NGHIÊN CỨU SỰ ĐA DẠNG DI TRUYỀN CỦA MỘT SỐ GIỐNG ĐẬU TƯƠNG CÓ KHẢ NĂNG KHÁNG BỆNH GỈ SẮT KHÁC NHAU

1
ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM

Vũ Thanh Trà

NGHIÊN CỨU SỰ ĐA DẠNG DI TRUYỀN CỦA MỘT SỐ
GIỐNG ĐẬU TƯƠNG CÓ KHẢ NĂNG KHÁNG BỆNH
GỈ SẮT KHÁC NHAU
Chuyên ngành: Di truyền học
Mã số: 62 42 70 01

TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC

Thái Nguyên - 2012


2
Công trình được hoàn thành tại Trường Đại học Sư phạm - ĐHTN

Người hướng dẫn khoa học: 1. PGS.TS. Chu Hoàng Mậu
2. TS. Trần Thị Phương Liên

Phản biện 1:..............................................................
..............................................................
Phản biện 2:..............................................................
..............................................................

Luận án sẽ được bảo vệ trước Hội đồng chấm luận án cấp Đại học
Thái Nguyên họp tại:.........................................................................
Vào hồi:....... giờ, ngày....... tháng...... năm 20.....

3
NHỮNG CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ
LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN
1. TA Pham, CB Hill, MR Miles, BT Nguyen, TT Vu, TD Vuong,
TT VanToai, HT Nguyen, GL Hartman. “Evaluation of soybean
for resistance to soybean rust in Vietnam”. Elsevier - Field Crops
Research 117: 131-138.
2. Vũ Thanh Trà, Trân Thị Phương Liên, Chu Hoàng Mậu. “Đánh
giá sự đa dạng di truyền của 50 giống đậu tương Việt Nam có
phản ứng khác nhau đối với bệnh gỉ sắt bằng chỉ thị SSR”. Tạp chí
Sinh học, 34(2), tr. 235-240.
3. Vũ Thanh Trà, Trần Thị Phương Liên, Chu Hoàng Mậu. “Nghiên
cứu mối quan hệ di truyền của một số giống đậu tương Việt Nam
có phản ứng khác nhau với bệnh gỉ sắt”. Tạp chí Khoa học và
Công nghệ - Đại học Thái Nguyên, 85(9)/2, tr. 11-16.
4. Vũ Thanh Trà, Hà Hồng Hạnh, Trần Thị Phương Liên, Chu
Hoàng Mậu. “Phân lập và phân tích protein từ lá cây đậu tương”.
Tạp chí Khoa học và Công nghệ - Đại học Thái Nguyên, 85(01)/1:
303-310.
5. Vũ Thanh Trà, Hà Hồng Hạnh, Trần Thị Phương Liên, Chu
Hoàng Mậu. “Phân tích protein của lá đậu tương nhiễm bệnh gỉ sắt
bằng phương pháp điện di hai chiều”. (Bài gửi Tạp chí Công nghệ
sinh học - chờ đăng).


4
MỞ ĐẦU
1. Đặt vấn đề

Đậu tương (Glycine max (L.) Merrill) là cây công nghiệp ngắn
ngày, có giá trị kinh tế cao, mang ý nghĩa trong cải tạo đất trồng, dễ
canh tác, đặc biệt có khả năng thích nghi với nhiều vùng sinh thái
khác nhau. Hạt đậu tương chứa 30-55% protein, chứa nhiều loại
amino acid không thay thế, 12-25% lipid và các vitamin cần thiết cho
cơ thể. Các sản phầm từ đậu tương được sử dụng rộng rãi cho các
mục đích khác nhau như làm thức ăn, dầu ăn, thực phẩm chức năng,
nguyên liệu cho y học và công nghiệp…Bên cạnh giá trị dinh dưỡng
cao, cây đậu tương còn có khả năng cố định đạm nhờ vi khuẩn R.
Japonicum sống cộng sinh trên rễ cây tạo thành các nốt sần, giúp cải
tạo đất hiệu quả. Do đó, cây đậu tương đã được quan tâm trồng và
phát triển mạnh ở nhiều quốc gia trên thế giới. Ở Việt Nam, đậu
tương là nhóm cây trồng chính được ưu tiên khuyến khích phát triển,
sản xuất đứng sau lúa, ngô và lạc.
Việt Nam từng là một nước xuất khẩu đậu tương vào những
năm 1980, tuy nhiên cho đến nay nước ta đã trở thành nước nhập
khẩu đậu tương với số lượng lớn với hàng triệu tấn khô dầu đậu
tương đang được nhập khẩu hàng năm. Mặc dù diện tích gieo trồng
có tăng hàng năm những năng suất thấp và sản lượng đạt được không
ổn định, khả năng chống chịu bệnh và các stress kém. Sâu bệnh nói
chung và bệnh gỉ sắt nói riêng là nguyên nhân trực tiếp ảnh hưởng
tới diện tích gieo trồng và làm giảm năng suất, chất lượng hạt đậu
tương, gây tổn thất lớn về kinh tế.
Bệnh gỉ sắt ở đậu tương do loài nấm Phakopsora pachyrhizi gây ra
và đang được coi là một trong những mối đe dọa chính trên cây đậu
tương gây thiệt hại đáng kể, làm giảm từ 10-80% năng suất và chất
lượng đậu tương ở nhiều nước trên thế giới trong đó có Việt Nam.
Trong những năm gần đây, các nghiên cứu về bệnh gỉ sắt ở đậu
tương đã được tiến hành và thu được một số kết quả đáng kể, tuy

5
nhiên hầu hết các nghiên cứu này mới chỉ tập trung vào việc giám sát
quá trình phát triển bệnh, nghiên cứu dịch tễ học, đánh giá sự thất thu
năng suất hoặc phân tích phản ứng bệnh mà chưa chú trọng nhiều
đến việc tìm hiểu khả năng kháng bệnh gỉ sắt. Việc nghiên cứu sự đa
dạng di truyền của tập đoàn đậu tương có phản ứng khác nhau đối
với bệnh gỉ sắt không chỉ có ý nghĩa trong việc bảo tồn các giống có
khả năng kháng bệnh mà còn có ý nghĩa quan trọng trong công tác
chọn tạo giống có chất lượng cao.
Xuất phát từ những lý do trên chúng tôi lựa chọn và thực hiện
đề tài: "Nghiên cứu sự đa dạng di truyền của một số giống đậu
tương có khả năng kháng bệnh gỉ sắt khác nhau".
2. Mục tiêu nghiên cứu
Đánh giá khả năng phản ứng của các giống đậu tương với bệnh
gỉ sắt nhằm phát hiện các giống kháng mới, xác định được sự đa
dạng di truyền trên cơ sở phân tích tính đa hình DNA, so sánh đa
hình protein và lập bản đồ điện di protein lá đậu tương.
3. Nội dung nghiên cứu
- Đánh giá khả năng kháng bệnh gỉ sắt của các giống đậu tương.
- Xác định hàm lượng protein, lipid và thành phần amino acid
trong hạt của các giống đậu tương nghiên cứu.
- Phân tích sự đa dạng di truyền của các giống đậu tương nghiên
cứu bằng chỉ thị phân tử RAPD và SSR.
- Lập bản đồ điện di protein lá đậu tương và định danh hệ protein
lá bằng phương pháp điện di một chiều, hai chiều và nhận diện
protein trên hệ sắc ký-khối phổ. Đồng thời phân tích, so sánh sự đa
dạng thành phần protein lá của một số giống đậu tương nhiễm và
kháng bệnh gỉ sắt.
4. Những đóng góp mới của đề tài

- Đề tài đã phân loại được mức độ kháng bệnh gỉ sắt của 50 giống
đậu tương thu thập ở Việt Nam thành 3 nhóm: nhóm mẫn cảm với
bệnh gỉ sắt, nhóm trung gian và nhóm kháng bệnh. Đặc biệt, công


6
trình đã phát hiện ra 6 giống kháng mới là PMTQ, HSP1, HSP2,
CNB, ZG và MTD65. Đồng thời, các thành phần hóa sinh của 50
giống đậu tương cũng đã được phân tích.
- Sử dụng chỉ thị phân tử RADP và SSR, đề tài đã phân tích được
mối quan hệ di truyền của 50 giống đậu tương, trong đó kết quả phân
tích cho thấy chỉ thị SSR có mức độ đa hình cao hơn.
- Bằng phương pháp điện di 2 chiều, luận án đã thiết lập được bản
đồ điện di 2DE của protein lá đậu tương ở giống kháng bệnh
DT2000 với 119 điểm protein trên gel, trong đó có 35 protein đã
được định danh và phân loại. Đặc biệt có 3 protein liên quan đến khả
năng kháng bệnh/phòng vệ, chống chịu stress, hạn đã được phát hiện.
Đây là những dẫn liệu đầu tiên về việc nghiên cứu hệ protein lá, lập
bản đồ protein, định danh các protein lá ở giống đậu kháng bệnh. Kết
quả này góp phần quan trọng vào việc tìm hiểu cơ chế bệnh cũng
như gợi ý cách tiếp cận nghiên cứu ở mức độ protein.
- Bằng phương pháp so sánh sự thay đổi của hàm lượng protein
được biểu hiện trên gel 2DE, luận án cũng đã phát hiện có 8 điểm
protein tăng và 1 điểm protein giảm so với đối chứng ở 2 giống đậu
tương nhiễm bệnh gỉ sắt, đã nhận diện và định danh được 6/9 điểm
protein. Hai mẫu protein ở hai giống mẫn cảm với bệnh gỉ sắt (DT12,
VMK) có 6 điểm protein tăng so với hai giống kháng bệnh gỉ sắt
(DT2000, CBU8325), đã nhận diện và định danh được 4/6 điểm
protein. Đây cũng là những số liệu đầu tiên được công bố ở Việt
Nam khi so sánh mức độ biểu hiện khác nhau của các protein lá ở

các giống nhiễm và đối chứng, giữa giống nhiễm và giống kháng
bệnh bằng phương pháp điện di 2DE kết hợp định danh bằng khối
phổ.
5. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn
- Đề tài đã nghiên cứu trên đối tượng là cây đậu tương, một cây
trồng có ý nghĩa quan trọng đối với nền nông nghiệp nước nhà. Sử
dụng các phương pháp nghiên cứu hiện đại, có độ tin cậy cao để


7
nghiên cứu đặc điểm, thành phần hóa sinh, đa dạng DNA và phân
tích protein của một số giống đậu tương có phản ứng khác nhau với
bệnh gỉ sắt. Đề tài là công trình được đầu tư nghiêm túc, công phu và
thu được các kết quả phong phú. Là cơ sở tham khảo cho các nghiên
cứu tiếp theo trên cây đậu tương, đồng thời các phương pháp như
phân tích đa dạng DNA bằng kỹ thuật RADP, SSR hay các phương
pháp phân tích bằng điện di, khối phổ là các cách tiếp cận mới có ý
nghĩa khoa học cao, hứa hẹn sẽ gợi mở nhiều điều thú vị về các cơ
chế nhiễm bệnh cũng như kháng bệnh.
- Về thực tiễn, đề tài đã phân loại các giống đậu tương có phản ứng
khác nhau với bệnh gỉ sắt làm 03 nhóm, trong đó đã phát hiện ra các
giống kháng mới là PMTQ, HSP1, HSP2, CNB, ZG và MTD65. Đây là
các thông tin hữu ích có thể ứng dụng trong thực tiễn chọn tạo giống.
6. Cấu trúc của luận án
Luận án gồm 115 trang, được chia thành các phần: Phần mở đầu
gồm có 3 trang; Chương 1: Tổng quan tài liệu, 29 trang; Chương 2: Vật
liệu và phương pháp nghiên cứu, 20 trang; Chương 3: Kết quả và thảo
luận, 46 trang; Phần kết luận và đề nghị, 2 trang; Các công trình đã công
bố của tác giả: 1 trang. Tài liệu tham khảo: 14 trang; Luận án có 15
bảng, 19 hình và 121 tài liệu tham khảo bằng tiếng Việt và tiếng Anh.

Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Cây đậu tương và đặc điểm hóa sinh của cây đậu tương
1.1.1. Cây đậu tương
Đậu tương (Glycine max (L.) Merrill) là cây thuộc họ đậu
(Fabaceae). Chi Glycine có hai chi phụ là Glycine và Soja. Về nguồn
gốc, đậu tương có nguồn gốc từ Đông Á. Về đặc điểm hình thái, đậu
tương là cây thân thảo, lá có ba loại: lá mầm, lá nguyên và lá kép. Hoa
đậu tương nhỏ không hương vị, có dạng cánh bướm. Quả thuộc loại
quả giáp, khó tách, hơi cong, lúc quả non có màu xanh, nhiều lông khi


8
chín có màu nâu. Hạt có nhiều hình dạng: hình tròn, hình bầu dục, tròn
dẹt... có giá trị dinh dưỡng cao. Về đặc điểm di truyền, đậu tương có
bộ nhiễm sắc thể lưỡng bội 2n = 40 là cây tự thụ phấn, ít có khả năng
thụ phấn chéo. Bộ gen đơn bội của đậu tương có từ 1,29 -1,8 x 109bp.
Thời gian sinh trưởng của đậu tương được chia làm 3 loại: chín sớm,
chín trung bình và chín muộn.
1.1.2. Đặc điểm hóa sinh của cây đậu tương
1.1.2.1. Thành phần protein trong hạt đậu tương
Trong hạt đậu tương, hàm lượng protein chiếm từ 12-55%. Protein
được dự trữ trong bào quan có chức năng cung cấp nguồn amino acid và
nitơ hoặc là các enzyme tham gia vào quá trình nảy mầm của hạt. Loại
potein được dự trữ chủ yếu ở hạt đậu tương là globulin..
1.1.2.2. Lipid, vitamin và một số chất khác trong hạt đậu tương
Ở đậu tương, hàm lượng lipid chiếm từ 12-25% khối lượng khô.
Chất lượng lipid của hạt đậu tương rất tốt, cho nên nó được sử dụng
rộng rãi trong công nghiệp chế biến thực phẩm. Hạt đậu tương còn
có các loại vitamin tan trong lipid, đặc biệt là vitamin E. Ngoài ra,
trong hạt đậu tương còn chứa một số chất khác như carbohydrade,

muối khoáng, nucleic acid, kích thích sinh trưởng.
1.1.2.3. Protein lá và hệ protein lá đậu tương
Các protein của lá đậu tương chủ yếu là các protein liên quan
đến quá trình trao đổi chất và chuyển hóa năng lượng. Đó là các
protein có liên quan đến quá trình vận chuyển điện tử, các enzyme,
các protein dự trữ, hoặc các protein có liên quan đến các quá trình
trao đổi và chuyển hóa của các amino acid hoặc các protein liên quan
đến tính kháng bệnh, stress.
1.2. Bệnh gỉ sắt và tính kháng bệnh gỉ sắt ở cây đậu tương
1.2.1. Bệnh gỉ sắt ở cây đậu tương


9
Bệnh gỉ sắt do nấm Phakopsora pachyrhizi gây ra là một trong
những bệnh chính trên cây đậu tương (Glycine max) ở Châu Á và
gây thiệt hại đáng kể về năng suất ở các nước trồng đậu tương.
Dấu hiệu và triệu chứng bệnh: là những chấm màu trong ở
phiến lá, cỡ 1mm, sau lớn dần và chuyển màu vàng rồi nâu, đạt tới
kích thước từ 2-5mm với hình đa dạng, có góc cạnh. Ở mặt dưới
phiến lá xuất hiện lớp bột màu nâu đó là các bào tử hạ của nấm.
Vòng đời và quá trình nhiễm bệnh: Quá trình nhiễm bệnh bắt
đầu khi bào từ hạ nảy mầm để hình thành một ống mầm phát triển
trên bề mặt lá (đường kính 5-400 µm) cho đến khi sợi áp hình thành.
1.2.2. Tính kháng bệnh gỉ sắt của cây đậu tương
Sự tương tác giữa vật chủ và vật ký sinh theo mô hình tương tác
gen đối gen (gen for gen). Đến nay, các nhà khoa học đã phát hiện
thấy có năm gen chính liên quan đến tính kháng bệnh gỉ sắt ở đậu
tương bao gồm: gen Rpp1, gen Rpp2; gen Rpp3; gen Rpp4 và gen
Rpp5.
1.3. Các phương pháp phân tích đa dạng di truyền ở cây đậu tương

1.3.1. Phương pháp sử dụng chỉ thị hình thái
Chỉ thị hình thái là một chỉ thị đồng trội, thường được biểu hiện
dưới dạng một tính trạng được kiểm soát bởi một locus đơn lẻ như
các gen quy định màu sắc hoa và hình dạng của hạt, vỏ...
1.3.2. Phương pháp sử dụng chỉ thị hoá sinh học
Các chỉ thị hoá sinh có trong hầu hết các protein đa hình như
isozyme và các protein dự trữ. Các isozyme có thể được phân tách
theo trọng lượng, kích thước phân tử và các chất mang.
1.3.3. Các phương pháp sử dụng chỉ thị phân tử DNA
1.3.3.1. Chỉ thị RAPD
Về nguyên tắc, kỹ thuật RAPD dựa trên phản ứng PCR, bằng
cách sử dụng những mồi ngắn có trình tự biết trước, bắt cặp và nhân


10
bản ngẫu nhiên những đoạn DNA có trình tự bổ sung với trình tự của
các mồi. Kỹ thuật RAPD bao gồm các bước sau: (i) Thiết kế mồi; (ii)
Chuẩn bị mẫu DNA và chạy PCR; (iii) kiểm tra sản phẩn nhân bản
trên gel agarose; (iv) Phân tích kết quả bằng phần mềm chuyên dụng;
(v) Xác định hệ số đồng dạng di truyền và thiết lập sơ đồ quan hệ di
truyền của các đối tương nghiên cứu .
1.3.3.2 Chỉ thị SSR
Kỹ thuật SSR do Litt và Luty (1989) phát hiện lần đâu tiên trên
đối tượng người. Việc sử dụng các chỉ thị SSR trong lập bản đồ di
truyền của các locus đặc trưng bao gồm các bước sau: (i) Phân lập
đoạn SSR từ thư viện hệ gen; (ii) Xác định trình tự của vùng có SSR;
(iii) Xác định các cặp mồi đặc trưng là các trình tự DNA bảo thủ giới
hạn hai đầu của đoạn SSR; (iv) Nhân vùng gen tương ứng bằng PCR
sử dụng các mồi đặc trưng; (v) Phân tích kích thước của sản phẩm
PCR nhằm xác định được sự có mặt của các alen SSR.

Chương 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Vật liệu

2.1.1. Vật liệu và phương pháp thu thập lá bệnh
Sử dụng 50 giống đậu tương có nguồn gốc từ các địa
phương Việt Nam do Trung tâm Nghiên cứu và Phát triển đậu đỗ và
Viện Di truyền Nông nghiệp và Trường Đại học Cần Thơ cung cấp
làm vật liệu nghiên cứu. Trong đó có 4 giống đối chứng kháng bệnh
gỉ sắt do Viện Bảo vệ thực vật cung cấp. Một số giống được thu thập
từ các địa phương Cao Bằng, Hà Giang và Thái Nguyên.
2.1.2. Hoá chất
Các hoá chất thông dụng, có độ tinh sạch cần thiết được mua
của các hãng Merck, Invitrogen, Amersham Pharmacia Biotech, New
England Biolabs...


11
2.2. Phương pháp nghiên cứu

2.2.1. Phương pháp nhiễm bệnh nhân tạo
2.2.2. Phương pháp phân tích hoá sinh
2.2.2.1. Xác định hàm lượng lipid tổng số
2.2.2.2. Xác định hàm lượng protein tan tổng số
2.2.2.3 Xác định thành phần amino acid trong hạt đậu tương
2.2.3. Các phương pháp phân tích đa dạng di truyền DNA
2.2.3.1. Phương pháp tách chiết và tinh chế DNA tổng số
2.2.3.2. Phương pháp xác định DNA bằng quang phổ
2.2.3.4. Điện di DNA trên gel polyacrylamide và nhuộm bạc
2.2.3.5. Phân tích đa hình bằng kỹ thuật RAPD
2.2.3.6. Phân tích đa hình bằng kỹ thuật SSR

2.2.3.7. Phương pháp xử lý số liệu
2.2.4. Các phương pháp phân tích đa hình protein
2.2.4.1 Tách chiết protein từ lá đậu tương
2.2.4.2. Điện di SDS-PAGE
2.2.4.3. Điện di 2 chiều - 2DE
2.2.4.4. Nhuộm protein và phân tích hình ảnh gel
2.2.4.5. Nhận diện protein trên bản điện di 2DE bằng khối phổ
Chương 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. Đánh giá khả năng kháng bệnh gỉ sắt của các giống đậu tương
Đánh giá khả năng kháng bệnh gỉ sắt của 50 giống đậu tương,
chúng tôi đã chia thành 3 nhóm có phản ứng khác nhau với bệnh gỉ sắt:
Nhóm kháng bệnh gỉ sắt bao gồm 13 giống: PI200492,
PI230970, PI462312, PI459025, DT2000, CBU8325, DT95,
MTD65, CNB, PMTQ, HSP2, HSP1, ZG: thể hiện phản ứng kháng
bệnh rất rõ với các vết bệnh có màu nâu đen, số lượng bào tử ít,
không có quầng vàng, tốc độ phát triển của bệnh chậm. Đặc biệt, kết


12
quả nghiên cứu của chúng tôi còn cho thấy có 6 giống kháng mới đã
được phát hiện là PMTQ, HSP1, HSP2, CNB, ZG và MTD65.
Nhóm trung gian bao gồm 12 giống: M103, DT96, PHCB, PS,
PT, NS, MT1, HG2, VK2, CT2, VK3, CT1, mang đặc điểm của hai
loại vết bệnh nhiễm và kháng. Trong đó còn có hai giống đại trà là
M103 và DT96.
Nhóm mẫn cảm với bệnh gồm 25 giống: DT12, VX92, VX93,
DT84, V79, SL, CV, VMK, HG, DK, CBD, CB7, QHCB, LVG,
TTHT, DBBT, DTBT, MT2, HG1, HTDT, MD, DL, MH, ND,
CSGL, HN..
3.2. Phân tích đặc điểm hóa sinh hạt của các giống đậu tương

3.2.1. Phân tích hàm lượng protein và lipid trong hạt của các
giống đậu tương
Kết quả phân tích hàm lượng protein tan và lipid tổng số của 50
giống đậu tương nghiên cứu như bảng 3.1 (không trình bày ở đây).
Giữa các giống, hàm lượng protein giao động từ 30,5% (giống
PMTQ) đến 43,5% (giống DT2000, DT96 và TTHT). Trong khi đó,
hàm lượng lipid giao động từ 11,35% (giống PMTQ) đến 17,4% (các
giống DT2000, DT96 và TTHT). Kết quả phân tích hàm lượng
protein và lipid của hạt 50 giống đậu tương cho thấy sự phù hợp với
kết quả nghiên cứu của tác giả Chu Hoàng Mậu (2002).
Xét về mối tương quan, giữa 3 nhóm đậu tương có phản ứng
khác nhau với bệnh gỉ sắt, chúng tôi nhận thấy không có sự sai khác
rõ rệt về hàm lượng lipid và protein giữa 3 nhóm. Tuy nhiên, trong
mỗi nhóm các giống lai có hàm lượng protein và lipid trong hạt cao
hơn các giống địa phương.
3.2.2. Phân tích hàm lượng và thành phần amino acid trong hạt
của một số giống đậu tương
Chúng tôi chọn 20/50 giống tham gia thí nghiệm đem phân tích
thành phần amino acid trong hạt. Trong đó, có 7 giống kháng, 4


13
giống trung gian và 9 giống nhiễm bao gồm cả giống lai, giống có
nguồn gốc từ địa phương và giống nhập nội.
Kết quả cho thấy đã xác định sự có mặt của 17 loại amino acid và
hàm lượng từng loại amino acid trong mỗi mẫu đậu tượng đã được
nghiên cứu; đồng thời cho thấy giữa 3 nhóm (kháng, trung gian và
nhiễm bệnh gỉ sắt) không có sự sai khác rõ rệt về tổng hàm lượng của 17
amino acid. Chúng dao động từ 31,81% - 39,54%, trong đó mẫu SL
(31,81%) có hàm lượng amino acid tổng số thấp nhất và các giống CNB

(39,54%), VX92 (39,51%) có hàm lượng amino acid tổng số cao nhất.
3.3. Đánh giá sự đa dạng di truyền của các giống đậu tương có khả
phản ứng với bệnh gỉ sắt khác nhau
3.3.1. Phân tích tính đa hình DNA của các giống đậu tương bằng chỉ thị
phân tử RAPD

Kết quả nhân bản các phân đoạn DNA bằng phản ứng RAPD
từ hệ gen của 50 giống đậu tương cho thấy trong 20 mồi có 15 mồi
biểu hiện tính đa hình. Với mỗi mồi ngẫu nhiên, số lượng các phân
đoạn DNA được nhân bản dao động từ 2-10 phân đoạn với kích
thước từ 250bp-2000bp. Tổng số phân đoạn DNA nhân bản được từ
hệ gen của 50 giống đậu tương là 3380 phân đoạn, trong đó mồi
M14 có số đoạn DNA nhân bản là nhiều nhất (335 phân đoạn
DNA) (hình 3.1) và ít nhất là mồi M8 (9 phân đoạn).
Kết quả ở bảng 3.2 cho thấy, tổng số phân đoạn DNA đa hình
của 20 mồi ngẫu nhiên khi phân tích 50 giống đậu tương là 113 đoạn.
Trong đó có 73 phân đoạn đa hình (chiếm 64,6%) và 40 đoạn không
có tính đa hình (chiếm 35,4%). Bảy mồi (M2, M3, M4, M9, M10,
M13 và M18) có tính đa hình hoàn toàn (100%) và năm mồi (M5,
M8, M12, M16 và M17) không cho tính đa hình (0%). Trong đó có
14/20 mồi có số phân đoạn đa hình trên 50%, mồi M14 có số phân
đoạn đa hình bằng 50% (Hình 3.1), mồi M18 số phân đoạn đa hình là
100% (Hình 3.2) (không trình bày ở đây).


14
Kết quả này cũng phù hợp khi phân tích hàm lượng thông tin đa
hình thể hiện ở giá trị PIC (bảng 3.2). Cụ thể, giá trị PIC của mồi
M14 là 0,27 (tỷ lệ đa hình là 50%) và giá trị PIC của mồi M4 là 0,86
(đa hình cao nhất), trong đó 13/20 mồi cho giá trị PIC ≥ 0,5.

Bảng 3.2. Tỉ lệ phân đoạn đa hình và giá trị PIC của các giống
STT Mồi
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10

M1
M2
M3
M4
M5
M6
M7
M8
M9
M10

PIC
0,74
0,76
0,67
0,86
0,00

0,85
0,79
0,00
0,84
0,75

Tổng số đoạn % đoạn
STT Mồi
đa hình
đa hình
6
83,3
11
M11
5
100,0
12
M12
6
100,0
13
M13
4
100,0
14
M14
2
0,0
15
M15

8
37,5
16
M16
7
85,7
17
M17
4
0,0
18
M18
10
100
19
M19
4
100
20 TRA4
Tổng

PIC
0,80
0,00
0,80
0,27
0,35
0,00
0,00
0,50

0,77
0,82

Tổng số đoạn % đoạn
đa hình
đa hình
6
83,3
3
0,0
5
100,0
8
50,0
6
83,3
4
0,0
3
0,0
4
100,0
8
87,5
10
80,0
113
64,6

Mối quan hệ di trưyền của 50 giống đậu tương

Với 20 mồi ngẫu nhiên, chúng tôi đã thiết lập được sơ đồ hình
cây của 50 giống đậu tương (Hình 3.3). Kết quả cho thấy 50 giống
đậu tương phân bố làm 2 nhánh lớn (nhánh I và nhánh II). Nhánh I
chỉ có 2 giống VK2 và DT12, có khoảng cách di truyền so với 48
giống còn lại là 21% (1 - 0,79). Nhánh II gồm 48 giống đậu tương
còn lại có khoảng cách di truyền dao động từ 0% đến 15%.
So sánh với nghiên cứu của tác giả Nguyễn Đức Thuận và cộng
sự (2006) được tiến hành trên 30 giống đậu tương (từ Viện Lúa Đồng
bằng sông Cửu Long) với 13 cặp mồi RAPD, kết quả cho thấy có 9
mồi thể hiện sự đa hình, đồng thời có 4 nhóm (nhóm A, B, C, D)
được phân chia với hệ số tương đồng từ 0,8-0,98.


15

Nhánh thứ hai

Nhánh thứ nhất

Hình 3.3. Sơ đồ hình cây của 50 giống đậu tương dựa trên hệ số
tương đồng di truyền và kiểu phân nhóm UPGMA
3.3.2. Phân tích tính đa hình DNA của các giống đậu tương
bằng chỉ thị phân tử SSR
Kết quả phân tích hình ảnh điện di sản phẩm SSR của 15 cặp
mồi (hình 3.4A, 3.4B, 3.4C và 3.4D). Trong số 15 chỉ thị SSR sử
dụng để phân tích sự đa dạng di truyền của 50 giống đậu tương thì có
14 chỉ thị cho tính đa hình di truyền (Satt460 không đa hình).
Có 81 alen tại 14 locus đã được phát hiện, số alen đa hình tại mỗi
locus biến động từ 4 đến 8 và đạt trung bình là 6 alen (bảng 3.3). Chỉ
thị Satt489 cho số lượng alen nhiều nhất là 8 alen. Giá trị PIC của các

chỉ thị SSR biến động từ 0,473 đến 0,798, đạt trung bình 0,729 và biên
độ dao động của hệ số đa dạng giữa các chỉ thị là tương đối hẹp (0,473
- 0,798). Kết quả này cho tính đa hình cao hơn khi so sánh với nghiên
cứu của Trần Thị Phương Liên và cộng sự trên cùng đối tượng
(0,6326). So sánh với một số tác giả khác trên thế giới, kết quả phân
tích đa hình di truyền DNA trên các giống đậu tương của chúng tôi
tiệm cận với nghiên cứu của Abe và cộng sự (2003) trên tập đoàn 131
giống đậu tương từ 14 nước Châu Á (hệ số đa dạng trung bình 0,782),
cao hơn so với nghiên cứu của Narvel và cộng sự (2000) trên 74 giống
đậu tương ở Bắc Mỹ (hệ số đa dạng trung bình 0,56).
Bảng 3.3. Kết quả phân tích sự đa dạng di truyền bằng chỉ thị SSR
STT
1

SSR
Satt005

Dạng SSR
(ATT)19

Liên kết
D1b

Số alen
7

PIC
0,770

16
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14

Satt009
Satt042
Sat_064
Satt146
Sct_187
Satt150
Satt173
Satt175
Satt373
Satt431
Satt489
Satt557
Satt567

(ATT)14

(ATT)27
(AT)34
(ATT)17
(CT)10
(ATT)20
(ATT)18
(ATT)16
(ATT)21
(ATT)21
(ATT)23(GTT)
(ATT)17GAT
(ATT)14

N
A1
G
F
G
M
O
M
L
J
C2
C2
M

5
4
5

7
6
5
5
7
6
5
8
5
6
81

0,690
0,473
0,767
0,798
0,757
0,686
0,767
0,798
0,753
0,692
0,784
0,707
0,757
0,729

Phân tích mối quan hệ di truyền bằng sơ đồ hình cây qua kết
quả phân tích nhóm (Hình 3.5)
Phân tích sơ đồ hình cây hình 3.5 cho thấy 50 giống đậu tương

được chia thành hai nhánh rõ rệt, khoảng cách di truyền giữa hai
nhánh là 29% (1-0,71):
(1) Nhánh thứ nhất, bao gồm các giống nhiễm bệnh gỉ sắt và một
giống trung gian VK2, có thể phân tiếp thành hai nhánh phụ. Nhánh phụ
thứ nhất (nhóm I) gồm 9 giống DBBT, CV, CSGL, DL, HG, QHCB,
HG1, SL và VX93. Nhánh phụ thứ hai lại chia ra hai nhánh nhỏ bao
gồm: (i) nhánh nhỏ 1 có các giống (nhóm II) như HTDT, MH, DTBT,
VMK, LVG, HN, CBD, ND, V79, DT84, DT12, và (ii) nhánh nhỏ 2 có
các giống (nhóm III): MD, MT2, CB7, VX92, TTHT và VK2.
(2) Nhánh thứ hai bao gồm các giống kháng bệnh và các giống
trung gian. Trong nhánh này, cũng có 2 nhánh phụ: nhánh phụ thứ
nhất gồm các giống (nhóm IV) như DT96, CT2, HG2, VK3, MT1,
CT1, PS, NS, M103, PT và PHCB; trong khi đó nhánh phụ thứ hai
lại phân chia làm 2 nhánh phụ nhỏ. Nhánh phụ nhỏ 1 có các giống
(nhóm V) như CBU8325, ZG, CNB, HSP1, PI462312, nhánh phụ
nhỏ 2 có các giống (nhóm VI) như MTD65, DT2000, HSP2,
PI230970, PI459025, PMTQ, DT95, PI200492.


17

Hình 3.5. Sơ đồ hình cây về mối quan hệ của 50 giống đậu tương có phản
ứng khác nhau với bệnh gỉ sắt dựa trên chỉ thị phân tử SSR

Mối tương quan giữa chỉ thị RAPD và SSR khi phân tích đa hình ở
đậu tương
Để so sánh mối tương quan của hai loại chỉ thị phân tử RAPD
và SSR, chúng tôi nhận thấy sử dụng chỉ thị RADP có 15/20 (chiếm
75%) mồi biểu hiện tính đa hình trong khi đó ở chỉ thị SSR biểu thị
tính đa hình cao hơn với 14/15 mồi (chiếm 93.3%).

Về giá trị PIC, ở chỉ thị RAPD chỉ số PIC giao động từ 0,27 đến
0,86 trong khi đó ở chỉ thị SSR chỉ số này biến động từ 0,473 đến
0,798. Như vậy sử dụng chỉ thị SSR thì biên độ dao động của hệ số
đa dạng là tương đối hẹp hơn so với chỉ thị RAPD. Mặt khác, khi sử
dụng sơ đồ hình cây để phân tích tính đa dạng dinh truyền chúng tôi
nhận thấy ở cả 2 chỉ thị RAPD và SSR 50 giống đậu tương đều được
phân thành 2 nhánh lớn với khoảng cách di truyền lần lượt là 21% và
29%, hệ số sai khác di truyền ở chỉ thị SSR là cao hơn so với chỉ thị
RAPD. Kết quả này cũng thể hiện ở sự phân nhánh lớn và nhánh phụ
của 50 giống đậu tương khi sử dụng hai loại chỉ thỉ thị khác nhau.
Kết quả ở chỉ thị RAPD thì 50 giống chỉ được phân làm 2 nhóm
chính, trong khi đó ở chỉ thị SST thì 50 giống được phân thành 5
nhóm nhỏ (I, II, III, IV, V) với hệ số tương đồng khác nhau (hình
3.5). Kết quả này một lần nữa khẳng định, phương pháp sử dụng chỉ


18
thị SSR có độ đa hình cao hơn và tin cậy hơn, đây là cơ sở ban đầu
mở ra khả năng tìm kiếm các giống đậu tương Việt Nam mang từng
gen kháng chuyên biệt.
3.4. Phân tích đa hình protein lá của một số giống đậu tương có
khả năng kháng bệnh gỉ sắt khác nhau
Để tiếp cận với hệ protein lá đậu tương, chúng tôi đã lựa chọn ra
2 cặp giống đậu tương tương nhập nội đang được sản xuất đại trà
(DT12 và DT2000) và cặp giống đậu tương địa phương (VMK và
CBU8325).
3.4.1. Lập bản đồ hệ protein của lá đậu tương bằng kỹ thuật điện di 2 chiều
3.4.1.1. Phân tách protein lá đậu tương
Protein lá đậu tương tương ứng với thời điểm 6 và 9 ngày tuổi
của các giống VMK, DT12, CBU8325 và DT2000 (mẫu đối chứng

không nhiễm bệnh) được phân tách bằng 2-DE và nhuộm bằng
coomassie G250. Hình 3.6 minh họa ảnh điện di 2-DE của protein lá
đậu tương giống DT2000 ở thời điểm 6 ngày (Hình 3.6A) và 9 ngày
(Hình 3.6B). Kết quả cho thấy, ở giống đậu tương DT2000 có 119
điểm protein được phát hiện trên ảnh điện di 2DE ở mẫu 9 ngày
trong khi đó ở mẫu 6 ngày chỉ có khoảng 103 điểm protein. Kết quả
này chứng tỏ ở thời điểm 9 ngày các protein lá đã được biểu hiện
nhiều hơn. Protein phân tách tốt các vị trí khá tương đồng, nhiều
điểm protein tạo thành các vệt, hoặc các vị trí tương ứng có thể là do
cùng một protein nhưng có những isoform khác nhau. Protein lá đậu
tương được phân tách trên thanh có dải gradient pH 3-10, có chiều
dài 7cm nhưng trên ảnh điện di các protein này tập trung chủ yếu ở
khoảng pH từ 5 đến 8. Điều này là khá hợp lý, bởi vì hầu hết các
protein nằm ở dải pH hơi kiềm, hơi acid hoặc trung tính.


19

Hình 3.6. Hình ảnh điện di 2-DE so sánh mức độ biểu hiện protein lá
đậu tương giống DT2000 ở thời điểm 6 ngày (A) và 9 ngày (B). Các
vùng phóng đại thể hiện sự so sánh mức độ biểu hiện khác nhau của
các điểm protein theo thời gian

Về khối lượng phân tử, các protein phân bố rộng, có nhiều
điểm protein với khối lượng phân tử >120 kDa, trong khi đó một số
điểm protein lại phân bố ở vùng có khối lượng phân tử thấp (<14
kDa), protein với mật độ dày ở khu vực 25 kDa đến 80 kDa. Ở một
số vùng, protein có mức độ biểu hiện đậm, thậm chí thành từng vệt,
đây là các protein có vai trò quan trọng với chức năng của lá, chúng
có nồng độ cao và được tạo ra thường xuyên trong lá như protein

rubisco hoặc là các protein màng trong hệ thống quang hóa.
3.4.1.2. Lập bản đồ điện di hệ protein lá đậu tương
Trong thí nghiệm này chúng tôi áp dụng phương pháp điện
di 2DE để thiết lập bản đồ điện di của protein lá đậu tương ở giống
kháng bệnh gỉ sắt DT2000 và so sánh với các giống khác như DT12,
CBU8325 và VMK.


20
DT2000

DT2000

VMK

CBU8325

Hình 3.7. So sánh sự đa dạng về protein lá đậu tương của các giống
DT12, DT2000, CBU8325 và VMK

Kết quả hình 3.7 thể hiện bản đồ điện di 2DE các protein lá
đậu tương ở giống DT2000. Trên bản điện di protein lá đậu tương,
chúng tôi nhận thấy có 109 điểm protein đã được phát hiện, trong đó
khối lượng phân tử của chúng phân bố từ 6 kDa đến 80 kDa, pH giao
động từ 4-9, trong đó các protein tập trung chủ yếu từ pH 5 đến 8.
Các điểm protein phân bố ổn định qua các lần chạy điện di khác
nhau. Mỗi protein có một khối lượng phân tử và điện tích đặc trưng
do đó khi điện di chúng có một vị trí nhất định trên gel, lập thành
một bản đồ điện di các protein.
3.4.1.3. Định danh hệ protein lá đậu tương

Để định danh các protein có mặt trên bản điện di, ở mẫu
DT2000 có 119 điểm protein, nhưng có một số là isoform nên chúng
tôi chỉ lựa chọn 80 điểm protein riêng rẽ để phân tích nhận dạng. Kết
quả, trong 80 điểm protein được lựa chọn phân tích bằng khối phổ,
có 35 protein đã được định danh (bảng 3.4. không trình bày ở
đây).Trong 35 protein lá đậu tương đã được định danh ở mẫu DT2000,
điểm số của các protein được nhận diện dao động từ 65 đến 438 điểm,


21
trong khi đó khối lượng của chúng phân bố trong khoảng từ 6,5 kDa
đến 57 kDa. Kết quả của chúng tôi là một trong những dẫn liệu đầu
tiên, trong đó với 119 điểm protein trên gel chúng tôi đã định danh
được 35 protein lá có mặt trong giống đậu tương DT2000 kháng
bệnh gỉ sắt, đặc biệt có 3 protein liên quan đến khả năng phòng
vệ/kháng bệnh đã được phát hiện và cần được nghiên cứu sâu.
3.4.1.4. Phân nhóm hệ protein lá đậu tương
Sử dụng các công cụ tin sinh GO dự đoán chức năng protein
trên cơ sở dữ liệu EBI và Swiss-Prot, trong số 35 protein ở lá đậu
tương có sự phù hợp về hầu hết các thành phần cơ bản trong lá, trong
đó protein có chức năng quang hợp chiếm tỷ lệ cao nhất với 29%,
sau đó đến nhóm protein chuyển hóa năng lượng của chu trình quang
hợp (17%), và các protein tham gia vào hệ thống đường phân (11%).
Ngoài các protein tham gia vào quá trình quang hợp, trong kết quả
này chúng tôi còn nhận diện thấy các nhóm protein dự trữ (9%),
protein liên quan đến cơ chế trao đổi chất (8%), nhóm protein vận
chuyển điện tử (8%), dịch mã (8%), kháng bệnh (8%) và chưa biết
(6%). Đặc biệt, trong 9 nhóm protein đã được phân loại (hình 3.8),
nhóm protein liên quan đến bệnh và sức đề kháng, chiếm tỷ lệ 8%
(Disease/defense).

Ascorbate peroxidase 2 là một enzyme giải độc các peroxide
bằng cách sử dụng ascorbate làm cơ chất. Có nghiên cứu cho rằng
việc xuất hiện đột biến sẽ gây ảnh hưởng đến nồng độ biểu hiện của
ascorbate peroxidase 2, protein này có phản ứng đối với tính chống
chịu mặn và quá trình chịu stress. Tuy nhiên vai trò của chúng đối
với kháng gỉ sắt chưa thấy có báo cáo nào ghi nhận. Việc protein này
có vai trò quan trọng trong tính kháng gỉ sắt ở giống DT2000 hay
không cần có những nghiên cứu riêng rẽ sâu hơn để làm sáng tỏ.


22

Hình 3.8. Phân nhóm chức năng hệ protein lá đậu tương giống DT2000

Catalase là một enzyme quan trọng tìm thấy ở hầu hết các sinh
vật. Enzyme này xúc tác cho phản ứng phân hủy hydrogen peroxide
qua đó giải độc cho cơ thể. Nghiên cứu của Balestrasse và cộng sự
chỉ ra rằng khi có stress cadmium, ở rễ và nốt sần của đậu tương sẽ
biểu hiện mạnh enzyme này. Do chúng có vai trò quan trọng trong
việc giải độc, cho nên sự biểu hiện tăng cường của enzyme này nhằm
chống lại với stress cadmium đã được khẳng định. Mặt khác, nghiên
cứu của Vasconcelos và cộng sự (2009) chỉ ra rằng khi gặp stress
khô hạn, các enzyme catalase và ascorbate peroxide có mức biểu
hiện thay đổi để giúp cây thích ứng với môi trường khô hạn. Trong
khi đó, stress-induced protein thuộc nhóm protein liên quan đến mầm
gây bệnh PR10, chúng được cho là có vai trò trong việc chống chịu
với bệnh u nang tuyến trùng ở đậu tương (soybean syst nematodeSCN), loại bệnh dịch phổ biến ở Mỹ. Các tác giả cho rằng protein
này có mức độ biểu hiện tăng đáng kể và trong thời gian dài ở rễ của
cây đậu tương mắc bệnh. Như vậy, vai trò rất quan trọng của protein
này trong việc phòng vệ và giúp cơ thể cây chống chịu với bệnh tật

đã được mô tả.
3.4.2. Nghiên cứu tính đa hình protein của các giống đậu tương
bằng kỹ thuật điện di hai chiều
3.4.2.1 So sánh mức độ biểu hiện protein ở giống đậu tương nhiễm bệnh
gỉ sắt


23
Trong nghiên cứu này, protein lá đậu tương giống DT12 và
VMK ở thời điểm 9 ngày sau khi lây bệnh của mẫu đối chứng và thí
nghiệm, được phân tách bằng 2-DE, sau đó gel được nhuộm bằng
coomassie G250 (Hình 3.9). Kết quả cho thấy các điểm protein phân
bố chủ yếu ở vùng pH từ 5 đến 9, nhiều điểm protein tạo thành vệt có
cùng một khối lượng nhưng điện tích khác nhau (isoform). Điều này
là do cùng một protein nhưng chúng có trạng thái điện tích khác
nhau nên có các đồng phân khác nhau.

Hình 3.9. So sánh sự đa dạng protein lá đậu tương đối chứng và
thí nghiệm ở các giống nhiễm bệnh 9 ngày DT12 và VMK

Ở cả hai giống DT12 và VMK, mẫu thí nghiệm có 9 điểm
protein cùng biểu thị mức độ thay đổi (tăng/giảm1,5 lần), trong đó 8
điểm (điểm 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 9) có nồng độ tăng và một điểm (điểm
số 8) có mức độ biểu hiện giảm khi so với đối chứng (Hình 3.9).
Đáng chú ý, ngoài bốn điểm (2, 6, 8 và 9) có hàm lượng protein lớn
thì 5 điểm còn lại (1, 3, 4, 5, 7) đều có hàm lượng protein khá thấp.
Trong lá đậu tương, các protein chiếm hàm lượng lớn chủ yếu là
các protein tham gia vào quá trình quang hợp (Rubisco và các
protein của hệ thống quang hóa) hoặc protein dự trữ ở lá. Việc tăng
(hoặc giảm, thậm chí mất hẳn) nồng độ của một số protein ở mẫu thí

24
nghiệm so với đối chứng của các lá bị nhiễm bệnh gỉ sắt (DT12,
VMK) chứng tỏ ở các giống này đã có sự biến đổi về mức độ trao
đổi chất, sự thay đổi hoạt động của các gen dẫn đến hàm lượng của
một số protein thay đổi khi có quá trình nhiễm bệnh xảy ra. Có thể sự
biến đổi về hàm lượng của các protein này có liên quan đến quá trình
nhiễm bệnh hoặc các phản ứng sinh lý của cây do hậu quả của việc
nhiễm bệnh. Bằng phương pháp sắc ký khối phổ ESI-Q-TRAP, các
điểm protein khác biệt này đã được nhận diện như bảng 3.5
Bảng 3.5. Nhận diện các protein có mức độ biểu hiện khác nhau
giữa thí nghiệm và đối chứng ở hai mẫu nhiễm bệnh DT12 và VMK
TT

Tên protein

Khối
Điểm
lượng
số
kDa

Spot

Số đăng ký

1

gi|5902586

212

Chức năng

Tăng/
Giảm

15.4

Quang hợp

Tăng

1 PSI PsaN subunit
precursor
2 PSI reaction centre
subunit IV A
3 Unknown
4 Stem 28 kDa protein
5 Vegetative storage
protein
6 Ribose 5-phosphate
isomerase

2

gi|5606709

179

16.3

Quang hợp

Tăng

3, 4, 5
6

gi|169898

128

29.0

Dự trữ

Tăng
Tăng

7

gi|170088

122

32.

Dự trữ

Tăng

8

gi|15285625

89

20.1

Trao đổi chất

Tăng

7 Rubisco large subunit

9

gi|3114769

235

54.2

Tham gia trong
quá trình cố định Giảm
carbon

Kết quả nhận diện cho thấy, giữa mẫu đối chứng và mẫu nhiễm

bệnh của hai giống DT12 và VNK các protein được phát hiện là các
protein có liên quan đến chu trình quang hợp (PSI PsaN subunit
precursor, PSI reaction centre subunit IV A, rubisco large subunit),
các protein dự trữ (stem 28 kDa protein, vegetative storage protein)
hoặc protein liên quan đến trao đổi chất (ribose 5-phosphate
isomerase). Đặc biệt ở các điểm 3,4,5 không nhận diện được trên cơ
sở dữ liệu protein.
Hiện nay đã có một số nghiên cứu về protein lá đậu tương, tuy
nhiên các kết quả so sánh các protein lá nhiễm bệnh với lá chưa lây
nhiễm hầu như còn hạn chế. Do vậy, theo hiểu biết của chúng tôi,


25
việc các protein quang hợp và các protein dự trữ trong lá tăng, chứng
tỏ chúng hoạt động mạnh tại thời điểm 9 ngày lây nhiễm, trong khi
đó protein liên quan đến trao đổi chất lại giảm. Như chúng ta đã biết,
khi bị nhiễm nấm thì cây đậu sẽ trưởng thành sớm và hậu quả là quá
trình quang hợp giảm, lá bị đốm vàng, rụng và năng suất hạt kém.
Tuy nhiên, trong giai đoạn 9 ngày lây nhiễm, theo hiểu biết của
chúng tôi rất có thể giai đoạn này cây có những thay đổi về sinh lý,
hóa sinh như quá trình quang hợp lại diễn ra mạnh, protein dự trữ
được tổng hợp tăng cường trong một thời gian nhất định để cây
trưởng thành sớm. Bằng chứng là nồng độ các protein tham gia vào
quá trình quang hợp như PSI PsaN subunit precursor, PSI reaction
centre subunit IV A, rubisco large subunit và các protein dự trữ như
stem 28 kDa protein, vegetative storage protein tăng. Hiện nay, chưa
thấy có nghiên cứu nào ghi nhận sự biến đổi của nồng độ các protein
lá ở giai đoạn 9 ngày lây nhiễm. Do đó, các nghiên cứu của chúng tôi
đã cung cấp những dẫn liệu ban đầu đồng thời gợi ý hướng nghiên
cứu về hệ protein lá để có thể tiếp cận gần hơn với cơ chế bệnh,

ngoài hướng nghiên cứu về gen.
3.4.3.2. So sánh mức độ biểu hiện protein giữa giống đậu tương
nhiễm bệnh và kháng bệnh gỉ sắt
Nhằm tìm hiểu những thay đổi của các protein giữa một số
giống đậu tương nhiễm bệnh và kháng bệnh, chúng tôi đã lựa chọn
và tiến hành phân tích 02 giống nhiễm (DT12 và VMK) và 02 giống
kháng (DT2000 và CBU8325). Kết quả cho thấy, có 06 điểm protein
lá ở giống nhiễm có hàm lượng tăng so với giống kháng.
Toàn bộ 6 điểm protein có mức độ biểu hiện tăng ở giống nhiễm
(DT12 và VMK) so với giống kháng (DT2000 và CBU8325) cho
thấy trong quá trình nhiễm bệnh, đã có sự thay đổi về quá trình trao
đổi chất và chuyển hóa của các protein trong lá, tuy nhiên sự tổng
hợp các protein trong giống kháng dường như không thay đổi. Bằng
phương pháp phân tích khối phổ, đã có 4 protein được nhận diện
(bảng 3.6). Đó là Rubisco large subunit , Rubisco small subunit
rbcS2, PSI reaction centre subunit IV A, Glyceraldehyde-3-