủng vi khuẩn lactic sinh tổng hợp L-lactate
oxidase

-

Tách dòng gen L-lactate oxidase từ chủng vi khuẩn được tuyển chọn

-

Tái tổ hợp gen L-lactate oxidase từ chủng vi khuẩn được tuyển chọn

-

Biểu hiện gen mã hóa cho L-lactate oxidase của chủng tuyển chọn trong
Escherichia coli.

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu

/>

CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Vi khuẩn lactic
1.1.1. Đặc điểm của nhóm vi khuẩn lactic
Nhóm vi khuẩn lactic là một nhóm không đồng nhất các vi sinh vật sinh ra axit
lactic như là sản phẩm cuối cùng của quá trình lên men carbohydrates [1]. Axit lactic
sinh ra có thể ở dạng đồng phân D(-), L(+) hoặc DL phụ thuộc vào gen lactate
dehydrogenase (LDH) và cơ chế hoạt động của nó ứng với từng loài vi sinh vật. Vi
khuẩn lactic được xếp chung vào họ Lactobacillaceae, thuộc bộ Eubacteriales. Nhóm
vi khuẩn này không đồng nhất về mặt hình thái (gồm cả hình que và hình cầu), nhưng

chúng tương đối đồng nhất về mặt sinh lý. Đặc điểm chung của vi khuẩn lactic là
những vi khuẩn Gram (+), kỵ khí hoặc vi hiếu khí, không sinh bào tử, không di động,
không có cytochrome, catalase âm tính, có khả năng chịu axit.. Vi khuẩn lactic thường
có mặt trong các thực phẩm giàu dinh dưỡng như sữa, các sản phẩm lên men từ sữa,
thịt, đồ uống, một số khác được tìm thấy trong niêm mạc miệng, ruột và âm đạo của
động vật có vú hay trên xác động – thực vật đang phân hủy. Trừ một số loài, phần lớn
vi khuẩn lactic đều không gây bệnh và được công nhận là an toàn. Các vi khuẩn lactic
điển hình thuộc các chi Lactobacillus, Lactococcus, Streptococcus, Pediococcus,
Oenococcus, Enterococcus, Leuconostoc, Tetragenococcus, Vagococcus, và Weissella.
Việc phân loại vi khuẩn lactic vào các chi khác nhau chủ yếu dựa trên hình thái, cơ chế
lên men glucose, nhiệt độ sinh trưởng, dạng đồng phân của axit lactic tạo thành, khả
năng chịu muối, chịu axit, chịu kiềm…Tuy nhiên, ngày nay các phương pháp phân loại
hiện đại như trình tự 16S rRNA, PCR, mẫu protein hòa tan đang được sử dụng song
song với các phương pháp truyền thống.
Các vi khuẩn lactic khác nhau có thể có nhu cầu dinh dưỡng không giống nhau,
nhưng nhìn chung chúng đều có đòi hỏi cao về dinh dưỡng, đặc biệt là các loại vitamin
và nguồn nitơ. Vi khuẩn lactic có thể sử dụng được rất nhiều loại carbohydrate, từ các
loại đường (glucose, fructose, mannose, galactose, saccharose, lactose, maltose) cho

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu

/>

đến các polysaccharide (tinh bột, dextrin). Trong đó, nguồn cơ chất quan trọng nhất đối
với vi khuẩn lactic là monosaccharide và disaccharide. Các nguồn carbon này được
dùng để cung cấp năng lượng, xây dựng cấu trúc tế bào và sinh ra các axit hữu cơ khác
như axit lactic, axit acetic, axit pyruvic, axit malic, axit fumaric và axit formic [2]. Một
số loài vi khuẩn lactic lên men dị hình phân lập được từ các sản phẩm thực phẩm, có
thể sử dụng các axit gluconic và axit galactorunic tạo thành CO 2, axit acetic và axit
lactic. Trong quá trình lên men cơ chất, vi khuẩn lactic có thể sử dụng các axit amin

như axit glutamic, arginine, tyrosine làm nguồn cung cấp năng lượng, khi đó xảy ra
quá trình decarboxyl và tạo ra CO2.
Vi khuẩn lactic là loài hô hấp tuỳ tiện, tuy vậy chúng vẫn có khả năng oxy hoá
rất nhiều chất nhờ sử dụng oxy phân tử. Điều này được thực hiện nhờ hệ enzyme FAD.
Quan hệ với oxy giữa các loài khác nhau thì khác nhau. Chẳng hạn loài Pediococcus
sp, Lactobacillus plantarum có thể đồng hoá được glycerin trong điều kiện hiếu khí.
Một vài loài Leuconostoc có thể cần sự có mặt của oxy trong giai đoạn đầu để đồng
hoá hexose. Loài Lactobacillus brevis, Lactobacillus buchneri cần oxy để oxy hoá
hexose, gluconate. Sự ảnh hưởng của oxy đôi khi còn phụ thuộc vào cả nhiệt độ, ví dụ
một vài chủng của loài Lactobacillus brevis, Lactobacillus buchneri phát triển tốt ở
30oC trong điều kiện yếm khí, trong khi ở 37 oC nó chỉ phát triển trong điều kiện hiếu
khí [3, 4, 5]. Quá trình oxy hoá ở vi khuẩn lactic thường kèm theo việc tạo thành H 2O2
đồng thời một số vi khuẩn lactic như Streptococcus faecalis, Streptococcus brevis,
Leuconostoc mesenteroides có thể khử được H2O2 thành nước cùng với sự tham gia của
một số chất bị oxy hoá [4].
1.1.2. Ứng dụng của vi khuẩn lactic
Với phạm vi ứng dụng vô cùng rộng lớn, từ lâu vi khuẩn lactic đã được sử dụng
trong công nghiệp hóa chất, thực phẩm, nông nghiệp, vật liệu, môi trường... Hơn thế, vi
khuẩn lactic còn có một giá trị to lớn đối với sức khỏe con người, giúp điều hòa hệ
miễn dịch, tăng cường chức năng tiêu hóa, bảo vệ đường ruột, kháng lại một số tác

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu

/>

nhân gây bệnh [6]. Chính vì lí do này, mà hiện nay một số chủng vi khuẩn lactic đang
được sử dụng như các chế phẩm prebiotic hoặc bổ sung dưới dạng vi khuẩn chức năng
vào thực phẩm [7]
Không chỉ dừng lại ở những ứng dụng truyền thống, các nhà khoa học hiện nay
đang tìm kiếm và thử nghiệm các hướng đi mới cho vi khuẩn lactic. Một trong những

hướng đi đầy triển vọng là sản xuất nhựa sinh học (bio-plastic). Đây là một loại vật liệu
mới có nguồn gốc từ các cây nông nghiệp như ngô, củ cải, lúa mì, được tổng hợp từ
sản phẩm lên men lactic. Nhựa sinh học được dự đoán có thể dùng để thay thế cho các
vật liệu tương ứng có nguồn gốc dầu mỏ trong tương lai. Ngoài ra, các hệ, phức hệ
enzyme của vi khuẩn lactic trong các con đường chuyển hóa các cơ chất khác nhau
cũng đang được quan tâm nghiên cứu, với mục đích ứng dụng trong công nghiệp dược
phẩm hoặc y sinh học.
1.2. L-lactate oxidase
1.2.1. L-lactate
Trải qua các nghiên cứu trong nhiều thập kỷ qua, lactate được coi như một chỉ
tiêu phân tích quan trọng trong y tế lâm sàng, y học thể thao và công nghiệp chế biến
thực phẩm. L-lactate là một chất chuyển hóa chính được hình thành từ quá trình trao
đổi chất kị khí trong cơ bắp. Quá trình sản sinh lactate đi kèm với sự gia tăng proton
trong tế bào, khi lượng lactate được tạo ra đủ cao để làm thay đổi nồng độ proton trong
tế bào, thì pH tế bào giảm. Điều này sẽ gây ra hiện tượng nhiễm toan tế bào (cell
acidosis) và cản trở hoạt động của cơ bắp [8].
Trong cơ thể người, nồng độ L-lactate máu dao động trong khoảng 0.5 – 1.5
mM khi ở trạng thái nghỉ ngơi và có thể tăng đến 12 mM khi vận động [9], thậm chí nó
có thể đạt mức 25 mM khi tập các bài tập toàn thân trong những điều kiện đặc biệt
[10]. Nồng độ lactate trong huyết tương đòi hỏi sự kết hợp một cách hài hòa giữa các
yếu tố có ảnh hưởng đến sự cân bằng giữa lượng lactate được tạo ra và lượng lactate bị
đào thải. Nếu sự cân bằng này bị phá vỡ sẽ gây ra hiện tượng nhiễm toan lactic. Lượng

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu

/>

axit lactic được tạo ra có thể tăng trong bất kì trường hợp nào có liên quan đến quá
trình trao đổi chất kị khí như sốc do mất máu hoặc nghẽn mạch phổi [11]. Nồng độ
lactate cũng có thể tăng ở các trường hợp bệnh lý như tim mạch, sốc nhiễm độc, suy hô

hấp, bệnh gan, rối loạn chức năng, suy thận, giảm oxy máu ở mô…[12]. Có thể nói, đối
với ngành y tế chỉ số lactate đóng vai trò như một thiết bị phát tín hiệu trong chẩn đoán
tình trạng hô hấp của bệnh nhân. Tầm quan trọng của việc xác định chỉ số lactate trong
chăm sóc y tế đã được chứng minh bằng thưc tế. Chỉ số lactate máu đã từ lâu được sử
dụng như một chỉ tiêu quan trọng trong cả thể thao và y tế. Điều này gắn liền với sự
phát triển các lactate sensor có độ nhạy cao dùng trong chẩn đoán.
Không chỉ có ý nghĩa trong thể thao và y tế, việc xác định chỉ số lactate trong
công nghiệp thực phẩm và sản xuất rượu vang cũng rất được chú ý. Chỉ số lactate cho
biết độ tươi, tính ổn định và chất lượng của các sảm phẩm thực phẩm như sữa, các sản
phẩm khác từ sữa, hoa quả, thịt, rau củ…[13]. Trong công nghiệp sản xuất rượu vang,
thường diễn ra quá trình lên men axit malic, khi axit malic bị chuyển hóa thành axit
lactic sẽ dẫn đến việc giảm độ axit tổng và cả vị chát của rượu [14]. Bởi thế việc giám
sát liên tục nồng độ lactate trong suốt quá trình lên men có ý nghĩa vô cùng quan trọng
đối với chất lượng rượu. Hơn thế, lactate natri còn được dùng như một chất bảo quản
thực phẩm [15]
1.2.2. L-lactate oxidase
LOX

L-lactate oxidase (LOX) có mã số trong hệ thống phân loại enzyme là EC
1.13.12.4. LOX là một enzyme flavin có chứa nhân flavin mononucleotide (FMN), xúc
tác quá trình oxy hóa L-lactate thành pyruvate và peroxide trong phản ứng sau:
L-lactate + O2

Pyruvate + H2O2

L-lactate oxidase lần đầu tiên được phát hiện ở chủng vi khuẩn Streptococcus
pneumonia vào năm 1959 [16]. Enzyme này được dùng để phát hiện lactate trong máu
của các bệnh nhân có bệnh lý liên quan đến việc thiếu hụt oxy như xuất huyết cấp tính,

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu

/>

nhồi máu cơ tim, thiếu máu oxy cấp…[17]. Bên cạnh đó, LOX cũng được ứng dụng
rộng rãi trong việc thiết kế các biosensor dùng trong y tế, sản xuất rượu vang và công
nghiệp thực phẩm [18]. Gần đây, ý tưởng sử dụng LOX để giải phóng lượng lactate
tích tụ trong cơ thể, phòng tránh bệnh chuột rút cũng đang nhận được sự chú ý.
L-lactate oxidase được tìm thấy ở nhiều vi sinh vật nhất là ở các chủng vi khuẩn
thuộc các loài như Aerococcus viridans [19], Pseudomomas sp [20], ở các chủng vi
khuẩn lactic như Streptococcus iniae, Streptococcus pneumoniae, Streptococcus
pyogenes [21; 22], Lactococcus lactis subsp lactis, Lactococcus lactis subsp. cremoris
[23]... Ngoài ra nó còn được tìm thấy ở nấm men Yarrowia lipolytica [17] và nấm mốc
Goetrichum candidum [18, 24]. Hiện tại trong GenBank có hơn 1500 trình tự gen Llactate oxidase (Lox) từ các vi sinh vật khác nhau. Trong đó, Lox từ Aerococcus
viridans được quan tâm nghiên cứu nhiều hơn cả. Lox từ các chủng của loài này đã
được tách dòng, tinh chế, xác định tính chất. Enzyme tái tổ hợp của Aerococcus
viridans hiện đã được thương mại hóa trên thị trường bởi các công ty hoá chất như
Sigma Aldrich, Genzyme Diagnostic... Enzyme này bao gồm 374 axit amin, có khối
lượng phân tử 44 kDa. L-lactate, D-lactate, glycolate được xác định là cơ chất đặc hiệu
của LOX dưới sự tham gia của FMN. Tuy nhiên, nó lại bị bất hoạt bởi bromopyruvate
do xuất hiện biến đổi liên kết cộng hóa trị không phân cực ở gần vị trí tâm hoạt động
của enzyme. [25; 26; 27]. Với sự phát triển của ngành công nghệ sinh học, các kỹ thuật
protein đã được sử dụng để nghiên cứu gây đột biến gen, nhằm thay đổi cơ chất đặc
hiệu cũng như làm tăng tính bền nhiệt của LOX [28; 19].
Gần đây, LOX từ các chủng vi khuẩn lactic cũng nhận được nhiều sự chú ý. Các
vi khuẩn lactic vừa sinh tổng hợp LOX vừa có thể tổng hợp L-lactate dehydrogenase
(LDH), là enzyme chuyển hóa ngược pyruvate thành L-lactate. Toda và Nishiya đã tách
dòng được gen Lox từ chủng vi khuẩn Lactoccocus lactis subsp. cremoris IFO3427
trước đó đã được công bố chứa gen LDH [29; 30; 31]. LOX của chủng Lactoccocus
lactis subsp. cremoris IFO3427 cũng đã được tinh sạch và nghiên cứu tính chất. Điểm

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu

/>

đẳng điện của enzyme được xác định khoảng 4,3 ± 0,2 với khối lượng phân tử khoảng
40 kDa. Enzyme từ chủng này nhiều đặc điểm tương đồng như enzyme từ Aerococcus
viridans, nhưng nó chỉ có khả năng chuyển hóa L-lactate chứ không thể chuyển hóa
được D-lactate [32].
1.2.3. Cấu trúc của L-lactate oxidase
Cấu trúc tinh thể của LOX được công bố lần đầu tiên năm 1998 bởi Morimoto
[33]. Đến năm 2006, cấu trúc 2.1 Å của LOX từ Aerococcus viridians cũng đã được
xác định và công bố [34]. Trong cấu trúc của LOX 8 tiểu phần protein (A, B, C, D, E,
F, G, H) gắn kết với nhau tạo thành 2 tetramer thể hiện cấu trúc không đối xứng của
enzyme. Kích thước tổng thể của mỗi tetramer vào khoảng 50 x 100 x 100 Å, với đầu
C gấp nếp để lấp kín lỗ trung tâm Vùng FMN-binding và vùng hoạt động được hình
thành ở phía đầu C của chuỗi β-barrel (Hình 1.1). Sự tiếp xúc giữa các tinh thể protein
tạo nên các vùng liên kết với kim loại giữa 2 tetramer (Hình 1.2), những vùng này sẽ bị
loại bỏ trong quá trình biểu hiện và tinh sạch protein

Hình 1.1.: Cấu trúc tinh thể của LOX từ A. viridans
(a) Bốn tiểu phần protein gắn kết với nhau tạo nên cấu trúc của phân tử LOX thể hiện
một nửa không đối xứng của enzyme. (b) Cấu trúc monomer nhìn từ đầu C của chuỗi

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu

/>

β-barrel và trung tâm hoạt động của enzyme, nơi phân tử FMN gắn vào. Trung tâm
hoạt động của monomer kéo dài từ vị trí axit amin số 190 đến 220.

Hình 1.2: Vị trí ion Zn giữa hai tetramer của L-lactate oxidase. Ion kim loại gắn kết 2
axit amin là Glu229 và His233 của tiểu đơn vị D và E.
Vùng liên kết FMN của L-lactate oxidase có vị trí tương tự như ở glycolate
oxidase, nó nằm sâu bên dưới vùng cơ chất dạng phễu, bên cạnh hoặc ở dưới cơ chất
khi nó bị giới hạn. Trong cả 8 tiểu phần L-lactate oxidase cofactor FMN bị uốn cong
khoảng 15º quanh các nguyên tử trung tâm, tạo thành hình dạng chữ U cho nhóm
flavin. [34]
1.3. Ứng dụng của LOX để chế tạo biosensor
1.3.1. Khái quát về biosensor
Biosensor hiện đang là một trong những hướng nghiên cứu nhận được nhiều sự
chú ý của các nhà khoa học trên thế giới. Được công bố lần đầu tiên trên thế giới bởi
Clark và Lyons vào năm 1962 [35], biosensor là sự kết hợp giữa một thành phần sinh
học (enzyme, axit nucleic, tế bào, kháng thể) và bộ cảm biến hóa lý để nhận biết, phân
tích một chất nào đó [36]. Nói cách khác, biosensor là thiết bị phân tích chuyển đổi một
phản ứng sinh học thành tín hiệu (Hình 1.3). Thuật ngữ "biosensor" thường được sử
dụng chung cho các thiết bị cảm biến dùng để xác định nồng độ các chất và các thông

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu

/>

số khác liên quan đến sinh học, ngay cả khi không sử dụng trực tiếp một hệ thống sinh
học [37].
*Nguyên lý hoạt động của biosensor:
Chất cần phân tích trong mẫu sẽ đi vào điện cực, sau đó thấm qua màng ngoài
của biosensor. Thành phần sinh học trong bộ thụ cảm (Bioreceptor) sẽ phản ứng với
các chất cần phân tích và tạo ra các đáp ứng mà bộ biến năng (Transducer) có thể phát
hiện và chuyển nó thành tín hiệu điện. Tín hiệu điện này sẽ được khuếch đại và xử lý
thông qua hệ thống điện tử.

Hình 1.3: Cấu tạo một biosensor [38]
1.3.2. Lactate biosensor
Trước đây L-lactate thường được xác định trong phòng thí nghiệm bằng phương
pháp quang phổ. Tuy nhiên, phương pháp này lại bộc lộ nhiều nhược điểm như giá

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu

/>

thành cao, kỹ thuật phức tạp. Do đó, để đáp ứng với nhu cầu xác định chỉ số lactate
trong các lĩnh vực, đòi hỏi phải phát triển một hệ thống gồm các lactate biosensor có
khả năng phân tích nhanh nhạy, chính xác, độ đặc hiệu cao nhưng nhỏ gọn, dễ sử dụng
và giá thành thấp.
Lactate biosensor có thể được thiết kế trên L-lactate oxidase hoặc L-lactate
dehydrogenase. Thậm chí, cytochrome b2 và lactate monooxygenase cũng từng được sử
dụng là nguyên liệu để chế tạo lactate biosensor ở quy mô nhỏ hơn. Trong đó, L-lactate
oxidase luôn là lựa chọn hàng đầu bởi cơ chế hoạt động của nó đơn giản, nhạy cảm,
phù hợp với nhiều phương pháp thiết kế và dễ dàng tìm thấy ở nhiều nguồn vi sinh vật.
Phương pháp được sử dụng để thiết kế biosensor từ L-lactate oxidase rất đa dạng như
phương pháp thẩm thấu [39], xuyên qua màng [40], liên kết cộng hóa trị [41, 42], tạo
thành dạng polymer [43, 44], hoặc cố định enzyme trên các mạng lưới sol-gel [45].
Ngoài ra, các phương pháp dựa vào sự phân tích sức phun của dòng chảy [46, 47] hoặc
đóng vai trò là chất xúc tác [48], hoặc liên kết với các hợp chất khác trong quá trình
oxy hóa khử [49] cũng đã được tiến hành thử nghiệm cho kết quả rất khả quan.
Khi lactate biosensor tiếp xúc với mẫu phân tích, với sự có mặt của oxy hòa tan,
L-lactate oxidase sẽ xúc tác quá trình oxy hóa L-lactate thành pyruvate và hydrogen
peroxide. Trong phản ứng điện hóa này, sự suy giảm nồng độ oxy cùng với quá trình
oxy hóa hydrogen peroxide sẽ làm thay đổi hiệu điện thế và do đó có thể phát hiện
bằng thiết bị chuyên dụng [50].
1.4. Tách dòng và biểu hiện gen Lox

1.4.1. Tách dòng gen Lox
Tách dòng gen là quá trình tách một đoạn gen cần quan tâm ra khỏi DNA nhiễm
sắc thể của sinh vật và nhân đoạn gen này lên thành dòng với số lượng lớn. Các vi sinh
vật được dùng làm chủng chủ để tách dòng gen rất đa dạng [51], [52]. Đối với gen Lox
chủng chủ được sử dụng để tách dòng chủ yếu là E. coli (Top10F’, DH5α, DH10b…
[22, 23, 53, 54, 55], bởi những ưu điểm của E. coli mang lại:

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu

/>

-

Là vi khuẩn gram âm, thành tế bào mỏng nên dễ dàng phá vỡ để thu nhận DNA

-

Đã được nghiên cứu đầy đủ về mặt di truyền, những chủng được sử dụng trong
tách dòng đều là những chủng không gây bệnh

-

Không sinh bào tử, khả năng chịu nhiệt kém, hạn chế được sự phát tán ra môi
trường, do vậy vấn đề an toàn sinh học được đảm bảo.

-

Tốc độ sinh trưởng nhanh

1.4.2. Biểu hiện gen Lox trong E. coli

Trong công nghệ DNA tái tổ hợp, các chủng E. coli chủ yếu được dùng để tách
dòng các gen Lox nói riêng và các gen khác nói chung. Tuy nhiên, trong nhiều trường
hợp gen Lox cũng được biểu hiện ở các chủng E. coli như JM109 [53, 55], pGR002
[57], BL21(DE3) [56], Top10F’ [54]…Các chủng E. coli được lựa chọn bởi chúng
cũng có khá nhiều ưu điểm cho quá trình biểu hiện như:
-

Số bản sao của plasmid lớn, gen biểu hiện mạnh [58],

-

Phù hợp với nhiều hệ vector biểu hiện, đặc điểm di truyền đơn giản, tốc độ sinh trưởng
nhanh, có tiềm năng nuôi cấy mật đô cao, thích hợp trong việc thu nhận enzyme quy
mô phòng thí nghiệm [59]

-

Ở E. coli cũng có các RNA polymerase phù hợp với promoter của các operon từ nhiều
loại vi sinh vật khác như Pseudomonas, Streptomyces, Bacillus. Đặc biệt là các nhân tố
δ có ở cả E. coli, B. subtilis và nhiều loại vi sinh vật khác có thể liên kết với RNA
polymerase tăng cường phiên mã của gen [58]
Để tạo chủng tái tổ hợp mang gen Lox trong E. coli người ta thường lựa chọn
các hệ vector biểu hiện như pET, pRSET với T7 promoter và T7 terminator từ
bacteriophage ở trước và sau điểm đa tách dòng của các vector hoặc các vector con
thoi có thể biểu hiện trong cả E. coli và Bacillus.
1.4.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến biểu hiện gen Lox
Biểu hiện gen Lox phụ thuộc vào rất nhiều yếu tố, bao gồm cả chủng chủ, vector
và gen Lox tái tổ hợp. Chính vì thế, khi thiết lập hệ thống chủng chủ - vector - gen Lox

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu

/>

tái tổ hợp cần phải đảm bảo sao cho gen mã hóa protein có thể biểu hiện tốt ở chủng tái
tổ hợp. Để biểu hiện gen thành công thì việc lựa chọn loại promoter phù hợp và đủ
mạnh là yếu tố cần thiết. Về cơ bản, có ba loại promoter được sử dụng để điều hòa biểu
hiện gen, đó là:
-

Promoter nhạy cảm với các tác nhân vật lý (nhiệt độ hoặc oxy hòa tan) [58, 60,
61]

-

Promoter nhạy cảm với các tác nhân hóa học [60, 58]
Promoter được điều hòa bằng các thành phần dinh dưỡng của môi trường nuôi
cấy chủng chủ mang gen ngoại lai [58]
Tùy thuộc vào loại promoter được tổ hợp với gen ngoại lai, các yếu tố được sử

dụng để điều hòa biểu hiện gen có thể là: nhiệt độ, nồng độ cơ chất, nồng độ oxy hòa
tan, tốc độ lắc và các tác nhân khác
•

Ảnh hưởng của nhiệt độ
Nhiệt độ có tác dụng điều hòa biểu hiện gen khi sử dụng promoter nhạy cảm với

nhiệt độ. Đối với promoter, nhiệt độ tác động theo cơ chế cảm ứng, còn với chủng chủ,
nhiệt độ lại có ảnh hưởng rất lớn đến tốc độ phát triển. Vì vậy nhiệt độ được coi như là
một yếu tố chính được sử dụng để điều hòa khả năng biểu hiện gen ở chủng tái tổ hợp
[60]. Ảnh hưởng của nhiệt độ lên khả năng biểu hiện gen ở các chủng tái tổ hợp khác

nhau là không giống nhau:
-

Chủng tái tổ hợp phát triển và biểu hiện gen tốt nhất ở nhiệt độ cao hơn nhiệt độ
tối ưu của chủng chủ

-

Chủng tái tổ hợp phát triển và biểu hiện gen tốt nhất ở nhiệt độ bằng nhiệt độ tối
ưu của chủng chủ

-

Chủng tái tổ hợp phát triển và biểu hiện gen tốt nhất ở nhiệt độ thấp hơn nhiệt
độ tối ưu của chủng chủ

•

Ảnh hưởng của nồng độ oxy hòa tan

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu

/>

Tương tự như yếu tố nhiệt độ, nhiệt độ oxy hòa tan cũng có ảnh hưởng trực tiếp
đến khả năng biểu hiện gen Lox. Oxy không chỉ cần thiết cho sự phát triển của các
chủng hiếu khí mà còn đóng vai trò làm chất cảm ứng khởi động cho quá trình phiên
mã trong trường hợp gen Lox được tái tổ hợp với promoter nhạy cảm với oxy [61]
•

Ảnh hưởng của cơ chất
Có nhiều loại cơ chất khác nhau được sử dụng để điều hòa quá trình biểu hiện

gen Lox, có thể là các nguồn đường như glucose, maltose, glycerol …[17, 57], DLlactate [20], L-lactate [27]… Tùy thuộc vào loại promoter của chủng tái tổ hợp mà
chúng ta lựa chọn loại cơ chất thích hợp cho quá trình biểu hiện. Nồng độ của các loại
cơ chất có tác dụng điều hòa biểu hiện gen tốt nhất được gọi là nồng độ giới hạn
(limited concentration)

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu

/>

CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
2.1. Vật liệu
- Các mẫu thực phẩm lên men lactic truyền thống như sữa chua, nước muối dưa
cà, nem chua được mua ở các chợ tại Hà Nội
- Kit GeneJETTM Genomic DNA Purification (Thermo scientific, Mỹ), Kit
GeneJETTM Plasmid Miniprep (Thermo scientific, Mỹ), Kit InsTAclone TM PCR Cloning
Kit (Thermo scientific, Mỹ), Kit GeneJET™ Gel Extraction (Thermo scientific, Mỹ)
- Dream Taq Polymerase (Thermo scientific, Mỹ), dNTPs (Thermo scientific,
Mỹ), các enzyme giới hạn (NEB, Mỹ)
- Các cặp mồi được cung cấp bởi IDT, Mỹ
- Chủng E.coli Top 10, E. coli BL21 (DE3) được cung cấp bởi hãng NEB, Mỹ
- Vector pHV33 nhận từ Viện Vi sinh vật và Sinh học phân tử, Trường Đại học
Tổng hợp Greifswald, CHLB Đức.
- Các hóa chất sử dụng đều đạt độ tinh khiết là sản phẩm của các hãng Merk
(Đức), Sigma (Mỹ)…
2.2. Môi trường
- Môi trường MRS (g/l): Peptone 10; Cao thịt 10; Cao nấm men 5; Glucose 20;
Tween 80 1; K2HPO4; CH3COONa 5; Amoni citrate 2; MgSO 4.7H2O 0,2; MnSO4.H2O

0,05; pH = 6,5 – 6,8
- Môi trường LB (g/l): Bacto tryptone 10; Cao nấm men 5; NaCl 5; pH = 7,2
- Môi trường TB (g/l): Bacto tryptone 12; Cao nấm men 24; glycerol 4 ml;
glucose 0,1. Bổ sung K phosphate (g/l: KH2PO4 - 23.1; K2HPO4 - 125.4) 100 ml;
- Môi trường lên men sinh tổng hợp L-lactate oxidase (g/l): L-lactate natri 10;
Peptone 2; Cao thịt 2; Cao nấm men 1; K2HPO4 0,9; KH2PO4 1,1; NH4Cl 1;
MgSO4.7H2O 0,5; CaCl2 0,005; dung dịch vi lượng 1,2 ml; pH = 7,0)

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu

/>

Thành phần vi lượng (g/l): Na 2EDTA 50; ZnSO4.7H2O 20; CaCl2 5,5;
MnCl2.4H2O 5; (NH4)2Mo7O24.4H2O 1; FeSO4.7H2O 5; CuSO4.5H2O 1,5; CoCl2.6H2O
1,6.
2.3. Phương pháp nghiên cứu
2.3.1. Phân lập các chủng vi khuẩn lactic
Lấy 1 g mẫu đặc (sữa chua/nem chua) hoặc 1 ml mẫu nước (nước dưa/cà muối)
cho vào ống nghiệm chứa 10ml nước khử trùng, lắc đều. Từ ống nghiệm này, các mẫu
tiếp tục được pha loãng đến nồng độ thích hợp để gạt trên đĩa môi trường MRS – agar
có bổ sung 7% CaCO3. Các đĩa được đặt trong tủ ấm 30 oC trong thời gian từ 18 – 24
giờ. Các khuẩn lạc có vòng phân giải CaCO 3 được thu nhận và giữ giống để tiếp tục
nghiên cứu khả năng sinh tổng hợp L-lactate oxidase. Số lượng vi khuẩn lactic có trong
1 g hoặc 1 ml mẫu phân lập (N) được tính theo công thức sau:
∑C
N = --------------------V(n1+0,1n2)d
Trong đó:

∑C: Tổng số khuẩn lạc đếm được trên tất cả các đĩa đã chọn
V: Thể tích cấy trên mỗi đĩa tính bằng ml

n1: Số đĩa của độ pha loãng thứ nhất được giữ lại
n2: Số đĩa của độ pha loãng thứ hai được giữ lại
d: Hệ số pha loãng của độ pha loãng thứ nhất

2.3.2. Xác định hoạt tính L-lactate oxidase
Các chủng vi khuẩn lactic phân lập được làm giàu trên môi trường MRS ở 30 oC
trong 24 giờ, sau đó được chuyển sang môi trường lên men sinh tổng hợp L-lactate
oxidase với tỉ lệ giống là 5%. Sau khi lên men 48 giờ ở 30 oC, tế bào được li tâm ở điều
kiện 12000 rpm, 4oC, 5 phút để loại bỏ dịch nổi. Tế bào được phá vỡ trong đệm 20 mM
KH2PO4/K2HPO4, pH 7 có bổ sung 1 mM PMSF để ức chế protease tế bào bằng siêu

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu

/>

âm. Li tâm thu dich enzyme thô và loại bỏ xác tế bào. Hoạt tính L-lactate oxidase được
xác định theo phương pháp quang phổ (Sigma Aldrich, Ltd) dựa trên phản ứng
L-lactate + O2

LOX

Pyruvate + H2O2

2H2O2 + 4-AAP + DMA

POD

Quinonediimine dye + H2O

Một đơn vị hoạt tính L-lactate oxidase được định nghĩa là một lượng enzyme

oxy hóa 1 µmole L-lactate thành pyruvate và H2O2 trong một phút ở 37oC, pH 6,5. Do
vậy, hoạt độ L-lactate oxidase được tính theo công thức:
(A565nm mẫu thí nghiệm – A565nm mẫu đối chứng)(3,02)(df)
U/ml = ----------------------------------------------------------------------(35,33)(0,5)(10)(0,02)
Trong đó:
3,02: Tổng thể tích phản ứng
Df: Hệ số pha loãng
35,33: Hệ số hấp thụ mol của Quinonediimine dye ở bước sóng 565nm
0,5: Hệ số chuyển hóa từ 1 mol H2O2 thành một nửa mol Quinonediimine dye
10: Thời gian phản ứng (phút)
0,02: Thể tích dịch enzyme sử dụng để xác định hoạt tính
2.3.3. Phân loại các chủng vi khuẩn lactic
Đặc điểm khuẩn lạc của chủng vi khuẩn được quan sát trên môi trường MRS –
agar, sau 18 – 24 giờ nuôi cấy. Hình dạng tế bào được quan sát trên tiêu bản nhuộm
Gram, dưới vật kính dầu của kính hiển vi quang học Olympus CH-2, độ phóng đại
1000 lần và chụp ảnh hình thái tế bào dưới kính hiển vị điện tử quét (SEM). Sử dụng
Kit API CHL 50 (BioMérieux, Pháp) để xác định các đặc điểm sinh hóa của chủng vi
khuẩn, từ đó định tên phân loại chủng vi sinh vật
2.3.4. Tách chiết DNA tổng số
DNA tổng số của chủng vi khuẩn được tách chiết theo hướng dẫn của bộ Kit
GeneJETTM Genomic DNA Purification (Thermo scientific, Mỹ).

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu

/>

2.3.5. Tách chiết DNA plasmid
DNA plasmid được tách chiết theo hướng dẫn của bộ Kit GeneJETTM Plasmid
Miniprep (Thermo scientific, Mỹ)
2.3.6. Nhân đoạn gen 16S rRNA của vi khuẩn:

DNA tổng số của các chủng vi khuẩn lactic tuyển chọn được dùng làm khuôn để
nhân đoạn gen 1500 bp mã hóa cho 16S rRNA bằng kỹ thuật PCR (Polymerase chain
reaction), sử dụng cặp mồi 16SF (5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’) và 16SR
(5’-TACGGTTACCTTGTTACGACTT-3’).
Phản ứng PCR được thực hiện trong 50 µl hỗn hợp có thành phần như sau:
Đệm Taq polymerase (10x)
dNTPs (10 mM)
Dream Taq polymerase (5000 U/ml)
Mồi 16SF
Mồi 16SR
DNA khuôn (20 ng)

5 µl
2 µl
0,5 µl
10 pmol
10 pmol
2 µl

Phản ứng trên được tiến hành theo chương trình sau:
95oC

3 phút

95oC
30 chu kỳ
1 phút
55oC
68oC
68oC

4oC

1 phút
1 phút 15 giây
7 phút
∞

Sản phẩm PCR được kiểm tra bằng điện di trên gel agarose 0,8%, sau đó được
tinh sạch bằng Kit GeneJET™ Gel Extraction (Thermo scientific, Mỹ) trước khi gửi đi
đọc trình tự trên máy ABI-377 Perkin Elmer tại Phòng Thí nghiệm trọng điểm và công
nghệ Gen, Viện Công nghệ Sinh học.

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu

/>

Trình tự gen 16S rRNA của các chủng vi khuẩn lactic tuyển chọn được so sánh
với các trình tự đã công bố trên GenBank và từ đó xây dựng cây phát sinh chủng loại
bằng các phần mềm Clustalw2 và TreeView
2.3.7. Tách dòng gen Lox
Cặp mồi LOXF (5’-ATGCATCTATCATCTACAGATGTAA-AC-3’) và LOXR
(TTAGTCAATCAATGAGGTATGTTTG-3’) được thiết kế dựa trên trình tự gen Lox
trên Genbank của các chủng vi khuẩn L. lactis để khuếch đại đoạn gen Lox có chiều dài
khoảng 1,1 kb. DNA tổng số của chủng vi khuẩn L. lactis VLSH-12 được dùng làm
khuôn để nhân đoạn gen Lox và hỗn hợp phản ứng được chuẩn bị như sau:
Đệm Taq polymerase (10x):
dNTPs (10 mM):
Dream Taq polymerase (5000 U/ml):
Mồi LOXF (10 pmol):
Mồi LOXR (10 pmol):

DNA khuôn (20 ng):
Nước:
Σ=

5 µl
2 µl
0,5 µl
1 µl
1 µl
1 µl
39,5 µl
50 µl

Phản ứng trên được tiến hành theo chương trình sau:
95 oC: 3 min
95 oC: 1 min
48 oC: 1 min
68 oC: 1 min 15 sec
68 oC: 7 min
4 oC: ∞

30 chu kỳ

Sản phẩm PCR được kiểm tra trên gel agarose 0,8% trước khi được làm sạch
bằng Kit GeneJET™ Gel Extraction (Thermo scientific, Mỹ). Sản phẩm PCR tinh sạch
sau đó được gắn vào vector tách dòng pTZ57R/T theo quy trình hướng dẫn sử dụng Kit
InsTAclone™ PCR Cloning Kit (Thermo scientific, Mỹ). Sản phẩm gắn tiếp tục được
biến nạp vào tế bào khả biến E. coli TOP10F’. Các tế bào E. coli TOP10F’ mang đoạn

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu

/>

gen ngoại lai được nuôi ở 37oC qua đêm trên đĩa thạch LB có bổ sung 50 mM X-Gal và
100 µg/ml ampicillin . Các khuẩn lạc trắng được tách riêng rẽ, nuôi trên môi trường LB
lỏng + ampicillin để thu sinh khối tách plasmid bằng Kit GeneJET™ Plasmid Miniprep
(Thermo scientific, Mỹ). Các plasmid sau khi tách chiết sẽ được cắt kiểm tra bằng
enzyme giới hạn HindIII và EcoRI. Plasmid mang đoạn gen dự đoán 1,1 kb sẽ được
gửi đi đọc trình tự ở Phòng Thí nghiệm trọng điểm và công nghệ Gen, Viện Công nghệ
Sinh học bằng cặp mồi M13/pUC sequencing primer (5’-GTAAAACGACGGCCAGT3’) và (5’-CAGGAAACAGCTATGAC-3’). Kết quả trình tự gen Lox sẽ được so sánh
với các trình tự gen Lox đã công bố trên GenBank.
2.3.8. Biểu hiện gen Lox trong E. coli bằng phương pháp Megaprimer [62].
•

Thiết kế các đoạn mồi:

- Đoạn mồi P1Bs được thiết kế dựa theo trình tự trước hệ promoter của gen αamylase từ chủng B. subtilis 168M (BsA) (5’-TTGATTTGTATTCACTCTGCC).
- Đoạn mồi PK được thiết kế với 20 nucleotide trước codon khởi đầu của BsA và
20 nucleotide tính từ codon khởi đầu gen Lox của chủng Lactococcus lactic subsp.
lactic VLSH-12 (5’-ACAATTTTTTGCTTCTCACTCTTGACACTCCTTATTTGA).
- Đoạn mồi P2LOX được thiết kế dựa theo trình tự nucleotide ở đầu N của gen Lox
(5’-ATGCATCTATCATCTACAGAT).
- Đoạn mồi P3LOX là đoạn mồi ngược được thiết kế theo trình tự ở đoạn kết thúc
phiên mã của gen Lox, với trình tự (5’-TTAGTCAATCAATGAGGTATGTTTGAT).
• Các bước tiến hành( Hình 2.1)

+ PCR1a với thành phần như sau:
Đệm Taq polymerase (10x):
dNTPs (10 mM):
Dream Taq polymerase (5000 U/ml):

Mồi P1Bs (10 pmol):
Mồi PK (10 pmol):
DNA khuôn (20 ng):

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu

5 µl
2 µl
0,5 µl
1 µl
1 µl
1 µl

/>