Các phương pháp phân tích và định tính Listeria Monocytogenes

BỘ CÔNG THƯƠNG
TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP THỰC PHẨM TP HỒ CHÍ MINH
Khoa CNSH & KTMT
MÔN: CÔNG NGHỆ SINH HỌC THỰC PHẨM

Phương pháp phân tích vi khuẩn
Listeria monocytogenes

GVHD: THS. TRẦN QUỐC HUY
NHÓM 7


Danh sách nhóm
• Phạm thị mợng tùn
• Lê hờng ngun
• Hờ thị diễm sương
• Ngũn thị ngọc cẩm
• Phạm thị quỳnh như
• Nguyễn thị tường vi
• Nguyễn thanh tuyền
• Hoàng thị hồng hạnh


Nội dung
Listeria monocytogenes
Đặt vấn đề
Giới thiệu
Phương pháp phân tích
Kết luận
Tài liệu tham khảo

ĐẶT VẤN ĐỀ
• Tầm quan trọng của vi khuẩn Listeria monocytogenes.
– Tiêu thụ thực phẩm ăn ngay tăng
– Gây bệnh cơ hội
– Tỉ lệ tử vong cao (30 – 40)%
– Sinh trưởng trong thực phẩm lạnh.
– Cơ chế kháng lại bệnh listeriosis  thực phẩm nhiễm ko
đến được tay người tiêu dùng.


TỞNG QUAN

Giới: Bacteria
Ngành: Fitmicutes
Lớp: Bacilli
Bộ: Bacillales
Họ: Listeriaceae
Giống: Listeria
Loài: Listeria
Hình 1: Cấu trúc tế bào L. monocytogenes
monocytogenes
Kích thước bộ gen của loài L. monocytogenes khoảng 3,0 Mb
(Ganbank/EMBL_accession number AL591824).


TỞNG QUAN

• Đặc tính
- Trực kh̉n nhỏ, Gram dương, kị khí không bắt buộc,

không sinh bào tử, di động.
- Sinh trưởng 1 – 44 oC. (opt 25 – 37) oC.
- Được phân lập từ đất, nước cống, xác thực vật, ruột động
vật, ruột người,...
- Yếu tố gây độc: từ listeriolysin O, tạo ra trong pha sinh
trưởng số mũ của tế bào, tác nhân xâm nhập vào tế bào cơ
thể , giải phóng độc tố, gây nên sự chết của tế bào.


TỞNG QUAN
• Bệnh và biện pháp phòng chữa
• 1-7 ngày nhiễm listeriosis:
– Người thường: sốt nhẹ, sôi bụng, tiêu chảy.
– Người mẫn cảm: nôn, đau đầu, sôi bụng, tiêu chảy, sốt.
– Phụ nữ có thai: nhiễm trùng huyết, viêm màng não, viêm não,
viêm màng trong tim.
 Biện pháp phòng tránh:
 kiểm soát nguồn lây nhiễm từ nhà máy.
 Đảm bảo vệ sinh thực phẩm trong ăn uống.
 Không sử dụng các sản phẩm như sữa cô đặc, phomai...


Phương pháp phân tích

Truyền thống

ELISA

Hiện đại

Lai phân tử

PCR


• Phương pháp truyền thống
1. Tăng sinh
Ủ ở 37oC trong 24 48h. Khuẩn lạc Listeria
có màu sám hay nâu
được bao quanh bởi
vịng đen, khuẩn lạc
lõm, nhỏ, đường kính
khoảng 1mm.

Đờng nhất 25 g mẫu + 225ml Mtr
LBI, 30’.
Ủ ở 30 o C , 24h
Chuyển 0,1ml sang LBII, Ủ ở 30
o C , 24h
ria

Trãi

mơi trường thạch Oxford
Agar
• 3. Xác định các chỉ tiêu

2. Phân lập

• Phương pháp hiện đại

Phương pháp ELISA

Chuẩn bị mẫu
(tăng sinh
lần 1 ở 30tắ
– c350C trong
Nguyên
24h, tăng sinh lần 2 ở 300C trong 22
– 24h)

•

Cho mẫu vật vào giếng để 30
Sử dụng kháng
cấp phủ bên ngoài những
phút, ởthể
35 –sơ
370C

giếng nhỏ nhằm mục đích thu giữ được phép thu
Thêm
khángthể
thể thứ 2 có gắn
giữ bằng cách
sửphức
dụnghợp
kháng
và tín

enzyme
enzyme phát
hiệu.
Thêm cơ chất, để khoảng
10 phút ở 20 – 250C
Đọc kết quả
Hình 3: Sơ đồ trên là quy trình phát hiện Listeria
monocytogenes


• Phương pháp hiện đại

Phương pháp ELISA

Cơ chế của ELISA


• Phương pháp hiện đại

Phương phápPCR

Nguyên tắc
-• Chủng
vi sinh
vật:
Listeria
monocytogenes.
- Giai đoạn
biến
tính:

tách chuỗi
DNA từ mạch đơi thành dạng
- DNA
mạchpolymerase.
đơn.
-• Các deoxyribonucleotit triphosphat (dNTP) và nồng độ Mg2+.
- Giai đoạn bắt cặp: gắn cặp mồi đặc trưng theo nguyên tắc bổ
- Dung
sung.dịch đệm (buffer).
- cặp mồi LM-F và LM-R. 2 đoạn mồi (mỗi đoạn mồi dài 18-30
• - Giai đoạn kéo dài chuỗi: tổng hợp chuỗi DNA mới giống DNA gốc.
bazơ).
→ Tất cả bỏ vào Eppendorf rồi đưa vào giếng để khuếch đại bằng
máy chạy PCR.


DNA khuôn
- tách và làm sạch DNA với
chloroform / xử lý nhiệt tế bào ở
1000C trong 10 phút.
- Tối ưu hóa điều kiện PCR về nồng
độ MG2+ (1 .5-4.0 mM), nồng độ
mồi (0.1-0.5pmol/mồi) và nồng độ
dNTPs (100- 250Mm/mỗi loại).
- Phản ứng PCR được thực hiện với
thể tích hỡn hợp 25ml vói chu
trình nhiệt gồm 940C/3 phút,
( 940C/ 1 phút, 600C/1 phút ,
720C/ 1 phút)×30 trình tự, 720C/ 5
phút và 40C/5 phút.

- Đánh giá kết quả trên gel agarose
1% với 3ml sản phẩm

Hình 6: Cơ chế khuếch đại


Phương pháp phân
tích

Ưu điểm

Nhược điểm

-Dụng cụ thí nghiệm đơn giản, có thể Thực hiện qua nhiều bước nên thời
thực hiện ở những phịng thí nghiệm gian thực hiện kéo dài
Truyền Phương pháp
nhỏ
Tỉ lệ phân lập chính xác khơng cao,
thống đếm
- Hóa chất dễ tìm, khơng địi hỏi chun dễ bị nhiễm trong q trình phân
mơn cao
lập
Tỉ lệ chính xác cao, thời gian ngắn, dễ Địi hỏi tính tỉ mỉ cao, người thực
Phương pháp
thực hiện, có thể tiến hành đồng thời hiện cần có chun mơn, cần có
Elisa
nhiều mẫu.
mẫu đối chứng mới thực hiện
được.
Thời gian cho kết quả nhanh, có thể Không phân biệt được tế bào sống

phát hiện những vi sinh vật khó ni với tế bào đã chết
cấy.
Sự ức chế hoạt tính của DNA
Hiện đại
Việc ni tăng sinh đơn giản, hóa chất polymerase do mẫu thương phẩm
dễ tìm và dễ tồn trữ Khơng cần dụng cụ Khơng phân tích được với mẫu có
Phương pháp
ni cấy và mơi trường phân tích phức mật độ vi sinh vật gây bệnh hiện
PCR
tạp, có thể thực hiện ngay .
diện trong mẫu thực phẩm thường
Ít tốn kém về nhân sự, có thể được tự thấp
động hóa để làm giảm chi phí phân tích
phát hiện các vi khuẩn gây bệnh trong


Kết ḷn
• Lm là mợt loại vi kh̉n tờn tại trong thực phẩm, gây
hại cho sức khỏe con người.
• Khi bị nhiễm Lm thời gian ủ bệnh khá lâu và nhiều
triệu chứng khác nhau.
• Việc tìm hiểu các pp xét nghiệm nhanh để hạn chế sự
lây lan của vi khuẩn này đã thu được kết quả nhận
định rằng PCR vẫn đang là phương pháp hiệu quả để
xác định Lm.
• Tương lai, hi vọng với những biện pháp hiện đại mới
hoặc được cải tiến sẽ giúp giải quyết được những
nhược điểm của pp hiện tại.

The end!


TỞNG QUAN

• Cơ chế lây nhiễm_ thơng qua con đường thực bào
internalin A (inlA)

internalin B (inlB).

E-Carherin

Clq-R (hoặc Met)
Vào tế bào vật chủ

Lm phân giải không bào  các lỗ trên màng tế bào , hoạt giải độc tính lưu huỳnh
PI-PLC kết hợp với PC-PLC, giúp LLO phân giải không bào.

Tiếp đến Lm được nhân lên nhờ protein bề mặt ActA để nó di chuyển từ tế bào này
sang tế bào khác và tổng hợp actin.
Đuôi actin cho phép vi khuẩn xâm nhập vào tế bào chủ khác, nó phụ thuộc vào hoạt
động của PC-PLC và Mpl.


TỞNG QUAN

Con đường lây nhiễm
• Qua đường tiêu hóa  qua dạ dày  các mô ở ruột non của vật chủ (tế
bào biểu mơ và các đại thực bào
• Trong suốt q trình di chuyển chúng sẽ khơng gây ra những thương tổn

mô học nếu liều lượng không đủ lớn.

Trong dịch lympho/ máu Lm di chuyển rất nhanh đến hạch bạch
huyết, lá lách và gan rồi nhanh chóng đi sâu vào không bào. Hầu
hết vi khuẩn xâm nhập và phá hủy không bào nhờ kết hợp với pH
thấp, các enzyme thủy phân và oxy hóa trong khơng bào.
Từ khơng bào  tế bào chất và nhân lên trong vòng 30 phút sau
khi xâm nhiễm, từ 40 – 60 phút ở trong tế bào gan và đại thực bào.
Quá trình xâm nhiễm vào cơ quan hoàn thành sau 5 -7 ngày.


Giải pháp phòng ngừa
• - Giữ thức ăn ngồi giới hạn của vùng nhiệt độ nguy hiểm từ 4oC đến
60oC
• - Thức ăn nào cần giữ lạnh thì phải giữ ở nhiệt độ 40C hoặc thấp hơn,
còn những thức ăn nóng thì phải giữ ở nhiệt độ trên 600C trở lên.
• - Nấu chín tồn bộ thức ăn tươi có nguồn gốc từ động vật.
• - Giữ vệ sinh tối đa lúc nấu nướng hay chuẩn bị bữa ăn. Chà rửa dụng cụ,
dao, thớt bằng dung dịch Javel pha loãng trong nước.
• - Cẩn thận với các loại cá và đồ biển hun khói.
• - Rửa tay bằng savon.


Giải pháp phòng ngừa
- Thường xuyên chùi rửa, tẩy trùng tủ lạnh.
- Khơng nên dùng thực phẩm có mùi lạ.
- Không dùng thực phẩm quá thời hạn sử dụng.
- Không để thực phẩm tươi sống chung với thức ăn đã nấu chín.
- Thức ăn nấu chín dùng ngay khơng để lâu ngày trong tủ lạnh.
- Rữa kỹ thức ăn trước khi sử dụng.

- Giữ thức ăn đã được nấu chín tách biệt khỏi rau, thực phẩm
chưa chế biến


TỞNG QUAN

• Tiêu chảy, sốt 38oC
(100,4oF) hoặc cao hơn,
đau các cơ, có các cơn ớn
lạnh hoặc rung mình,
b̀ng nơn.
• Có những thay đổi về
tâm thần. Có xáo trộn về
mặt nhận thức và tinh
thần, có cơn co giật, mất
kiểm sóat vận động các
chi.

Dấu hiệu