Bài báo về biến tính tinh bột bằng cyclomaltodextrinase

Bài báo về biến tính tinh bột bằng cyclomaltodextrinase

GVHD: Nguyễn Minh Hải

BIẾN TÍNH TINH BỘT BẰNG CÁCH SỬ DỤNG CYCLOMALTODEXTRINASE TỪ VI KHUẨN BACILLUS ƯA KIỀM ĐỂ
LÀM GIẢM HÀM LƯỢNG AMYLOSE
Cyclomaltodextrinase (CDase) được phân lập từ vi khuẩn Bacillus ưa kiềm sp. I-5 (CDase I-5) và tồn tại ở dạng dodecameric, một nhóm
gồm sáu dimer, mỗi vị trí xúc tác của enzyme này nằm ở rãnh hẹp trên bề mặt của đơn vị dimer.

Hình 1: Dạng dodecameric

Hình 2: Dạng dimers [2]
Do sự duy nhất về hình dạng hình học của vị trí xúc tác, enzyme có thể phân biệt kích thước phân tử của cơ chất. Một cuộc phân tích về
phản ứng thủy phân của enzyme cho thấy giá trị k cat/Km đối với amylose là 14.6 s-1(mg/mL)-1, còn đối với amylopectin là 0.92 s-1(mg/mL)-1, cho
thấy sự ưa thích cao của enzyme này đối với amylose. CDase I-5 được dùng để biến tính cấu trúc tinh bột để tạo ra những sản phẩm tinh bột có
hàm lượng amylose thấp bằng cách ủ tinh bột gạo với enzyme này. Chúng ta thấy rằng lượng amylose của tinh bột gạo giảm từ 28.5% xuống 9%,
trong khi lượng amylopectin vẫn giữ nguyên với sự thay đổi không đáng kể trong sự sắp xếp chiều dài chuỗi. Tinh bột gạo được xử lý CDase I-5
được trữ ở nhiệt độ 4ºC trong 7 ngày, tốc độ thoái hóa khá chậm khi so sánh với tốc độ thoái hóa của mẫu kiểm soát.

1.

Giới thiệu
Tinh bột là nguồn cung ứng carbonhydrate chủ yếu ở thực vật, được tìm thấy ở dạng hạt. Tinh bột bao gồm chủ yếu hai polymer khác nhau
về cấu trúc là amylose và amylopectin. Amylopectin (AP) là một polymer có chứa liên kết D-glucose α-(1,4) với 4-5% liên kết α-(1,6) ở mạch

Nhóm 6

Trang 1


Bài báo về biến tính tinh bột bằng cyclomaltodextrinase

GVHD: Nguyễn Minh Hải

nhánh, trong khi amylose (AM) thì chủ yếu là liên kết α-(1,4) D-glucan mạch thẳng với rất ít nhánh. Tỉ lệ AM và AP trong tinh bột thì khác nhau,
phụ thuộc phần lớn vào nguồn gốc thực vật. Ví dụ, tinh bột bắp hàm lượng amylose cao (50-70%), trong khi tinh bột dạng sáp không chứa
amylose. Tỉ lệ AM/AP khác nhau ở tinh bột thực vật gây nên sự khác biệt về tính chất, chức năng, dinh dưỡng.
Bảng 1: Bảng so sánh về sự khác nhau giữa amylose và amylopectin [1]
Chỉ tiêu so sánh

Amylose

Amylopectin

Cấu tạo

Liên kết 1,4-glucoside

Liên kết 1,4-glucoside và liên kết 1,6
Chỉ có một đầu khử duy nhất

Có một đầu không khử và một đầu khử
Phân tử lượng

3.105-1.106

5.104-1.106

Độ hòa tan

Dễ hòa tan trong nước ấm

Chỉ hòa tan khi đun nóng

Độ nhớt

Không cao

Cao

Phản ứng với Iot

Tạo ra phức hợp có màu xanh

Tạo ra phức hợp có màu tím đỏ

Độ bền

Dễ bị thoái hóa khi nhiệt độ hạ thấp (tạo
gel vô định hình, kết tủa không
thuận nghịch…)

Không có xu hướng kết tinh do phân tử
khá cồng kềnh

Khả năng giữ nước

Kém

Tốt

Khả năng trương phồng

Thấp

Cao

Enzyme làm thoái hóa cyclodextrin được biết đến là cyclomaltodextrinase (CDases; E.C. 3.2.1.54) thủy phân cyclomaltodextrins rất hiệu
quả (CDs), có cấu tạo là oligomer glucose dạng vòng được liên kết bởi liên kết α-D-(1,4) glycosidic. Gen mã hóa CDase được nhân lên từ
Bacillus sp. I-5 ưa kiềm, cấu trúc gen, đặc tính hóa sinh, và cấu trúc protein 3D của CDase I-5 được mô tả trong phòng thí nghiệm. Gen CDase I5 gồm hệ thống 559 amino acid với trọng lượng phân tử tương đối 65kDa. Cấu trúc 3D của CDase I-5 cho thấy enzyme tồn tại ở dạng
dodecameric, gồm 6 dimer. CDase I-5 tinh sạch thủy phân cyclomaltoheptaose (β-CD) trên tinh bột và pullulan hòa tan và mô tả hoạt động
chuyển hóa glucosyl. Những đặc tính của enzyme CDase được phân biệt với những đặc tính của enzyme α-amylase điển hình (ví dụ như TAKAamylase A (TTA; E.C. 3.2.1.1) từ Aspergillus oryzae). Một nghiên cứu cho thấy TTA không thủy phân CDs và chỉ có một vài loại α-amylose có
thể thủy phân CDs ở tốc độ rất chậm. Rãnh trung tâm hoạt động của enzyme làm thoái hóa CD ở dạng nhị trùng (dimeric) để hình thành đường
rãnh hẹp và sâu trên đỉnh khối, trong khi tâm hoạt động rộng và cạn được quan sát ở α-amylase. Sự ưa thích cơ chất của CDase theo đối với CDs
dạng phẳng và mỏng có thể được giải thích bởi hình dáng đặc thù của tâm hoạt động của CDase. Hành động phân biệt mẫu CDase có thể sử dụng
để sản xuất tinh bột hàm lượng amylose thấp bằng việc làm biến đổi phân tử amylose.
Trong cuộc nghiên cứu này, hành động phân biệt mẫu Bacillus I-5 ưa kiềm CDase (CDase I-5) trên cấu trúc tinh bột được kiểm tra về số
lượng; và khả năng ứng dụng cũng được kiểm tra đối với việc chế biến thức ăn giàu tinh bột bằng cách đánh giá hiệu quả chống thoái hóa đối với
tinh bột gạo được xử lý CDase. Enzyme biến tính tinh bột có thể sử dụng để làm giảm độ nhớt và cải thiện sự ổn định gel, cảm quan, dáng vẻ, cấu
trúc, và tạo khả năng kháng nhiệt cho tinh bột. Ngoài ra, CDase I-5 có thể sử dụng để sản xuất tinh bột không chứa amylose, đây là mối quan tâm
trong nhiều ngành công nghiệp.

2.1

2.

Nguyên liệu và phương pháp
Nguyên liệu: Amylose, amylopectin và tinh bột được cung cấp từ tập đoàn Sigma-Aldrich. (St. Louis, MO). Các chất hóa học khác được sử dụng
đều là những loại hóa chất đã được công bố.

2.2

Tinh sạch protein, dòng vi khuẩn và plasmids
Nhân dòng gen trong vi khuẩn E. Coli. CDase của Bacillus I-5 ưa kiềm được tinh sạch từ canh trường của vi khuẩn E. Coli MC1061([ F¯,
araD139, araABC-leu] 7696, galU, kalK, lacX74, rpsL, t6hi, hsdR2, mcrB) chứa gen CDase trên thể plasmid pUC18. Để mô tả đặc tính enzyme
của CDase I-5, protein được sản xuất từ E. coli tái tổ hợp MC1061.



Phương pháp sắc kí trao đổi ion: mục đích là để tách các protein từ chủng E. coli tái tổ hợp MC1061.
Nguyên tắc: Tại bất kỳ một điểm pH nào trừ điểm đẳng điện, các protein đều có mang một điện tích tương ứng với điểm pH đó. Dựa vào
điện tích thực của chúng tại một điểm pH nhất định, ta có thể phân tách hỗn hợp protein.[3]
Trong phương pháp này, pha tĩnh là những hạt mang sẵn một điện tích nhất định, những hạt này sẽ tương tác với các phân tử (protein) mang
điện tích trái dấu với chúng. Cụ thể, nếu hạt mang điện âm (như cột carboxymethyl-cellulose (CM-cellulose)), tiến trình được gọi là sắc ký trao
đổi ion dương, thì sẽ tương tác với những phân tử mang điện tích dương. Ngược lại, nếu hạt mang điện tích dương (như cột diethylaminoethyl-

Nhóm 6

Trang 2


Bài báo về biến tính tinh bột bằng cyclomaltodextrinase

GVHD: Nguyễn Minh Hải

cellulose (DEAE-cellulose)), gọi là sắc ký trao đổi ion âm, thì tương tác với phân tử mang điện tích âm. Vì thế, những protein cùng dấu với cột sẽ
chạy ra khỏi cột trong khi những protein trái dấu bị giữ lại cột. Để phóng thích những protein này, ta tăng nồng độ ion của pha động, những ion
này sẽ thay thế phân tử protein tương tác với các hạt mang điện tích. Ví dụ, trong sắc ký trao đổi ion dương, ta thêm muối natri clorua hay muối
khác trong dung dịch tách giải bởi vì ion natri sẽ tranh bám vào cột với các protein có điện tích dương, do đó, những protein mang điện tích
dương được phóng thích ra ngoài cột lần lượt theo độ lớn về điện tích.

Hình 3: Phương pháp sắc ký trao đổi ion



Tủa bằng muối ammonium sulfate: sau khi đã tách được các thành phần protein trong hỗn hợp ta có thể tiến hành tách sơ bộ enzyme CDase I-5
bằng phương pháp tủa bằng muối ammonium sulfate.
Nguyên tắc: Ở nồng độ muối cao, phần lớn protein sẽ giảm tính hòa tan, hiện tượng này gọi là tủa bằng muối. Mỗi loại protein sẽ kết tủa ở
một nồng độ muối nhất định. Vì vậy, hiện tượng tủa bởi muối có thể được dùng để phân đoạn protein. CDase I-5 phần lớn bị kết tủa khi có mặt
50% (w/v) ammonium sulfate. Sau đó lượng muối sẽ được loại bỏ bằng phương pháp thẩm tách.



Cuối cùng enzyme CDase sẽ được tinh sạch hơn bằng FPLC sử dụng một cột Q-sepharose và một cột DEAE-8HR
Phương pháp FPLC ( Fast protein liquid chromatoraphy) là một kỹ thuật tương tự như sắc kí lỏng cao áp HPLC, được sử dụng để phân tách
và làm sạch các protein trong hỗn hợp.
Nguyên tắc: một lượng nhỏ hỗn hợp cần phân tách sẽ theo pha động được đưa vào đầu cột, tiếp xúc với pha tĩnh bên trong cột. Do ái lực
khác nhau của mỗi cấu tử đối với pha tĩnh và pha động mà chúng sẽ phân bố ở những vị trí khác nhau bên trong cột và được pha động lôi cuốn ra
khỏi cột sắc kí với những vận tốc khác nhau. Những cấu tử nào có ái lực lớn với pha động sẽ được pha động lôi kéo với vận tốc lớn hơn và được
tách ra khỏi cột nhanh hơn, còn các cấu tử có ái lực yếu với pha động sẽ ra khỏi cột chậm hơn. Điều này được đặc trưng bởi thời gian lưu của
từng cấu tử trong cột sắc kí. Sau khi ra khỏi cột, các cấu tử này được đầu dò ghi nhận và truyền tín hiệu cho máy tính xử lý, từ đó ta có thể định
tính và định lượng cấu tử trong mẫu.

Nhóm 6

Trang 3


Bài báo về biến tính tinh bột bằng cyclomaltodextrinase

GVHD: Nguyễn Minh Hải

Pha tĩnh là các hạt nhựa agarose liên kết ngang còn pha động là các dung môi không phân cực như hexane. Áp lực sử dụng trong phương
pháp này tối đa 3-4Mpa.

Hình 4: Phương pháp FPLC
Sau khi tiến hành phương pháp FPLC thì CDase I-5 sẽ được tinh sạch. Để kiểm tra độ tinh sạch của Cdase I-5 ta sử dụng phương pháp
SDS-PAGE sẽ được nêu ở phần dưới.

2.3

Hoạt động của enzym
Hoạt động của CDase I-5 được thử nghiệm bằng phương pháp xác định nồng độ đường khử 3,5-dinitrosalicylic acid (DNS). Hỗn hợp thử
nghiệm chứa 0.5% (w/v) β-CD và 0.1% (v/v) CDase I-5 trong 50mM dung dịch đệm sodium phosphate (pH 7.0) ủ ở 50 oC trong vòng 10 phút.
Phản ứng ngừng lại khi thêm gấp 3 lần dung dịch DNS (v/v) và được đun sôi khoảng 5 phút. Khả năng hấp thụ của hỗn hợp phản ứng được đo ở
575 nm. Đương lượng liên kết glycosidic bị thủy phân bằng đương lượng đường maltose dựa trên đường cong maltose chuẩn. Một đơn vị của
hoạt động enzym được xác định bằng một lượng enzym giải phóng ra 1µmol đường khử một phút.

2.4

Nghiên cứu động học dựa trên sự thủy phân những cơ chất khác nhau
Phương pháp copper bicinchoninate (BCA) được thực hiện để đo nồng độ đường khử được sinh ra trong quá trình thủy phân enzyme, và
thông số động học của CDase I-5 đối với 3 loại cơ chất khác nhau (β-CD, amylase, và amylopectin) được xác định để so sánh những đặc trưng
riêng của từng loại cơ chất.

2.5

Hàm lượng amylose và amylopectin
Hàm lượng amylose trong tinh bột được đo bằng phương pháp iot. Ví dụ cân chính xác 100 mg mẫu tinh bột cho vào trong bình Erlen 50ml
cùng với 1ml ethanol 95% và 9 ml NaOH 1N. Sau đó đun sôi trong 10 phút để hồ hóa tinh bột. Sau khi làm nguội xuống nhiệt độ phòng thì cho
vào bình thể tích 100ml và định mức lên 100ml bằng nước cất. Hút 5ml dung dịch hồ tinh bột vào bình 100ml và cho vào 1ml acid acetic 1N và

2ml dung dịch iot (0.2g iot và 2.0g potassium iodide trong 100ml nước). Sau đó dung dịch được định mức lên 100ml bằng nước cất, lắc đều và để
yên trong 20 phút. Dùng máy quang phổ đo khả năng hấp thụ ở 620nm.
Để xác định sự thay đổi về tỷ lệ các thành phần riêng lẻ trong phản ứng CDase I-5, tinh bột gạo bình thường được hòa tan trong DMSO
90% bằng cách gia nhiệt và được sử dụng như là cơ chất cho phản ứng. Hỗn hợp phản ứng bao gồm 0.5% tinh bột gạo và CDase I-5 (1U/mg cơ
chất) trong 50mM dung dịch đệm sodium phosphate, và hàm lượng amylose, amylopectin và lượng đường khử được phân tích ở thời gian 10, 30,
60 phút. Hàm lượng amylose được đo theo phương pháp hấp thụ iot, còn hàm lượng đường khử được đo theo phương pháp DNS như lượng
đường maltose. Hàm lượng amylopectin được tính bằng cách lấy tổng trừ đi hàm lượng amylose và đường khử.
Cách xác định hàm lượng đường khử bằng phương pháp DNS

•

Nguyên tắc:

Phương pháp này dựa trên cơ sở phản ứng tạo màu giữa đường khử với thuốc thử acid dinitrosalicylic (DNS). Cường độ màu của hỗn hợp
phản ứng tỉ lệ thuận với nồng độ đường khử trong một phạm vi nhất định. Tiến hành so màu ở bước sóng 540nm. Dựa theo đồ thị đường chuẩn
của glucose tinh khiết với thuốc thử DNS sẽ tính được hàm lượng đường khử của mẫu nghiên cứu. [4]

Nhóm 6

Trang 4


Bài báo về biến tính tinh bột bằng cyclomaltodextrinase

GVHD: Nguyễn Minh Hải

Một số kiến thức về thuốc thử DNS
Thuốc thử DNS (dinitrosalicylic acid), bao gồm các thành phần như:



Nước cất 60-70 ml



NaOH rắn 1,6g



Acid Dinitrosalicylic (DNS: C7H4N2O7) 1g



Muối seignette (C4H4O6KNa.4H2O) 30g

Khuấy tan hỗn hợp bằng máy khuấy từ và định mức đến vạch 100ml bằng bình định mức. Thuốc thử được bảo quản trong điều kiện nhiệt
độ thấp và tránh ánh sáng.

•

Cách thực hiện

Chuẩn bị mẫu phân tích:
Chuẩn bị mẫu trắng: Dùng 5 ống nghiệm cho vào mỗi ống nghiệm lần lượt dung dịch glucose chuẩn 0,1%, nước cất, thuốc thử DNS
Chuẩn bị mẫu chuẩn: Dùng 4 ống nghiệm, cho vào mỗi ống lần lượt dung dịch mẫu, nước cất, thuốc thử DNS
Đun cách thủy: Đun sôi cách thủy các ống nghiệm trên trong thời gian 5 phút. Sau đó, làm nguội nhanh đến nhiệt độ phòng.
Phân phối mẫu: Đổ lần lượt các ống nghiệm trên vào các cuvet nhựa, sau đó, tiến hành đo mật độ quang.
Đo: Dùng máy quang phổ so màu UV-VIS đo mật độ quang ở bước sóng 540nm với các mẫu chuẩn và mẫu trắng.
Xử lý số liệu
Sau khi tiến hành đo mật độ quang cuả mẫu trắng và mẫu chuẩn sẽ xử l ý số liệu thu được, dựa vào đường cong chuẩn suy ra hàm lượng

đường khử.

2.6

Sự cô cạn protein
Một lượng protein được đo bằng phương thức được miêu tả trong Bradford. Hỗn hợp phản ứng bao gồm 100 ml dung dịch enzyme loãng và
900 ml dung dịch Bradford (100 mg thuốc thử Coomassie Brillant Blue G-250 trong 50 ml ethanol, 100 ml acid phosphoric 85% và 850 ml nước
cất). Hỗn hợp phản ứng được thực hiện ở nhiệt độ phòng trong khoảng 5 phút và sau đó khả năng hấp thụ được đo ở 595 nm bằng phương pháp
quang phổ. Mẫu trắng được chuẩn bị bằng việc thay thế dung dịch enzym bằng dung dịch đệm. Sử dụng serum albumin (BSA) để xây dựng
đường cong chuẩn. Từ đường cong chuẩn suy đoán ra lượng protein cần xác định.

2.7

SDS- PAGE (sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis)
Protein được điện di trên gel polyacrylamide không liên tục với sự có mặt của SDS (sodium dodecyl sulfate).
Nguyên tắc:
Sự tách protein sẽ phụ thuộc vào sự va chạm của các protein bên trong môi trường và điện tích của các phân tử protein.

Sự di chuyển =

(điện thế thực nghiệm)(lưới điện tích trên phân tử)

Sự va chạm của các phân tử
Protein có thể mang điện tích âm hoặc mang diện tích dương. Điều này sẽ phụ thuộc vào pH dung dịch và pI của chúng. Protein mang điện
tích âm nếu pH > pI và nó mang điện tích dương nếu pH < pI. Điện tích và điện thế thực nghiệm sẽ quyết định protein di chuyển bao xa trong từ
trường. Điện thế càng cao và điện tích protein càng mạnh thì sự di chuyển phân tử protein trong từ trường càng lớn. Khi có sự va chạm thì sự di
chuyển của protein sẽ giảm. Ngoài ra hình dạng và kích thước phân tử protein cũng sẽ quyết định sự di chuyển của phân tử protein trong môi
trường gel.

Nhóm 6

Trang 5


Bài báo về biến tính tinh bột bằng cyclomaltodextrinase

GVHD: Nguyễn Minh Hải

Khi điện di trong gel polyacrylamide, các protein sẽ được phản ứng với các chất hoạt động bề mặt mang điện tích âm SDS (Sodium Dodecy
Sulfate) để tạo thành một phức hợp mang điện tích âm và sẽ di chuyển về phía cực dương của điện trường. Thêm vào đó một chất khử là
Mercaptoethanol hoặc Dithithreitol (DTT) để phá vỡ cầu nối disulfur (-S-S-). Nghĩa là sau khi xử lí với SDS, protein trở thành dạng phân tử
polymer không có cấu trúc. Đồng thời, SDS tạo thành lớp vỏ ion và làm phân tử protein tích điện âm đồng đều hơn. Nhờ đó, sự di chuyển trong
gel của các phân tử protein trong cùng điều kiện chỉ phụ thuộc vào kích thước. Những phân tử nhỏ hơn kích thước lỗ gel sẽ có thể di chuyển
xuyên qua gel, trong khi đó những phân tử lớn hơn lỗ gel thì gần như không di chuyển. Những phân tử có kích thước trung bình di chuyển trong
gel với nhiều vận tốc khác nhau. Từ đó, ta có thể tách được hỗn hợp protein.
Khi không có SDS, điện di vẫn có thể phân tách các loại protein nhưng lúc này còn có các yếu tố khác nhau của các loại protein là trọng
lượng phân tử, tổng điện tích và điểm đẳng điện.

Hình 5: Gel polyacrylamide
Chuẩn bị gel phân tách và mẫu:
Gel polyacrylamide 10% được tạo ra bằng cách trùng hợp polyme hóa 33,5% acrymide (CH 2=CH-CH2)và 0.3% N,N’methylendiacrylamide [CH2(NHCOCH=CH2)2] với sự có mặt của chất xúc tác thích hợp. Chất xúc tác này là hỗn hợp amonium persufat 0.10.3% (khối lượng) và N,N,N’,N’- tetramethylen ethylen diamin (TMED)... Thành phần của gel phân tích bao gồm: 12ml dung dịch acrylamide/
bisacrylamide, 15.2ml dung dịch đệm Tris HCl 1M (pH=9.0), 0.4ml dung dịch SDS 10%, 11.2 ml nước cất, 1ml ammonium persulfate 3% và
20ml TMED. Ngoài ra ta cũng có thể chuẩn bị gel phân tích gồm: 1.3ml dung dịch acrylamide 4% (30% acrylamide và 0.44% N,N’methylendiacrylamide), 2.5 ml dung dịch đệm Tris HCl 1M (pH= 6.8), 0.1 ml dung dịch SDS 10%, 6.1 ml nước cất, 0.1ml ammonium persulfate
3% và 20µL TMED.
Dung dịch đệm điện di bao gồm: 25 mM Tris, 192 mM glycine, 0.1% SDS (pH=8.3).
Mẫu sẽ được phối trộn với 2 lần thể tích dung môi đệm (0.25 M dung dịch Tris-HCl (pH=6.8), 10% β-mercaptoethanol, 4% SDS, 20%
glycerol và 0.004% bromophenol blue, dung môi này được bảo quản ở nhiệt độ -70ºC trước khi sử dụng) và được đun nóng 3 phút trước khi chạy
điện di trên gel.
Cách thực hiện:
Tạo khuôn bản gel: gel polyacrylamide thường được đặt đứng, để chế gel cần sử dụng các tấm thủy tinh có kết cấu chuyên dụng để làm

khuôn.
Rửa sạch các tấm thủy tinh bằng nước sạch, để khô rồi lau lại bằng ethanol. Ráp các tấm thủy tinh theo hướng dẫn của hãng sản xuất sao
cho tạo được khoảng hở giữa hai tấm thủy tinh được bịt kín để không làm chảy nguyên liệu tạo gel khi rót vào.
Tiến hành bơm gel polyacrylamide vào khuôn thủy tinh. Sau 15-30 phút, gel gần cứng tiến hành bơm dung dịch điện di vào hai buồng điện
di, bơm 5-15 µm mẫu vào giếng theo thứ tự, đậy hộp điện di, đóng điện và tiến hành chạy điện ổn định dòng 2 mA/ giếng. Khoảng 1h sau khi
vạch màu chỉ thị xuống gần dưới đáy của gel, tách điện và lấy gel ra nhuộm.
Sau khi điện di xong, lấy gel ra khỏi tấm kính. Ngâm gel trong dung dịch đĩa petri có thuốc nhuộm protein (coomassie brilliant blue,
methanol, acid acetic, nước cất), lay động nhẹ cho đến khi thuốc nhuộm thấm vào gel, thời gian ngâm từ 1-4 giờ.
Chuyển gel sang dung dịch rửa màu (methanol 400ml, acid acetic 70ml, nước cất vừa đủ 1 lít), thay dung dịch rửa mới vài lần cho đến khi
gel có màu trong suốt, lúc này sẽ xuất hiện những vạch lơ xanh trên gel, chụp ảnh gel và lưu lại. Dựa vào mẫu và nhận xét.

2.8

Sắc kí bản mỏng

Nhóm 6

Trang 6


Bài báo về biến tính tinh bột bằng cyclomaltodextrinase

GVHD: Nguyễn Minh Hải

Sắc ký bản mỏng là một kỹ thuật tách các chất được tiến hành khi cho pha động di chuyển qua pha tĩnh trên đó đã đặt hỗn hợp các chất cần
tách. Pha tĩnh là chất hấp phụ được chọn phù hợp theo từng yêu cầu phân tích, được trải thành bản mỏng đồng nhất và được cố định trên các
phiến kính hoặc phiến kim loại. Pha động là một hệ dung môi đơn hoặc đa thành phần được trộn với nhau theo tỷ lệ quy định trong từng chuyên
luận. Trong quá trình di chuyển qua lớp hấp phụ, các cấu tử trong hỗn hợp mẫu thử được di chuyển trên bản mỏng, theo hướng pha động, với
những tốc độ khác nhau. Kết quả, ta thu được một sắc ký đồ trên bản mỏng. Cơ chế của sự chia tách có thể là cơ chế hấp phụ, phân bố, trao đổi
ion, sàng lọc phân tử hay sự phối hợp đồng thời của nhiều cơ chế tùy thuộc vào tính chất của chất làm pha tĩnh và dung môi làm pha động. [5]

Ðại lượng đặc trưng cho mức độ di chuyển của chất phân tích là hệ số di chuyển Rf được tính bằng tỷ lệ giữa khoảng dịch chuyển của chất
thử và khoảng dịch chuyển của dung môi:

Trong đó:

♣

a là khoảng cách từ điểm xuất phát đến tâm của vết mẫu thử, tính bằng cm.

♣

b là khoảng cách từ điểm xuất phát đến mức dung môi đo trên cùng đường đi của vết, tính bằng cm.

♣

Rf: Chỉ có giá trị từ 0 đến l.
Cách tiến hành
Dụng cụ:

♣

Bình triển khai, thường bằng thuỷ tinh trong suốt có kích thước phù hợp với các phiến kính cần dùng và có nắp đậy kín.

♣

Ðèn tử ngoại, phát các bức xạ có bước sóng ngắn 254 nm và bước sóng dài 365 nm.

♣

Dụng cụ để phun thuốc thử.

♣

Tủ sấy điều nhiệt để hoạt hóa và sấy bản mỏng và sắc ký đồ, hoặc để sấy nóng đối với một số phản ứng phát hiện.

♣

Tủ hút hơi độc.

♣

Máy sấy dùng để sấy khô sắc ký đồ và cho phép chấm nhanh nhiều lần những dung dịch pha loãng chất cần phân tích.

♣

Một máy ảnh thích hợp (với ống kính Macro) có thể chụp lưu giữ sắc ký đồ ở ánh sáng ban ngày với khoảng cách 30-50 cm.

♣

Tủ lạnh để bảo quản những thuốc thử dễ hỏng.

♣

Micropipet nhiều cỡ từ l, 2, 5, 10 đến 20 ml, các ống mao quản hoặc dụng cụ thích hợp.

♣

Bản mỏng tráng sẵn chất hấp phụ có chất phát quang thích hợp.

♣

Trường hợp phòng thí nghiệm không có điều kiện trang bị các loại bản mỏng tráng sẵn thì tự chuẩn bị lấy bản mỏng với các dụng cụ sau đây:

♣

Các tấm kính phẳng có kích thước phù hợp đã được xử lý trước bằng hóa chất rồi rửa sạch bằng nước và sấy khô.

♣

Thiết bị trải chất hấp phụ lên tấm kính thành một bản mỏng đồng đều, có chiều dày thích hợp.

♣

Giá để xếp các tấm kính đã trải.
Chuẩn bị bản mỏng
Bản mỏng chứa chất hấp phụ dạng bột mịn, được phủ thành một bản mỏng gắn trên các bản mỏng dùng làm giá mang bằng kính, nhôm
hoặc bằng plastic.
Sắp xếp các bản mỏng và chuẩn bị thiết bị: Các phiến kính phải được lau chùi cẩn thận và tẩy sạch hoàn toàn các chất béo bằng cách ngâm
trong dung dịch sulfocromic. Sau đó, cọ kỹ bằng bàn chải dưới tia nước máy rồi tráng nước cất và sấy khô trên giá ở nhiệt độ thường hay trong tủ
sấy.

Nhóm 6

Trang 7


Bài báo về biến tính tinh bột bằng cyclomaltodextrinase

GVHD: Nguyễn Minh Hải

Ðiều chế chất hấp phụ: Chất hấp phụ được chọn lọc sao cho phù hợp với yêu cầu phân tích như: Silicagel G, kieselguhr, cellulose, nhôm
oxyd, trong số đó silicagel G được dùng thông dụng nhất. Trộn 25g silicagel G với 50 ml nước cất và nhào trong cối hoặc lắc mạnh trong bình
nón có dung tích 200 - 250 ml, nút kín, trong 30 - 45 giây. Dịch treo tạo được ở dạng lỏng và đồng nhất, se lại trong vài phút sau đó, vì có bột bó.
Rót ngay vào thiết bị trải đã điều chỉnh độ dày cho bản mỏng khoảng 0,25 mm.
Ðể nguyên các phiến kính tại chỗ khoảng 10 phút tới khi mặt trên hết bóng, hoặc để khô tự nhiên qua đêm tại nhiệt độ phòng.
Hoạt hóa: Cho các bản mỏng đã khô mặt vào tủ sấy và sấy ở 105 - 110 oC trong 30 phút. Ðể nguội rồi bảo quản trong bình hút ẩm. Khi dùng,
nếu cần thì hoạt hóa lại bằng cách sấy ở 105-1100C trong 1 giờ rồi cạo bỏ một dải mỏng chất hấp phụ dọc hai bên cạnh của tấm kính.
Dung dịch phân tích: hòa tan hỗn hợp các chất trong dung môi thích hợp (thường là dung môi phân cực) để được dung dịch có nồng độ 1%.
Lượng chất hoặc hỗn hợp chất đưa lên bản mỏng có ý nghĩa quan trọng đối với hiệu quả tách sắc ký, đặc bịệt ảnh hưởng rất lớn đến trị số
Rf. Lượng chất quá lớn làm cho vết sắc ký lớn và kéo dài, khi đó, vết của các chất có trị số Rf gần nhau sẽ bị chồng lấp. Lượng chất nhỏ quá có
thể không phát hiện được do độ nhạy của thuốc thử không đủ (thông thường độ nhạy của các thuốc thử trên 0,005 mg). Lượng mẫu thông thường
cần đưa lên bản mỏng là 0,1 - 50 mg ở dạng dung dịch trong ether, c1oroform, nước hay dung môi thích hợp khác. Thể tích dung dịch từ 0,001 ml
đến 0,005 ml đối với trường hợp đưa mẫu lên bản mỏng dưới dạng điểm và từ 0,l - 0,2 ml khi đưa mẫu lên bản mỏng dưới dạng vạch như trong
trường hợp sắc ký điều chế. Ðối với sắc ký điều chế thì lượng chất có thể lên tới 10 - 50 mg. Ðối với các dung dịch có nồng độ rất loãng thì có thể
làm giàu trực tiếp trên bản mỏng bằng cách chấm nhiều lần ở cùng một vị trí và sấy khô sau mỗi lần chấm.
Dùng ống mao quản nhỏ hút dung dịch mẫu và chấm lên tuyến xuất phát sao cho các vệt cách nhau khoảng 1.5-2.0 cm và cách mép bên
khoảng 1.5-2.0 cm, đường kính vệt khoảng 2-3mm. Các vết ở bìa phải cách bờ bên của bản mỏng ít nhất 1 cm để tránh hiệu ứng bờ. Khi làm sắc
ký bản mỏng bán định lượng, độ chính xác của kết quả phân tích phụ thuộc rất nhiều vào độ chính xác của lượng chất thử đưa lên bản mỏng, tức
là thể tích dung dịch chấm lên bản mỏng. Do đó, với những trường hợp phân tích bán định lượng phải dùng các mao quản định mức chính xác.
Khi không cần định lượng dùng micropipet hoặc ống mảo quản thường.
Quá trình triển khai sắc kí được tiến hành trong bình kín chứa dung môi làm pha động (dung môi pha động gồm: n-butanol/acid acetic/
nước: 5:3:1) tại nhiệt độ phòng. Các bình khai triển thường là bình thủy tinh, hình hộp hay hình trụ, có nắp đậy kín, kích thước thay đổi tùy theo
yêu cầu của các bản mỏng sử dụng. Bão hòa hơi dung môi trong bình bằng cách lót giấy lọc xung quanh thành trong của bình, rồi rót một lượng
vừa đủ dung môi vào bình, lắc rồi để giấy lọc thấm đều dung môi. Lượng dung môi sử dụng sao cho sau khi thấm đều giấy lọc còn lại một lớp
dày khoảng 5 mm đến 10 mm ở đáy bình. Ðậy kín nắp bình và để yên 1 giờ ở nhiệt độ 20 - 25oC.
Triển khai sắc ký: Ðặt bản mỏng gần như thẳng đứng với bình triển khai, các vết chấm phải ở trên bề mặt của lớp dung môi khai triển. Ðậy
kín bình và để yên ở nhiệt độ không đổi. Sau khi triển khai sắc kí, bản mỏng sẽ được sấy khô và nhúng nhanh vào dung dịch thuốc hiện màu (3g
N-(1-naphthy)-ethylenediamine và 50ml H2SO4 chứa 1% methanol). Sau đó bản này sẽ được sấy khô ở 110ºC trong 10 phút.
Đánh giá: Quan sát các vết xuất hiện, tính giá trị Rf hoặc Rr và tiến hành định tính, phát hiện tạp chất hoặc định lượng như quy định.
Việc sắc ký bản mỏng được tiến hành trong điều kiện chuẩn hoá cho kết quả có độ tin cậy cao hơn. Hiện nay người ta thường tiến hành sắc

ký với sự giúp đỡ của hệ thống sắc ký bản mỏng hiệu năng cao (Planar chromatography - HPTLC).

Hình 6: Máy sắc kí bản mỏng

2.9

Sắc kí thẩm thấu gel (sắc kí lọc gel)

Nhóm 6

Trang 8


Bài báo về biến tính tinh bột bằng cyclomaltodextrinase

GVHD: Nguyễn Minh Hải

Nguyên lý:
Phương pháp sắc kí lọc gel được ứng dụng để tách hỗn hợp các chất dựa vào sự khác nhau về kích thước, hình dạng, cấu trúc không gian,
phân tử lượng. [6]
Quá trình triển khai sắc kí được thực hiện thông qua sự tương tác giữa 2 pha:
Pha tĩnh: các hạt gel có cấu trúc mở, chứa liên kết ngang tạo thành mạng lưới không gian ba chiều được nhồi cố định trong cột. Bên ngoài
và bên trong hạt đều chứa những mao quản có kích thước nhỏ. Cả cột gel đều được giữ cân bằng bằng cách rửa qua dung dịch đệm.
Pha động: là hỗn hợp gồm các dịch enzyme và các hợp chất hòa tan khác có kích thước phân tử khác nhau được pha trong dung dịch đệm.
Dung dịch mẫu chứa enzyme và các cấu tử hòa tan (pha động) có kích thước khác nhau chạy qua cột. Những phân tử có kích thước lớn hơn
lỗ mao quản của gel thì không thể đi vào bên trong hạt gel, vì thế chúng di chuyển vào khoảng không gian giữa các hạt. Những phân tử có kích
thước nhỏ hơn thì có khả năng khuếch tán vào bên trong các hạt gel.
Tốc độ di chuyển của các phân tử có liên quan đến kích thước, cấu trúc không gian của phân tử. Các hạt có kích thước trung gian di chuyển
qua cột với vận tốc trung bình so với các phân tử có kích thước lớn và nhỏ. Chất rửa giải thường là dung dịch đệm, dung dịch này thường giúp
cho cấu tử ổn định và không bị biến tính.

Hình 7: Sắc ký thấm gel
Sự biến đổi của phân tử amylose và amylopectin được phân tích bằng kĩ thuật sắc kí thấm gel. Kĩ thuật này sử dụng những cột superdex 200
(10×300mm), superdex 30 (10×300mm). Quá trình rửa giải được thực hiện ở nhiệt độ phòng với dung dịch NaCl 100mM với tốc độ rửa giải là
0.7mL/phút. Những carbonhydrate được rửa giải sẽ được nhận biết bằng một đầu dò đo chỉ số khúc xạ.

2.10

HPAEC (kĩ thuật phân tích bằng sắc kí trao đổi ion hiệu năng cao)

Sản phẩm của quá trình thủy phân tinh bột gạo và tinh bột sáp được phân tích bằng việc sử dụng kĩ thuật HPAEC (high-performance anion
exchange chromatography). Kĩ thuật này có các đầu dò bằng điện và các loại cột nhồi để tiến hành phân tích. HPAEC có thể phân tách được
monosaccharides và oligosaccharide. Mẫu phân tích sau khi lọc sẽ được rửa giải bằng dung môi có chứa sodium acetate 600mM và 150 mM
NaOH.
Sự phát hiện dựa trên tính chất điện hóa của hợp chất rửa giải bằng detector xung ampe (PAD), và định lượng bằng việc so sánh với diện
tích pic của dung dịch chuẩn.
Thuốc thử: chỉ sử dụng thuốc thử đạt chất lượng tinh khiết phân tích, trừ khi có quy định khác và chỉ sử dụng nước cất hoặc nước đã loại
ion hoặc nước tinh khiết tương đương (NaOH, HCl, nước đã khử khoáng)
NaOH: 50% (m/m) dung dịch nước, thuốc thử chỉ chứa lượng tối thiểu natri cacbonat và thủy ngân. Không lắc hoặc khuấy dung dịch trước
khi sử dụng.
HCl: dung dịch tiêu chuẩn thể tích nồng độ 1mol/l.
Chất rửa giải: sử dụng nước khử khoáng 18MΩ.cm. Lọc nước đã khử khoáng qua màng lọc 0.2µm. Khử khí bằng cách sục khí Heli trong
khoảng 20-30 phút. Dùng pipet lấy 15.6 ml dung dịch NaOH cho vào 985 ml nước đã khử khí ở trên.

Nhóm 6

Trang 9


Bài báo về biến tính tinh bột bằng cyclomaltodextrinase

GVHD: Nguyễn Minh Hải

Lưu ý: Việc loại bỏ dioxit cacbon hòa tan từ các chất rửa giải ra trước khi dùng rất quan trọng. Cacbonat sẽ hoạt động như một sức đẩy
mạnh trên cột, kết quả làm giảm hẳn sự phân giải và hiệu quả phân tách. Chuấn bị dung dịch trong ngày trước khi phân tích.
Dung dịch tiêu chuẩn:
Chuẩn bị dung dịch: arabinoza, fructoza, galactoza, glucoza,... Cân mỗi cacbonhydrat khoảng 100mg, chính xác đến 0.1mg, cho vào các
bình định mức dung tích 100ml riêng rẽ và pha loãng bằng nước đến vạch. Khi biết thời gian lưu của mỗi cacbonhydrate ở các điều kiện sắc kí
thông thường, thì có thể chuẩn bị dung dịch tiêu chuẩn hỗn hợp từ các dung dịch tiêu chuẩn gốc riêng biệt.
Tiếp tục pha loãng dung dịch tiêu chuẩn để đạt được nồng độ carbohydrat giống với nồng độ trong mẫu.

Hình 8: Thiết bị HPAEC

2.11

Phân tích chiều dài mạch nhánh của phân tử amylopectin

Để tiến hành phân tích người ta chuẩn bị một hỗn hợp phản ứng gồm 0.5% amylopectin và CDase I-5 (1U/mg cơ chất). Hỗn hợp này được ủ
trong 3h ở nhiệt độ 50ºC và sau đó chiều dài của mạch sẽ được phân tích. Mẫu CDase-amylopectin đã được xử lý sẽ được tách lại với pullulanase
ở 60ºC trong 12 giờ. Các sản phẩn này sẽ được phân tích bởi HPAEC với cột CarboPac PA1 và một đầu dò điện. Quá trình rửa giải cũng được
thực hiện bởi 600mM dung dịch sodium acetate 0-70% trong 150mM NaOH. Tốc độ rửa giải là 1ml/phút.

2.12

Quét vi sai nhiệt lượng (DSC)

Differential scanning calorimetry (DSC) là một kỹ thuật phân tích nhiệt dựa trên sự khác biệt về nhiệt lượng cung cấp vào mẫu và được
khảo sát như một hàm của nhiệt độ. Các mẫu khảo sát đều được đặt gần nhau ở cùng nhiệt độ trong suốt quá trình khảo sát. [7]
Kỹ thuật này được phát triển bởi ES Watson và MJ O'Neill vào năm 1960 và giới thiệu thương mại tại Pittsburgh năm 1963 ở Hội nghị về
phân tích Hóa học và ứng dụng phổ.

Ứng dụng chủ yếu của DSC là nghiên cứu về trạng thái chuyển tiếp pha như: nhiệt độ chảy, nhiệt độ thuỷ tinh hoá, nhiệt độ phân huỷ.
Những trạng thái chuyển tiếp pha này liên quan đến sự thay đổi năng lượng hay khả năng hấp thu nhiệt, điều này có thể được kiểm tra của bộ
phận dò nhiệt trong thiết bị DSC.
Sự thoái hóa của mẫu gạo được nấu chín có thể được xác định bằng phương pháp quét vi sai nhiệt lượng sau khi lưu giữ mẫu trong vòng 7
ngày ở 4ºC. Thiết bị DSC được hiệu chuẩn bằng indium (156.6ºC, 28591j/g) và Sn (232.2ºC, 60.62 j/g). Nước cất được sử dụng như là một chất
tham khảo. Cân lượng tinh bột và cho vào nồi, sau đó gia nhiệt từ 20-120ºC (5ºC/ phút). Sự thoái hóa được thể hiện bằng việc tính toán giá trị
enthalpy trong vùng thu nhiệt, giữa đỉnh 40 và 80ºC.

Nhóm 6

Trang 10


Bài báo về biến tính tinh bột bằng cyclomaltodextrinase

GVHD: Nguyễn Minh Hải

Hình 9: Thiết bị DSC

3.
3.1

Kết quả và thảo luận
Sự tinh sạch protein cyclomaltodextrinase (CDase I-5)
Khối lượng phân tử của CDase I-5 tinh sạch khoảng 64kDa như được xác định bởi SDS-PAGE (Hình 1).Trọng lượng phân tử giống với
trọng lượng phân tử của enzyme maltogenic amylase (maltogenase).

Hình 10: Phương pháp SDS—PAGE

3.2

Ảnh hưởng của nhiệt độ và pH trên hoạt tính của CDase I-5
Phản ứng enzyme được thực hiện trong dung dịch đệm sodium phosphate có pH = 7. Nhiệt độ phản ứng tối ưu của CDase I-5 là 50ºC với cơ
chất là β-CD (Hình 11). Nhiệt độ tối ưu của maltogenic amylase khác như sau: BLMA 50ºC, BBMA 45ºC, BSMA 55ºC, Npase 55ºC từ vi khuẩn
Bacillus stearothermophillus IMA6503, BTMA 70ºC, ThMA 60ºC và EFMA 45ºC.
Hoạt động của CDase I-5 ở các pH khác nhau được xác định trong dung dịch đệm sodium phosphate (pH 6—8) và hoạt tính enzyme cao
nhất ở pH 7.5 trên β-CD (Hình 11). Dung dịch đệm sodium phosphate (50mM, pH 7.5) cũng được chọn cho sự mô tả rõ hơn về enzyme.

Nhóm 6

Trang 11


Bài báo về biến tính tinh bột bằng cyclomaltodextrinase

GVHD: Nguyễn Minh Hải

Hình 11: Ảnh hưởng của nhiệt độ và pH đối với hoạt động của enzyme

3.3

Nghiên cứu động học trên sự thủy phân nhiều cơ chất khác nhau
Tốc độ thủy phân của CDase I-5 đối với β-CD, amylose và amylopectin được xác định và tổng kết trong bảng sau.
Bảng 2: Thông số động học của CDase I-5 trên những cơ chất khác nhau

Nhóm 6

Trang 12

Bài báo về biến tính tinh bột bằng cyclomaltodextrinase

GVHD: Nguyễn Minh Hải

Amylose cho thấy giá trị kcat/Km cao gấp 16 lần so với amylopectin. Đặc điểm này bắt nguồn từ cấu trúc bậc 4 khác thường của nó, trong đó
sản phẩm thủy phân được giải phóng từ một trung tâm hoạt động trên một bộ phận được chấp nhận nhanh chóng vào trung tâm hoạt động khác
của cùng một nhóm. Qua sự sắp xếp không gian của trung tâm hoạt động trong bộ phận siêu phân tử, CDase I-5 dạng dodecameric thuận lợi hơn
để phân biệt phân tử trong giới hạn kích thước. Vì vậy, hình dạng đường thẳng của phân tử amylose có thể dễ dàng vào trung tâm hoạt động của
CDase I-5 hơn là amylopectin, gây ra tính đặc hiệu cao trên CDase I-5.

3.4

Phân tích bằng phương pháp sắc kí bản mỏng và sắc kí thẩm thấu gel
Amylose và amylopectin thương mại được sử dụng như cơ chất để nghiên cứu hoạt động của CDase I-5 trên thành phần tinh bột. Phản ứng
enzyme bắt đầu khi cho 1U/mg cơ chất của CDase I-5 vào 0.25% (w/v) amylose hoặc 0.25% amylopectin trong 50 mM dung dịch đệm sodium
phosphate (pH 7.5). Sự phân tán của amylose và amylopectin khoai tây (mỗi loại khoảng 2%, w/v) trong 90% DMSO được chuẩn bị và chưng cất
bằng nước đã được tách ion, sau đó được sử dụng để xử lý enzyme. Sau khi ủ ở nhiệt độ 50 0C trong thời gian 0.5, 1, 5 và 24h, một phần hỗn hợp
phản ứng được lấy ra, phản ứng ngừng lại khi bị đun sôi trong 5 phút. Sản phẩm thủy phân của amylose và amylopectin bằng enzyme CDase I-5
được mô tả bằng sự phân tích của TCL. Maltose và glucose là những sản phẩm thủy phân chủ yếu của amylose khi sử dụng enzyme CDase I-5
trong khoảng thời gian phản ứng 24h. Tuy nhiên, những sản phẩm bị biến đổi ít khi được phát hiện từ việc thủy phân amylopectin. Những kết quả
nghiên cứu cho thấy CDase I-5 có xu hướng làm biến đổi amylose hơn là amylopectin, điều này làm cho CDase I-5 khác biệt so với các loại
enzyme thủy phân amylose khác.
Sự thay đổi trong sự phân bố khối lượng phân tử của amylose/amylopectin gây ra bởi phản ứng CDase I-5 cũng được phân tích bằng sắc kí
thẩm thấu gel. Mẫu được lấy ở các thời gian ủ khác nhau (0.5, 1, 5, 24h) và cho vào cột Superdex 200 (10×300 mm). Trong 0.5h đầu tiên,
amylose bị thoái nhanh chóng và điểm cực đại của amylose dần dần thay đổi khi phân tích trong thời gian dài. Khi thời gian phản ứng đạt 1h, hầu
hết các cấu tử của amylose bị biến mất. Tuy nhiên, trong phương pháp sử dụng CDase I-5, điểm cực đại của amylopectin không bị ảnh hưởng,
thậm chí khi chúng ta duy trì thời gian phản ứng đến 25h. Sự thay đổi trong sự phân bố khối lượng phân tử do phản ứng enzyme gây ra chứng tỏ
rằng CDase I-5 có khả năng gây biến đổi có chọn lọc đối với amylose hơn là amylopectin. Hiện tượng tương tự đối với tinh bột gạo và sáp (tinh
bột chỉ chứa amylopectin), điều này cho thấy tính đặc thù cao của enzyme CDase đối với amylose thậm chí khi có mặt amylopectin. Những kết
quả của các cuộc nghiên cứu cho thấy enzyme CDase I-5 là ứng cử viên tiềm năng được sử dụng để sản sinh tinh bột hàm lượng amylose thấp

bằng việc loại bỏ hoặc làm giảm lượng amylose trong tinh bột.

Nhóm 6

Trang 13


Bài báo về biến tính tinh bột bằng cyclomaltodextrinase

GVHD: Nguyễn Minh Hải

Hình 12: Phân tích sản phẩm thủy phân từ amylose và amylopectin với CDase I-5 bằng phương pháp sắc kí bản mỏng (TLC) và sắc kí thẩm
thấu gel (GPC)
A: Phân tích hỗn hợp phản ứng có 0.25% amylopectin bằng TLC
B: Phân tích hỗn hợp phản ứng có 0.25% amylose bằng TLC
C: Phân tích hỗn hợp phản ứng có 0.25% amylopectin bằng GPC
D: Phân tích hỗn hợp phản ứng có 0.25% amylose bằng GPC

3.5

Xác định hàm lượng các thành phần tinh bột
Từ những kết quả đã đề cập trước, ta có thể kết luận rằng amylose được thủy phân có chọn lọc bởi CDase 1-5, ngay cả khi có mặt
amylopectin. Những biến đổi của các thành phần có trong tinh bột do phản ứng 1-5 CDase được tóm tắt trong bảng sau.
Bảng 3: Xác định các thành phần tinh bột trong suốt quá trình diễn ra phản ứng CDase I-5 (hỗn hợp phản ứng bao gồm tinh bột gạo 0,5%
và CDase 1-5 (1 U/mg cơ chất) trong 50 mM dung dịch đệm Na3PO4)

Nhóm 6

Trang 14

Bài báo về biến tính tinh bột bằng cyclomaltodextrinase

GVHD: Nguyễn Minh Hải

Khi thời gian phản ứng diễn ra, một phần amylose giảm dần dưới tác dụng của enzyme trong khi một phần lượng đường khử tăng lên tương
ứng với lượng amylose bị giảm. Cả lượng amylose bị giảm và lượng đường khử tăng lên đo được đều tương ứng với nhau, điều này cho thấy
lượng đường khử được sinh ra hầu như chủ yếu là do amylose và phần amylopectin không bị ảnh hưởng trong suốt giai đoạn phản ứng.

3.6

Ảnh hưởng của CDase I-5 trên chuỗi amylopectin
Sự thay đổi trên chiều dài chuỗi amylopectin đã được nghiên cứu bằng cách sử dụng HPAEC sau khi xử lý với pullulanase, và tỷ lệ phần
trăm diện tích đỉnh từ DP 5 đến DP 30 được tính trong khoảng thời gian phản ứng (hình 13). Có rất ít sự khác biệt về sự sắp xếp trên chiều dài
chuỗi giữa amylopectin được kiểm soát và amylopectin được xử lý bằng CDase 1-5, điều này cho thấy enzyme này ít ảnh hưởng đến độ dài chuỗi
amylopectin. Ta chỉ thấy sự tăng nhẹ trong tỷ lệ tương đối của các chuỗi ngắn (ít hơn DP 13) trong quá trình xử lý CDase I-5.

Hình 13: Khoảng phần trăm của chuỗi AP từ DP2-DP30

3.7

Hiệu

quả

của

việc

xử

lý

CDase

I-5

trên

sự

thoái

hóa

của

tinh

bột

gạo

o

Trong biểu đồ nhiệt DCS, đỉnh thu nhiệt đầu tiên của tinh bột hồ hóa và được lưu trữ vào khoảng 40-60 C, gọi là sự thu nhiệt cũ, bắt nguồn từ
sự tan chảy của amylopectin tái kết tinh. Thành phần amylose trong tinh bột bị thoái hóa nhanh, tiếp theo là sự tái kết tinh chậm của thành phần
amylopectin theo thời gian.
Amylose chịu trách nhiệm về sự thoái hóa ngắn hạn và cũng tham gia vào việc kết hợp xoắn kép của chuỗi amylose và amylopectin trong
giai đoạn sau, góp phần điều phối sự thoái hóa. Do đó, amylose đóng góp một cách sâu sắc đến sự thoái hóa tinh bột và tốc độ thoái hóa phụ

thuộc rất nhiều vào hàm lượng amylose cũng như amylopectin.

Nhóm 6

Trang 15


Bài báo về biến tính tinh bột bằng cyclomaltodextrinase

GVHD: Nguyễn Minh Hải

Hình 14: Biểu đồ nhiệt DSC của gạo đã nấu chín sau 7 ngày lưu trữ ở 4oC. Đỉnh thu nhiệt đại diện cho sự thoái hóa của tinh bột và entanpy
có thể được tính tại vùng đỉnh.
Khi kiểm tra tinh bột hồ hóa sau 7 ngày lưu trữ ở 4oC, tinh bột gạo cho thấy đỉnh thu nhiệt là 1,83 mJ/mg, trong khi mẫu tinh bột xử lý
CDase I-5 là 0,83 mJ/mg, bằng 45.4% của tinh bột gạo (Hình 14). Vì vậy, việc xử lý CDase I-5 làm chậm đáng kể sự thoái hóa của gạo nấu chín,
có thể do một lượng đáng kể amylose đã bị biến đổi bởi phản ứng enzyme. Hàm lượng amylose bị giảm có thể thay đổi sự sắp xếp bên trong giữa
amylose và amylopectin, kết quả là làm giảm đi sự thoái hóa của tinh bột.

4.

Kết luận
Enzyme CDase I-5 có xu hướng làm biến đổi amylose hơn là amylopectin, cụ thể là làm giảm hàm lượng amylose. Do đó ta có thể ứng
dụng đặc điểm này để sản xuất các loại tinh bột có hàm lượng amylose thấp.
Tinh bột được xử lý CDase I-5 có khả năng bị thoái hóa chậm hơn tinh bột bình thường do đó giúp cải thiện sự ổn định gel, cảm quan,
dáng vẻ, cấu trúc cho tinh bột.

Tài liệu tham khảo:
[1] Lê Ngọc Tú và các cộng sự, Hóa sinh công nghiệp, NXB Khoa học và kỹ thuật, 2005.
[2] />[3], [6] Ngô Lâm Tuấn Anh, Bài giảng môn Phân tích thực phẩm, 2009.
[4] Tài liệu thí nghiệm Phân tích thực phẩm.

[5] />[7] />
Nhóm 6

Trang 16


Bài báo về biến tính tinh bột bằng cyclomaltodextrinase

Mục lục

Nhóm 6

Trang 17

GVHD: Nguyễn Minh Hải