Bài dịch kỹ thuật chuyển đổi bacillus subtilis cho sản xuất ethanol lactate dehydrogenase đóng vai trò chìa khóa trong chuyển hóa lên men

Trường Đại Học Khoa Học Tự Nhiên thành phố Hồ Chí Minh
Khoa Sinh Học
Ngành Công Nghệ Sinh Học
******

BÁO CÁO VI SINH
Bài Dịch:

KỸ THUẬT CHUYỂN ĐỔI BACILLUS SUBTILIS
CHO SẢN XUẤT ETHANOL
Lactate Dehydrogenase Đóng Vai Trò Chìa Khóa Trong Chuyển Hóa
Lên Men
Susana Romero,1 Enrique Merino,2 Francisco Bolívar,1 Guillermo Gosset,1 and
Alfredo Martinez1

Giáo viên hướng dẫn: TS. Võ Minh Trí
Nhóm 2

Thành phố Hồ Chí Minh
1


KỸ THUẬT CHUYỂN ĐỔI BACILLUS SUBTILIS
CHO SẢN XUẤT ETHANOL
Lactate Dehydrogenase Đóng Vai Trò Chìa Khóa Trong Chuyển Hóa Lên Men

TÓM TẮT
Dạng hoang dại của Bacillus subtilis lên men 20g/l glucose trong 48 giờ, sản
xuất lactate và butanediol, nhưng không có ethanol và acetate. Để xây dựng một
chủng B. subtilis sản xuất ethanol, tái tổ hợp tương đồng được sử dụng làm gián
đoạn gen (ldh) tự nhiên tổng hợp enzyme dehydrogenase lactate (LDH) bằng

cách gắn chèn vào bộ nhiễm sắc thể B. subtilis gen decacboxylase pyruvate (pdc)
và gen dehydrogenase II ancohol (adhB) của Zymomonas mobilis dưới sự điều
khiển của promoter gen ldh tự nhiên. Giá trị hoạt động của enzym PDC và
ADHII nội bào trong chủng B. subtilis BS35 được thiết kế giống như trong chủng
E.coli sản xuất ethanol. BS35 sản xuất được ethanol và butanediol. Tuy nhiên, sự
tăng trưởng tế bào và mức tiêu thụ glucose bị giảm còn 70 và 65%, tương ứng, so
với trong chủng ban đầu. Để loại bỏ sự sản xuất butanediol, gen acetolactate
synthase (alsS) bị làm bất hoạt. Trong chủng BS36 (BS35_alsS), sản xuất ethanol
đã được nâng cao, với năng xuất cao (89% theo lý thuyết), tuy nhiên, sự tăng
trưởng tế bào và mức tiêu thụ glucose còn thấp. Điều thú vị, đặc tính động học
của enzyme LDH từ B. subtilis cho thấy nó có khả năng oxi hóa NADH và
NADPH. Sự biểu hiện của transhydrogenase được mã hóa bởi gen udhA từ
E.coli đã cho phép khôi phục một phần tốc độ tăng trưởng tế bào và một khởi
đầu sớm sản xuất ethanol. Ngoài sự chuyển đổi pyruvate thành lactate và quá
trình oxi hóa NADH, một bổ sung quan trọng vào vai trò sinh lý của LDH cho
quá trình tiêu thụ glucose dưới điều kiện lên men được đề nghị. Nuôi cấy liên tục
chỉ ra rằng 8,9g/l có thể đạt được khi sử dụng chủng BS37 (BS37-alsS udhA).
Cho đến nay, đây là hàm lượng và sản lượng ethanol cao nhất được báo cáo với
một chủng B. subtilis.

GIỚI THIỆU CHUNG
Ethanol sản xuất từ nguồn tái tạo, chẳng hạn như sinh khối, là một sự lựa chọn
đầy hứa hẹn để cạnh tranh và dần dần thay thế các nhiên liệu hóa thạch không thể
phục hồi; nó có lợi thế đáng kể về tính bền vững, phát thải khí nhà kính thấp hơn, và
giảm chi phí. Hiện nay, nhiên liệu ethanol được sản xuất bằng cách sử dụng
Saccharomyces cerevisiae loài mà lên men sucrose từ mía hoặc đường từ bột bắp thủy
phân. Tuy nhiên, số lượng lớn các loại đường có sẵn trong sinh khối thực vật. Sinh
khối này là hỗn hợp phức tạp của polymer carbohydrate, chủ yếu là cellucose và
hemicellulose. Sử dụng Cellulose đòi hỏi trước tiên phải phá vỡ bằng enzyme để giải
phóng đường glucose, tuy nhiên, việc sử dụng các cellulase làm tăng chi phí sản xuất

ethanol.
Vi khuẩn gram dương có một số đặc điểm như khả năng chịu dựng được độ pH
tương đối thấp, nhiệt độ cao, đường cao, muối và nồng độ cồn, và các điều kiện khắc
nghiệt khác nhau, nên có thể được dùng để phát triển một chất xúc tác sinh học tiên
2


tiến và nâng cao khả năng cạnh tranh thương mại của nhiên liệu sản xuất ethanol. Một
số nhóm đã cố gắng phát triển các vi khuẩn gram dương sản xuất ethanol, nhưng với
sự thành công còn bị hạn chế.
Những operon pet lý thuyết khác nhau đã được xây dựng bằng cách sử dụng gen
pdc và adhB từ Zymomonas mobilis (vi khuẩn gram âm) hoặc bằng cách sử dụng gen
pdc từ Sarcina ventriculy (vi khuẩn gram dương) để biểu hiện trong những vector đơn
dòng hoặc đa dòng trong vi khuẩn gram dương. Trong một số trường hợp, chức năng
của enzyme pyruvate decacboxylaza (PDC) và alcohol dehydrogenase (ADH) đã
được phát hiện, mặc dù sản lượng ethanol tạo ra thấp hoặc không có.
Bacillus subtilis nói chung được công nhận là an toàn, chuyển hóa được nhiều loại
đường và có thể tổng hợp hiệu quả nhiều proteinases, vận chuyển chúng ra ngoài bằng
hệ thống tiết. Khả năng đó có tiềm năng được sử dụng để xuất cellulases, có thể phân
hủy chất thải thực vật, phóng thích cellobiose và glucose. Do đó những chủng B.
subtilis được thiết kế trong tương lai có thể tiêu thụ cả carbohydrate để sản xuất
ethanol. Thiết kế như vậy giúp giảm chi phí của nhiên liệu sản xuất ethanol. Tuy
nhiên trong điều kiện lên men, B. Subtilis sản xuất lactate, acetate, butanediol, và
lượng rất nhỏ ethanol từ glucose, amino acid, và puryvate. (Hình 1)

HÌNH 1: Những con đường lên men B. subtilis. Con đường phát sinh đã sử dụng
trong nghiên cứu này được đánh dấu bằng hình elip nét đứt. PDC và ADHII từ Z.
mobilis. ALDC (acetolactate decarboxylase), AR ( acetone reductase), PDH
( pyruvate dehdrogenase), CoA ( coenzyme A), ALDH (acetaldehyde
dehydrogenase), PTA ( phosphotransacetylase), ACK ( acetate kinase).

Lactate được sản xuất bằng cách khử puryvate, một phản ứng được xúc tác bằng
lactate dehydrogenase (LDH), đồng thời với quá trình oxy hóa một phân tử NADH thì
mỗi phân tử puryvate bị khử. Trong nghiên cứu này, các chuyển hóa lên men không
đồng nhất của B. subtilis đã được cải biến để thu được một chủng vi khuẩn gram
dương sản xuất ethanol như là sản phẩm lên men chính. Bằng cách bất hoạt gen
lactate dehydrogenase (ldh) thông qua sự gắn chèn vào nhiễm sắc thể gen pdc, adhB
3


của Z. mobilis và loại bỏ tổng hợp butadienol bằng cách chèn gen udhA.
transhydrogenase của E.coli vào vị trí của alsS, kết quả là chủng B. subtilis tái tổ hợp
sản xuất được ethanol là sản phẩm lên duy nhất.
Sự bất hoạt LDH làm cho chủng B. subtilis tăng trưởng không hoàn hảo bất
chấp sự bổ sung chất hóa học tương đương quá trình oxi hoa khử ( PDC- ADHII).
Chúng ta nhận thấy rằng LDH oxi hóa NADH thành NAD - và NADPH thành NADP-.
Giá trị Km biểu kiến của 2 cofactor được so sánh với giá trị Km cho NADH của LDH
của các vi khuẩn gram dương. Do đó một bổ sung quan trọng vào vai trò sinh lý của
LDH cho sự tiêu thụ glucose trong điều kiện lên men được đề nghị. Các kết quả thu
được đã chỉ ra rằng vai trò sinh lý quan trọng này của LDH cho sự tiêu thụ glucose
trong điều kiện lên men cần được xem xét trong việc phát triển những chủng B.
subtilis sản xuất ethanol mới.

VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
Các chủng B. subtilis và plasmid được sử dụng trong nghiên cứu này được liệt kê
trong bảng 1, và các oligonucletide trong bảng 2.

4

Để tránh điều kiện TRp, những tế bào B. subtilis WB700 khả nạp, được biến đổi
bằng cách sử dụng DNA của nhiễm sắc thể từ một chủng Trp-B.subtilis BSR1, những
dạng tổ hợp được chọn lọc trong môi trường vô cơ chứa glucose, và chủng tự dưỡng
được đặt tên CH1 (bảng 1). Chủng B. subtilis CH1 đã được sử dụng để xây dựng
những chủng B. subtilis sản xuất ethanol. Trong khi xây dựng chủng và plasmid,
chủng được phát triển trong môi trường agar Luria- Bertani (LB) có chứa kháng sinh
thích hợp. Các nồng độ kháng sinh cuối cùng có được như sau: 5_g/ml
chloramophenicol (Cm), 5_g/ml erythromycin (Ery), 5_g/ml lincomycin (Lâm),
100_g/ml spectinomycin(SPT), 10_g/ml tetracycline (Tc), 50_g/ml Kanamycin (Km),
và 100_g/ml ampicilin( Ap).
.
(i) Thao tác gen.
Quy trình thông thường được sử dụng cho việc chuẩn bị plasmid, cắt hạn chế,
nối, biến nạp, và điện di gel agaroses. E.coli XL1- Blue được sử dụng như vật chủ cho
việc xây dựng plasmids và tế bào được tăng trưởng trong môi trường LB. B. subtilis
được biến đổi bằng cách sử dụng phương pháp khả nạp tự nhiên. Gắn chèn hay cắt
đoạn nhiễm sắc thể được xác nhận bằng cách sử dụng kháng sinh đánh dấu thích hợp,
phân tích PCR và xét nghiệm các sản phẩm lên men.
(ii) Bất hoạt ldh và gắn chèn pdc, adhB của Z. mobilis vào nhiễm sắc thể .
Mồi đặc trưng được thiết kế để khuếch đại pdc và adhB (Bảng 2). Việc thiết kế
mồi phải kể đến trình tự consensus Shine- Dalgarno của B. subtilis và khỏang cách
bảo tồn giữa motif này và codon khởi đầu của mỗi gen. Gen pdc của Z. mobilis được
khuếch đại từ vetor pLOI276, sử dụng mồi 1 và 2, thu được những đoạn có kích thước
1.7 kb, sau đó được tạo dòng trong pCR-TOPO, tạo thành vetor IpTOPO-pdc. Gen
adhB của Z. mobilis, được theo sau bởi terminator của gen cryIIIA trong chủng
Bacillus thuringiensis (cryIIIAt) được khuếch đại. Trong lần PCR đầu tiên, sử dụng
mồi 3 và 4, gen adhB được khuếch đại bởi vetor pLOI284, chứa 1 nửa của cryIIIAt.
Trong PCR lần 2, sử dụng mồi 3 và 5, gen adhB được theo sau bởi terminator hoàn
chỉnh, được khuếch đại, phân đoạn PCR này được tạo dòng trong pCR-TOPO, tạo ra
pTOPO-adh-term.

Gen pdc được thu nhận từ đoạn gen dài 1.7 kb nằm giữa EcoRV- AscI trong vetor
IpTOPO-pdc. Đoạn này được nối vào vị trí giữa BamHI và AscI đã xử lý đầu bằng tại
vị trí trước gen adhB trong pTOPO-adh-term, thu được vector pTOPO-pdc-adh-term.
Gen pdc và adhB được thu nhận từ đoạn gen 2.88-kbp giữa EcoRI và NaeI từ
vector pTOPO-pdc-adh-term. Đoạn này được nối vào vị trí giữa EcoRI và HincII của
vector pSG- PLK, thu được vector pSG-operon. Plasmid này chứa gen pdc và adhB
theo sau bởi transcription terminator cryIIIAt và cassette kháng chloramphenicol (cat).

5


HÌNH 2: Các vector được xây dựng để bất hoạt (A) gen ldh của chủng B. subtilis
(ldhBs) bằng cách gắn chèn gen pdc (pcdZm) và adhB (adhBZm) của Z. mobilis vào
nhiễm sắc thể; (B) gen alsSBm bằng Stp cassette; (C) gen alsSBs bằng cách gắn chèn
gen udhA và Stp cassette của E. coli vào nhiễm sắc thể.
Gen ldh của B. subtilis được khuếch đại bằng PCR, sử dụng đoạn mồi 6 và 7, và
được tạo dòng tại vị trí HindII của plasmid pUC19 để tạo thành pUC-ldh.
Gen pdc và adhB thiếu promoter, cryIIIAt, và cat được thu nhận từ đoạn gen dài
4,5-kbp nằm giữa AccI được xử lý đầu bằng từ vector operon-pSG và được nối vào
vị trí của EcoRV trên gen ldh trong pUC-ldh, thu được plasmid pUCldh::operonCm(fig.2A).
Những tế bào B. subtilis CH1 khả nạp được biến đổi bằng cách đưa vào vector
pUC-ldh::operonCm; từ đó, gen pdc và adhB được gắn chèn vào ldh trên bộ gen của
chủng B. subtilis CH1 bởi việc tái tổ hợp tương đồng trên ldh vào bộ gen B. subtilis
dưới sự điều khiển của promoter ldh. B.subtilis tái tổ hợp được chọn lọc bởi Cmr và
được nhận biết bởi việc thiếu sự sản xuất lactate dưới điều kiện lên men. Chủng được
tạo thành là BS35.
(iii) Tạo dòng alsS và sự khử hoạt tính.

6

Gen alsS được khuếch đại từ bộ gen B.
subtilis bằng PCR sử dụng đoạn mồi 8 và 9.
Đoạn này được tạo dòng vào vector pCR-TOPO
để tạo thành vector pTOPO-alsS. Một đoạn 1,2kbp chứa Spt cassette được cắt ra bằng BamHIHindIII từ vector pCm::Spt (30). Sau đó đầu
cuối của Spt cassete được xử lý đầu bằng, Spt
cassete được nối vào vi trí SspI trên gen alsS
của pTOPO-alsS, tạo ra plasmid pTOPOalsS::Spt (fig. 2B). Sự bất hoạt gen alsS, bằng
cách chèn vào Spt cassete được thu nhận trong
plasmid này, được chuyển đến vị trí alsS của B.
subtilis bằng cách tái tổ hợp 2 gen tương đồng.
Kết quả của sự thay đổi alsS được chọn lọc bởi
môi trường kháng sinh Sptr và được nhận biết
bởi sự có mặt của 2,3-butanediol sản sinh dưới
điều kiện lên men. Chủng mới được đặt tên là
BS36. Chủng đột biến alsS CH1 được xây dựng
để đánh giá Km biểu kiến của LDH trong dịch
chiết tế bào của chủng B. subtilis. Plasmid
pTOPO-alsS::Spt được biến nạp vào những tế
bào khả nạp của chủng CH1. Chủng đột biến
alsS được chọn lọc bằng Sptr và được nhận biết
bởi sự có mặt của 2,3-butanediol sản sinh dưới
điều kiện lên men.
(iv) Sự bất hoạt alsS bằng việc kết hợp với
nhiễm sắc thể transhydrogenase (udhA).
Đoạn mồi được thiết kế để khuếch đại gen
udhA của E.coli bao gồm các nhân tố chuyển
đổi giống như sử dụng trong việc khuếch đại
gen pdc và adhB. Sản phẩm PCR bao gồm gen
udhA được khuếch đại từ bộ gen E.coli JM101

sử dụng đoạn mồi 10 và 11, được nối vào
pTOPO-alsS::Spt tại vị trí duy nhất SalI. Tạo
thành pTOPO-alsS::UdhA_Spt (fig.2C). Plasmid
này được biến nạp vào những tế bào B. subtilis
BS35 khả nạp; bằng cách đó gen udhA được gắn
chèn bằng cách tái tổ hợp 2 gen tương đồng trên
alsS vào nhiễm sắc thể B. subtilis BS35, dưới sự
điều khiển của mồi alsS cho phép sự biểu hiện
gen udhA. Chủng biến nạp được chọn lọc trong
đĩa agar môi trường LB-Spt. B. subtilis BS37
(BS35_alsS udhA_) được xác định bằng phương
pháp PCR khuếch đại gen udhA từ bộ gen của
chủng đột biến gen alsS và được nhận biết việc
thiếu sản phẩm lactate và butanediol dưới điều
kiện lên men.
HÌNH 3 : Đồ thị mô tả chủng B. subtilis dưới điều kiện lên men trong môi
trường LB có chứa glucose (20g/l). Sự hình thành khối lượng tế bào (A), sự tiêu thụ
glucose (B), lactate (C), butanediol (D), và sự sản xuất ethanol (E) từ chủng B.
7


subtilis CH1 (□), BS35 (Δ), BS36 (Ο), BS37 (◊), B. subtilis CH1 (■) thì được kể đến
như mẫu đối chứng, sử dụng môi trường LB mà không bổ sung glucose.
Chuẩn bị vật liệu cấy chuyền và điều kiện lên men.
Đĩa môi trường LB-glucose chứa 0.2% agar đã cấy tế bào được bảo quản ở 70 0C
trong glycerol và ủ qua đêm ở 370C. Những tế bào này được sử dụng để cấy vào lọ
500ml bao gồm 150ml nước cao thịt với 20g/l glucose. Lọ này được ủ qua đêm ở
370C và ly tâm 100vòng/ phút (rpm). Tế bào từ lọ được ly tâm và được sử dụng để đo
mật độ quang ở bước sóng 600nm(OD 600). Việc nuôi cấy được thực hiện bằng cách
nhân đôi trong lọ chứa nhỏ bao gồm 200ml môi trường LB bổ sung thêm 20g/l

glucose. Hoạt động trong điều kiện 350C, ly tâm 100vòng/phút , và pH 7 (điều chỉnh
bằng cách tự động thêm vào KOH 2N). Sự tăng trưởng được giám sát bằng cách đo
bước sóng 600nm (Lambda 11; Perkin Elmer, Pomona, CA). Mẫu được lấy ra một
cách định kỳ và đem đi ly tâm; phần nổi trên mặt được sử dụng cho những phân tích
xác định. Tế bào được điều chỉnh ở bước sóng 600nm được lấy ra sau 48h lên men, ly
tâm, và thử nghiệm hoạt tính của enzym.
Phương pháp phân tích.
Việc đo sinh khối bằng OD600 được ghi lại để tính trọng lượng khô của tế bào
(DCW) sử dụng 1 cuver chuẩn (1 OD600 _ 0.35 g DCW/liter). Hoạt tính của enzym
PDC và ADHII được thử nghiệm ở 30 0C sau đó protocol được biểu hiện trước. Hoạt
tính của LDH được thử nghiệm bằng cách sử dụng pyruvate, NADH, và sử dụng dung
dịch đệm cho thử nghiệm PDC. Giá trị Km biểu kiến được xác định trong dịch chiết tế
bào của B. subtilis CH1_alsS, những tế bào được thu nhận sau 48h lên men. B.
subtilis BS35 và BS36 được xem như mẫu đối chứng âm. Từ sự xác định giá trị Km
biểu kiến, nồng độ khác nhau của NADH (0-0.5mM) và NADPH (0-1.3mM) được
kiểm tra, với nồng độ pyruvate luôn là hằng số (0.5mM), sử dụng chất đệm tương tự
như sử dụng cho thử nghiệm của PDC ở 300C.
Nồng độ protein được xác định bằng việc sử dụng thuốc thử Bradford thương mại
theo sự chỉ dẫn của nhà sản xuất (Bio-Rad Laboratories, Inc., United States). Mức độ
glucose, lactate, và butanediol được đo bằng sắc ký lỏng áp suất cao và mức ethanol
bằng sắc ký khí như báo cáo trước đây.

KẾT QUẢ
B. subtilis sản xuất lactate và butanediol dưới điều kiện lên men. B. subtilis
chuyển hóa glucose dưới điều kiện lên men kỵ khí cho những sản phẩm khác nhau,
phụ thuộc vào điều kiện nuôi cấy, môi trường nuối cấy, và cuối cùng là chất nhận điện
tử cuối cùng (7, 10, 26). Việc thể hiện ranh giới của chủng sinh vật sử dụng chất vô
cơ CH1 được mô tả dưới điều kiện kỵ khí, sử dụng môi trường LB bổ sung thêm 20g/l
glucose. Trong 10h đầu nuôi cấy, B. subtilis CH1 phát triển theo hàm mũ, tạo ra 0.6g/l
khối lượng tế bào, sản xuất chủ yếu là lactate (4.7g/l) và 2,3-butanediol (1g/l).

8


Bảng 3. Những thông số về động lực học của chủng B. subtilis CH1 và những
dạng biến đổi dưới sự phát triển lên men trong LB với 20g glucose/l.
Bảng 3 đưa ra tóm tắt những giới hạn động học được xác định cho những môi
trường nuôi cấy. Trong pha ổn định, một lượng lớn lactate (14.5g/l) được tích lũy (fig
3 và bảng 3). Tốc độ tiêu thụ glucose đặc trưng giảm 75% so với tốc độ của pha theo
hàm mũ (pha log), và glucose được dùng hết trong 48h. Một lượng 0.5g/l 2,3butanediol được tạo ra. Ethanol, acetate, succinate, formate, và aceton không được tìm
thấy trong quá trình nuôi cấy.
B. subtilis CH1 được đưa ra như mẫu đối chứng, sử dụng môi trường không có
glucose. Tế bào CH1 phát triển theo hàm mũ, chỉ có 0.11g/l khối lượng tế bào và
0.8g/l lactate (fig3).
B. subtilis bao gồm gen pdc và adhB sản xuất ethanol, nhưng sự phân cắt ldh
làm giảm tốc độ biểu hiện và sự tiêu thụ glucose. Dựa vào khả năng sản xuất lactate
cao trong pha log và pha ổn định, promoter của ldh được xem như la 1 lựa chọn tốt sử
dụng để truyền tín hiệu cho việc biểu hiện của các gen khác nhau dưới điều kiện kỵ
khí. Vì vậy, promoter này được chọn lựa để truyền tín hiệu cho gen pdc và adhB được
biểu hiện trong nhiễm sắc thể của B. subtilis.
Sự biểu hiện của chủng BS35 (CH1 ldh::pdc-adhB) dưới điều kiện kỵ khí chỉ ra
rằng gen pdc và adhB khác loại đã được biểu hiện, chủ yếu là tổng hợp chức năng của
enzym.

Bảng 4. Các hoạt tính đặc trưng của enzyme PDC, ADH, LDH trong những
chủng B. subtilis
Bảng 4 đưa ra tóm tắt sự xác định hoạt tính của enzym PDC, ADHII, và LDH
trong chủng CH1 và BS35. Thật thú vị , sự gián đoạn của gen ldh làm suy yếu sự phát
triển của chủng BS35 (fig 3A), tốc độ phát triển giảm đi 70% so với chủng CH1, có
thể đó là hệ quả của việc giảm 65% tốc độ tiêu thụ glucose đặc trưng (fig.3B và bảng

3). Trong sự so sánh với tốc độ đặc trưng và chuẩn của việc sản xuất butanediol trong
chủng CH1, cuối cùng tốc độ đặc trưng và chuẩn của việc sản xuất butanediol được
giảm đi ở mức không đáng kể trong chủng BS35, nhưng việc sản xuất lactate hoàn
toàn bị hủy bỏ (bảng 3 và fig. 3C và D). Mặc dù tốc độ phát triển và sự tiêu thụ
glucose trong chủng BS35 bị làm giảm đi, nó sản xuất ethanol trong pha ổn định (fig
3E), với khả năng sản xuất đặc trưng 0.08g ethanol/g DCW/h (bảng 3). Thật thú vị, sự
tích tụ ethanol trong dịch nuôi cấy được tìm thấy sau 24h lên men, và 0.95g/l được thu
nhận sau 48h.
Sự kìm hãm tổng hợp butanediol tăng khả năng sản xuất ethanol. Sự tổng
hợp aceton từ pyruvate bao gồm 2 bước, được xúc tác bởi acetonlactate synthase
(ALSS) và acetonlatate decarboxylase (fig 1). Butanediol được hình thành từ sự khử
aceton (7). Theo cách đó, ALSS ngay lập tức cạnh tranh với PDC để lấy được
9


pyruvate trong chủng BS35. Kể từ lúc này sự tăng thêm pyruvate sẵn sàng, gen alsS
bị gián đoạn như đã được mô tả trong phần vật liệu và phương pháp. Thêm vào đó sự
bất hoạt gen alsS hoàn toàn hủy bỏ việc sản xuất butanediol (fig 3D) và cho phép sản
xuất mạnh mẽ ethanol trong 24h nuôi cấy (fig 3E). Tốc độ sản xuất ethanol đặc trưng
trong chủng BS36 tăng lên 50% so với chủng BS35 (bảng 3). Phân tích sự tiêu thụ
glucose và sản xuất ethanol trong pha ổn định (từ 12-48h) cho ra 1.5g/l ethanol từ việc
tiêu thụ 3g/l glucose. Giá trị này phù hợp đến 98% so với sản lượng lớn nhất của lý
thuyết (0.51g ethanol/g glucose). Trong sự so sánh với tốc độ của chủng CH1, tốc độ
và sự tiêu thụ glucose vẫn còn yếu.
L-LDH của B. Subtilis có thể dùng NADH và NADPH như là cofactor
Con đường sản xuất ethanol phát sinh trong chủng BS35 thì tương tự như con
đường sản xuất lactate vốn có trong chủng CH1 trong điều kiện tái oxi hóa NADH.
Tuy nhiên, như trình bày ở trên, mức độ phát triển và tiêu thụ glucose bị giảm khi con
đường tạo ra lactate tương ứng bị thay thế bởi con đường ethanol.
Để xác định cofactor đặc trưng của LDH, chúng ta xác định NADPH có phải là

cơ chất cho enzyme LDH trong B. subtilis hay không. Các cuộc thử nghiệm enzyme
đã phân tích rỏ ràng rằng cả NADH và NADPH là cơ chất cho LDH. Một cuộc kiểm
tra được tiến hành, dùng những tế bào của BS35 và BS36, cho thấy trong sự vắng mặt
của LDH, không có sự sản xuất NADPH nào được phát hiện.

BẢNG 5. Xác định hoạt động enzyme của LDH ở những chủng B. subtilis
hướng về 2 cofactor khác nhau.
Hơn nữa, để kiểm tra rằng chỉ có hoạt động của LDH đóng vai trò cho sự oxi
hóa NADPH thì ta xác định Km biểu kiến ( Michaelis_Meten affinity constant) trong
những tế bào thu nhận từ chủng B. subtilis ldh_alS (chủng CH1 đột biến alsS) ( bảng
1). Giá trị Km biểu kiến của LDH là 0.13 mM dối với NADH và 0.288 mM đối với
NADPH.
Sự biểu hiện của transhydrogenase làm tăng sự phát triển và giảm thời gian
khởi đầu cho việc sản xuất ethanol.
Gen udhA ở E. coli mã hoá cho transhydrogenase. Enzyme này làm tăng tốc độ
phản ứng ngược của việc khử sự tương đương giữa NADP - va NAD- theo sự cân
bằng sau: NADPH_NAD- NADP-_NADH.
Không có bật kì một gen giả định nào mã hoá cho transhydrogenase hoặc cũng
không có bật cứ một hệ thống enzyme có chức năng tương tự nào được nhận diện
trong bộ gen B. subtilis. Để xác định LDH có đóng vai trò duy trì sự cân bằng
NADPH/NADP- hay không, thì gen udhA từ E. coli được chèn vào nhiễm sắc thể của
B. sutilis BS35 làm gián đoạn gen alsS, cùng một lúc, nó sẽ chịu sự điều khiển của
của promoter alsS ( xem chi tiết ở Meterials nad Methods). Dưới những điều kiện
yếm khí, promoter alsS được cảm ứng trong suốt pha tăng trưởng và nó được duy trì
trong suốt pha ổn định. Tốc độ phát triển tăng 22% và mức độ tiêu thụ glucose tăng
10


59% trong pha tăng trưởng đã được xác định ( Fig. 3 và table 3); như dự đoán, không
có sự sản xuất butanediol. Sự sản xuất ethanol bắt đầu sau 6h nuôi cấy, và 2g/l ethanol

được sản xuất ở 48h, 4,1g glucose/l được tiêu thụ trong suốt thời gian này, chỉ ra rằng
năng suất chuyển đổi cao từ glucose thành ethanol (giá trị cao nhất theo lý thuyết là
96%)
B. subtilis có thể sản xuất lactate và butanediol từ môi trường giàu dinh
dưỡng.
Những kết quả với chủng CH1 ban đầu chỉ ra rằng năng suấtt cao hơn đã đạt
được trong sự so sánh với lượng glucose tiêu thụ, cho rằng năng suất cao nhất theo lý
thuyết của lactate và butanediol từ glucose là 1.0g lactate/g glucose và 0.5g
butanediol/g glucose. Ngoài ra một ít lactate được chủng CH1 sản xuất trong môi
trường LB không có glucose. Những kết quả này cho thấy các thành phần từ môi
trường giàu dinh dưỡng được dùng để tích lũy sinh khối tế bào và tổng hợp những sản
phẩm lên men. Hơn nữa, môi trường LB được bổ sung glucose phát sinh sự giảm
năng lựơng của chủng CH1, để tạo ra một lượng lớn lactate nà butanediol. Mặt khác,
BS35 sản xuất 0.95g ethanol/l và 3.8g butanediol/l. Sau sự bất hoạt enzyme ALSS ở
chủng BS36, không có butanediol chỉ có 1.5g ethanol/l được sản xuất ở 48h; chỉ sản
xuất ethanol hơn chủng BS35 0.65g ethanol/l và một lượng lớn hơn được dự đoán,
Dựa vào carbon, 2mol pyruvate được dùng để sản xuất 1mol butanediol, nhưng chỉ
dùng 1 mol NADH. So sánh, 2mol pyruvate và NADH được dùng để chuyển thành 2
mol ethanol. Do đó, trong những điều kiện năng lượng giảm. Mặc dù một lượng lớn
carbon có sẵn để sản xuất ethanol có thể tồn tại trong chủng BS36, nhưng sự giảm về
năng lượng vẫn giới hạn sự sản xuất ethanol. Từ những kết quả này đã đề xuất rằng
BS35 sản xuất butanediol từ nguồn carbon trong môi trường giàu dinh dưỡng với sự
giảm năng lượng ít hơn glucose. Ngoài ra sự bất hoạt ldh làm giảm sinh khối tế bào,
nhưng một lượng nhỏ glucose tiêu thụ được chuyển đổi thành ethanol ở chủng BS36
và BS37. Trong những trường hợp này, người ta cho rằng những thành phần từ môi
trường LB chỉ dùng cho sinh khối tế bào. BS37 cũng mọc được trong môi trường LB
không glucose, và sinh khối là 0.19g/l (tương tự đã được tìm thấy ở 12h đầu tiên ở
môi trường có glucose; không có ethanol được sản xuất trong điều kiện này. Những
kết quả này cho thấy rằng những thành phần từ môi trường giàu dinh dưỡng được
dùng để tích lũy sinh khối tế bào, và ethanol đạt đuợc ở chủng BS36 và BS37 được

tổng hợp từ sự tiêu thụ glucose.
Pyruvate ngoại sinh được chuyển đổi thành ethanol, tăng mức độ phát
triển.
B. subtilis phát triển chậm ở điều kịện yếm khí trong môi trường glucose-MM.
Tuy nhiên, khi môi trường glucose-MM được bổ sung pyruvate hoặc amino acid, B.
subtilis có thể phát triển ở điều kiện yếm khí, sản xuất lactate, acetate, butanediol.
Thông thường để kiểm tra pyruvate có sẵn hay hoạt động của PDC và ADHII giới hạn
sự phát triển yếm khí của BS37 trong môi trường giàu dinh dưỡng( LB), môi trường
LB-glucose được bổ sung 2g pyruvate/l. Người ta cho rằng glucose và pyruvate cùng
được chuyển hóa trong suốt pha tăng trưởng. Ở pha này, pyruvate và glucose được
tiêu thụ ở mức độ như nhau. Mức độ phát triển của BS37 tăng lên từ 0.11 h_ 1(bảng 3)
lên 0.27 h_1 khi pyruvate được thêm vào ( fig. 3 and 4). Pyruvate được dùng hết ở 12
giờ, trùng với sự kết thúc ở pha tăng trưởng.

11


HÌNH 4: Đồ thị mô tả chủng B.
subtilis BS37 trong môi trường LB bổ
sung glucose (20g/l) và pyruvate (2g/l)
dưới điều kiện lên men. Khối lượng tế
bào (□), tiêu thụ glucose (Ο), tiêu thụ
pyruvate ( ),và sự sản xuất ethanol
(◊).

HÌNH 5: Thời gian lên men của
B. subtilis BS37 trong môi trường LB
bổ sung glucose (20g/l). Khối lượng tế
bào (□), tiêu thụ glucose (Ο), và sự sản
xuất ethanol (◊).

Sự sản xuất ethanol bắt đầu sau 6 giờ nuôi cấy, mức độ sản xuất ethanol là 0.9g
ethanol/g DCW/h khi glucose và pyruvate được tiêu thụ đồng thời. Mức độ này thì
tương tự với mức độ sản xuất ethanol của sinh vật sản xuất ethanol như E. coli KO11
và nấm men. Trong những điều kiện mol, tổng mức độ glucose và pyruvate tiêu thụ
thì tương đương với mức độ sản xuất ethanol (19 versus 22 mmmol ethnol/g DCW/h),
chỉ ra rằng những mức PDC và ADHII ở BS37 thì không giới hạn sự sản xuất ethanol;
do đó, mức độ biểu hiện của những enzyme này không phải là lý do cho sự tiêu thụ
glucose và sự suy giảm về tăng trưởng. Sau khi pyruvate được dùng hết, 3.5g
glucose/l được tiêu thụ, 1.6g ethanol/l được sản xuất (năng suất lý thuyết 90%).
Trong môi trường nuôi cấy liên tục, B. subtilis BS37 sản xuất 8.9g/l ethanol
từ glucose. Sự phát triển và tạo thành những sản phẩm từ chủng BS37 được biểu thị
đặc điểm trong dịch môi trường LB với 2g/l glucose dưới những điều kiện yếm khí
trong môi trường nuồi cấy liên tục. Ở bốn ngày đầu tiên, BS37 sản xuất ethanol
(3.6g/l) từ glucose (7.5g/l) với năng suất cao (95% theo lý thuyết). Mặc dù mức độ
đặc trưng cho sản xuất ethanol thấp, nó thì không thay đổi trong suốt 9 ngày ở môi
trường mẻ. Do đó, B. sutilis BS37 sản xuất 8.9g ethanol/l từ 20.3g glucose/l, mặc dù
hiệu suất sản xuất ethanol thấp hơn trong những ngày cuối, nguyên nhân hiệu suất
thấp ở những ngày cuối do sự bốc hơi ethanol. Sự tạo thành ethanol trong suốt 9 ngày
chỉ ra rằng PDC và ADHII có chức năng trong thời kì dài này.

THẢO LUẬN
Một vài nhóm nghiên cứu đã cố gắng phát triển vi khuẩn gram dương sản xuất
ethanol bằng kỹ thuật lên men vi khuẩn lactic của loài Corynebacteria và Bacillus.
Tuy nhiên chỉ có rất ít hoặc không có ethanol được sản xuất bởi các vi sinh vật tái tổ
hợp này.
Barbosa và Iagram đã cố gắng biểu hiện gen pdc và adhB của Z. mobilis bằng
cách sử dụng vector đa dòng trong B. subtilis. Bằng cách sử dụng phương pháp phân
12

tích Western Blot, họ đã thấy rằng mặc dù cả hai loại protein đều được tổng hợp trong
B. subtilis, nhưng không có hoạt tính enzyme hay là việc sản xuất ethanol không diễn
ra.
Talarico và cộng sự đã xây dựng những operon lý thuyết khác nhau bằng cách sử
dụng gen pdc từ vi khuẩn gram dương và gram âm, và từ chủng Saccharomyces
cerevisize, để được biểu hiện trong vector đa dòng của Bacillus megaterium. Họ cho
rằng mức độ hoạt động khác nhau của enzyme PDC trong mỗi nguồn cho biết tầm
quan trọng của sự khác nhau trong cách sử dụng codon giữa vi khuẩn gram dương và
vi khuẩn gram âm. Mặc dù, enzyme PDC và ADH có hoạt tính trong chủng B.
megaterium tái tổ hợp, việc sản xuất ethanol in vivo bị vô hiệu và trong thử nghiệm in
vitro thì cần thiết để chứng minh việc sản xuất ethanol từ pyruvate.
Enzyme LHD đóng vai trò phức tạp trong quá trình chuyển hóa lên men của
B. subtilis
Người ta thấy rằng sự bất hoạt gen ldh làm giảm tốc độ tăng trưởng của B.
subtilic dưới điều kiện lên men. Trong nghiên cứu hiện nay, với việc thay thế hoạt
động kết hợp của hai enzyme PDC và ADH cho hoạt động của enzyme LDH, chúng
ta đã cố gắng duy trì sự cân bằng thế oxi hóa khử NADH/NAD -. Tuy nhiên sự tiêu thụ
glucose và tốc độ tăng trưởng của chủng B. subtilis đột biến ldh đã bị làm giảm đi.
Hai giả thuyết có thể giải thích hiện tượng này:
Thứ 1, mức độ hoạt động của enzyme PDC và ADHII không đủ khả năng để thay
thế cho hoạt tính của enzyme LDH ban đầu, vì vậy, sự cân bằng thế oxi hóa khử
NADH/NAD- trong chủng này có thể bị hạn chế. Tuy nhiên, enzyme PDC và ADH
trong Z. mobilis được nhận thấy có chức năng trong B. subtilis, với mức hoạt tính
tương tự như trong chủng E.coli sản xuất ethanol. Việc bổ sung pyruvate làm tăng
32% trong mức tiêu thụ glucose. Ngoài ra, người ta cũng cho biết rằng hoạt động của
những enzyme này có thể sản xuất ethanol với một tốc độ tương tự như E.coli KO11
và nấm men sản xuất ethanol đã được báo cáo (0.9 g ethanol/g DCW/h). Điều này giải
thích tiềm năng của việc sản xuất ethanol từ BS37 và rút ra khả năng về hoạt tính của
enzyme PDC và ADH thì không đủ để hỗ trợ sự tăng trưởng trong điều kiện kị khí

của B. subtilis.
Thứ 2, enzyme LDH của B. subtilis có thể đóng góp vào việc duy trì sự cân bằng
thế oxi hóa khử NADPH/NADP- dưới điều kiện lên men. Người ta nhận thấy rằng
enzyme LDH trong B. subtilis oxi hóa NADH thành NAD- . Nhiều tài liệu đã chứng
minh rằng enzyme LDH trong B. subtilis có thể sử dụng cả NADH và NADPH như là
những cofactor, mặc dù giá trị Km biểu kiến của enzyme LDH chỉ ra một sự bắt buộc
có tính ưu tiên NADH hơn là NADPH. Giá trị Km cho NADH thì tương tự như giá trị
đã được báo cáo bởi Yoshida. Giá trị Km của enzyme LDH đối với NADH của những
vi khuẩn gram dương khác nhau nằm trong dãy từ 0,001 đến 0,22mM. Trong đó,
enzyem LDH của B. subtilis có một khoảng hoạt động rộng nhất và có mối quan hệ
cao nhất với NADH. Giá trị Km cho NADPH của enzyme LDH từ B. subtilis thì
tương tự như giá trị Km cho NADH của LDH từ Lactobacillus acidophilus và
Lactobacillus jensenii. Vì vậy, enzyme LDH từ B. subtilis có một ái lực cần thiết cho
NADPH, mà ảnh hưởng của nó lên sự cân bằng NADPH/NADP - phải được quyết
định trong quá trình lên men của B. subtilis.
Một phần hoạt động của enzyme transhydrogenase phục hồi lại tốc độ tăng
trưởng đã bị giảm đi, chứng minh giả thuyết rằng enzyme LDH có thể có một vai trò
sinh lý và điều tiết quan trọng, liên quan đến thế cân bằng NADPH/NADP - .Theo
hướng này, sự không cân bằng nồng độ cofactor gây ra bởi sự bất hoạt của enzyme
LDH có thể ảnh hưởng đến sự chuyển hóa của B. subtilis, làm giảm sự tiêu thụ

13


glucose trong B. subtilis sản xuất ethanol- một vai trò mà con đường sản xuất ethanol
không thể đáp ứng.
Sự bất hoạt của enzyme LDH trong Lactobacillus cũng được cảnh báo có những
tác động tiêu cực đến tốc độ tiêu thụ glucose và sự phát triển tế bào và trên sự tổ hợp
tiền peptidoglycan. Căn cứ vào kết quả của những công trình trước đó và những người
trình bày của nghiên cứu này, người ta có thể suy đoán vai trò của enzyme LDH trong

một vài vi khuẩn gram dương thì phức tạp như trong B. subtilis, nó không chỉ duy trì
sự chuyển đổi pyruvate thành lactate và oxi hóa NADH -, mà hình như còn oxi hóa cả
NADPH. Do đó, sự phát triển của vi sinh vật sản xuất ethanol xuất phát từ một vi
khuẩn gram dương như B. subtilis phải yêu cầu việc sử dụng hoạt tính của các enzyme
khác, như là enzyme transhydrogenase hoặc sự tiến hóa trực tiếp của protein để đạt
được những enzyme ADH mới mà có thể đáp ứng vai trò phức tạp của enzyme LDH
trong sự chuyển hóa của vi khuẩn gram dương.
Sản xuất ethanol với sản lượng cao từ glucose ở chủng B. subtilis.
Nghiên cứu này cho biết kỹ thuật chuyển đổi B. subtilis cho việc sản xuất ethanol
như là sản phẩm lên men chính. Kỹ thuật này dựa trên sự thay thế hoạt động của
enzyme LDH bởi hoạt động của enzyme PDC và ADHII. Chủng được tạo thành sản
xuất ethanol, trong khi chủng ban đầu thì không sản xuất được hợp chất này dưới điều
kiện tăng trưởng tương tự. Để đảm bảo hiệu quả biểu hiện của các gen này đến mức
độ phiên mã và dịch mã trong nghiên cứu này, người ta sử dụng một promoter mạnh
(ldhp) và trình tự consesus B. subtilis Shine-Dalgarno của chủng B. subtilis
(AAGGAAG) đặt tại một khoảng cách tối ưu từ codon khởi đầu ATG thì được tính
đến. Ngoài ra, để tránh trao đổi chất liên tục và có một chủng di truyền ổn định, các
operon pet khác loài được đồng nhất bằng cách làm gián đoạn gen ldh vốn có. Đồng
thời, các gen ldh của promoter (ldhp) sẽ làm cho gen pdc và adhB được biểu hiện. Sự
kết hợp của tất cả các yếu tố cho phép sự hình thành của một chủng B. subtilis với
hoạt tính enzyme tương đối cao cho cả PDC và ADHII. Mức hoạt tính của enzyme thì
có thể so sánh với E.coli KO11 sản xuất ethanol, chỉ ra sự phiên mã, dịch mã và gấp
cuộn protein tương ứng của enzyme PDC và ADHII trong B. subtilis trong điều kiện
kị khí.
Khi gen alsS bất hoạt, chủng B. subtilis sản xuất ethanol được tạo ra đã đạt được
một sản lượng ethanol lên đến 88,8% theo giá trị lý thuyết tối đa từ glucose tiêu thụ
trong 48h của nuôi cấy mẻ, mặc dù chủng B. subtilis sản xuất ethanol tiêu thụ chỉ 3g/l
suốt thời gian này; điều này là do tốc độ đặc trưng của tiêu thụ glucose thì chậm. Điều
thú vị, ngoài phục hồi một phần tốc độ tăng trưởng với sự biểu hiện của gen udhA,
thời gian bắt đầu sản xuất ethanol được rút ngắn, tương tự như thời gian bắt đầu sản

xuất lactate trong chủng CH1 ban đầu. Với chiến lược nói trên, chủng B. subtilis
BS37 sản xuất được 9g/l ethanol với hiệu suất tạo ethanol từ nguồn glucose gần 90%
suốt 9 ngày lên men. Những kết quả rõ ràng này chứng tỏ rằng có thể sử dụng B.
subtilis để sản xuất ethanol như là một sản phẩm lên men duy nhất. Tốc độ riêng của
việc sản xuất ethanol là tương đối thấp và liên quan chặt chẽ đến tốc độ riêng của sự
tiêu thụ glucose.
Tóm lại, đây là lần đầu tiên một chủng B. subtilis tái tổ hợp có thể sản xuất
ethanol in vivo như là một sản phẩm lên men duy nhất với sản lượng ethanol lớn từ
glucose. Kết quả này mở ra những tiềm năng mới để phát triển một quy trình mà dựa
vào những thuận lợi của hệ thống tiết của B. subtilis bằng cách sử dụng phức hệ cơ
chất phức cho việc sản xuất ethanol.

14


.

15