Tổng hợp và biểu hiện gen mã hóa cho enterocin AS 48 của vi khuẩn enterococcus faecium trong tế bào

Luận văn Thạc sĩ Sinh học

Page 1 of 96
1
MỞ ĐẦU
Hàng năm, trên thế giới và Việt Nam, các vụ ngộ độc thực phẩm không
ngừng gia tăng. Nguyên nhân chính gây ra ngộ độc thực phẩm được xác định là do
vi sinh vật gây bệnh và các yếu tố độc (độc tố nấm hay thuốc trừ sâu có trong rau
quả ). Các vi sinh vật gây bệnh đều có khả năng sinh trưởng, phát triển tốt trong
các loại thực phẩm như thịt lợn, thịt gia cầm, trứng, hải sản và các sản phẩm sữa.
Ngộ độc thực phẩm ảnh hưởng trực tiếp đến sức khỏe và tính mạng con người,
đồng thời gây tác động không nhỏ đến nền kinh tế, chính trị của mỗi quốc gia.
Chính vì thế, vấn đề bảo quản lương thực, thực phẩm luôn được đặt lên hàng đầu
trong chính sách kinh tế, sức khỏe cộng đồng của mỗi quốc gia, đặc biệt là bảo quản
tránh khỏi các vi sinh vật gây bệnh.
Để khắc phục những hạn chế của các phương pháp bảo quản thực phẩm
truyền thống (bảo quản theo phương pháp hóa học, vật lý), các nhà khoa học trên
thế giới đã và đang nghiên cứu, ứng dụng chất bảo quản sinh học không độc hại gọi
chung là bacteriocin. Đây là các peptit có hoạt tính kháng khuẩn, đặc biệt an toàn,
không gây tác dụng phụ khi sử dụng do bị phân cắt nhanh chóng bởi protease trong
đường tiêu hóa ở người. Nhiều bacteriocin đã được nghiên cứu nhưng hiện nay mới
có nisin và pediocin PA-1/AcH được thương mại hóa, sử dụng trong công nghệ
thực phẩm dưới dạng bột. Do đó, việc nghiên cứu và tìm ra các bacteriocin an toàn,
ứng dụng trong bảo quản thực phẩm là rất cần thiết. Enterocin là các bacteriocin
được tạo ra từ chi vi khuẩn Enterococcus rất phong phú và đa dạng, có những đặc
tính đáng quan tâm trong chế biến, bảo quản thực phẩm. Điển hình là enterocin AS-
48 - mét bacteriocin cấu trúc dạng vòng, có phổ ức chế rộng cả vi khuẩn gram
dương và gram âm. Những đặc trưng khác của AS-48 như tính ổn định, bền nhiệt và
tính tan tiêu biểu trong phạm vi pH rộng (thích hợp với nhiều loại thực phẩm) hứa
hẹn là sự lùa chọn thay thế cho các chất bảo quản hóa học trong tương lai.
Từ tính ưu việt của enterocin, đặc biệt là enterocin AS-48 trong bảo quản

nhiều loại thực phẩm, các nhà khoa học đã nghiên cứu nhằm thu lượng lớn peptit
Luận văn Thạc sĩ Sinh học

Page 2 of 96
2
này với mong muốn sử dụng thành thương phẩm. Vấn đề gặp phải là các chủng vi
khuẩn Enterococcus có khả năng sinh enterocin thường tiết ra độc tè. Việc lên men
và thu hồi sản phẩm theo tiêu chuẩn sạch để có thể sử dụng trong thực phẩm gặp
nhiều khó khăn và đạt hiệu suất thấp. Do đó, việc tập trung nghiên cứu tạo enterocin
tái tổ hợp không những khắc phục hạn chế trên mà còn chủ động được nguồn
enterocin. Enterocin AS-48 hoàn toàn có thể được tổng hợp bằng con đường tái tổ
hợp khi biết trình tự ADN của gen mã hóa cho AS-48 mà không cần phải phân lập
từ các chủng tự nhiên. Như vậy, enterocin AS-48 có thể được tổng hợp với hiệu
suất cao bằng con đường tái tổ hợp nhờ vi khuẩn E. coli.
Từ thực trạng trên, chúng tôi đã tiến hành đề tài: “Tổng hợp và biểu hiện
gen mã hóa cho enterocin AS-48 của vi khuẩn Enterococcus faecium trong tế
bào Escherichia coli ER2566” nhằm mục đích tổng hợp enterocin AS-48 tái tổ hợp
để ứng dụng làm chất bảo quản nông sản, thực phẩm sinh học. Công trình này được
thực hiện tại phòng Kỹ thuật Di truyền, Viện Công nghệ Sinh học, Viện Khoa học
và Công nghệ Việt Nam.

Luận văn Thạc sĩ Sinh học

Page 3 of 96
3

CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. TỔNG QUAN VỀ BACTERIOCIN
1.1.1. Giới thiệu chung
1.1.1.1. Ngộ độc thực phẩm
Mặc dù con người đã sử dụng những công nghệ bảo quản thùc phẩm mới và
an toàn (ví dụ: HACCP - hệ thống kiểm soát rủi ro về vệ sinh an toàn thực phẩm
mang tính phòng ngõa) trong chế biến và bảo quản nhưng các ca ngộ độc thực
phẩm vẫn không ngừng gia tăng Error! Reference source not found.. Các hóa
chất, kim loại nặng, ký sinh trùng, nấm, virus và vi khuẩn đều có thể gây ngộ độc
thực phẩm. Trong đó, vi khuẩn là nguyên nhân phổ biến nhất với hơn 90% các ca
ngộ độc thực phẩm hàng năm, chủ yếu do Staphylococcus aureus, Salmonella,
Clostridium botulinum, Clostridium perfringens, Campylobacter jejuni, Listeria
monocytogenes, Vibrio parahaemolyticus, Bacillus cereus, Toxoplasma gondii và
Escherichia coli O157:H7 6, Error! Reference source not found.. Trường hợp
nhẹ là những hậu quả về rối loạn tiêu hóa, mất cân bằng điện giải, kiệt sức, trường
hợp nặng có thể dẫn đến tử vong nếu không chữa trị kịp thời, đúng cách. Do đó, an
toàn thực phẩm luôn là vấn đề quan tâm hàng đầu của mỗi quốc gia mà trọng tâm là
bảo quản thực phẩm phòng tránh các vi sinh vật gây bệnh 6. Theo uỷ ban Khoa
học và Công nghệ Hoa Kỳ, ước tính hàng năm nước này có khoảng 76 triệu ca ngộ
độc thực phẩm, gây ra 5000 ca tử vong. Thực phẩm chính là thịt lợn, thịt gia cầm,
trứng, hải sản và các sản phẩm sữa, tiêu tốn từ 6,5-34,9 tỷ đô la Error! Reference
source not found.. Các mầm bệnh thực phẩm như Listeria spp. có khả năng chịu
nhiệt độ thấp và nồng độ muối cao, gây ra hơn 2500 vụ ngộ độc thực phẩm với 500
ca tử vong chỉ riêng ở Hoa Kỳ 12. Ở Việt Nam, hàng năm cũng có hàng nghìn ca
ngộ độc thực phẩm, gây tổn thất về sức khỏe và kinh tế. Trong năm 2008, tính đến

tháng 7, đã có 106 vụ ngộ độc thực phẩm, gần 5000 người mắc và 43 người đã bị tử
Luận văn Thạc sĩ Sinh học

Page 4 of 96
4
vong. Bởi vậy, những chất bảo quản thực phẩm an toàn là vô cùng quan trọng 1,
12.
Cùng với sự gia tăng nhu cầu về những thực phẩm tự nhiên và an toàn hơn,
con người cần những công nghệ bảo quản mới để ngăn ngõa sự hư háng và nhiễm
độc thực phẩm. Các cách truyền thống đã được thay thế bởi những công nghệ mới,
cải tiến như khử trùng nhẹ bằng nhiệt, giảm không khí, đóng gói chân không, áp
suất thuỷ tĩnh cao, chiếu tia tử ngoại và sử dụng chất kháng khuẩn tự nhiên - các
bacteriocin 6, Error! Reference source not found.. Việc sử dụng bacteriocin một
mình hoặc kết hợp với xử lý hoá lý và chất bảo quản hoá học có thể là biện pháp
hiệu quả để đảm bảo hàm lượng dinh dưỡng của nguyên liệu thô và thực phẩm, kéo
dài thời gian bảo quản, kìm hãm vi khuẩn làm háng, gây bệnh 2.
1.1.1.2. Bacteriocin
Bacteriocin được Gratia phát hiện lần đầu tiên năm 1925 với tên là principe
V bắt nguồn từ một chủng E. coli có khả năng chống lại các chủng E. coli khác
trong cùng môi trường nuôi cấy. Thuật ngữ “colicin” do Gratia và Fredericq đặt ra
năm 1946. Ngày nay, colicin được dùng cho protein kháng khuẩn từ các loài E. coli
và có quan hệ gần với Enterobacteriaceae Error! Reference source not found..
Năm 1953, Jacob và CS. đã đặt tên cho các protein có hoạt tính kháng khuẩn đặc
hiệu cao là bacteriocin.
Thuật ngữ bacteriocin được giải thích đơn giản. Tương tự “ase” sử dụng
trong enzyme, tiếp tố “cin” dùng để biểu thị hoạt tính tạo bacteriocin. Tiếp tố “cin”
được viết thêm vào tên chi (hay đúng hơn là tên loài). Colicin được phân lập đầu
tiên từ E. coli, monocins từ L. monocytogenes, subtilin được tạo ra bởi Bacillus
subtilis, staphylocin từ S. aureus và nhiều loại khác. Các chữ cái theo thứ tù tìm ra
được viết sau tên bacteriocin để phân biệt với bacteriocin duy nhất từ chủng khác

cùng loài. Ví dụ, lactacin F là bacteriocin thứ 6 được tìm ra từ loài Lactobacilli
34.
Luận văn Thạc sĩ Sinh học

Page 5 of 96
5
Trong tự nhiên, vi sinh vật có khả năng tạo ra các hợp chất khác nhau nhằm
hạn chế hoặc chống lại các vi sinh vật khác 44, 60. Các hợp chất này được biết
đến như kháng sinh, sản phẩm trao đổi chất thứ cấp như axit lactic, các yếu tố phân
giải như lysozym, các dạng exotoxin protein và bacteriocin. Bacteriocin được tổng
hợp khi vi khuẩn gặp các điều kiện ức chế - tác động của môi trường sống, cạnh
tranh về nguồn dinh dưỡng, không gian Các bacteriocin có hoạt tính kháng khuẩn
cao thậm chí ở nồng độ rất thấp 69. Họ bacteriocin gồm các protein đa dạng về
mặt kích thước, vi khuẩn đích, dạng hoạt động và cơ chế miễn dịch. Hiện nay, có
hàng trăm loại bacteriocin. Những bacteriocin này được tìm thấy trong hầu hết các
vi khuẩn, gần đây còn tìm thấy trong vi khuẩn cổ - Archaea (gọi là các Archaeocin)
60.
Nhiều nghiên cứu được tiến hành với bacteriocin trên các loài vi khuẩn khác
nhau cho thấy chúng được mã hóa bởi các gen trên plasmid (ví dô, Col plasmid
trong E. coli). Mét số được mã hóa bởi các gen nằm trên ADN hệ gen, như
plantaracin A và sakacina 674, trong khi có trường hợp được xác định trên các
transposon như nisin 69.
Vì cũng có hoạt tính kháng khuẩn nên trước đây, bacteriocin bị nhầm lẫn
như là “các chất kháng sinh”. Năm 1965, Reeves và CS. đã tìm ra sự khác biệt của
bacteriocin với các chất kháng sinh bởi đặc điểm đặc trưng: Bacteriocin có bản chất
là protein. Chính sự khác biệt này đã tạo nên đặc tính ưu việt của bacteriocin trong
ứng dụng bảo quản thực phẩm 34.
Sù tranh luận nên được đặt vào bối cảnh khám phá ra nisin năm 1924, trước
cả penicillin và colicin. Khi đó những chất kháng khuẩn protein bị xem là các chất
kháng sinh. Chất kháng sinh được tạo ra bởi một nhóm hạn chế vi sinh vật, là sản

phẩm trao đổi chất bậc hai. Các chất này không có chức năng rõ ràng trong sinh
trưởng và sinh sản của bản thân vi khuẩn, được tiết dễ dàng ra khỏi tế bào 60. Khi
khám phá ra trong cấu trúc nisin có chứa một số axit amin hiếm như de-
hydroalanin, dehydrobuterin và cầu lanthion sulfur đơn, nisin không được xem là
Luận văn Thạc sĩ Sinh học

Page 6 of 96
6
một protein bởi riboxom không tạo những axit amin này (kÓ cả những chất tương
đồng với nisin như subtilin và epidermin). Chỉ đến khi Hansen và CS. (1990) phát
hiện ra rằng, nisin thực tế được tạo ra bởi riboxom qua quá trình khử nước các axit
amin và sự hình thành cầu lanthion diễn ra sau dịch mã, nisin mới được công nhận
là một bacteriocin. Sự có mặt của các gen riêng rẽ trong tổng hợp bacteriocin xác
nhận rằng chúng là protein peptit thực sự. Như vậy, bacteriocin được phân biệt để
tránh sự nhầm lẫn và liên quan tới chất kháng sinh y học - có thể gây dị ứng bị cấm
sử dụng trong thực phẩm đối với con người. Đặc điểm khác biệt chính là:
Bacteriocin được tổng hợp trong riboxom, không phải là các chất chuyển hóa. Do
có bản chất protein (thử nghiệm với các enzyme phân giải protein như trypsin, -
chymotrypsin và pepsin) 4 nên bacteriocin không gây tác dụng phụ do bị phân cắt
nhanh chóng bởi protease trong đường tiêu hóa ở người. Bacteriocin có phổ kháng
khuẩn tương đối hẹp, được tiết vào môi trường để ức chế sự sinh trưởng của vi
khuẩn hay bào tử, đôi khi tiêu diệt các vi khuẩn quan hệ gần gũi với chủng sản xuất.
Các tế bào sản xuất thì miễn dịch với hoạt tính bacteriocin. Các bacteriocin có dạng
hoạt động kháng khuẩn khác với kháng sinh. Các đặc điểm trên được tổng kết trong
bảng 1 12, Error! Reference source not found. .
Bảng 1. Sù khác nhau giữa bacteriocin và kháng sinh
Các đặc điểm
Bacteriocins
Các kháng sinh
Ứng dông

Thực phẩm
Y học
Tổng hợp
Riboxom (sản phẩm chuyển hóa bậc 1)
Sản phẩm chuyển hóa
bậc 2
Hoạt tính
Phổ hẹp
Phổ rộng
Miễn dịch tế bào chủ
Có
Không
Sự có mặt của các tế bào
miễn dịch trong tế bào chủ
Có mặt
Vắng mặt
Luận văn Thạc sĩ Sinh học

Page 7 of 96
7
Dạng hoạt động
Hầu hết qua sự hình thành lỗ nhưng đôi
khi cũng tác động lên sự tổng hợp sinh
học thành tế bào
Màng tế bào hay các
đích nội bào
Ảnh hưởng độc lên tế bào
nhân chuẩn
Không
Có

1.1.2. Phân loại bacteriocin
Có nhiều tiêu chuẩn phân loại bacteriocin: Theo đặc điểm cấu trúc, khối
lượng phân tử, phổ kháng khuẩn, sinh vật sản xuất 56, 59. Riley và CS. (2007)
đã chia bacteriocin thành hai nhóm lớn theo vi khuẩn gram dương và gram âm.
Bacteriocin của vi khuẩn gram dương phong phú và đa dạng hơn ở vi khuẩn gram
âm. Chúng phân biệt với bacteriocin gram âm theo hai cơ sở. Thứ nhất, quá trình
tạo bacteriocin không cần sự giết chết bản thân nó như ở vi khuẩn gram âm. Đây là
do cơ chế vận chuyển, giải phóng bacteriocin ở vi khuẩn gram dương. Một số tham
gia vào hệ thống vận chuyển đặc hiệu bacteriocin, trong khi một số khác tham gia
vào con đường vận chuyển phô thuộc chuỗi tín hiệu (signal sequences dependent
export pathway). Thứ hai, vi khuẩn gram dương tạo quá trình điều hòa đặc hiệu
bacteriocin, trong khi các bacteriocin từ vi khuẩn gram âm chỉ phụ thuộc vào hệ
thống điều hòa của tế bào chủ 60.
1.1.2.1. Bacteriocin từ vi khuẩn gram âm
Các bacteriocin tạo ra từ vi khuẩn gram âm là những protein kích thước lớn.
Hơn 30 loại bacteriocin từ E. coli đã được xác định. Tuy nhiên, đến nay các yếu tố
ảnh hưởng đến quá trình tạo bacteriocin và sự đa dạng của chúng vẫn chưa hoàn
toàn rõ ràng. Những hiểu biết này rất cần thiết, không chỉ giúp phân loại các quần
thể vi khuẩn trong môi trường tự nhiên mà còn để giải quyết vấn đề ứng dông 60.
Luận văn Thạc sĩ Sinh học

Page 8 of 96
8
Đại diện tiêu biểu cho bacteriocin từ vi khuẩn gram âm là colicin với phổ
kháng khuẩn hẹp và hoạt động thông qua tương tác với thụ thể đặc hiệu màng ngoài
của tế bào đích. Colicin có các cụm gen phân bố trên các plasmid và được sắp xếp
thành gen colicin mã hóa cho protein gây độc, gen miễn dịch mã hóa cho protein

chịu trách nhiệm miễn dịch đặc hiệu với tế bào sản xuất (bằng cách gắn và bất hoạt
protein gây độc) và gen phân giải mã hóa cho protein tham gia vào việc giải phóng
colicin thông qua phân giải tế bào chủ 12, 60. Sù tạo colicin được thông qua đơn
vị điều hòa SOS (SOS regulon - là một dạng phản ứng của vi khuẩn với sự hư hại
ADN, trong đó, các gen lexA và recA có vai trò chủ chốt giúp điều hòa chuỗi phản
ứng SOS) 35, 73 và do đó, nã được tạo ra chủ yếu dưới những điều kiện ức chế.
Colicin tiêu diệt vi khuẩn qua các cơ chế khác nhau, bằng cách ngăn chặn tổng hợp
thành tế bào, tăng tính thấm của màng tế bào đích do sự hình thành lỗ hay hoạt hoá
hoạt động của nuclease 60.
Phân loại bacteriocin vi khuẩn gram âm
Các bacteriocin từ vi khuẩn gram âm được đặt tên theo chi, loài sản xuất,
như klebicin của Klebsiella pneumoniae hay theo loài như colicin của E. coli,
marcescin của Serratia marcescens, alveicins của Hafnia alvei và cloacins của
Enterobacter cloacae) 60. Bacteriocin từ vi khuẩn gram âm có thể được phân
thành ba nhóm dùa vào kích thước: Nhóm 1 - Colicin kích thước lớn (25-80 kDa),
nhóm 2 - Các microcin kích thước nhỏ hơn (<10 kDa) và nhóm 3 - Bacteriocin như
phần đuôi của phage gồm các đơn vị lắp ghép peptit. Trong đó, microcin là những
peptit khối lượng phân tử thấp không cảm ứng SOS, có cấu trúc tương tự
bacteriocin líp II của vi khuẩn gram dương, được tổng hợp trong pha cân bằng 42.
Bacteriocin như đuôi phage là các nuclease và protease kháng vi khuẩn que, tiêu
diệt tế bào nhạy cảm bởi sự khử cực màng. Chúng là những phage thiếu sót hay có
nguồn gốc từ phage với chức năng như bacteriocin. Ví dô: Pyocin R2 (từ
Pseudomonas spp.) là một phần thừa của phage P2 trong khi pyocin F2 tương tự
như phage  60.
Luận văn Thạc sĩ Sinh học

Page 9 of 96
9
1.1.2.2. Bacteriocin từ vi khuẩn gram dương
Nisin là đại điện được nghiên cứu sớm nhất trong các bacteriocin vi khuẩn

gram dương. Đây là lantibiotic được tạo ra từ Lactococcus lactis spp. gọi là “các
chất ức chế nhóm N” 59. Hầu hết bacteriocin từ vi khuẩn gram dương là các
peptit nhá, mang điện dương, kỵ nước hay lưỡng tính và thường không có thụ thể
nhận biết đặc hiệu trên màng tế bào (trừ một số trường hợp ngoại lệ). Các
bacteriocin này khác nhau ở dạng giải phóng, vận chuyển trong tế bào và sự phân
cắt trình tự dẫn đầu trong quá trình chế biến tạo phân tử trưởng thành 56, 60.
Phân loại bacteriocin vi khuẩn gram dương
Nhiều nhà khoa học phân loại bacteriocin từ vi khuẩn gram dương theo các
líp có một số điểm khác nhau. Dùa trên các kết quả của Klaenhammer et al. 1993,
Kemperman et al. (2003a), Cotter et al. (2005b) … bacteriocin từ vi khuẩn gram
dương được chia thành bốn líp theo hình 1:

Hình 1. Sơ đồ phân loại các bacteriocin từ vi khuẩn gram dương
B
B
a
a
c
c
t
t
e
e
r
r
i
i
o
o
c

c
i
i
n
n


t
t
ừ
ừ


v
v
i
i


k
k
h
h
u
u
ẩ
ẩ
n
n

g
g
r
r
a
a
m
m


d
d
ư
ư
ơ
ơ
n
n
g
g


Lớp II: các non-
lantibiotic, Mr bé
(<10 kDa)
Lớp I: các
lantibiotic
Lớp III: các
protein Mr lớn

(>10 kDa)
Lớp IV: các
peptit vòng
Loại A:
mạch dài
dài
Loại B:
hình cầu
Loại C: đa
thành phần
AII: như
SA-FF22
AI: như
nisin
Phân lớp IIa:
như pediocin
IIb: đa
thành phần
IIc: còn lại
IIIb: không
phân giải
IIIa: các
lysin
Luận văn Thạc sĩ Sinh học

Page 10 of 96
10
Líp I - Các lantibiotic (từ lanthionin - chứa antibiotic) là các peptit bền
nhiệt, tác động lên cấu trúc màng (<5 kDa), chứa các axit amin hiếm, bị biến đổi
sau dịch mã như lanthionin (Lan), -methyllanthion, -methyl lanthionin (MeLan),

dehydroalanin và dehydrobutyrin. Líp I còn được phân nhỏ hơn thành các
lantibiotic loại A, B, C theo cấu trúc hóa học và hoạt tính kháng khuẩn.
 Lantibiotic loại A là các peptit có cấu trúc mạch thẳng kéo dài và
linh động. Loại A được phân thành hai phân loại AI và AII dùa trên kích thước, sự
tích điện và trình tự peptit dẫn đầu. Ví dụ: nisin thuộc phân loại AI, streptococcin
A-FF22 (SA-FF22) tạo ra bởi S. pyogenes chủng FF22 thuộc phân loại AII.
 Lantibiotic loại B là các peptit có hình cầu và kém linh động so với
loại A, thường không mang điện hay mang điện âm ở pH trung tính. Hoạt động
kháng khuẩn dùa trên sự can thiệp những phản ứng enzyme thiết yếu của các tế bào
nhạy cảm. Mersacidin đại diện cho loại này là peptit gồm 20 axit amin.
 Lantibiotic loại C là các lantibiotic đa thành phần, chủ yếu cấu tạo
gồm hai peptit biến đổi sau dịch mã. Trong đó, mỗi peptit có một Ýt hay không có
hoạt tính kháng khuẩn nhưng chúng có vai trò điều phối, nghĩa là chỉ khi kết hợp
hai peptit mới tạo phân tử bacteriocin có hoạt tính kháng khuẩn. Ví dụ lactacin 3147
từ Lactococcus lactis DP3147 gồm hai peptit LtnA1 và LtnA2 34.
Líp II - Bacteriocin <10kDa gồm các bacteriocin peptit đa dạng về khối
lượng phân tử, bền nhiệt và chứa các axit amin thông thường (non-lantibiotic). Đây
là líp được các nhà khoa học tập trung nghiên cứu nhất 60. Những peptit này được
chia thành ba phân líp là:
 Phân líp IIa gồm các bacteriocin với cấu trúc tương tù nh- pediocin-
có một trình tự liên ứng đầu N của bacteriocin hoàn chỉnh - Tyr-Gly-Asn-Gly-Val-
Xaa-Cys. Phân líp này được tập trung nghiên cứu nhiều do hoạt tính diệt mầm bệnh
L. monocytogenes hiệu quả. Ví dụ: pediocin PA-1, mét peptit 44 axit amin từ
Pediococcus acidilactici 17 .
Luận văn Thạc sĩ Sinh học

Page 11 of 96
11
 Phân líp IIb là bacteriocin nhiều thành phần cũng tương tù nh- ở
lantibiotic loại C. Ví dụ, lactococcin G từ L. lactis. Mặc dù rất hiếm gặp nhưng

cũng có những bacteriocin ba hay bốn thành phần. Ví dụ : SLUSH -hemolysin từ
Staphylococcus lugdunensis, là bacteriocin ba peptit; aureocin A70 từ S. aureus
gồm bốn peptit.
 Phân líp IIc là các bacteriocin còn lại của líp này nh- bacteriocin tiết
ra bởi con đường phụ thuộc chuỗi tín hiệu. Ví dô : Sakacin Q.
Líp III - Bacteriocin kích thước lớn >10kDa là các protein không bền
nhiệt, trừ propionicin SM1 từ Propinonibacterium jensenii. Do đó, lớp này Ýt được
ứng dụng trong thực phẩm 60. Có thể chia thành hai phân líp, đầu tiên là
bacteriolysin (các enzyme bacteriolytic) tiêu diệt các chủng nhạy cảm bằng cách
phân giải tế bào, ví dụ : lysostaphin từ Staphylococcus simulans biovar
staphylolyticus. Phân líp thứ hai là các protein kháng khuẩn không phân giải, phải
kể đến đầu tiên là helveticin J, mét bacteriocin 37 kDa từ Lactobacillus helveticus.
Lớp IV - Các bacteriocin vòng là líp đặc biệt gồm các bacteriocin có cấu
tróc vòng (Bảng 2). Đây là các peptit được biến đổi sau dịch mã bằng liên kết cộng
hoá trị nội phân tử tạo cấu trúc vòng cho peptit trưởng thành. Đến nay, líp này gồm
một số thành viên nh- enterocin AS-48, circularin A, gassericin A … được tổng kết
ở bảng 2 60, 63.
Bảng 2. Các bacteriocin vòng tạo ra từ vi khuẩn gram dương
Bacteriocin
Nguồn gốc
Kích thước
(axit amin)
Đặc điểm đặc trưng
1. Enterocin AS-
48
Enterococcus
faecalis
70
- Dạng chuẩn và là bacteriocin vòng biết rõ nhất cả về
hóa sinh và di truyền

2. Gassericin A
Lactobacillus
gasseri LA39
58
- Bacteriocin vòng đầu tiên được báo cáo chứa hỗn hợp
D và L-axit amin (ít nhất D-Ala)
3. Reutericin 6
Lactobacillus
reuteri LA6
58
- Trình tự axit amin bậc nhất tương tự như gassericin A
nhưng khác biệt ở phổ ức chế do thành phần thay đổi D-
Ala (tỷ lệ của D-Ala:L-Ala)
Luận văn Thạc sĩ Sinh học

Page 12 of 96
12
4. Circularin A
Clostridium
beijerinckii ATCC
25752
69
- Có quá trình cải biến sau dịch mã khác thường; locus
gen (cir) chứa các gen cùng nguồn gốc với các gen được
tìm thấy trong locus của as-48
5. Butyrivibriocin
AR10
Butyrivibrio
fibrisolvens AR10
58

- Bacteriocin vòng đầu tiên được phân lập từ vi khuẩn
dạ cỏ, tương đồng 45% với gassericin A
6. Uberolysin
Streptococcus
uberis 42
70
- Từ chi Streptococcus, đáng chó ý do tính không bền
nhiệt và chỉ phân giải các tế bào sinh trưởng nhanh
7. Acidocin B
Lactobacillus
acidophilus M46
58
- Bacteriocin có trình tự tương tự gassericin A, gen mã
hóa (acdB) ở trên một plasmid của chủng sản xuất
8. Subtilosin A
Bacillus subtilis
35
- Bacteriocin vòng mang điện âm, tác động lên cả vi
khuẩn gram dương và gram âm, đáng chú ý ở khả năng
chống chịu các điều kiện ức chế

1.1.3. Ứng dụng của bacteriocin
Đối với vi sinh vật, bacteriocin là phương thức để cạnh tranh dinh dưỡng và
không gian sống giữa các loài, giúp cân bằng sinh thái vi sinh vật 69. Đối với con
người, bacteriocin còng có vai trò quan trọng. Những ứng dụng tiềm năng của
bacteriocin gồm:
1.1.3.1. Bảo quản sinh học thực phẩm
Trước đây bảo quản thực phẩm dùa trên việc sử dụng các chất phụ gia tổng
hợp hóa học. Điều này khiến người tiêu dùng lo ngại do những ảnh hưởng có hại
đến sức khỏe. Bảo quản sinh học thực phẩm với việc sử dụng các vi sinh vật đối

kháng (giống bảo vệ) hay các sản phẩm trao đổi của chúng (chất bảo quản sinh học)
để ức chế hay tiêu diệt các vi sinh vật không mong muốn là giải pháp có nhiều tiềm
năng 56. Ưu điểm của bacteriocin trong bảo quản sinh học thực phẩm là tăng thời
hạn sử dụng, hạn chế sự truyền mầm bệnh trong chuỗi thức ăn, giảm thiệt hại kinh
tế do hư háng thực phẩm, hạn chế sử dụng chất bảo quản hóa học cũng như những
xử lý nhiệt khắt khe. Bacteriocin giúp bảo quản giá trị dinh dưỡng và vitamin, cung
cấp những thực phẩm mới (ít axit, hàm lượng muối thấp và hàm lượng nước cao)
Luận văn Thạc sĩ Sinh học

Page 13 of 96
13
thỏa mãn nhu cầu công nghiệp và người tiêu dùng Error! Reference source not
found., 44. Mét xu hướng trong công nghiệp thực phẩm ở Châu Âu là hạn chế sử
dụng chất phụ gia và thành phần nhân tạo, hạn chế sự chế biến nhưng phải đảm bảo
an toàn, giữ nguyên chất lượng. Những yêu cầu này có thể được đáp ứng nhờ sử
dụng bacteriocin 30, 34.
Bacteriocin có các đặc điểm lý tưởng trong bảo quản sinh học thực phẩm.
Nhiều bacteriocin bền trong điều kiện nhiệt độ chế biến cao và hoạt động trong
phạm vi pH rộng. Các bacteriocin được xem là hợp chất an toàn do bị phân giải như
những protein khác trong thức ăn 56. Bacteriocin không mùi, không màu, không
vị, ảnh hưởng không đáng kể lên khu hệ vi sinh vật đường ruột, có phổ kháng khuẩn
tương đối rộng lên nhiều mầm bệnh và vi khuẩn gây háng thực phẩm 30. Mét sè
bacteriocin cho thấy hiệu quả bổ trợ khi sử dụng phối hợp với các yếu tố kháng
khuẩn khác như hợp chất phenolic tự nhiên cũng như những protein kháng khuẩn
khác. Sự kết hợp các bacteriocin khác nhau có thể giúp ngăn ngõa sự phát triển của
những chủng kháng. Ngoài ra, sự kết hợp bacteriocin với xử lý vật lý như áp suất
cao hay xung điện trường giúp bảo quản thực phẩm hiệu quả hơn, nhất là đối với
những dạng có khả năng sống sót cao như vi khuẩn sinh bào tử. Tính hiệu quả của
bacteriocin thường bị ảnh hưởng bởi các yếu tố môi trường như pH, nhiệt độ, thành
phần thực phẩm và cấu trúc, cũng như vi khuẩn thực phẩm. Thực phẩm phải được

xem như là hệ sinh thái mà các tương tác vi khuẩn có thể ảnh hưởng lớn đến cân
bằng vi sinh vật và sự phát triển những vi khuẩn có lợi hay gây hại. Do đó, cần xác
định hiệu quả của bacteriocin cho mỗi hệ thống thực phẩm 34.
Các bacteriocin được sử dụng trong bảo quản sinh học thực phẩm dưới ba
dạng chính: 12.
- Ủ thực phẩm với giống bảo vệ (thường là vi khuẩn lactic - LAB: Lactic axit
bacteria) để tạo bacteriocin in situ. Trong trường hợp này, khả năng LAB sinh
trưởng và tạo bacteriocin trong sản phẩm là quyết định.
- Bổ sung bacteriocin tinh chế hay bán tinh chế như là các chất bảo quản thực phẩm.
Luận văn Thạc sĩ Sinh học

Page 14 of 96
14
- Sử dụng bán thành phẩm lên men trước đó với một chủng sinh bacteriocin như là
một thành phần trong quá trình chế biến thực phẩm Error! Reference source not
found..
Một lùa chọn mới hiện nay trên cơ sở dạng thứ hai là dùng màng polythen
hoạt tính bacteriocin cho đóng gói thực phẩm 12.
1.1.3.2. Các sản phẩm chăm sóc sức khỏe
Do nisin có khả năng ức chế phổ rộng các vi khuẩn gram dương nên được sử
dụng trong ngăn ngõa chứng viêm vú ở gia súc. Hiện nay, mutacin từ cầu khuẩn
thuộc các chủng của Streptococcus mutans biến đổi di truyền được sử dụng trong
sản phẩm chăm sóc sức khỏe răng miệng như kem đánh răng, nước súc miệng để ức
chế sâu răng và cao răng. Bacteriocin có trong xà phòng, mỹ phẩm giúp loại trừ
mụn, trứng cá 34, 52.
Các bacteriocin gần đây cũng được ứng dụng trong lĩnh vực y tế. Do vi sinh
vật đang tăng dần tính kháng kháng sinh nên các liệu pháp trong điều trị chống lại
bệnh nhiễm trùng sẽ trở nên vô hiệu. Bacteriocin có thể là một giải pháp cho trình
trạng này, giúp điều trị nhiễm trùng da cục bộ hay nhiễm trùng kháng đa thuốc 56.
Chóng có thể ức chế sự sinh trưởng của vi khuẩn với ưu điểm: Sản phẩm tự nhiên,

từ “vi khuẩn tốt” và không có rủi ro nhiễm bệnh hay các vấn đề khác. Các chủng
probiotic và các chủng tạo bacteriocin có khả năng bảo vệ đường tiêu hóa chống lại
vi khuẩn gây bệnh 12, 34.
1.1.3.3. Các giống khởi động
Giống khởi động (Starter cultures) là các sản phẩm công nghiệp mà bản thân
tế bào vi sinh vật được sử dụng làm nguyên liệu cấy. Thông thường giống khởi
động là hỗn hợp các loài vi sinh vật có vai trò tạo màu, tạo mùi thơm đặc trưng, làm
giảm độ pH, ngăn cản sự phát triển của vi khuẩn có hại trong thực phẩm. Khi sử
dụng như là một giống khởi động, chủng sinh bacteriocin phải thực hiện lên men tối
ưu, ngoài ra phải tạo lượng bacteriocin đủ khả năng bảo vệ. Ở mét số trường hợp,
Luận văn Thạc sĩ Sinh học

Page 15 of 96
15
sự tạo bacteriocin có thể giúp tăng tính cạnh tranh và ổn định giống nhưng không
được can thiệp đến chức năng của giống khởi động ban đầu. Do đó, giống khởi
động phải kháng với bacteriocin. Chúng được tạo ra qua quá trình chọn lọc các thể
đột biến kháng tự nhiên, bằng nuôi cấy phụ lặp lại với việc tăng nồng độ bacteriocin
để chọn lọc các giống thích nghi hay bằng biến đổi gen. Ví dụ, sự nuôi cấy một
chủng Enterococcus sinh enterocin AS-48 như là giống đồng nuôi cấy kết hợp với
một giống khởi động thương mại trong sản xuất phomat không ảnh hưởng đến sự
sinh trưởng của giống khởi động hay đặc tính hóa sinh của phomat tạo ra. Đồng thời
bacteriocin được tạo ra trong phomat đủ đảm bảo ức chế Bacillus cereus Error!
Reference source not found., 34.
Kỹ thuật ADN tái tổ hợp đã tạo ra các giống khởi động tái tổ hợp chứa gen
miễn dịch và gen tạo bacteriocin. Các gen này nằm trên một đoạn ADN cụ thể,
được cài vào vector nhân dòng và chuyển vào các giống khởi động. Chúng có thể
được đưa vào giống khởi động trong sữa và trong sản xuất các thực phẩm lên men
khác để ức chế sự sinh trưởng của mầm bệnh in situ và tăng thời hạn sử dụng; vào
nấm men để ức chế các vi khuẩn gây háng lactic 34.

1.1.3.4. Các probiotic
Trong những năm gần đây, các nghiên cứu về probiotic tăng lên nhanh
chóng. Nhiều sản phẩm probiotic đã xuất hiện trên thị trường dưới dạng các loại sản
phẩm đa dạng như viên bọc, bột, sữa chua làm giàu và nhiều loại thực phẩm khác.
Thuật ngữ probiotic bắt nguồn từ tiếng Hy Lạp có nghĩa là vì sự sống. Theo đó,
probiotic là: “Những vi sinh vật sống mà khi đưa vào cơ thể một lượng đủ lớn sẽ tác
động có lợi cho sức khỏe của vật chủ” Error! Reference source not found.. Vi
sinh vật sử dụng cho các sản phẩm probiotic là nấm men, vi khuẩn (đặc biệt là
nhóm LAB). Ví dô, Lactobacillus acidophilus là LAB lên men đồng hình được tìm
thấy trong đường tiêu hoá của người và động vật. Chúng được bổ sung vào các sản
phẩm sữa lên men thương mại nh- sữa chua acidophilus. Những vi khuẩn này có
ảnh hưởng tích cực lên sức khoẻ con người nhờ khả năng sinh bacteriocin - giúp ức
Luận văn Thạc sĩ Sinh học

Page 16 of 96
16
chế hay tiêu diệt các vi khuẩn gây bệnh. Các bacteriocin từ L. acidophilus và L.
gasseri có tác dụng kích thích hoạt động của hệ thống miễn dịch, bất hoạt các hợp
chất gây đột biến và ung thư tiềm năng, giảm cholesterol trong máu. Probiotic từ
LAB hiệu quả trong ngăn ngõa sự rối loạn đường ruột và điều trị tiêu chảy do các
nguyên nhân khác nhau. Bacteriocin giúp vi sinh vật có lợi cạnh tranh với vi sinh
vật bản xứ còng nh- hệ vi khuẩn đường ruột gây bệnh 31, 34.
1.1.3.5. Các dấu chuẩn tạo vector tách dòng trong thực phẩm
Các gen kháng kháng sinh (kanamycin, erythromycin, tetracyclin,…) được
sử dụng phổ biến nh- là dấu chuẩn chọn lọc trong vector tách dòng. Với mục đích
khoa học, các gen kháng kháng sinh dùng là dấu chuẩn hữu hiệu cho chọn lọc
những thể biến nạp 69, 73. Tuy nhiên, các dấu chuẩn này không được chấp nhận
trong thao tác với giống khởi động bởi lo ngại chúng có thể truyền tính kháng
kháng sinh vào hệ vi khuẩn đường ruột. Do đó, các gen kháng bacteriocin có thể
được sử dông nh- là dấu chuẩn chọn lọc thay thế, tạo vector tách dòng an toàn trong

thực phẩm 34. Tương tù nh- dấu chuẩn chọn lọc kháng sinh, chúng có thể được
truyền và chọn lọc trong tế bào nhạy cảm với các yếu tố chọn lọc (bacteriocin) hay
thiếu khả năng chuyển hóa yếu tố sử dụng chọn lọc (khả năng sử dông hydrat
cacbon) 69. Ví dụ, gen miễn dịch lafI kháng lactacin F dùng cho các chủng
Lactobacillus - nhạy cảm với lactacin F. Gen miễn dịch ltnI kháng lacticin 3147 từ
L. lactis, gen kháng nisin 69, 73.
Luận văn Thạc sĩ Sinh học

Page 17 of 96
17

Hình 2. Các ứng dụng của bacteriocin
1.1.4. Các bacteriocin thương mại
Những năm gần đây, mối quan tâm về tính an toàn và chất lượng của thực
phẩm đã thôi thúc các nhà khoa học khám phá và phát triển phương pháp mới trong
bảo quản thực phẩm, đặc biệt là các bacteriocin. Tuy nhiên đến nay, tác dụng của
các bacteriocin trong thực phẩm chủ yếu là trên thí nghiệm. Có thể do yêu cầu khắt
khe đối với một sản phẩm bảo quản sinh học an toàn còng nh- những quan điểm
trái ngược về những giống khởi động cải biến di truyền trong thực phẩm. Tuy
nhiên, khi người tiêu dùng cần những sản phẩm được bảo quản, Ýt bị chế biến, việc
sử dụng bacteriocin có thể trở nên phổ biến hơn, nh- là một phương tiện giúp bảo
quản thực phẩm “tự nhiên” 20. Dưới đây là một số tiêu chuẩn đặt ra cho sản phẩm
bacteiocin ứng dụng trong công nghệ thực phẩm:
-Về tiêu chuẩn an toàn: Chủng sản xuất phải có dạng GRAS (Generally
regarded as safe - được đánh giá là những vi sinh vật an toàn), phải được thử
nghiệm tính độc, không có rủi ro về sức khỏe qua quá trình xác định các mặt như
ảnh hưởng tích lũy, điều phối và tiềm tàng 69.
Đ
Đ
ư

ư
ờ
ờ
n
n
g
g


t
t
i
i
ê
ê
u
u


h
h
ó
ó
a
a




c

c
ủ
ủ
a
a


n
n
g
g
ư
ư
ờ
ờ
i
i


B
B
a
a
c
c
t
t
e
e
r

r
i
i
o
o
c
c
i
i
n
n


L
L
A
A
B
B


T
T
h
h
ự
ự
c
c

p
p
h
h
ẩ
ẩ
m
m




Thuốc chữa bệnh
An toàn và chất lượng
thực phẩm
Tinh sạch
Chất phụ gia
(Nisin)
Các probiotic
Giống khởi
động hay
đồng nuôi cấy
Luận văn Thạc sĩ Sinh học

Page 18 of 96
18
-Tính hiệu quả: Bacteriocin phải ức chế sự sinh trưởng lên phổ rộng các
mầm bệnh và vi khuẩn gây háng nh- L. monocytogenes và C. botulinum hay có hoạt
tính chống lại một mầm bệnh đặc hiệu. Bacteriocin phải bền nhiệt và có hoạt tính

cao khi kết hợp trong thực phẩm. Tất nhiên, bacteriocin cũng không được ức chế
sinh trưởng của các giống khởi động khác 12, 44.
Hiện nay, chỉ có hai bacteriocin được thương mại là nisin từ Lactococcus
lactis và pediocin PA-1/AcH từ Pediococcus acidilactici, chóng đều được sử dụng
trong công nghiệp thực phẩm. Nisin và pediocin PA-1/AcH có tên thương mại
tương ứng là Nisaplin
TM
, ALTA
TM
12.
Nisin được khám phá ra đầu tiên với mong muốn ứng dụng trong công nghệ
trị liệu. Tuy nhiên những nghiên cứu sau đó cho thấy nisin không bền ở pH sinh lý
và tính nhạy cảm cao với sự phân hủy của enzyme. Với khả năng ức chế các mầm
bệnh (đặc biệt là L. monocytogenes) giúp nisin phù hợp hơn trong công nghiệp thực
phẩm. Nisin được thương mại đầu tiên ở Anh năm 1953. Ngày nay, nisin là một sản
phẩm được FDA phê chuẩn, được WHO công nhận an toàn 69 và bán dưới dạng
bột sấy khô - từ sữa tách bơ qua quá trình lên men. Nisaplin được sử dông hơn 50
nước như là một chất phụ gia thực phẩm, chủ yếu trong chế biến phomat, sản phẩm
sữa và thực phẩm đóng hộp 12.
Pediocin PA-1 đã được thương mại và kiểm soát bởi một số hãng độc quyền
Hoa Kỳ và Châu Âu. Quá trình lên men tạo pediocin PA-1 đã sẵn sằng để thương
mại và được sử dụng như là một chất bảo quản thực phẩm Error! Reference
source not found..
Các bacteriocin khác như lacticin 3147, enterocin AS-48 hay variacin cũng
có nhiều triển vọng. Trong khi đó, các bacteriocin phổ hẹp có thể được dùng trong
ức chế lùa chọn đặc hiệu cao với vi khuẩn gây hại nguy hiểm như L. monocytogenes
34.
1.2. ENTEROCIN
Luận văn Thạc sĩ Sinh học

Page 19 of 96
19
1.2.1. Enterocin
1.2.1.1. Giới thiệu enterocin
Đa số các chủng của Enterococci có khả năng tạo bacteriocin. Chúng được
gọi là các enterocin hay enterococcin và hầu hết thuộc về líp II. Hầu hết các
enterocin được tinh chế và xác định di truyền nhiều năm nay đều từ E. faecalis và
E. faecium 52. Điều thó vị là enterocin có khả năng chống lại các Enterococci
khác, LAB, L. monocytogenes, S. aureus và Clostridium spp. (gồm C. botulinum, C.
perfringens và C. tyrobutyricum) 57. Hoạt tính kháng Listeria có thể được giải
thích bởi thực tế rằng Enterococci và Listeria có quan hệ gần về mặt phát sinh
Error! Reference source not found.. Enterocin có tính bền với nhiệt độ cao và
sự dao động pH 26.
Enterocin là các peptit nhỏ được tổng hợp trong riboxom, không bị biến đổi
sau dịch mã, trừ việc phân cắt peptit dẫn đầu. Những nghiên cứu sâu hơn là cần
thiết để xác định liệu enterocin được mã hóa bởi gen xác định trên ADN hệ gen hay
ADN plasmid; xác định các đặc điểm của bacteriocin giúp cho việc tinh sạch, nhân
dòng và biểu hiện gen thuận tiện 57.
1.2.1.2. Phân loại enterocin
Các enterocin có thể được phân chia thành hai líp chính:
Líp I: Lantibiotic với duy nhất một đại diện là cytolysin hai peptit từ E.
faecalis 27. Đây là peptit duy nhất được phân lập từ Enterococci với hoạt tính
cytolytic (hemolytic-tiêu máu). Cytolysin là một yếu tố độc nên nã không được xem
là yếu tố kháng khuẩn. Các gen mã hóa cho cytolysin được tìm thấy không chỉ trong
các chủng Enterococcus từ bệnh viện, người bệnh mà còn từ thực phẩm, động vật
42, 52.
Líp II gồm các enterocin tương tự với bateriocin từ các chi LAB khác 23, là
bacteriocin kích thước nhỏ, mang điện dương, kỵ nước, bền nhiệt. Líp này có thể
được chia thành các phân líp 27, 34:
Luận văn Thạc sĩ Sinh học

Page 20 of 96
20
Phân líp IIa - tương tự pediocin. Chóng bao gồm enterocin A từ E. faecium
CTC 492, enterocin CCM 4231 từ E. faecium CCM 4231, enterocin CRL35 từ E.
faecium CRL35 và mundticin từ E. mundtii. Nhiều loại E. mundtii khác cũng tạo
bacteriocin nhưng cấu trúc của chúng chưa được xác định. Những bacteriocin phân
líp IIa này có hoạt tính kháng khuẩn cao, điển hình là Listeria. Đặc biệt, enterocin
CRL35 có hoạt tính ức chế thậm chí cả virus Herpes simplex 18, 27.
Phân líp IIb là các enterocin gồm hai chuỗi polypeptit. Mét trong hai chuỗi
có hoạt tính nhưng cả hai chuỗi đều cần thiết trong sù tạo hoạt tính sinh học đầy đủ
27. Enterocin 1071A và 1071B từ E. faecalis, enterocin L50A và L50B với hoạt
động điều phối. Chúng không bị biến đổi sau dịch mã và không cần sự có mặt của
một peptit tín hiệu cho quá trình tiết Error! Reference source not found.,
enterocin I (tương tự enterocin L50A).
Phân líp IIc gồm bacteriocin không thuộc các phân líp trên, như enterocin P
từ E. faecium P13, bacteriocin 31 từ E. faecalis tiết ra bởi con đường phụ thuộc
chuỗi tín hiệu, enterocin Q, enterocin M (một biến thể của enterocin P), enterocin B.
Phân líp cuối cùng là bacteriocin vòng với đại diện enterocin AS-48, đây là
bacteriocin đầu tiên được tinh sạch từ chi Enterococcus 27, 42, 52, 57, 67.
1.2.2. Hệ vi khuẩn sinh tổng hợp enterocin: Enterococci
1.2.2.1. Enterococci
Enterococci lần đầu tiên được miêu tả bởi Thiercelin năm 1899, là một chi
lớn thuộc họ LAB 12, 23. Enterococci gồm các cầu khuẩn gram dương, kỵ khí tùy
tiện, thường tồn tại dưới dạng cặp và chuỗi, lên men đồng hình và tạo L(+)LA (axit
lactic đồng phân hình học dạng L). Đây là quá trình lên men hydrat cacbon thành
axit lactic như là sản phẩm cuối cùng duy nhất, phân biệt với lên men dị hình (axit
lactic là sản phẩm chính, ngoài ra còn các sản phẩm phụ như axit axetic, ethanol,
CO
2

, format hay succinat) 12, 59, 67. Enterococci phân bố rất rộng rãi, được tìm
Luận văn Thạc sĩ Sinh học

Page 21 of 96
21
thấy trong không khí, nước, chất thải, đất, thực vật. Enterococci có nguồn gốc từ
đường tiêu hóa của người và động vật máu nóng 42.
Nguyên nhân chính giải thích cho sự phân bố rộng rãi trong tự nhiên của
Enterococci so với các LAB khác đó là sự sống bền bỉ và chống chịu tốt trong các
môi trường đa dạng, các yếu tố ức chế sinh trưởng như axit, muối, khô hạn, nhiệt và
các yếu tố hóa học. Chúng sinh trưởng ở nhiệt độ từ 10-45
o
C, sống sót ở nhiệt độ
62,8
o
C trong 30 phót, nồng độ 6,5% NaCl và 40% muối mật, sinh trưởng ở pH 4,0-
9,6, do đó cạnh tranh hiệu quả về dinh dưỡng và không gian sống 23, 42.
Trong thời gian dài, sự có mặt của Enterococci trong thực phẩm bị xem như
là một chỉ thị của sự vệ sinh kém. Nhưng ngày nay, Enterococci được xem như bình
thường trong hệ vi khuẩn thực phẩm bởi chúng có vai trò quan trọng giúp làm chín
và tạo mùi vị trong các thực phẩm lên men 42. Sù phân bố đa dạng và hoạt động
của Enterococci đã kích thích nghiên cứu của các nhà khoa học. Nhiều nghiên cứu
gần đây đã tập trung vào sự xác định chi tiết và mô tả nhóm thó vị này của vi sinh
vật 42, 61.
Sự xác định Enterococci có thể được tiến hành bằng cách sử dụng các thử
nghiệm sinh lý. Tuy nhiên, một số chủng với các đặc điểm không điển hình có thể
bị nhầm lẫn ở mức độ loài, thậm chí ở mức độ chi với Lactococci hay Vagococcus
fluvialis. Do đó, các phương pháp di truyền là cần thiết để xác định tin cậy những
thành viên của chi Enterococcus 23, như nghiên cứu lai ADN: ADN và sự tương
đồng trình tự gen rARN 16S. Hiện nay, các nhà khoa học đã xác định được hơn 26

loài Enterococcus, phân thành 8 nhóm loài dùa trên quan hệ phát sinh loài (tổng
hợp ở bảng 3) [Error! Reference source not found., 44]. Trong đó, E. faecalis và
E. faecium là hai loài chiếm ưu thế, có vai trò quan trọng trong vi sinh y học và thực
phẩm 23, 42, 44].


Luận văn Thạc sĩ Sinh học

Page 22 of 96
22
Bảng 3. Các “nhóm loài” khác nhau của Enterococci hiện nay và các loài dùa
trên quan hệ phát sinh chủng loại
STT
Nhóm
Loài
1
E. faecium
‘E. azikeevi' (loài mới), E. durans, E. faecium, E. hirae, E. mundtii, E.
porcinus, E. villorum
2
E. avium
E. avium, E. malodoratus, E. pseudoavium, E. raffinosus
3
E. gallinarum
E. casseliflavus, E. flavescens (ít gặp), E. gallinarum
4
E. dispar
E. asini, E. dispar (ít gặp)
5
E. saccharolyticus

E. saccharolyticus, E. sulfureus (ít gặp)
6
E. cecorum
E. cecorum, E. columbae (ít gặp)
7
E. faecalis
E. faecalis, E. haemoperoxidus, E. moraviensis, 'E. rottae' (loài mới)

8
Tetragenococcus
E. solitarius, Tetragenococcus halophilus, Tetragenococcus muriaticus


1.2.2.2. Vai trò của Enterococci
Enterococci có ý nghĩa lớn trong vi sinh vật học môi trường, thực phẩm và y
học. Chúng giữ vai trò quan trọng trong quá trình chín, tạo kết cấu và mùi vị một
loạt thực phẩm lên men truyền thống ở Châu Âu như phomat, xúc xích 42. Các
chủng của Enterococcus được sử dụng trong probiotic cho người và động vật ở một
số nước 12, tăng cường giá trị dinh dưỡng thực phẩm 42. Enterococci tạo ra một
loạt các bacteriocin khác nhau, một số chủng thậm chí có khả năng tạo ra nhiều
bacteriocin 23. Dùa trên những nghiên cứu và theo hoạt tính kháng Listeria spp.
mạnh, ứng dụng tiềm năng trong bảo quản thực phẩm sử dụng bacteriocin từ
Enterococci là rất hứa hẹn Error! Reference source not found..
Tuy nhiên, cũng có rủi ro khi sử dông Enterococci, đó là việc chúng có thể
gây háng thực phẩm (chủ yếu là các sản phẩm thịt), chỉ thị của sự kém vệ sinh 50,
61. Mét vài chủng Enterococcus có thể gây bệnh cho người như viêm màng trong
tim, nhiễm trùng đường tiết niệu 23. Mét nguyên nhân đáng chú ý là tính kháng
Luận văn Thạc sĩ Sinh học

Page 23 of 96

23
của chúng với kháng sinh 10, 29. Đặc biệt là các chủng kháng vancomycin, gây ra
một loạt nguy hiểm và khó khăn trong điều trị bệnh nhiễm trùng 12, 23, 50.
Những nghiên cứu gần đây cho thấy một số loài trong phân lập thức ăn có thể chứa
các yếu tố độc. Trong đó, E. faecalis chứa nhiều rủi ro tiềm Èn hơn và với tần suất
cao hơn các chủng E. faecium. Sù truyền các yếu tố độc mã hóa trên plasmid đáp
ứng pheromon có thể diễn ra in vitro hay trong đường tiêu hóa (với các nghiên cứu
trên mô hình động vật). Nhiều tính độc khác có mặt trong ADN hệ gen hay
transposon 23, 40.
Câu hỏi đặt ra về tính an toàn, có thể chấp nhận enterocin trong thực phẩm
và probiotic vẫn được tranh luận nhiều 23. Việc sử dông Enterococci như là các
probiotic cần được nghiên cứu kỹ lưỡng. Mỗi chủng của Enterococci nên được
kiểm tra tách biệt và chỉ cho phép ứng dụng trong thực phẩm nếu không chứa các
yếu tố độc và kháng kháng sinh 12, 61. Cần nhấn mạnh rằng: Một số chủng
Enterococcus đã được công nhận với lịch sử lâu dài về tính an toàn. Ví dô, E.
faecium SF68 đã được nghiên cứu hơn 20 năm cho việc sử dụng như một probiotic
ở người, đặc biệt trong điều trị tiêu chảy và được xem như một lùa chọn thay thế
các kháng sinh Error! Reference source not found.. Hơn nữa, vai trò và lợi Ých
cụ thể của Enterococci trong thực phẩm xứng đáng được tập trung nghiên cứu 23,
29, 42.
1.3. ENTEROCIN AS-48
Enterocin AS-48 đã được nghiên cứu hơn 20 năm qua, là peptit kháng khuẩn
dạng vòng, được phân lập đầu tiên từ E. faecalis subsp. liquefacies chủng S-48.
Chính cấu trúc vòng nội phân tử này tạo nên hoạt tính sinh học ưu việt của AS-48
so với các enterocin khác. Enterocin AS-48 có hoạt tính kháng khuẩn rộng gồm vi
khuẩn gram dương và gram âm 44, 60. Trong đó, các vi khuẩn gram âm nh- E.
coli, Myxococcus spp., Agrobacterium spp., Salmonella cholerasuis và Shigella
sonnei bị ức chế ở nồng độ bacteriocin cao hơn so với các vi khuẩn gram dương gây
bệnh do ảnh hưởng bảo vệ của màng ngoài tế bào Error! Reference source not
Luận văn Thạc sĩ Sinh học

Page 24 of 96
24
found.. Đến nay, chưa có bacteriocin nào khác từ LAB được biết có phổ ức chế
rộng nh- thế. AS-48 còn có đặc tính bền trong khoảng rộng pH và nhiệt độ, nhạy
cảm với protease. Do đó, enterocin AS-48 hứa hẹn cho những ứng dụng công nghệ
sinh học trong lĩnh vực bảo quản sinh học thực phẩm 63. Ngoài ra, enterocin AS-
48 còn được sử dụng nhiều trong nghiên cứu tương tác protein - màng 4. Đến nay,
AS-48 là bacteriocin vòng được nghiên cứu rộng rãi nhất về đặc tính hoá sinh và di
truyền 60.
Các nhà khoa học đã tiến hành sàng lọc bằng kỹ thuật dùa vào PCR trên 15
chủng Enterococcus sinh bacteriocin, kết quả cho thấy sự tương tự của gen cấu trúc
với gen mã hóa cho AS-48. Kết quả đạt được là 8 trên 10 chủng E. faecalis và 3
trên 5 chủng E. faecium nghiên cứu tạo enterocin tương tự với AS-48 52. Ví dụ,
một vài biến thể tự nhiên của AS-48 có tên enterocin EFS2, enterocin 4 và enterocin
21 đã được tìm thấy trong nhiều chủng E. faecalis còng nh- ở E. faecium 7C5. Gần
đây, một biến thể của AS-48 (enterocin vòng AS-48RJ) với thay sù thay thế mét
axit amin Glu
20
bằng Val
20
đã được phân lập từ chủng E. faecium RJ16. Đa số các
cụm gen as-48 được miêu tả xác định trên plasmid trừ AS-48RJ từ E. faecium RJ16
là trên ADN hệ gen Error! Reference source not found., 46, 63.
1.3.1. Đặc điểm di truyền
Enterocin AS-48 được mã hóa bởi plasmid đáp ứng pheromon pMB2 kích
thước 68 kb 25, 63. Locus tổng hợp sinh học AS-48 là một cụm (14,8 kb) gồm 10
gen as-48ABCC
1
DD

1
EFGH tham gia trong quá trình sản xuất enterocin AS-48 và
tạo tính miễn dịch. Gen cấu tróc as-48A, mã hoá một pre-peptit 105 axit amin chứa
một đoạn peptit dẫn đầu gồm 35 axit amin. Thó vị là hai gen gối lên nhau as-48BC
xác định 73 nucleotit xuôi dòng codon kết thúc TAA của as-48A 23. Côm gen as-
48 chứa hai protein vận chuyển ABC (ATP-binding cassette transporter) được mã
hóa bởi as-48C
1
D và as-48EFGH, cùng được phiên mã trong mét mARN
polycistronic với as-48D
1
. Ba gen as-48BC
1
D tạo các protein chịu trách nhiệm
trong quá trình hoàn thiện và tiết của AS-48, bao gồm: Protein vận chuyển As-
Luận văn Thạc sĩ Sinh học

Page 25 of 96
25
48C
1
D và protein As-48B. Trong khi As-48C
1
D có khả năng tạo tính miễn dịch ở
mức thấp, As-48B có thể một mình hay phối hợp với As-48C
1
D (tạo protein đa
thành phần As-48BC
1
D) giúp loại bỏ peptit dẫn đầu, thúc đẩy sự tạo vòng đầu -

đuôi đồng thời với việc vận chuyển phân tử AS-48 trưởng thành ra ngoài màng tế
bào 62, 63.
Các gen as-48D
1
EFGH có vai trò tự bảo vệ tế bào sản xuất hay miễn dịch
60. Trong đó, As-48EFGH (protein vận chuyển thứ hai) - tham gia trong quá trình
tự bảo vệ chống lại AS-48 ngoại sinh, chóng hoạt động theo cơ chế miễn dịch bổ
trợ. Gen as-48D
1
mã hóa cho mét peptit nhỏ kỵ nước, mang điện dương tạo tính
kháng bacteriocin sinh ra, được xác định như quyết định tính miễn dịch 23. Đặc
điểm và vai trò cụ thể của các gen trong côm gen as-48 được tổng kết chi tiết trong
bảng 4.
Bảng 4. Đặc điểm của các protein trong côm gen as-48
Gen
Axit amin
pI
Các đặc điểm liên quan
Chức năng protein
as-48A
105
10,50
Pre-propeptit
AS-48 tiền thân
as-48B
563
10,48
Protein màng đầy đủ (12TM)
Bộ máy tổng hợp
as-48C

178
10,07
Protein màng đầy đủ (4 TM)
Protein miễn dịch bổ trợ
as-48C
1

164
10,96
Protein màng đầy đủ (6 TM)
Transporter ABC xuất khẩu
as-48D
219
9,30
Protein gắn ATP
Transporter ABC xuất khẩu
as-48D
1

56
10,81
2 TM
Protein miễn dịch
as-48E
169
10,20
Protein màng đầy đủ (4 TM)
Transporter ABC miễn dịch
as-48F
407

5,40
Ưa nước trừ phần đầu N, vùng
cuộn
Protein bổ trợ tham gia trong
phục hồi As-48G
as-48G
227
7,80
Protein phụ thuộc ATP, ưa nước
Transporter ABC miễn dịch