Ly trích và tinh sạch bromelain từ khóm

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
VIỆN NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIỂN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

THỰC TẬP PRÔTEIN & ENZYME
MÃ HP: CS312

LY TRÍCH VÀ TINH SẠCH BROMELAIN TỪ
KHÓM
CÁN BỘ HƯỚNG DẪN:
T.S . Võ Văn Song Toàn

NHÓM 11B.

Cần Thơ - 11/2015.


Mục Lục
BÀI 1. TRÍCH LY PROTEIN..........................................................................................................1
I. Cơ sở lý thuyết:.........................................................................................................................1
II. Dụng cụ thí nghiệm:.................................................................................................................1
1. Nguyên liệu: một trái khóm.................................................................................................1
2. Cách tiến hành:.....................................................................................................................1
III. Kết quả:...................................................................................................................................2
IV. Câu hỏi phúc trình:.................................................................................................................2
BÀI 2. PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ...................................................................................................5
I. Cơ sở lý thuyết:.........................................................................................................................5
1. Khái niệm:............................................................................................................................5
2. Nguyên tắc:...........................................................................................................................5
II. Dụng cụ - hóa chất:.................................................................................................................7
III. Cách tiến hành:.......................................................................................................................7

IV. Kết quả và thảo luận:..............................................................................................................8
1.Kết quả:..................................................................................................................................8
V. Câu hỏi phúc trình: ...............................................................................................................11
1. Phương pháp trao đổi ion:..................................................................................................11
2. Trạng thái tích điện của protein – enzyme ( pH 4, pH 6) ? Giải thích ?............................11
3. Giá trị pH mỗi phân đoạn rữa giải. Ý nghĩa thực tiễn của các trị số pH vừa xác định trong
quá trình tinh sạch...................................................................................................................12
BÀI 3. ĐỊNH LƯỢNG PROTEIN.................................................................................................13
BẰNG PHƯƠNG PHÁP BRADFORD.........................................................................................13
I.Cơ sở lý thuyết:........................................................................................................................13
II. Thiết bị, dụng cụ - hóa chất:..................................................................................................14
1. Thiết bị, dụng cụ:................................................................................................................14
2. Hóa chất:.............................................................................................................................14
1. Đối tượng thí nghiệm..........................................................................................................20
2. Nguyên tắc..........................................................................................................................20
2.2 Đơn vị hoạt tính của bromelain........................................................................................21
3. Thiết bị dụng cụ thí nghiệm, hóa chất................................................................................21
II. Cách tiến hành:......................................................................................................................21
1.Dựng đường chuẩn Tyrosin.................................................................................................21
2.Xác định hoạt tính enzyme bằng phương pháp Kunitz cải tiến...........................................22
III. Kết quả:.................................................................................................................................23
BÀI 5. PHÂN TÍCH PROTEIN BẰNG PHƯƠNG PHÁP ĐIỆN DI TRÊN.................................27
GEL POLYACRYLAMIDE..........................................................................................................27
I. Mục đích: ................................................................................................................................27
II. Giới thiệu:..............................................................................................................................27
III. Nguyên tắc: ..........................................................................................................................28
Thiết bị, dụng cụ thí nghiệm, hoá chất.......................................................................................29
1.Thiết bị:................................................................................................................................29
2.Dụng cụ thí nghiệm:............................................................................................................29
3.Hóa chất: .............................................................................................................................29

V. Tiến hành thí nghiệm.............................................................................................................30
VI. Kết quả thí nghiệm và thảo luận:..........................................................................................32


Danh sách bảng
Danh mục hình


Thực tập Protein & Enzyme

Nhóm – 11B

BÀI 1. TRÍCH LY PROTEIN
I. Cơ sở lý thuyết:
Trích ly enzyme là quá trình thu nhận enzyme thô từ các nguồn nguyên liệu động
vật, thực vật và vi sinh vật để thực hiện các bước tinh sạch và các nghiên cứu khác. Trong
cơ thể sinh vật, enzyme có trong tế bào chất và các cấu tử (nhân , ty thể,..). Các phân tử
enzyme không có khả năng di chuyển qua màng tế bào và màng của các cấu tử tế bào. Do
đó, có thể chiết rút các enzyme nội bào cần phải phá vỡ cấu trúc của các tế bào Nguyễn
Đức Lượng, 2004).Có thể các tế bào bằng các biện pháp: Xay nhuyễn, nghiền: nghiền với
bột thủy tinh hoặc bột cát, sóng siêu âm., sử dụng dung môi hữu cơ như: Butylic, aceton,
glycerine,..
Sau khi phá vỡ màng tế bào, enzyme được tách chiết bằng các dung dịch hoặc muối
trung tính. Ngoài ra còn có thể sử dụng các biện pháp lắng, lọc, ly tâm, trích ly,..(Nguyễn
Đức Lượng, 2004).
II. Dụng cụ thí nghiệm:
Cân điện tử, máy ly tâm lạnh, cối xoay, micropipette, đầu cole các loại (200, 1000,
5000 µL), ống đong, ống eppendoft, dao, thớt, vải lọc, thùng đá lạnh…
1. Nguyên liệu: một trái khóm
2. Cách tiến hành:

‒ Cắt quả khóm khoảng 1cm (vừa chạm phần mắt khóm). Sau đó cắt lát mỏng.
‒ Xoay mẫu bằng cối xoay. Dùng vải lọc ép lấy dịch khóm.
‒ Ly tâm 6000v/phút ở 40C trong 15 phút để thu nhận bromelain vỏ khóm.
‒ Trữ mẫu ở - 200C:
+ 6 ống eppendorf. Mỗi ống 1ml dịch enzyme. (để xác định hàm lượng protein,
hoạt tính enzyme và điện di SDS-PAGE trong các bài sau)
+ 22 mL dịch enzyme/ bọc (để sử dụng cho sắc kí trao đổi ion).
+ Phần enzyme còn dư cho vào một bọc khác để trữ lại.
Chú ý:
Viện Nghiên Cứu & Phát Triển Công Nghệ Sinh Học

1

Đại Học Cần Thơ


Thực tập Protein & Enzyme

Nhóm – 11B

‒ Toàn bộ quá trình cần thao tác nhanh, trong điều kiện lạnh 4 0C để enzyme không
bị mất hoạt tính.
‒ Cắt vỏ khóm càng nhỏ càng tốt.
‒ Khi xay mẫu không xoay quá lâu vì xay lâu tạo nhiệt làm mất họat tính enzyme.
III. Kết quả:
Khối lượng mẫu (khóm) ban đầu: 473,3 g
Khổi lượng vỏ khóm: 177,33 g
Phần trăm vỏ khóm thu được:
%Vỏ khóm = Khối lượng vỏ khóm *100/ khối lượng mẫu ban đầu.
=

177,33 * 100
= 37,5%
473,3

Thể tích dịch:
+ Trước ly tâm: 75 ml (113,32g).
+ Sau ly tâm:73 ml (84,05g)
Hiệu xuất thu hồi (thể tích) dịch enzyme thô thu được trên 1 trái khóm sau khi trích ly.
Hiệu xuất thu hồi = (khối lượng dịch enzyme sau li tâm )/(khối lượng khóm ban đầu)*100
= (84,05/473,3)*100
= 17,76 %

Cần phải xác định các thông số đầu vào của mỗi nguyên liệu vì:
Biết được tỉ lệ các thành phần.
Để tính hiệu xuất thu hồi.
Hiểu được công dụng, liều lượng trong một trường hợp sử dụng nào đó.
Đạt hiệu trái cao trong sản xuất, tránh lãng phí nguyên liệu.

IV. Câu hỏi phúc trình:
Câu 1. Lượng vỏ khóm thải bỏ từ nhà máy chế biến thực phẩm khóm đóng hộp
của một nhà máy hoặc 1 tỉnh, và cả nước trong 1 mùa vụ và 1 năm.
Tại Việt Nam (chủ yếu các tỉnh miền Tây nam bộ) khóm được trồng khá phổ biến,
phân bố từ Phú Thọ đến Kiên Giang. Tiền Giang là tỉnh có sản lượng khóm đứng đầu cả
nước. Năm 2007, sản lượng khóm của tỉnh Tiền Giang đạt 260.300 tấn. Tiếp theo là Kiên
Giang (85.000 tấn), Ninh Bình (47.400 tấn), Nghệ An (16.600 tấn), Long An (47.000
tấn), Hà Nam (23.400 tấn), Thanh Hoá (20.500 tấn). Tổng sản lượng cả nước năm 2007
Viện Nghiên Cứu & Phát Triển Công Nghệ Sinh Học

2

Đại Học Cần Thơ


Thực tập Protein & Enzyme

Nhóm – 11B

đạt 529.100 tấn. Nhiều địa phương xây dựng thương hiệu đặc sản trái khóm như
khóm Đồng Giao (Tam Điệp - Ninh Bình), hoặc ở Kiên Giang, Tiền Giang đều có những
nhà máy chuyên sản xuất, chế biến các thực phẩm từ trái khóm.
Tính đến ngày 24/11/2014, nông dân vùng chuyên canh dứa (khóm) Tân Phước (Tiền
Giang) đã thu hoạch được 14.195 ha. Sản lượng dứa đạt trên 275.000 tấn, vượt chỉ tiêu
11,6% so kế hoạch cả năm, tăng gần 30.000 tấn so với năm trước. Đây là mức tăng cao
nhất từ trước đến nay. Tính tính trung bình có từ 30 – 40 % lượng vỏ khóm được bỏ đi,
tương đương với 103.125 tấn/ năm.
Câu 2. Ý nghĩa của Bromelain đã được tinh sạch? (y dược, thực phẩm…)
 Trong Y học:
Enzyme có một vị trí quan trọng trong y học. Đặc biệt là các phương pháp
định lượng và định tính enzyme trong hóa học lâm sàng và phòng thí nghiệm chẩn
đoán. Do đó, hiện nay trong y học đã xuất hiện lĩnh vực mới gọi là chẩn đoán
enzyme, có nhiệm vụ:
‒ Phân tích xác định nồng độ cơ chất như glucose, ure, cholesterol,..
‒ Xác định hoạt tính xúc tác của enzyme trong mẫu sinh vật.
‒

Xác định nồng độ cơ chất với sự hỗ trợ của thuốc thử enzyme đánh dấu.

Ngoài ra còn dùng enzyme làm thuốc, ví dụ protease làm thuốc tắc nghẽn tim
mạch, tiêu mủ vết thương, làm thông đường hô hấp, chống viêm, làm thuốc tăng tiêu

hóa protein, thành phần của các loại thuốc dùng trong da liễu và mỹ phẩm…
Trong y học các protease cũng được dùng để sản xuất môi trường dinh dưỡng
để nuôi cấy vi sinh vật sản xuất ra kháng sinh, chất kháng độc… Ngoài ra người ta
còn dùng enzyme protease để cô đặc và tinh chế các huyết thanh kháng độc để chữa
bệnh.
Giảm đau: nhiều nghiên cứu khẳng định tác dụng của Bromelain trong việc giảm
sưng, bầm tím, đặc biệt là đẩy nhanh thời gian phục hồi và giảm đau nhanh sau khi phẫu
thuật và cả các chấn thương vật lý khác. Ở Đức, trên thị trường có một sản phẩm chứa
90mg bromelain, 48mg trysin (enzyme nguồn động vật) và 100mg rutin (một flavonoid
bảo vệ mao mạch).
Viện Nghiên Cứu & Phát Triển Công Nghệ Sinh Học

3

Đại Học Cần Thơ


Thực tập Protein & Enzyme

Nhóm – 11B

Thử nghiệm nhằm so sánh sản phẩm này trong 6 tuần trên 90 người bị hư khớp
háng với diclofenac (100mg/ngày). Và kết quả điều trị tốt như diclofenac về đau nhức
do hư khớp, không có tác dụng phụ.
Liền sẹo: nhiều nghiên cứu trên động vật còn chỉ ra rằng Bromelain khi sử dụng trên
da còn loại bỏ các tế bào chết, hay còn gọi là mở ổ, từ các vết bỏng độ 3.
 Trong thực phẩm:
Làm mềm thịt: Bromelain có tác dụng thủy phân protein thành các acid amin giúp
dễ tiêu hóa và hấp thụ.
Đông tụ sữa: để chế biến các sản phẩm từ sữa người ta dùng remin, remin là

enzyme đông tụ sữa truyền thống. Tuy nhiên, lượng remin sản xuất chưa đủ đáp ứng nhu
cầu cung cấp sữa. Gần đây người ta sử dụng enzyme thực vật vào trong chế biến sữa và
đang được nghiên cứu. Trong đó enzyme Bromelain đang được quan tâm.
Trong công nghiệp dệt may: trong sản xuất tơ tằm người ta dùng protease để sản
xuất tơ. Với công đoạn xử lý bằng enzyme sau khi xử lý bằng dung dịch đệm xà phòng sẽ
giúp lạu có tính đàn hồi tốt, bắt màu hồng đều và dễ trang trí trên lụa.
Trong công nghiệp thuộc da: trong công nghiệp thuộc da, enzyme prtesae được
dùng để làm mềm da, làm sạch da, rút ngắn thời gian, tránh ô nhiễm môi trường. Việc xử
lý đã được tiến hành bằng cách ngâm da trong dung dịch enzyme Bromelain, hay phất
dịch enzyme lên bề mặt của da. Enzyme sẽ atch1 các chất nhờn và làm đức một số liên
kết trong phân tử collagen làm cho da mềm hơn.
Câu 3. Giá thành của Bromelain trong thị trường:
Nước uống đóng họp từ khóm là 4.000 đồng/ họp.
Bromelain dạng bộ nguyên chất là 30 – 99$/ kilogram.
Nature’ s Plus Chewable Bromelain (40Mg) có giá 12,95$.
Bromelain can used in Meat Tenderizer có giá 200$.

Viện Nghiên Cứu & Phát Triển Công Nghệ Sinh Học

4

Đại Học Cần Thơ


Thực tập Protein & Enzyme

Nhóm – 11B

BÀI 2. PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ.
I. Cơ sở lý thuyết:

1. Khái niệm:
Sắc ký trao đổi ion là một quá trình cho phép phân tách các ion hay phân tử phân
cực dựa trên tính chất của chúng.
2. Nguyên tắc:
Protein mang điện tích trên bề mặt, tại bất kỳ một điểm pH nào trừ điểm đẳng điện,
các protein đều có mang một điện tích tương ứng với điểm pH đó. Tùy vào pH của môi
trường chúng sẽ tích điện dương hay âm, với pH < pI protein tích điện dương và pH > pI
protein sẽ tích điện âm. Vì vậy có thể chọn loại gel thích hợp cho từng loại protein dựa
vào pI và độ bền pH của protein.
Hệ thống sắc ký bao gồm hai pha:
Pha động: Mẫu chứa chất cần phân tích, thường là dòng chảy của dung môi, di
chuyển qua pha tĩnh.
Pha tĩnh: là những hạt mang sẵn một điện tích nhất định, những hạt này sẽ tương tác
với các phân tử (protein) mang điện tích trái dấu với chúng.
•

Nếu hạt mang điện âm, tiến trình được gọi là sắc ký trao đổi ion dương, thì sẽ
tương tác với những phân tử mang điện tích dương.

•

Ngược lại, nếu hạt mang điện tích dương, gọi là sắc ký trao đổi ion âm, thì
tương tác với phân tử mang điện tích âm.

•

Vì thế, những protein cùng dấu với cột sẽ chạy ra khỏi cột trong khi những
protein trái dấu bị giữ lại cột.
Sắc ký trao đổi ion dựa trên hiện tượng trao đổi thuận nghịch giữa các ion linh động

của pha tĩnh với các ion trong dung dịch cần phân tích khi cho dung dịch này đi qua cột
được nạp đầy pha tĩnh. Pha tĩnh trong trường hợp này gọi là chất trao đổi ion (ionit). Bản
chất của quá trình tách là do ái lực khác nhau của các ion trong dung dịch đối với trung
tâm trao đổi ion của ionit.

Viện Nghiên Cứu & Phát Triển Công Nghệ Sinh Học

5

Đại Học Cần Thơ


Thực tập Protein & Enzyme

Nhóm – 11B

Đầu tiên, protein ở trạng thái tích điện bề mặt (tích điện dương hay âm phụ thuộc
vào pH của môi trường và giá trị pI của protein cần phân tách) sẽ tương tác với hạt gel
thích hợp và được giữ lại trên cột sắc ký. Khi thay đổi giá trị pH hay tăng nồng độ muối,
thì protein sẽ không thể tiếp tục tương tác với gel vì thay đổi điện tích hoặc do các ion
muối cạnh tranh với protein trong tương tác với các hạt gel, làm protein được giải phóng.
Các protein (enzyme) khác nhau sẽ được đẩy ra ở các phân đoạn khác nhau. Ví dụ, trong
sắc ký trao đổi ion dương, ta thêm muối natri clorua hay muối khác trong dung dịch tách
giải bởi vì ion natri sẽ tranh bám vào cột với các protein có điện tích dương, do đó, những
protein mang điện tích dương được phóng thích ra ngoài cột lần lượt theo độ lớn về điện
tích.
Có 2 loại gel trao đổi ion:
•

Gel trao đổi ion dương: có

các nhóm chức năng mang điện
tích âm tương tác với các protein
mang điện tích dương.

•

Gel trao đổi ion âm: có các
nhóm chức năng mang điện tích
dương tương tác với các protein
mang điện tích âm.
Hình1. cột
sắc kí trao đổi
ion

Viện Nghiên Cứu & Phát Triển Công Nghệ Sinh Học

6

Đại Học Cần Thơ


Thực tập Protein & Enzyme

Nhóm – 11B

II. Dụng cụ - hóa chất:
Gel SP – Streamline, dung dịch đệm ammonium acetate 0,1M pH 4, đệm phosphate
pH 6, hệ thống sắc ký lỏng, bơm nhu động, cốc thủy tinh, ống đong, ống epp, ống nghiệm
nhỏ, khây đựng ống nghiệm…
III. Cách tiến hành:

Bước 1: Chuẩn bị gel SP – Streamline:
Cân bằng 10gram bằng gel SP – Streamline bằng dung dịch đệm amonium acetate
0,1M pH=4.
Bước 2. Chuẩn bị cột gel SP – Streamline:
Nhồi gel vào cột thủy tinh (2,0cm×9,0cm)(đường kính×chiều cao). Cân bằng cột
gel với dung dịch đệm ammonium acetate 0,1M pH 4 (3 lần thể tích cột), tốc độ dòng
chảy 1ml/phút.
Bước 3. Load mẫu lên cột:
Bơm 20 ml mẫu + 20 ml đệm ammonium acetate 0,1 M pH 4 với tốc độ dòng chảy 1
ml/ phút.
Bước 4:
Rửa cột gel: Rửa cột gel bằng dung dịch đệm ammonium acetate 0,1 M pH 4 với tốc
độ dòng chảy 1 ml/ phút;theo dõi quá trình rữa cột qua sắc ký đồ hoặc thu mẫu vào từng
ống nghiệm, cho đến khi phân đoạn protein không bám trên cột được đẩy ra khỏi cột.
Chú ý:
Khi rửa cột gel, cách 5 phút sẽ chuyển ống nghiệm một lần sau đó tiến hành đo OD
bước sóng 280nm, vẽ sắc kí đồ trữ phân đoạn và biết khi nào dừng rửa cột gel. Quá trình
kết thúc khi giá trị OD đo được gần bằng với giá trị OD của đệm ban đầu và không tăng.
Bước 5. Rửa giải:
Protein bám trên cột gel được rửa giải bằng dung dịch đệm phosphate 0,1 M pH=6
với tốc độ dòng chảy là 1ml/ phút. Thu dung dịch protein rữa giải vào từng ống nghiệm
rồi đem đo OD. Theo dõi sắc ký đồ để xác định các phân đoạn protein khác nhau. Quá
trình dừng lại khi giá trị OD gần bằng đệm ban đầu thì dừng lại. Xác định từng phân đoạn
và tổng thể tích của mỗi phân đoạn này, trữ mẫu ở điều kiện 40C.
Bước 6. Thu phân đoạn và trữ mẫu:
Viện Nghiên Cứu & Phát Triển Công Nghệ Sinh Học

7

Đại Học Cần Thơ

Thực tập Protein & Enzyme

Nhóm – 11B

‒ Thu, tách riêng các phân đoạn protein dựa theo sắc ký đồ vẽ được từ số liệu mẫu
OD280.
‒ Đồng nhất mỗi phân đoạn riêng biệt và xác định tổng thể tích của mỗi phân đoạn,
giá trị pH.
‒ Trữ mẫu ở - 200C:
+ 6 ống epp. Mỗi ống chứa 1 ml dịch enzyme. (để xác định hàm lượng protein,
hoạt tính enzyme và điện di SDS – SPAGE trong các bài sau).
+ Phần dịch enzyme của mỗi phân đoạn còn dư cho vào một bọc khác để trữ lại.
IV. Kết quả và thảo luận:
1. Kết quả:
Bảng 1: Bảng thể hiện giá trị OD (280nm)
Ống nghiệm
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12

13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26

OD
0.088
0.086
0.089
0.097
0.2
2.584
3
3
3
3
0.088
3
3
3

3
2.283
0.459
0.339
0.315
0.311
0.539
0.96
0.567
0.449
0.391
0.404

Viện Nghiên Cứu & Phát Triển Công Nghệ Sinh Học

Ống nghiệm
46
47
48
49
50
51
52
53
54
55
56
57
58
59

60
61
62
63
64
65
66
67
68
69
70
71
8

OD
0.228
0.289
0.334
0.257
0.188
0.17
0.16
0.158
0.155
0.151
0.15
0.145
0.145
0.141
0.137

0.136
0.135
0.132
0.132
0.131
0.13
0.131
0.131
0.125
0.123
0.126
Đại Học Cần Thơ


Thực tập Protein & Enzyme

27
28
29
30
31
32
33
34
35
36
37
38
39
40

41
42
43
44
45

Nhóm – 11B

0.397
0.309
0.271
0.261
0.236
0.229
0.229
0.229
0.233
0.407
0.418
0.374
0.358
0.337
0.318
0.293
0.273
0.252
0.232

72
73

74
75
76
77
78
79
80
81
82
83
84
85
86
87
88
89

0.24
0.323
0.26
0.29
0.311
0.283
0.273
0.258
0.25
0.244
0.244
0.243
0.233

0.225
0.225
0.225
0.223
0.214

Bảng 2: Kết quả phân đoạn sắc ký

Số thứ tự ống thu

UB
5-15

UB
UB1
UB2
20-23 36-41

fraction
UB4
F1
F2
F3
47-49 71-73
75-78 79-87

Ống đỉnh

4-14

21

37

48

72

76

79

Trị số OD ống đỉnh

3,000

0,960

0,418

0,334

0,323

0,311

0,258

pH
Thể tích thu được(ml)

4
55

4
20

4
30

4
15

4,5
15

5
20

6
45

2. Sắc ký đồ:

Viện Nghiên Cứu & Phát Triển Công Nghệ Sinh Học

9

Đại Học Cần Thơ

Thực tập Protein & Enzyme

Nhóm – 11B

Hình 2: Biểu đồ sắc ký trao đổi ion

Biểu đồ sắc ký và bảng 3 cho thấy sau quá trình sắc ký trao đổi ion nhóm thu được
4 phân đoạn UB ở giai đoạn rửa cột gel, phân đoạn F1 ,F2, F3 thu được trong giai đoạn
rửa giải.
Nhận xét:
 Ở giai đoạn rửa các protein không bám đáng lẽ chỉ có một UB đó là UB1, nhưng
lại xuất hiện thêm nhiều UB khác. Nguyên nhân có thể là do:
Giả thuyết 1: có một số protein khác không phải là Bromalain cạnh tranh vị trí bám
trên gel. Nhưng gel này là gel tạo điều kiện tối ưu cho Bromelain bám vào, do đó các
protein khác này sẽ bị rửa trôi với pH = 4. Nhóm đã suy nghĩ theo hướng này và gom tất
cả các UB thành một phân đoạn, sử dụng cho cac thí nghiệm sau. Riêng điện di SDS –
page sẽ sử dụng ống đỉnh là ống có OD = 3.

Viện Nghiên Cứu & Phát Triển Công Nghệ Sinh Học

10

Đại Học Cần Thơ


Thực tập Protein & Enzyme

Nhóm – 11B

Giả thuyết 2: Có thể là lượng gel trong cột quá ít mà hàm lượng Bromelain có trong
mẫu lại nhiều, do đó chúng sẽ không có bị trí bám trên gel bị đẩy ra khỏi cột gel. Nếu khi
xác định hoạt tính hay điện di SDS – page có sự hiện diện của Bromelain.
Nhóm đã xác định khi rửa giải có 3 phân đoạn là F1, F2, F3. Nhưng vấn đề đáng chú
ý là các phân đoạn này có giá trị OD đỉnh rất thấp, và gần nhau. Nguyên nhân là có thể
do:
Quá trình rửa các protein không bám thì Bromelain đã bị rửa đi phần nào đó.
Cho ra 3 phân đoạn F1, F2, F3 gần kề nhau với OD đỉnh không cao mà không phải
là một phân đoạn điều này có thể là do pH không đủ mạnh, cụ thể là chưa đủ bằng 6. Điều
này hoàn toàn có khả năng vì pH của mỗi phân đoạn lần lượt là F1 với pH = 4,5; F2 với
pH = 5, pH = 6 với F3 và khi pha đệm các bạn đã quên chỉnh lại bằng pH kế.
V. Câu hỏi phúc trình:
1. Phương pháp trao đổi ion:
Sắc ký trao đổi ion là 1 phương pháp sắc ký lỏng, rắn mà pha tĩnh là hợp chất có
khả năng trao đổi ion (gọi là các ionit). Sắc ký trao đổi ion được phân loại dựa trên cơ chế
của quá trình tách: do ái lực khác nhau của các ion trong dung dịch (pha động) với các
trung tâm trao đổi ion (nhóm chứa ion) trên chất rắn (pha tĩnh). Gel trao đổi ion : Có hai
loại giá thể dùng trong sắc ký trao đổi ion: Chất trao đổi ion âm (anion exchanger) là
những chất mang nhóm điện tích dương (+) sẽ tương tác với các ion âm (-). Ngược lại,
chất trao đổi ion dương (cation exchanger) là những chất mang nhóm điện tích âm (-) sẽ
tương tác với các ion dương (+).
Trong quá trình rửa cột gel, cột gel được cân bằng bằng dung dịch đệm Ph-4 mà
enzyme bromelin có pH = 4,6, pH dụng phương pháp trao đổi ion dương với gel trao đổi ion mang điện tích âm.
2. Trạng thái tích điện của protein – enzyme ( pH 4, pH 6) ? Giải thích ?
Trong dung dịch đệm amonium acetate pH 4 protein-enzyme tích điện âm, tại pH
6 protein-enzyme tích điện dương, trong điều kiện trích ly enzyme tích điện âm.
Bromelain từ quả có điểm đẳng điện (pI) = 4.6 tại pH 4, pH < pI phân tử protein thể hiện
tính base, nhận ion H+, do đó số điện tích dương lớn hơn số điện tích âm, protein là một
Viện Nghiên Cứu & Phát Triển Công Nghệ Sinh Học

11

Đại Học Cần Thơ


Thực tập Protein & Enzyme

Nhóm – 11B

đa cation, tích điện dương (Yamada et al – 1976 và Ota et al năm 1985). Tại pH 6, pH >
pI phân tử protein thể hiện tính acid, cho ion H+, do đó số điện tích âm lớn hơn số điện
tích dương, protein là một đa anion, tích điện âm ( Lê Kim Thanh, 2007) thì dịch trích có
pH 3.7 nên nhỏ hơn pI và cũng tích điện dương.
3. Giá trị pH mỗi phân đoạn rữa giải. Ý nghĩa thực tiễn của các trị số pH vừa
xác định trong quá trình tinh sạch.
Khi rữa giải dung dịch đệm pH=6 đi vào sẽ kết hợp với dung dịch đệm có pH=4
trong cột gel. pH trong cột gel sẽ tăng dần từ 4 lên 6. pH tăng dần cũng sẽ làm cho điện
tích của protein-enzyme thay đổi rồi từ dương sang âm. Những protein nào tích điện
dương nhỏ (pI trên lệch với pH=4 không nhiều) trong giai đoạn rữa cột sẽ bị đẩy ta khỏi
cột gel trước do dễ thay đổi điện tích từ dương sang âm. Còn những protein tích điện
dương lớn (pI chênh lệch so với pH=4 nhiều) cần pH tăng lên hơn nữa thì mới đủ để thay
đổi điện tích của chúng và bị đẩy ra khỏi cột. Tóm lại có thể xác định được điện tích
protein lớn hay nhỏ dựa vào giá trị pH.
Bảng 3. Giá trị pH của mỗi phân đoạn
Phân đoạn
pH

UB
4

F1
4,5

F2
5

F3
6

Ý nghĩa:
- UB: pH < pIbromelain nên bromelain chúng ta cần tinh sạch tích điện dương và bám
được vào gel mang điện tích âm, còn các protein thu được trong giai đoạn này là các
protein không bám.
- F1: do dung dung dịch đệm pH 6 để rửa giải nên pH của các phân đoạn tăng dần
lên, ở pH 4,5 (vẫn nhỏ hơn pI bromelain) nên đây vẫn không phải là protein chúng ta cần tinh
sạch.
- F2 vần còn sự hiện diện của pH 4 nên pH =5.
- F3: pH của dung dịch ở 2 phân đoạn này là 6, lớn hơn pI bromelain, lúc này bromelain
chuyển sang tích điện âm, không bám được vào gel mang điện tích âm nữa nên sẽ bị đẩy
ra khỏi cột gel. Rất có thể đây là protein chúng ta cần tinh sạch.

Viện Nghiên Cứu & Phát Triển Công Nghệ Sinh Học

12

Đại Học Cần Thơ


Thực tập Protein & Enzyme

Nhóm – 11B

Tuy nhiên , theo nhóm ở thí nghiệm này không dựa trên pH để xác định Bromelain
cần tìm vì pH nhóm chưa chính xác.

BÀI 3. ĐỊNH LƯỢNG PROTEIN
BẰNG PHƯƠNG PHÁP BRADFORD.
I. Cơ sở lý thuyết:
Phương pháp Bradford dung để xác định hoạt tính protein hòa tan trong dung dịch.
Phương pháp này dựa vào tính không tan và bám chặt vào thuốc nhuộm của protein và
biến đổi độ hấp thụ ánh sáng của Coomassie Brilliant Blue. Protein ổn định mang điện
tích âm trong liên kết với chất màu bằng tương tác kỵ nước và ion.
Các protein khi phản ứng với coomassie ( coomassie brilliant blue – CBB) sẽ hình
thành hợp chất màu có khả năng hấp thụ ánh sáng ở bước sóng 595nm, cường độ màu có
tỉ lệ với nồng độ protein trong dung dịch.
Đặc điểm của phương pháp Bradford:
‒ Cường độ màu tỉ lệ với protein trong dung dịch. Nồng độ protein càng cao thì màu
xanh càng đậm.
‒ Không phụ thuộc vào nồng độ acid amin trong dung dịch.
‒ Phương pháp có độ phát hiện cao cho phép phát hiện với vài gam protein/ml.
‒ Tiết kiệm thời gian.
‒ Ít bị ảnh hưởng bởi các chất thường gặp trong tế bào như muối.
 Mục đích: Định lượng protein:
‒ Protein sau khi được tách chiết và làm sạch có thể được định lượng. Nếu thông qua
việc xác định rotein nghiên cứu là enzyme thì việc định lượng thông qua xác định
hàm độ của enzyme.
‒ Theo qui ước quốc tế: 1 đơn vị hoạt đọ enzyme là lượng enzyme làm chuyển hóa 1
mol cơ chất trong 1 phút ở các điều kiện tiêu chuẩn.
‒ Nếu là protein vận chuyển thì có thể xác định chúng thông qua nồng độ chất mà

chúng vận chuyển.

Viện Nghiên Cứu & Phát Triển Công Nghệ Sinh Học

13

Đại Học Cần Thơ


Thực tập Protein & Enzyme

Nhóm – 11B

II. Thiết bị, dụng cụ - hóa chất:
1. Thiết bị, dụng cụ:
Máy đo quang phổ, vortex, micropipette, ống nghiệm thủy tinh, cuvette thủy tinh,
đầu cole xanh, vàng, …
2. Hóa chất:
Thuốc thử Bradford (CBB) là hợp chất màu gồm Coomassie Brilliant Blue G-250 và
phosphoric acid hòa tan trong ethanol/nước cất theo tỉ lệ thích hợp. CBB(C 47H50N307S2 ) là
một trong hai hình thức hóa học của hợp chất triphenylmethane disulfonate. G- 25 tạo
phản ứng màu với protein (màu xanh ) nên nó còn được gọi là thuốc nhuộm
Coomasie.Nhuộm bằng CBB là phương pháp nhuộm phổ biến thường được sử dụng phát
hiện protein trên gel polyacrylamide. Rất dễ phát hiện khi có 0,1-1µg protein trên băng.
Tùy theo hàm lượng protein mà ta có thể thây đổi thành phần các chất cũng như chất
nhuộm.
‒ Dung dịch protein chuẩn bovine serum albumin (BSA) 1mg/ml (- 200C).
‒ Cồn tuyệt đối.
III. Tiến hành thí nghiệm:
1. Xây dựng đưỡng chuẩn BSA.

Chuẩn bị dãy protein BSA chuẩn với nồng độ tăng từ 0, 30, 60, 120, 180, 240, 300
µg/ml.
Bảng 4. Dãy nồng độ BSA dùng để dựng đường chuẩn
Ống nghiệm

1

2

3

4

5

6

7

[BSA](µl)

0

30

60

120

180

240

300

VBSA(µl)

0

30

60

120

180

240

300

Nước cất (µl)

1000

970

940

880

820

760

700

Quy trình thực hiện:
Bước 1: Chuẩn bị ống nghiệm nhỏ và thêm vào các chất theo bảng 2 (thí nghiệm lặp lại 3
lần). Lắc đều các ống nghiệm chứa BSA chuẩn vừa chuẩn bị

Viện Nghiên Cứu & Phát Triển Công Nghệ Sinh Học

14

Đại Học Cần Thơ


Thực tập Protein & Enzyme

Nhóm – 11B

Bước 2: tiếp tục lấy các ống nghiệm xếp vào giá tương ướng với các ống nghiệm ở trên.
Ở mỗi nồng độ có ba ống nghiệm xếp theo chiều dọc tương đương 3 lần lặp lại.
Bước 3: Lấy 100 µl dung dịch từ các ống nghiệm trên cho vào một dãy ống nghiệm cùng
hàng ở phía sau
Bước 4: Cho vào mỗi ống 2ml thuốc thử CBB, lắc đều bằng vortex.
Bước 5: Sau 10 phút tiến hành đo OD bằng máy đo quang phổ có bước sóng 595nm.
Chú ý:
‒ Lắc đều bằng vortex nhưng tránh để có bọt.

‒ Đo mẫu có nồng độ thấp đến cao.
Kết quả:
Biểu đồ đường chuẩn BSA thể hiện tương quan tuyến tính giữa nồng độ
protein (30 – 300 µL/ml) tương ứng với độ hấp thj OD ở bước sóng 595nm.
2. Định lượng protein có trong mẫu.
‒ Thí nghiệm lặp lại 3 lần.
‒ Mẫu: thô pha loãng 2 lần và 5 lần.
UB, F1, F2, F3 không pha loãng.
Cách tiến hành:
Chuẩn bị các ống nghiệm nhỏ và thêm vào các chất sau:
Bảng 5. Pha loãng mẫu enzyme
Ống nghiệm

Thô 2x

Thô 5x

UB

F1

F2

F3

Vmẫu (µl)

50

20

100

100

100

100

Nước cất (µl)

50

80

0

0

0

0

Quy trình định lượng hàm lượng protein:
Bước 1: Lắc đều các ống nghiệm chứa dịch enzyme vừa pha loãng trên.
Bước 2: Lấy ở mổi ống nghiệm 100µl dung dịch cho vào các ống nghiệm được dánh số
thứ tự được xếp cùng một hàng. Mỗi mức độ pha loãng của các mẫu được lặp lại 3 lần.
Bước 3: Cho vào mỗi ống 2ml thuốc thử CBB, lắc đều bằng vortex.

Viện Nghiên Cứu & Phát Triển Công Nghệ Sinh Học

15

Đại Học Cần Thơ


Thực tập Protein & Enzyme

Nhóm – 11B

Bước 4: Sau 10 phút tiến hành đo OD bằng máy đo quang phổ có bước sóng 595nm. Ghi
nhận kết quả.
Chú ý:
‒ Lắc đều bằng vortex nhưng tránh để có bọt.
‒ Đo mẫu có nồng độ thấp đến cao.
Kết quả:
Bảng 6. Kết quả OD595nm đường chuẩn BSA
Nồng độ BSA

0 (đc)

30

60

120

180

240

300

Lần 1

0,62

0,727

0,826

1,012

1,127

1,22

1,357

Lần 2

0,623

0,749

0,856

1,048

1,214

1,298

1,414

Lần 3

0,62

0,754

0,867

1,023

1,174

1,243

1,45

ODtrung bình (TB)

0,623

0,743

0,850

1,028

1,172

1,254

1,407

ODTB -ODđối chứng

0

0,119

0,225

0,403

0,547

0,629

0,783

Viện Nghiên Cứu & Phát Triển Công Nghệ Sinh Học

16

Đại Học Cần Thơ

Thực tập Protein & Enzyme

Nhóm – 11B

Hình 4: Biểu đồ thể hiện mối quan hệ giữa giá trị OD (595nm) và hàm lượng protein
Phương trình đường chuẩn trên cho ta thấy mối quan hệ tương quan giữa nồng độ
BSA (µg/ml) và giá trị OD ở bước sóng 595nm theo phương trình y = 0,0025x + 0,0511,
R2 = 0,9822.
Trong đó :x là nồng độ BSA(µg/ml)
y là giá trị OD595nm
Phương trình trên cho thấy mối quan hệ giữa hàm lượng BSA và giá trị OD rất
chặt chẽ và phương trình hồi quy vừa xây dựng là đáng tin cậy(R2 = 98,22%).
Kết quả:
Bảng 7: kết quả đo OD595nm hàm lượng protein trong mẫu
Mẫu

OD1

OD2

OD3

ODtrung bình

ODtrung bình - ODđối chứng

Thô 2x

1,451

1,61

1,618

1,560

0,935

Thô 5x

1,066

1,169

1,153

1,129

0,505

Viện Nghiên Cứu & Phát Triển Công Nghệ Sinh Học

17

Đại Học Cần Thơ


Thực tập Protein & Enzyme

Nhóm – 11B

UB

0,69

0,716

0,719

0,708

0,084

F1

0,713

0,735

0,731

0,726

0,102

F2

0,725

0,789

0,785

0,766

0,142

F3

0,784

0,813

0,81

0,802

0,178

Từ kết quả đo OD trên kết hợp với phương trình đường chuẩn BSA ta tiến hành
tính hàm lượng protein có trong mẫu.
=> Hàm lượng protein (µg/ml) = x = (y – 0,0511)/0,0025* hệ số pha loãng
Bảng 8. Kết quả hàm lượng protein trong mẫu

Loại mẫu

Thô
UB
F1
F2

F3

Hàm lượng

Hệ số

Tổng thể

Hàm lượng

Hàm lượng

pha

tích

protein

proetin

loãng

(ml)

(µg/ml)

(mg/ml)

2

73

707,39

0,707

(mg/ml)
51,611

5

73

907,8

0,909

66,357

1
1
1
1

120
15
20
45

65,8

20,36
36,36
50,57

0,0658
0,0204
0,0364
0,0506

7,896
0,306
0,728
2,277

protein
tổng

Nhận xét:
Theo quan sát ta thấy thứ tự nồng độ tăng dần của các ống thì màu xanh của dung dịch
cũng đậm dần. Nồng độ BSA (µg/ml) càng lớn thì giá trị OD càng cao, hay nói cách khác,
độ hấp thụ quang (OD) của BSA tăng tuyến tính theo nồng độ BSA (µg/ml).
Hàm lượng protein ở mẫu enzyme thô là cao nhất 898,35(µg/ml) vì protein thô chứa
hỗn hợp nhiều thành phần protein, do trong mẫu protein thô ngoài Bromelain còn có
nhiều protein tạp.
UB có hàm lượng protein 12,935 (µg/ml) thấp hơn hẳn 2 phân đoạn F1 và F2. chứng
tỏ phân đoạn này chứa các protein tạp, không phải là Bromelain. F2 35,9 (µg/ml) có hàm

Viện Nghiên Cứu & Phát Triển Công Nghệ Sinh Học

18

Đại Học Cần Thơ


Thực tập Protein & Enzyme

Nhóm – 11B

lượng protein cao hơn F1 19,94 (µg/ml). Kết quả này phù hợp với kết quả đo OD qua kết
quả sắc ký ở bài trước

Viện Nghiên Cứu & Phát Triển Công Nghệ Sinh Học

19

Đại Học Cần Thơ


Thực tập Protein & Enzyme

Nhóm – 11B

BÀI 4. XÁC ĐỊNH HOẠT TÍNH PROTEASE
BẰNG PHƯƠNG PHÁP KUNITZ CẢI TIẾN.
I. Cơ sở lý thuyết:
1. Đối tượng thí nghiệm.
Enzyme bromelain vỏ và cơ chất casein.
2. Nguyên tắc.
Phương pháp đo hoạt tính dựa vào phản ứng thủy phân cơ chất protein (casein hoặc
hemoglobin) bởi enzyme.

2.1 Khái quát cơ chất casein.
Phản ứng xúc tác bởi enzyme đặc trưng bởi loại cơ chất và kiểu phản ứng. Vì vậy,
để xác định hoạt tính của enzyme thì phải lựa chọn cơ chất phù hợp với loại enzyme.
Trong bài này, cơ chất được sử dụng là Casein.
Casein gây ra hiện tượng trắng và đục cho sữa, là một loại protein chiếm khoảng
78% - 85% protein sữa. Trong sữa, casein tồn tại dưới dạng phức hợp các phân tử bao
gồm phân tử casein, calcium, phosphate vô cơ và ion citrate. Casein có điểm đẳng điện pI
= 4,6 và có 4 dạng chính là: αS1-casein, αS2-casein, β-casein và K-casein.
- αS1-casein: là dạng phổ biến nhất trong casein của sữa bò và được cho là một tác
nhân chống oxi hóa và liên quan đến sự vân chuyển của casein từ mạng nội chất đến hệ
thống Golgi.
- αS2-casein: có 207 gốc acid amin. Sự phân giải các đoạn αS2-casein cho thấy
khả năng kháng khuẩn.
- β-casein: trọng lượng phân tử khoảng 24 kDa. β - casein được báo cáo rằng có
liên quan đến nhiều chức năng sinh học như hoạt tính thực bào, đào thải peroxide. Bên
cạnh đó nó còn là một tác nhân endo-oligopeptidase mạnh. K-casein: có trọng lượng
phân tử khoảng 19 kDa bao gồm 169 gốc acid amin. K-casein được sắp xếp có định
hướng trên bề mặt của các hạt casein có chức năng tạo tương tác giữa các phần kỵ nước
bên trong và môi trường nước.

Viện Nghiên Cứu & Phát Triển Công Nghệ Sinh Học

20

Đại Học Cần Thơ


Thực tập Protein & Enzyme

Nhóm – 11B

2.2 Đơn vị hoạt tính của bromelain
Trong phản ứng này, đơn vị hoạt tính của bromelain được thể hiện qua đơn vị
Tyrosine (Tu: Tyrosine unit). 1Tu là lượng sản phẩm sinh ra tương đương với số µmol
Tyrosine do sự thủy phân casein của enzyme có trong 1ml dung dịch trong thời gian 1
phút ở điều kiên nhiệt độ và pH môi trường nhất định.
Hoạt tính đặc hiệu của bromelain là số đơn vị hoạt tính enzyme có trong 1 mg
protein (Tu/mg).
3. Thiết bị dụng cụ thí nghiệm, hóa chất.
3.1 Thiết bị - dụng cụ thí nghiệm:
 Máy đo quang phổ, máy lắc ủ, máy ly tâm tốc độ cao (14.000v/phút), cân điện
tử…
 Micropipet 20, 100, 200, 1000
 Ống eppendorf loại 1,5 mL.
3. 2 Hóa chất:
 Dung dịch đệm Na – phosphate, pH 7,5
 Casein 1% (m/v)
 Dung dịch acid Trichloroacetic (TCA) 15% (w/v).
 Tyrosin 1umol/mL.
 Cystein 0,05M.
II. Cách tiến hành:
1.Dựng đường chuẩn Tyrosin.
‒ Thí nghiệm lặp lại 3 lần.
‒ Dựng đường chuẩn Tyrosin theo bảng sau:
Bảng 9. Công thức đường chuẩn.
Ống nghiệm
[ Tyrosine] (µmol/mL)
VTyrosine (µL)
Nước cất (µL)

1
0
0
1500

2
0,2
300
1200

3
0,4
600
900

4
0,6
900
600

5
0,8
1200
300

6
1,0
1500
0

‒ Tiến hành đo OD ở bước sóng 280 nm.
Viện Nghiên Cứu & Phát Triển Công Nghệ Sinh Học

21

Đại Học Cần Thơ


Thực tập Protein & Enzyme

Nhóm – 11B

‒ Vẽ đường chuẩn thể hiện mối liên quan tuyến tính giữa nồng độ Tyrosine
(µmol/mL) với độ hấp thụ OD tại bước sóng 280nm
2.Xác định hoạt tính enzyme bằng phương pháp Kunitz cải tiến.
‒ Thí nghiệm lặp lại 3 lần đối với mẫu thật, một đối chứng tương ứng với từng phân
đoạn. (do máy ủ lắc, chỉ có 24 giếng)
‒ Mẫu: thô pha loãng 2 lần và không pha loãng.
UB, F1, F2, F3 không pha loãng.
‒ Thí nghiệm được tiến hành trong các ống eppendorf. Tương ứng với mỗi mẫu
enzyme, ta thực hiện một mẫu đối chứng để khi đo độ hấp thụ ta chuyển mẫu đối
chứng về 0.
Các bước đo hoạt tính mẫu đối chứng.

Các bước đo hoạt tính mẫu.

140µL đệm + 40µL Cystein 0,05M

140µL đệm + 40µL Cystein 0,05M

20µL enzyme

20µL enzyme

ủ 370C, 20 phút.

ủ 370C, 20 phút.

Bổ sung 600µL TCA 15%

Bổ sung 600µL Casein 15%

Lắc ủ 10 phút, 370C

Lắc ủ 10 phút, 370C

Bổ sung 600µL Casein 1%.

Bổ sung 600µL TCA1%.

ổn định 40C, 10 phút.

ổn định 40C, 10 phút.

Ly tâm 10.000 vòng/phút, 10 phút, 250C

Ly tâm 10.000 vòng/phút, 10 phút, 250C

Đo độ hấp thụ ở 280nm.

Đo độ hấp thụ ở 280nm.

Viện Nghiên Cứu & Phát Triển Công Nghệ Sinh Học

22

Đại Học Cần Thơ