thực hành vi sinh vật thú y (Escherichia coli và Salmonella cholerasuis)
Bạn đang xem bản rút gọn của tài liệu. Xem và tải ngay bản đầy đủ của tài liệu tại đây (4.46 MB, 28 trang )
Thời gian: từ 18/01/2016 đến 21/01/2016
Địa điểm: phòng 119 khu thí nghiệm
Đối tượng thí nghiệm: vi khuẩn Escherichia coli (E. coli) và Salmonella (Sal.)
Kết quả cần đạt:
-
Xác định được vi khuẩn E. coli và Sal. thuần chủng và thí nghiệm các chỉ tiêu
-
sinh hóa đối với vi khuẩn thuần.
Hiểu biết cách làm và đọc kết quả kháng sinh đồ.
Các chú ý trước khi vào phòng thí nghiệm:
-
Phải mặt áo blouse khi vào phòng thí nghiệm.
Trước, trong và sau khi tiến hành thí nghiệm cần rửa tay bằng cồn 70 để sát
-
trùng.
Trong quá trình thí nghiệm cần tuân thủ các quy định của phòng thí nghiệm.
Sau khi thí nghiệm cần vệ sinh phòng thí nghiệm trước khi về.
Ngày 18/01/2016
1/ Tiến hành nuôi cấy và thí nghiệm trên vi khuẩn E. coli và Sal.
1.1/ Chuẩn bị:
1.1.1/ Dụng cụ và thiết bị
-
Tăm bông vô trùng
Que cấy thẳng, que cấy vòng đã được thanh trùng
Đèn cồn
Ống nghiệm đã thanh trùng, đĩa petri
Óng nghiệm để chứa môi trướng vận chuyển
Cồn, khăn giấy, giá để ống nghiệm, microwave, micropipet.
1.1.2/ Nguyên vật liệu:
-
Cồn
-
Môi trường vận chuyển NA ¼.
-
Môi trường tiền tăng sinh (BPW Buffered Peptone Water) cho Sal.monella
-
Môi trường tăng sinh (Rappaport ) cho Salmonella
-
Môi trường chuyên biệt cho E. coli: EMB (Eosin Methylene Blue), MC (Mac
Conkey)
1
-
Môi trường chuyên biệt cho Sal.monella: BGA (Brilliant Green Agar); XLD
(Xylose lysine deoxycholate agar)
-
Các môi trường để kiểm tra sinh hóa: KIA (Kligler Iron Agar), Indole, MR_VP,
Nutrient Broth, Ci (Simon Citrate Agar).
-
Thuốc thử và hóa chất kiểm tra sinh hóa: kovac’s, methyl red. KOH 40%, α
napthol, giấy tẩm ure.
-
Môi trường giữ trống NA (Nutrient Agar).
1.2/ Lấy mẫu:
1.2.1: Chuẩn bị môi trường vận chuyển:
-
Môi trường cần chuẩn bị để chứa mẫu là môi trường NA 1/4 .
Môi trường cho vào microwave cho tan, sau đó chia đều vào các ống nghiệm
-
có nắp đậy.
Đem ống nghiệm chứa môi trường đi thanh trùng 121 oC/ 15 phút.
Sau khi thanh trùng cần phải bảo quản lạnh liên tục để tránh nấm mốc phát
triển làm hỏng môi trường.
1.2.2: Lấy mẫu:
-
Cần chuẩn bị bông thấm nước, tăm bông vô trùng, ống nghiệm chứa môi
-
trường vận chuyển đã chuẩn bị để chứa mẫu được bảo quản trong thùng đá.
Trước khi lấy mẫu cần vệ sinh vùng xung quanh hậu môn của con vật cần lấy
-
mẫu trách mẫu tạp.
Lấy tăm bông vô trùng cho vào hậu môn của con vật cho ngập phần bông gòn
để lấy mẫu phân. (chú ý: khi cho tăm bông vào cần phải chú ý theo sự co bóp
-
của cơ vòng hậu môn con vật tránh gây tổn thương con vật và gây tạp mẫu).
Mở ống nghiệm chứa môi trường hơ miệng ống nghiệm trên ngọn lửa đèn
-
cồn
Cho tăm bông đã lấy mẫu vào (ngập trong môi trường).
Hơ phần cán tăm bông (nơi tiếp xúc của tay) bẻ bớt đi nếu dài hơn ống
-
nghiệm, hơ miệng ống nghiệm sau đó đậy nắp lại.
Luôn bảo quẩn lạnh mẫu trước khi nuôi cấy mẫu.
2
1.3/ Tiến hành thí nghiệm:
1.3.1/ Nuôi cấy và phân lập E. coli
Ngày 18/01/2016
1.3.1.1/
Chuẩn
bị trước nuôi cấy:
-
Mẫu phân gà, phân chó
chứa trong môi trường
-
vận chuyển.
Mẫu vi khuẩn E. coli đã
-
chuẩn bị sẵn.
Đĩa petri chứa môi
trường chuyên biệt để
nuôi cấy E. coli:
+ 2 đĩa chứa môi trường MC
Hình 1: Môi trường EMB (trái) và môi trường MC (phải)
+ 2 đĩa chứa môi trường EMB
Mỗi đĩa môi trường
-
chia làm 2 phần.
Que cấy, đèn cồn, cồn,
1.3.1.2/ Phân lập mẫu phân để xác định vi khuẩn E. coli :
Mẫu sử dụng: mẫu phân gà và mẫu phân chó.
Môi trường nuôi cấy đã chuẩn bị:
+ 1 đĩa chứa môi trường MC
+ 1 đĩa chứa môi trường EMB
* Cấy mẫu phân vào môi trường:
- Mỗi phần đã chia trên đĩa môi trường chứa một mẫu phân, 2 đĩa khác môi trường
có cùng code mẫu
- Hơ nóng que cấy vòng, để nguội.
- Lấy các ống nghiệm chứa mẫu phân,
hơ
miệng ống nghiệm, dùng kẹp đã hơ
qua
ngọn lửa đèn cồn gắp tăm bông ra
một
phần.
Hình 2: Cách cấy mẫu trên đĩa petri
3
- Rút tăm bông ra và cho vào đĩa petri, dàn ra một phần. Sau đó để tăm bông trở lại
ống nghiệm hơ phần đầu tăm bông trên ngọn lửa đèn cồn trước khi đẩy hết vào ống
nghiệm (tránh gây tạp mẫu). Hơ miệng ống nghiệm qua ngọn lửa đèn cồn trước khi
đậy ống nghiệm lại.
- Dùng que cấy vòng dàn đếu phần mẫu trên đĩa petri theo hình zigzag:
- Cấy tương tự trên đĩa còn lại chú ý code mẫu 2 đĩa phải giống nhau.
- Đem các đĩa môi trường đã cấy đi ủ trong 24h ở 37 oc
Hình 3: Mẫu đã được cấy trên MC và EMB
(2 đĩa bên trái cấy mẫu phân chó và gà, 2 đĩa bên phải
cấy 2 mẫu có sẵn)
Ngày 19/01/2016
-
Sau 24h ủ, đọc kết quả được:
• Trên môi trường EMB mẫu phân gà, phân chó: màu môi trường không
thay đổi, khuẩn lạc màu tím có ánh kim
4
•
Trên môi trường MC mẫu phân gà, phân chó: màu môi trường không
thay đổi, khuẩn lạc màu hồng nhạt có áng mây xung quanh.
Hình 4: Hình đối chiếu sau khi nuôi cấy
→ chọn một số khuẩn lạc đặc trưng để chuẩn bị kiểm tra độ thuần của E. coli.
1.3.1.3/ nuôi cấy vi khuẩn E. coli với mẫu sẵn có:
-
Mẫu sử dụng: mẫu vi khuẩn E. coli của cô đã chuẩn bị sẵn (mẫu E28d,
-
E28d4).
Môi trường nuôi cấy đã chuẩn bị:
+ 1 đĩa chứa môi trường MC
+ 1 đĩa chứa môi trường EMB
* Cấy mẫu vào môi trường:
-
Hơ nóng que cấy vòng, để nguội
Dùng que cấy chọn 1 khuẩn lạc
rời, đặc trưng trên đĩa petri
-
chứa mẫu.
Đưa que cấy chứa mẫu vào đĩa
petri chứa môi trường cần nuôi
cấy, dàn đều theo hình zigzag.
(làm tương tự trên cả 2 môi Hình 5: Mẫu đã được cấy trên MC và EMB
(2 đĩa bên trái cấy mẫu phân chó và gà,
trường.
2 đĩa bên phải cấy 2 mẫu có sẵn)
5
-
Cấy tương tự trên đĩa còn lại chú ý code mẫu 2 đĩa phải giống nhau.
Đem ủ trong 24h ở 37oc
Sau 24h ủ, đọc kết quả được:
o Trên môi trường EMB mẫu
E.28d,
E28d4:
màu
môi
trường
không
thay
đổi,
khuẩn lạc màu tím có ánh
kim
o Trên môi trường MC mẫu
E.28d,
E28d4:
màu
môi
trường
không
thay
đổi,
khuẩn lạc màu hồng nhạt có
áng mây.
→ Chọn một số khuẩn lạc đặc trưng để
Hình 6: Hình đối chiếu sau nuôi cấy
chuẩn bị kiểm tra độ thuần của E. coli.
Ngày 19/01/2016
1.3.1.4/ Kiểm tra E. coli thuần:
-
Chọn 3 đĩa petri đã khử trùng:
+ Đĩa 1: Chứa môi trường MC
+ Đĩa 2: Chứa môi trường EMB
+ Đĩa 3: Chứa môi trường NA
Chia mỗi đĩa ra 10 phần (số phần được chia
-
bằng số khuẩn lạc được xem là đặc trưng
trong mẫu đã nuôi cấy)
Đọc trên những đĩa petri chứa môi trường
-
chuyên biệt của vi khuẩn E. coli để chọn ra
những khuẩn lạc có các đặc điểm đặc trưng
của E. coli (đánh dấu lại)
Dùng que cấy vòng hơ qua ngọn lửa đèn cồn,
-
để nguội chọn một khuẩn lạc đã đánh dấu, sau
Hình 7: Đĩa petri được chia
o
đó lần lượt cấy vào cả 3 môi trường
o Ở môi trường MC: Gạch một
đường thẳng duy nhất vào khoảng giữa của phần đã chia.
Ở môi trường EMB: Thao tác tương tự như trên môi trường MC
6
o
Ở môi trường NA: Cấy theo hình zigzag đều trên phần đã chia
-
Hình 8; Đĩa petri đã được cấy mẫu
Chú ý:
•
Chỉ lấy khuẩn lạc một lần duy nhất cho cả 3 môi trường và phải có
cùng vị trí đánh dấu trên 3 đĩa môi trường.
• Cấy vào đúng phần đã chọn để chứa vi khuẩn và chỉ cấy một đường
thẳng duy nhất
• Khi cấy chú ý không được cấy gần vách chia các phần, không chạm vào
-
tâm, thành ngoài của đĩa.
Tiếp tục làm tương tự với các khuẩn lạc đã chọn còn lại trên các phần đĩa.
Đem đĩa đã cấy đi ủ trong 24h ở 37oc
Sau 24h ủ, đọc kết quả trên đĩa chứa môi trường MC và đĩa môi trường EMB,
nếu khuẩn lạc trên cả 2 đĩa thuần, vậy ta chọn khuẩn lạc có cùng code mẫu
(với code mẫu trên 2 môi
trường trước) trên môi
trường NA để làm các thí
nghiệm sinh hóa trên E.
coli
→
Chọn khuẩn lạc thuần
Hình 9: Đĩa petri sau nuôi cấy
trên
môi trường NA để làm
các thí nghiệm sinh hóa
Ngày 20/01/2016
231.3.1.5/ Kiểm tra sinh hóa trên E. coli:
-
Chuẩn bị 5 ống nghiệm (đã thanh trùng)
• Ống 1: Chứa 5môi trường môi trường KIA
• Ống 2: Chứa 2ml môi trường Indole
• Ống 3: Chứa 2ml môi trường MR_VP(kiểm tra MR)
7
•
•
Ống 4: Chứa 2ml môi trường MR_VP (kiểm tra VP)
Ống 5: Chứa 4ml môi trường Ci
→ Đem ống nghiệm có chứa môi trường đi thanh trùng, môi trường KIA là môi
trường có cả thạch nghiêng vạ thạch đứng, môi trường Ci là môi trường thạch
nghiêng do đó cần để nghiên ống nghiệm để đảm bảo môi trường đúng để tiến hành
thí nghiệm.
-
Chuẩn bị các hóa chất, thuốc thử để kiểm tra sinh hóa: kovac’s, methyl red,
-
KOH 40%, α napthol.
Que cấy thẳng, ống nhỏ giọt.
Vi khuẩn thuần đã được xác định trên
môi trường NA trong thí nghiệm trước.
* Tiến hành thí nghiệm:
- Ống nghiệm 1: chứa môi trường KIA
+ Lấy que cấy thẳng chon một khuẩn lạc.
+ Đưa que cấy vào ống nghiệm theo
đường thẳng đến phần đọng nước của
thạch nghiêng, sau đó tiếp tục đưa vào phần
Hình 10: Kết quả nuôi cấy trên môi trường KIA
thạch đứng (theo đường thẳng, không chạm
đáy ống nghiệm)
+ Rút que cấy ra khỏi phần thạch đứng theo đường thẳng, đến phần thạch
nghiêng thì di chuyển que cấy theo hình zigzag ngược lên trên cho đến khi que
cấy ra khỏi phần thạch nghiêng.
+ Ủ trong 24h ở 37ºc
Ống nghiệm 2: chứa môt trường Indole (lỏng)
+ Dùng que cấy lấy khuẩn lạc trên môi
trường cho vào ống nghiệm, khuấy nhẹ cho vi
khuẩn vào môi trường
+ Ủ trong 24h ở 37ºC
Hình 11: Kết quả nuôi cấy trên môi trường Indole
Ống nghiệm 3: chứa môi trường MR_VP
8
Hình 12: Kết quả nuôi cấy trên môi trường MR_VP
+ Dùng que cấy lấy khuẩn lạc trên môi trường cho vào ống nghiệm, khuấy
nhẹ cho vi khuẩn vào môi trường
+ Ủ trong 24h ở 37ºC
Ống nghiệm 4: chứa môi trường MR_VP
+ Dùng que cấy lấy khuẩn lạc trên môi
trường cho vào ống nghiệm, khuấy nhẹ cho vi
khuẩn vào môi trường
+ Ủ trong 24h ở 37ºC
Hình 13: Kết quả nuôi cấy trên môi trường MR_VP
-
Ống nghiệm 5: chứa môi trường CI
+ Dùng que cấy lấy khuẩn lạc trên môi trường cho vào ống nghiệm, di chuyển
que cấy theo hình chư Z trong ống nghiệm.
+ Ủ trong 24h ở 37ºC
+ Sau 24h ủ, môi trường không đổi màu.
Hình 14: Kết quả nuôi cấy trên môi trường Ci
9
Ngày 21/01/2016
* Tiến hành thí nghiệm các chỉ tiêu sinh lý:
Ống nghiệm 1 (KIA): đọc kết quả
Hình 15: Kết quả kiểm tra sinh hóa trên môi trường KIA
Ống nghiệm 2 (Tryphtone): dùng ống
nhỏ giọt lấy 2 giọt thuốc thử Kovac’s
cho từ từ vào ống nghiệm (thuốc thử
chạy dọc thành ống nghiệm
Ống nghiệm 3 (MR_VP Broth): dùng
Hình 16: Kết quả kiểm tra sinh hóa trên môi trường Indole
10
Ống nghiệm 4 (MR_VP Broth): cho 6 giọt thuốc thử α napthol vào ống nghiệm lắc
đều, cho tiếp 2 giọt dung dịch KOH 40% vào ống nghiệm.
Hình 18: Kết quả kiểm tra sinh hóa trên môi trường MR_VP
Ống nghiệm 5: đọc kết quả
Hình 19: Kết quả kiểm tra sinh hóa trên môi trường Ci
11
•
•
Đọc kết quả
Bảng 1: Các đặc điểm của vi khuẩn E. coli:
Môi
trường
Thuốc thử
Phản ứng
Hiện tượng
Lên men Glucose
Môi trường từ màu đỏ
chuyển sang màu vàng
(phần thạch đứng và
phần thạch nghiêng),
không có màu đen,
khối thạch bị nứt.
+
+
+
+
-
-
+
+
Khả năng sinh indole
Trên mặt môi trường
nơi tiếp xúc với thuốc
thử chuyển sang màu
hồng
+
+
Methyl Red
Xác định vsv sản xuất và
duy trì các acid bền
trong quá trình lên men
Glucose
Môi trường chuyển
sang màu đỏ
+
+
Voges
Proskauer
Phát hiện vsv tạo sản
phẩm trung tính trong
quá trình lên men
glucose
Môi trường có màu
cafe sữa
-
-
Môi trường không đổi
màu(xanh lá cây)
-
-
Lên men Lactose
KIA
Sinh H2S
Sinh hơi
Indole
Kovac’s
MR_VP
Ci
Vi khuẩn E.
coli
Mẫu
Mẫu
E28d
chó
Hình 20: Kết quả kiểm tra sinh hóa trên E .coli
Kết luận : Mẫu phân chó có chứa vi khầu E. coli
1.3.2/ Thí nghiệm nuôi cấy và phân lập Sal.:
Ngày 18/01/2016
1.3.2.1 Chuẩn bị trước thí nghiệm:
-
Mẫu phân gà
Mẫu vi khuẩn Sal. đã chuẩn bị sẵn của cô
Đĩa petri chứa môi trường chuyên biệt của Sal.:
• 2 đĩa chứa môi trường BGA
• 2 đĩa chứa môi trường XLD
→ Mỗi đĩa chia làm 2 phần
-
Môi trường tiền tăng sinh BPV (Buffered Peptone Water)
Môi trường tăng sinh Rappaport
Que cấy, đèn cồn, cồn, túi nilon vô trùng, ống nghiệm, micropipette
1.3.2.2/ Phân lập mẫu phân để xác định vi khuẩn Sal.:
-
Do vi khuẩn Sal. nhạy cảm với các yếu tố như nhiệt độ, độ ẩm,.. bên ngoài cơ
thể động vật. Nên sau khi lấy mẫu phân trong đó có rất ít vi khuẩn Sal. vì
chúng rất dễ chết -> không đủ số lượng cho quá trình nuôi cấy. Vì vậy trước
-
khi tiến hành nuôi cấy cần phục hồi và tăng số lượng vi khuẩn lên.
Sau khi lấy mẫu phân về phòng thí nghiệm (sử dụng mẫu đã dùng để nuôi cấy
-
E. coli trước đó)
Cho 9ml dung dịch môi trường tiền tăng sinh BPW vào túi nilon vô trùng →
cho tăm bông chứa mẫu vào túi, khuấy nhẹ.
-
Ủ trong 24h ở 37ºc
Ngày 19/01/2016
Túi môi trường BPW chứa vi khuẩn vẫn
đục.
-
Giải thích: do vi khuẩn phục hồi nên
-
môi trường bị vẫn đục.
Nuôi trong môi trường Rappaport để
tăng số lượng vi khuẩn thí nghiệm
Hình 21: Kết quả nuôi cấy Sal. trên môi trường BPW
+ Cho 9ml dung dịch môi trường tăng
sinh Rappaport vào túi nilon vô trùng
+ Dùng micropipette rút 1ml dung dịch đã nuôi cấy trước đó trong môi
trường BPW cho vào túi nilon chứa môi trường Rappaport.
-
Ủ trong 24h ở 37ºC
Ngày 20/01/2016
Túi chứa môi trường vẫn đục vi khuẩn tăng lên số lượng.
Hình 22: Kết quả nuôi cấy Sal. trên môi trường tăng sinh rappaport
(Chú ý: khi nuôi cấy không cho tay vào túi nilon, cần hơ thành miệng bình môi
trường qua ngọn lửa đèn cồn trước khi đổ môi trường vào túi).
Ngày 21/01/2016
-
Cấy vào môi trường chuyên biệt cho Sal.: môi trường XLD, môi trường BGA
Ủ trong 24h ở 37oC
Ngày 22/01/2016
-
Sau 24h ủ, đọc kết quả:
+ Trong đĩa môi trường XLD: môi trường từ màu cam chuyển sang màu đỏ,
khuẩn lạc vàng, đó là vi khuẩn E. coli.
+ Trong đĩa môi trường BGA: môi trường từ màu vàng xanh chuyển sang
màu vàng, khuẩn lạc vàng, đó là vi khuẩn E. coli
Hình 23: Kết quả nuôi cấy trên môi trường BGA (trái) và XLD (phải)
→ Kết luận: trong mẫu phân gà không có vi khuẩn Sal., nhưng có vi khuẩn E. coli
1.3.2.3/ Nuôi cấy vi khuẩn Sal. với mẫu sẵn có:
Ngày 18/01/2016
-
Mẫu sử dụng: mẫu vi khuẩn Sal. của cô đã chuẩn bị sẵn (mẫu Sal.139,
-
Sal.102a, Sal.148a2, Sal.148a21).
Môi
trường nuôi cấy đã chuẩn bị:
+ 2 đĩa
chứa môi trường BGA
+ 2 đĩa
chứa môi trường XLD
* Cấy mẫu vào
môi trường:
-
Hơ nóng
Dùng
que cấy vòng, để nguội
que cấy chọn 1 khuẩn lạc rời, đặc trưng
-
trên đĩa
Đưa que
petri chứa mẫu.
cấy chứa mẫu vào đĩa petri chứa môi
trường
cần nuôi cấy, dàn đều theo hình zigzag,
đường
cấy 1 và 2 dày và thưa dần ở đường cấy 3
-
và
Cấy
4Hình 24: Đĩa petri đã cấy mẫu(làm tương tự trên cả 2 môi trường).
tương tự trên đĩa còn lại chú ý code mẫu 2
-
đĩa phải
Đem ủ
giống nhau.
trong 24h ở 37oC
Ngày 19/01/2016
-
Sau 24h ủ, đọc kết quả được:
o Trên môi trường XLD mẫu
Sal.102a, Sal.148a21, Sal.139,
Sal.148a2: môi trường từ màu cam
chuyển sang màu hồng đỏ, khuẩn
lạc tròn có tâm đen rìa trắng, lồi
trên bề mặt môi trường.
o Trên môi trường BGA mẫu
Sal.102a, Sal.148a21, Sal.139,
Sal.148a2: môi trường từ màu
vàng xanh chuyển sang màu đỏ,
khuẩn lạc tròn, có màu hồng sữa.
→ Chọn một số
khuẩn lạc đặc trưng để
chuẩn bị kiểm tra độ thuần của Sal.
Hình 25: Kết quả nuôi cấy Sal.
Ngày 19/01/2016
1.3.2.4/ Kiểm tra độ thuần của Sal.:
-
Chọn 3 đĩa petri đã khử trùng:
+ Đĩa 1: chứa môi trường XLD
+ Đĩa 2: chứa môi trường BGA
+ Đĩa 3: chứa môi trường NA
-
Chia mỗi đĩa ra 10 phần (số phần được chia bằng số khuẩn lạc được chọn
-
trong mẫu đã nuôi cấy)
Đọc trên những đĩa petri chứa môi trường chuyên biệt (XLD và BGA) của vi
khuẩn Sal. để chọn ra những khuẩn lạc có các đặc điểm đặc trưng của Sal.
-
(đánh dấu lại)
Dùng que cấy vòng hơ qua ngọn lửa đèn cồn, để nguội chọn một khuẩn lạc đã
đánh dấu, sau đó lần lượt cấy vào cả 3 môi trường
o Ở môi trường XLD: gạch một đường thẳng duy nhất vào khoảng giữa
o
o
•
của phần đã chia.
Ở môi trường BGA: thao tác tương tự như trên môi trường MC
Ở môi trường NA: cấy theo hình zigzag đều trên phần đã chia
Chú ý:
Hình 26: Đĩa petri đã cấy mẫu
o
Chỉ lấy khuẩn lạc một lần duy nhất cho cả 3 mẫu và phải có cùng vị trí
o
đánh dấu trên 3 đĩa môi trường.
Cấy vào đúng phần đã chọn để chứa vi khuẩn và chỉ cấy một đường
thẳng duy nhất
o Khi cấy chú ý không được cấy đè lên vách chia các phần, không chạm
-
vào tâm, thành ngoài của đĩa).
Tiếp tục làm tương tự với các khuẩn lạc đã chọn còn lại trên các phần đĩa.
Đem đĩa đã cấy đi ủ trong 24h ở 37oc
Sau 24h ủ, đọc kết quả trên đĩa chứa môi trường XLD và đĩa môi trường BGA,
nếu khuẩn lạc trên cả 2 đĩa thuần, vậy ta chọn khuẩn lạc có cùng code mẫu
(với code mẫu trên 2 môi trường trước) trên môi trường NA để làm các thí
nghiệm sinh hóa trên Sal.
Hình 27: Đĩa petri sau nuôi cấy
→ Chọn khuẩn lạc thuần trên môi trường NA để làm các thí nghiệm sinh hóa.
Ngày 20/10/2016
1.3.2.5/ Kiểm tra sinh hóa trên Sal.
-
Chuẩn bị 5 ống nghiệm (đã thanh trùng)
o Ống 1: chứa môi trường KIA/TSI
o Ống 2: chứa môi trường Indole
o Ống 3: chứa môi trường MR_VP
o Ống 4: chứa môi trường NB
o Ống 5: chứa môi trường CI
→ Đem ống nghiệm có chứa môi trường đi thanh trùng
-
Chuẩn bị các hóa chất, thuốc thử để kiểm tra sinh hóa: kovac’s, KOH 10%, α
-
napthol, giấy tẩm Ure
Que cấy thẳng, ống nhỏ giọt.
Vi khuẩn thuần đã được xác định trên môi trường NA trong thí nghiệm
•
trước.
Tiến hành thí nghiệm:
-
Ống nghiệm 1: chứa môi trường KIA
o Lấy que cấy thẳng chon một khuẩn
lạc.
o Đưa que cấy vào ống nghiệm theo
đường thẳng đến phần đọng nước
của thạch nghiêng, sau đó tiếp tục
đưa vào phần thạch đứng (theo
đường thẳng, không chạm đáy ống
nghiệm)
o Rút que cấy ra khỏi phần thạch
Hình 28: Kết quả nuôi cấy trên môi trường KIA
đứng theo đường thẳng, đến phần
thạch nghiêng thì di chuyển que cấy theo hình zigzag ngược lên trên
cho đến khi que cấy ra khỏi phần thạch nghiêng.
o Ủ trong 24h ở 37ºc
-
Ống nghiệm 2: chứa môt trường Indole
(lỏng)
o
Dùng que cấy lấy khuẩn lạc trên môi
trường cho vào ống nghiệm, khuấy
nhẹ cho vi khuẩn vào môi trường
o Ủ trong 24h ở 37ºC
Hình 29: Kết quả nuôi cấy trên môi trường Indole
Ống nghiệm 3: chứa môi trường NB
o
Dùng que cấy lấy khuẩn lạc trên môi
trường cho vào ống nghiệm, khuấy
nhẹ cho vi khuẩn vào môi trường
o Cho giấy tẩm ure vào môi trường
o Ủ trong 24h ở 37ºC
Hình 30: Kết quả nuôi cấy trên môi trường NB
-
Ống nghiệm 4: chứa môi trường MR_VP
o Dùng que cấy lấy khuẩn lạc trên
môi trường cho vào ống nghiệm,
khuấy nhẹ cho vi khuẩn vào môi
o
o
trường
Ủ trong 24h ở 37ºC
Sau 24h ủ, môi trường vẫn đục
Hình 31: Kết quả nuôi cấy trên môi trường MR_VP
-
Ống nghiệm 5: chứa môi trường CI
o Dùng que cấy lấy khuẩn lạc trên môi
trường cho vào ống nghiệm, di
chuyển que cấy theo hình chư Zigzag
trong ống nghiệm.
o Ủ trong 24h ở 37ºC
Hình 32: Kết quả nuôi cấy trên môi trường Ci
Ngày 21/01/2016
* Tiến hành thí nghiệm các chỉ tiêu sinh
hóa:
Ống nghiệm 1: Trên ống môi trường KIA
ở phần thạch đứng từ màu đỏ chuyển
sang vàng, glucose (+); phần thạch
nghiêng có màu đỏ, lactose (-); xuất hiện
thêm màu đen ở thạch đứng và đôi khiHình 33: Kết quả kiểm tra sinh hóa trên môi trường KIA
có cả ở thạch nghiêng, H2S (+); khối
thạch bị đẩy lên, sinh hơi (+).
Ống nghiệm 2: sau 24h ủ, môi trường
vẫn đục. Dùng ống nhỏ giọt cho 2 giọt
thuốc thử Kovac’s từ từ vào ống nghiệm
(thuốc thử chạy dọc thành ống nghiệm),
bề mặt tiếp xúc có màu vàng xanh là vi
khuẩn không có khả năng sinh Indole.
Hình 34: Kết quả kiểm tra sinh hóa trên môi trường Indole
Ống nghiệm 3: sau 24h ủ, môi trường từ
màu trắng chuyển sang màu hồng nhạt,
ure (-)
Hình 35: Kết quả kiểm tra sinh hóa trên môi trường NB
Ống nghiệm 4: sau 24h ủ, môi trường
vẫn đục, tiếp tục cho 6 giọt thuốc thử α
napthol vào ống nghiệm lắc đều, cho
tiếp 2 giọt dung dịch KOH 40% vào ống
nghiệm Không xuất hiện màu đỏ nhạt
trên môi trường, tức là VP (-)
Hình 36: Kết quả kiểm tra sinh hóa trên môi trường MR_VP
Ống nghiệm 5: sau 24h ủ, môi trường từ
màu xanh lá chuyển sang màu xanh dương,
Ci (+).
Hình 37: Kết quả kiểm tra sinh hóa trên môi trường Ci
* đọc kết quả
Bảng 2: Các đặc điểm của vi khuẩn Sal.:
Môi
trườn
g
Thuốc thử
Lên
Glucose
Lên
Lactose
Sinh H2S
Sinh hơi
KIA
Indole
Kovac’s
Ure
MR_VP
Ci
Phản ứng
Voges
Proskauer
Hiện tượng
men
Vi khuẩn Sal.
Mẫu
Mẫu
148a2
102a
Môi trường từ màu đỏ +
chuyển sang vàng và màu
men
đen ở phần thạch đứng, phần thạch nghiêng có màu
+
đỏ, khối thạch bị đẩy lên.
+
Trên mặt môi trường nơi
Khả năng sinh tiếp xúc với thuốc thử
indole
chuyển sang màu vàng
xanh
Môi trường chuyển sang
màu hồng nhạt
Phát hiện vsv
tạo sản phẩm
trung tính trong Môi trường có màu cafe sữa quá trình lên
men glucose
Môi trường chuyển từ màu
xanh lá sang màu xanh +
dương.
Hình 38: Kết quả kiểm tra sinh hóa trên Sal.
Kết luận : Mẫu phân chó có chứa vi khầu E. coli
+
+
+
-
-
+
2/ Quan sát vi khuẩn E. coli và Sal. qua kính hiển vi bằng phương pháp
nhuộm đơn. (Do đã xác định vi khuẩn thuộc Gram âm từ thí nghiệm trước
đó).
2.1/ Chuẩn bị
2.1.1 Thiết bị và dụng cụ:
- Kính hiển vi
- Cốc thủy tinh chứa nước cất
- Que cấy
- Đèn cồn, bình tia chứa cồn, nước cất
- Lame kính
2.1.2/ Nguyên vật liệu:
-
Đĩa petri chứa vi khuẩn cần quan sát
Thuốc nhuộm: safranin, fuchsin
2.2/ Tiến hành nhuộm đơn:
Bước 1: Làm vết bôi( trải trùng)
-
Nhỏ 1 giọt nước vô trùng lên phiến kính,
Dùng que cấy khử để nguội, lấy 1 ít vi khuẩn từ môi trường NA hòa vào giọt
nước trên phiến kính hòa và trải mỏng trên mặt kính,
Bước 2: Cố định mẫu:
Hơ nhẹ phiến kính trên ngọn đèn cồn 3-4 lần cho khô bề mặt kính
Mục đích:
•
•
•
Giết chết tế bào sống
Gắn chặt tế bào sống vào phiến kính để khi rửa tế bào không bị trôi
Làm cho tế bào dễ bắt màu hơn.
Bước 3: Nhuộm màu
Nhỏ vài giọt thuốc nhuộm đơn (Blue methylen 0,1% hay Fuchsin Ziecl) lên vết
trải trong 30 giây
Rửa nước, hơ trên ngọn lửa đèn cồn cho phiến kính khô (không để quá gần
ngọn lửa tránh quá nóng)
Quan sát dưới kính hiển vi
Đưa tiêu bản lên mâm kính
Điều chỉnh ốc vi cấp và ốc thứ cấp để quan sát rõ mẫu ở vật kính X10, sau
đó chuyển sang vật kính X40, X100, nhỏ giọt dầu soi kính. Chỉnh ốc vi cấp
để có hình ảnh chuẩn.
3/
T
hự
c
Hình 39: vi khuẩn Sal. mẫu 148a2 trên kính hiển vi
hiện kháng sinh đồ:
3.1/ chuẩn bị:
3.1.1/ Dụng cụ và thiết bị
-
Que cấy, đèn cồn, bình tia chứa cồn, kẹp gắp, đĩa petri, ống nghiệm
Que tăm bông vô trùng
Thước đo mm, máy lắc
3.1.2/ Nguyên vật liệu
-
Đĩa petri chứa vi khuẩn gây E. coli và Sal. trên môi trường NA
Môi trường MHA (Muller Hinton Agar)
Đĩa giấy tẩm kháng sinh (amoxicillin and clavulanic acid (Ac), gentamicin
(Ge), neomycin (Ne), tetracycline (Te), nalidixic acid (Ng), ciprofloxacin (Ci),
-
trimethoprim sulfamethoxazoic (Bt))
Nước muối sinh lí 9o/oo ( pha 300ml nước cất và 2,7g NaCl )
Ống đo độ đục chuẩn McFarland 0.5
3.2/ Tiến hành thí nghiệm:
•
Chọn một ít khuẩn lạc từ môi trường NA đã nuôi cấy trước đó (chọn 1 khuẩn
lạc E. coli, 1 khuẩn lạc Sal.)
• Dùng que cấy đã hơ qua ngọn lửa đèn cồn, để nguội lấy khuẩn lạc đã chọn
hòa vào ống nghiệm chứa 2ml nước sinh lý, dùng máy Vortex lắc đều để đạt
độ đục tương đương với ống so độ đục chuẩn McFarland 0.5. (thực hiện với 2
ống nghiệm chứa 2 mẫu E. coli và Sal. Phải ghi code mẫu lên ống nghiệm)
• Lấy tăm bông vô trùng cho vào ống nghiệm chứa vi khuẩn đã pha loãng
