Nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật siRNA hướng gen mục tiêu KSP và VEGF trên một số dòng tế bào ung thư gan người

1. GIỚI THIỆU CHUNG
Ung thư gan (UTG) là một trong những loại ung thư phổ biến nhất trên toàn thế giới, chiếm
6,26% trong tổng số các ung thư ở người, với hơn 500.000 trường hợp được phát hiện mỗi năm. Tại
Việt Nam, UTG là loại ung thư phổ biến đứng thứ 4 ở cả nam và nữ. Tỷ lệ người mắc bệnh UTG ở
Việt Nam đứng thứ hai thế giới, cao gấp 10 lần so với Hoa Kỳ. Hiện nay, việc điều trị UTG chủ yếu
dựa trên ba phương pháp cơ bản, gồm phẫu thuật cắt bỏ khối u (có thể kết hợp với hóa trị hoặc xạ
trị), xạ trị (sử dụng tia xạ để tiêu diệt khối u) và hóa trị (sử dụng hóa chất gây độc để tiêu diệt tế bào
ung thư). Đa số các phương pháp điều trị truyền thống đều chưa mang đến kết quả mong đợi. Hạn
chế lớn nhất đối của các phương pháp này là gây tổn thương cho các tế bào lành tính đang hoạt
động bình thường. Gần đây, với các tiến bộ trong lĩnh vực sinh học phân tử và tế bào, các chiến
lược tác động trúng đích trong điều trị UTG được đề xuất và phát triển, bao gồm cả kỹ thuật RNA
can thiệp (RNA interference – RNAi). RNAi là một cơ chế điều hòa biểu hiện gen chuyên biệt được
hoạt hóa bởi phân tử nhỏ siRNA (small-interfering RNA) với kích thước khoảng 19-23 nucleotide.
RNAi có vai trò ức chế sự biểu hiện các gen mục tiêu thông qua việc phân hủy các trình tự mRNA
tương ứng hay ức chế quá trình dịch mã. Tác động có tính chọn lọc và đặc hiệu của RNAi lên bất kỳ
một gen nào giúp cho RNAi trở thành một công cụ hiệu quả trong nghiên cứu biểu hiện gen in vitro
và in vivo. Hơn nữa, RNAi có thể tác động ức chế đồng thời sự biểu hiện của nhiều gen khác nhau
liên quan đến ung thư. Ngoài ra, RNAi dễ dàng tổng hợp (siRNA) hay dòng hóa vào các vector
(shRNA). Hiệu quả tác động của RNAi lên gen đích dễ dàng phát hiện trong một thời gian ngắn. Do
vậy, việc sử dụng kỹ thuật RNAi bất hoạt các gen giữ vai trò quan trọng trong con đường truyền tín
hiệu tế bào ung thư đang là một hướng đi đầy hứa hẹn trong điều trị UTG.
Sự hình thành và phát triển của ung thư phụ thuộc vào nhiều yếu tố khác nhau. Thứ nhất, sự
tăng trưởng quá mức của tế bào do việc mất kiểm soát sự cân bằng giữa quá trình sống và chết của
tế bào. Thứ hai, sự kháng lại quá trình tế bào chết theo chương trình (apoptosis) do rối loạn chức
năng kiểm soát trong chu trình tế bào. Thứ ba, sự bất tử hóa của tế bào do hoạt tính telomerase được
tăng cường hay do sự tái tạo các đoạn telomere. Thứ tư, sự lẩn tránh khỏi hệ thống miễn dịch bởi
những biến đổi về mặt di truyền của tế bào ung thư. Cuối cùng, sự tạo mạch của khối u được thúc
đẩy bởi sự biểu hiện quá mức của các nhân tố kích thích tạo mạch. Đây chính là những điểm khác
biệt thường thấy giữa mô bình thường và mô ung thư. Tương tự như các loại ung thư khác, tiến trình
phát triển của UTG cũng phụ thuộc vào sự tăng sinh quá mức của tế bào. Trong đó, nguyên phân là
một bước quan trọng trong quá trình tăng sinh tế bào. Protein cấu trúc thoi vô sắc Kinesin (Kinesin

spindle protein – KSP), một thành viên của họ protein vận động Kinesin, đóng một vai trò chủ đạo
trong quá trình nguyên phân. KSP tham gia vào quá trình phân chia tế bào bằng cách gián tiếp phân
tách các trung thể và sắp xếp thoi vô sắc về hai cực trong nhân tế bào. Do vậy, sự kìm hãm hoạt
động của KSP sẽ dẫn đến thất bại trong việc phân tách trung thể, ngăn chặn sự hình thành thoi vô
sắc lưỡng cực, ức chế quá trình nguyên phân, cảm ứng apoptosis và cuối cùng dẫn đến gây chết tế
bào đang phân chia. Gen KSP thường biểu hiện thấp hoặc không biểu hiện trong các tế bào và mô
không tăng sinh, nhưng biểu hiện mạnh ở các tế bào tăng sinh hay tế bào chuyển dạng. Mức độ biểu
hiện của KSP trong các mô của ung thư vú, ung thư phổi,… thường cao hơn so với các mô bình
thường nằm gần khối u. Sự biểu hiện quá mức của KSP gây ra sự mất ổn định di truyền và hình
thành khối u trong chuột. Ngoài ra, sự biểu hiện của KSP cũng thường được phát hiện thấy trong các
mô UTG và có mối tương quan chặt chẽ với tiến trình phát triển của UTG. Do vậy, KSP trở thành
một đích trị liệu đầy hứa hẹn trong điều trị UTG. Bên cạnh các phương pháp điều trị sử dụng thuốc
ức chế KSP, việc sử dụng kỹ thuật RNAi tác động trực tiếp lên gen KSP cũng là một hướng đi mới
trong điều trị UTG.
1


Bên cạnh sự tăng sinh quá mức của các tế bào, sự hình thành và phát triển hệ thống mạch
máu trong khối u đặc cũng là một điểm đặc trưng của UTG. Trong đó, sự tạo mạch đóng vai trò
chính trong tiến trình phát triển của bệnh. Sự hình thành các mạch máu bên trong và xung quanh
khối u làm tăng khả năng cung cấp oxy và chất dinh dưỡng, đồng thời loại bỏ bớt các chất thải cho
khối u. Sự tạo mạch cũng tạo thuận lợi cho sự di cư của các tế bào khối u tới những vùng xa hơn
trong cơ thể, hình thành sự di căn hay xâm lấn của các tế bào UTG. Vì vậy, chiến lược ức chế sự tạo
mạch của khối u là một hướng trị liệu tiềm năng đối với các dạng u ác tính, kể cả khối u đặc. Nhân
tố tăng sinh nội mô thành mạch (Vascular endothelial growth factor – VEGF) là nhân tố điều hòa
quan trọng trong quá trình hình thành mạch của khối u. Gen VEGF thường biểu hiện trong mô
UTG. Sự gia tăng mức độ biểu hiện của VEGF tương ứng với sự gia tăng kích thước khối u gan.
VEGF, chủ yếu là VEGF-A, được tiết ra nhiều bởi các tế bào khối u gan. VEGF có thể tác động lên
nhiều loại tế bào khác nhau như tế bào nội mô, tế bào tiền thân nội mô, tế bào gan vệ tinh, tế bào u
máu theo cơ chế cận tiết hay tự hoạt hóa chính các tế bào khối u thông qua cơ chế tự tiết nhằm kích

hoạt sự thay đổi mạch trong khối u gan. VEGF có khả năng gắn kết với thụ thể VEGFR-1 và
VEGFR-2. Đây là các thụ thể biểu hiện hầu hết trên bề mặt tế bào của các tế bào nội mô, tế bào gan
vệ tinh cũng như tế bào UTG. Sự tương tác giữa VEGF với thụ thể VEGFR sẽ kích hoạt con đường
truyền tín hiệu thúc đẩy các quá trình sinh học như tăng sinh, biệt hóa, di căn, đáp ứng thuốc,…và
kéo dài sự sống của tế bào ung thư. Ngoài ra, mức độ biểu hiện của VEGF có tương quan với các
giai đoạn phát triển của bệnh UTG. Những ảnh hưởng này cho thấy VEGF thực sự là một trong
những yếu tố quan trọng trong chiến lược điều trị UTG. Sự hình thành mạch của khối u có thể bị ức
chế thông qua việc ức chế hoạt động của VEGF gắn kết với thụ thể VEGFR bằng kháng thể kháng
VEGF (Bevacizumab, Avastin) hay các thụ thể VEGFR hòa tan. Tuy nhiên, bất lợi lớn của các
phương pháp tiếp cận này là VEGF luân chuyển tuần hoàn phải bị bắt giữ và vô hiệu hóa hoàn toàn
để ngăn chặn các tác động diễn ra sau đó của VEGF. Ngoài ra, việc sử dụng kháng thể kháng VEGF
hay các chất ức chế khác gây ra những tác dụng phụ không mong muốn như gây chảy máu hay đông
tụ huyết. Do vậy, việc giảm lượng VEGF tiết ra từ khối u gan thông qua việc ức chế sự biểu hiện
của VEGF bằng kỹ thuật RNAi có thể là một cách tiếp cận thích hợp. Hơn nữa, hiệu quả ức chế sự
biểu hiện của VEGF bằng siRNA đã được chứng minh trên nhiều mô hình tế bào ung thư khác nhau.
Sự hình thành và phát triển của UTG liên quan tới các đột biến di truyền xảy ra đồng thời
trên nhiều gen khác nhau. Các chiến lược điều trị dựa trên sự ức chế biểu hiện riêng biệt một gen có
thể không đủ để kìm hãm tiến trình phát triển của bệnh. Do vậy, việc ức chế đồng thời sự biểu hiện
của nhiều gen hi vọng mang lại hiệu quả điều trị tốt hơn. Ngoài ra, việc kết hợp liệu pháp tác động
trúng đích (siRNA) với liệu pháp truyền thống (hóa trị liệu) cũng là một phương thức tiếp cận phù
hợp hiện nay trong điều trị ung thư, đặc biệt là các loại ung thư có mức độ đáp ứng thuốc thấp như
UTG. Trong định hướng phát triển liệu pháp điều trị UTG bằng siRNA, đề tài “Nghiên cứu ứng
dụng kỹ thuật siRNA hướng gen mục tiêu KSP và VEGF trên một số dòng tế bào ung thư gan
người” được thực hiện với các mục tiêu:
1. Lựa chọn các trình tự siRNA hướng gen KSP và gen VEGF có hiệu quả ức chế cao nhất.
2. Đánh giá ảnh hưởng của các siRNA lên một số dòng tế bào UTG người.
3. Đánh giá hiệu quả phối hợp giữa siRNA và thuốc kháng ung thư trong việc tiêu diệt tế bào
UTG in vitro.
Đề tài triển khai một hướng nghiên cứu hoàn toàn mới trong điều trị ung thư ở Việt Nam. Sự
thành công của nghiên cứu hi vọng mở ra hướng đi mới trong việc tiếp cận và phát triển thuốc dựa

trên kỹ thuật RNAi nhằm điều trị UTG và một số bệnh khác trong tương lai tại chính đơn vị tác giả
đang công tác.
2


2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Vật liệu sử dụng trong nghiên cứu
2.1.1. Các dòng tế bào sử dụng trong nghiên cứu
Nghiên cứu được tiến hành trên các dòng tế bào UTG, gồm Hep3B, HepG2, Huh-7, tế bào
gan THLE-3 và tế bào nội mô HUVEC. Các dòng tế bào này được cung cấp bởi viện nuôi cấy tế
bào Hoa Kỳ (American Type Culture Collection-ATCC) và công ty cung cấp tế bào của Đức (Cell
Line Service-CLS).
2.1.2. Trình tự các siRNA sử dụng trong nghiên cứu
Các trình tự siRNA hướng gen mục tiêu VEGF (VEGF-siRNA) hay KSP (KSP-siRNA) và
trình tự siRNA không tác động lên gen mục tiêu dùng làm đối chứng (CONT-siRNA) được cung
cấp bởi ngân hàng siRNA thuộc phòng nghiên cứu và phát triển sản phẩm (RD), công ty TNHH
CNSH Dược Nanogen (Bảng 2.1). Các siRNA được biến đổi (gắn đuôi dTdT) và tổng hợp bởi công
ty Bioneer (Daejeon, Hàn Quốc). Ngoài ra, một trình tự siRNA đối chứng gắn chất huỳnh quang
FITC (FITC-CONT-siRNA, sc-36869) được mua từ công ty Santa Cruz Biotechnology (Hoa Kỳ).
Bảng 2.1. Trình tự các siRNA được sử dụng trong nghiên cứu.
Vị trí bắt cặp
Tên
Trình tự (5’–3’)
Mạch mang mã: GCACAUAGGAGAGAUGAGCdTdT
VEGF-siRNA#1
1383-1401
Mạch đối mã: GCUCAUCUCUCCUAUGUGCdTdT
Mạch mang mã: UGAAGUUCAUGGAUGUCUAdTdT
VEGF-siRNA#2
1160-1178

Mạch đối mã: UAGACAUCCAUGAACUUCAdTdT
Mạch mang mã: GCCUUGCCUUGCUGCUCUAdTdT
VEGF-siRNA#3
1070-1088
Mạch đối mã: UAGAGCAGCAAGGCAAGGCdTdT
Mạch mang mã: CUGAAGACCUGAAGACAAUdTdT
KSP-siRNA #1
2431-2449
Mạch đối mã: AUUGUCUUCAGGUCUUCAGdTdT
Mạch mang mã: UCGAGAAUCUAAACUAACUdTdT
KSP-siRNA #2
1241-1259
Mạch đối mã: AGUUAGUUUAGAUUCUCGAdTdT
Mạch mang mã: CUGGAUCGUAAGAAGGCAGdTdT
KSP-siRNA #3
1857-1875
Mạch đối mã: CUGCCUUCUUACGAUCCAGdTdT
Mạch mang mã: GCGGAGAGGCUUAGGUGUAdTdT
CONT-siRNA
Mạch đối mã: UACACCUAAGCCUCUCCGCdTdT
Ngoài ra, nghiên cứu sử dụng các kháng thể, trình tự mồi (primer), bộ kit, môi trường nuôi
cấy tế bào và một số hóa chất cho các thí nghiệm cụ thể (tham khảo luận án).
2.2. Quy trình nghiên cứu
Nghiên cứu chia làm ba giai đoạn. Mỗi giai đoạn tương ứng với một mục tiêu nghiên cứu.
2.2.1. Quy trình nghiên cứu giai đoạn 1
Nghiên cứu thiết kế các thí nghiệm để lựa chọn trình tự siRNA tốt nhất từ các trình tự siRNA
ban đầu. Trước tiên, nghiên cứu đánh giá mức độ biểu hiện các gen VEGF và KSP trên các tế bào
UTG và tế bào gan bằng phương pháp real-time qRT-PCR, Western blot và ELISA. Dựa trên kết
quả này, nghiên cứu lựa chọn một dòng tế bào UTG để tối ưu quy trình chuyển siRNA vào tế bào.
Để đánh tối ưu quy trình chuyển siRNA vào tế bào, CONT-siRNA hay FITC-CONT-siRNA

được chuyển vào dòng tế bào UTG đã lựa chọn. Quy trình chuyển siRNA được đánh giá thông qua:
mức độ gây độc của siRNA đối với tế bào và hiệu quả chuyển siRNA vào tế bào. Mức độ gây độc tế
bào bởi siRNA theo nồng độ được đánh giá thông qua tỉ lệ tế bào sống chết bằng phương pháp
3


WST-1. Hiệu quả chuyển siRNA vào tế bào theo nồng độ và thời gian được đánh giá thông qua tín
hiệu huỳnh quang FITC bằng kỹ thuật FACS. Với các kết quả đạt được, nghiên cứu lựa chọn nồng
độ và thời gian phù hợp để đánh giá hiệu quả ức chế các gen đích bởi các siRNA trên tế bào UTG.
Sau khi đã có quy trình tối ưu, nghiên cứu đánh giá hiệu quả ức chế gen đích của các trình tự
siRNA khác nhau thông qua sự giảm mức độ biểu hiện mRNA của các gen này. Dựa trên kết quả
này, nghiên cứu lựa chọn trình tự siRNA có hiệu quả ức chế các gen đích tốt nhất. Sau đó, hiệu quả
ức chế gen đích theo thời gian bởi các trình tự siRNA đã lựa chọn tiếp tục được kiểm tra. Thời gian
đánh giá dựa vào thời gian chuyển tối ưu FITC-CONT-siRNA vào tế bào. Sự thay đổi biểu hiện gen
VEGF và KSP của tế bào sau khi chuyển siRNA tại các thời điểm được đánh giá ở mức độ mRNA
bằng phương pháp real-time qRT-PCR và protein bằng phương pháp Western blot và ELISA.
2.2.2. Quy trình nghiên cứu giai đoạn 2
Các thí nghiệm được thiết kế nhằm đánh giá hiệu quả tác động của các trình tự siRNA lựa
chọn lên các dòng tế bào khác nhau. Trước tiên, các siRNA được chuyển riêng biệt hay đồng thời
(phối hợp VEGF-siRNA hay KSP-siRNA theo tỉ lệ 1:1, được gọi là cocktail siRNA) vào các dòng
tế bào UTG và tế bào gan. Hiệu quả ức chế riêng biệt hay đồng thời sự biểu hiện các gen VEGF và
KSP bởi siRNA được đánh giá ở hai mức độ mRNA và protein.
Sau khi đã đánh giá hiệu quả ức chế gen mục tiêu của siRNA trên các dòng tế bào, nghiên
cứu đánh giá tác động của các siRNA lên một số đặc tính sinh học của tế bào UTG và tế bào
thường: khả năng tăng sinh và khả năng cảm ứng apoptosis. Hiệu quả ức chế tăng sinh tế bào bởi
các siRNA được đánh giá qua phương pháp tăng sinh tế bào WST-1. Hiệu quả cảm ứng apoptosis tế
bào được đánh giá thông qua phương pháp nhuộm tế bào đồng thời với protein Annexin V có gắn
chất phát huỳnh quang FITC (Annexin V-FITC) và thuốc nhuộm nhân PI. Tỉ lệ tế bào cảm ứng
apoptosis được xác định bằng kỹ thuật FACS. Sau đó, nghiên cứu cũng đánh giá sự thay đổi biểu
hiện một số nhân tố kiểm soát quá trình tăng sinh và apoptosis của tế bào, bao gồm nhân tố kháng

apoptosis (BCL-2, Survivin) và nhân tố cảm ứng apoptosis (Caspase-3/-7). Sự thay đổi biểu hiện
của các nhân tố này được đánh giá ở hai mức độ mRNA và protein.
Bên cạnh đó, nghiên cứu cũng đánh giá ảnh hưởng siRNA lên một số đặc tính sinh học cơ
bản của tế bào UTG như: khả năng di cư (mô hình lành hóa vết rạch), khả năng di căn (mô hình đĩa
chuyển màng), khả năng sống (sự thành bào lạc của các tế bào đơn) và khả năng kích thích tạo mạch
(mô hình kích thích tế bào nội mô hình thành mạch). Các đánh giá tác động của siRNA lên một số
đặc tính sinh học của tế bào và sự thay đổi biểu hiện của một số nhân tố kiểm soát các quá trình này
là cơ sở để chứng minh hiệu quả ức chế gen đích của các siRNA trên tế bào UTG.
2.2.3. Quy trình nghiên cứu giai đoạn 3
Nghiên cứu thiết kế các thí nghiệm để đánh giá hiệu quả phối hợp giữa siRNA và thuốc
kháng ung thư trong việc tiêu diệt tế bào UTG in vitro. Trước tiên, nghiên cứu đánh giá mức độ đáp
ứng thuốc của các tế bào UTG với Doxorubicin theo nồng độ và thời gian. Mức độ đáp ứng thuốc
của tế bào được đánh giá thông qua sự ức chế tăng sinh tế bào bằng phương pháp WST-1. Kết quả
làm cơ sở đánh giá sự đáp ứng thuốc của tế bào và hiệu quả tiêu diệt tế bào UTG của Doxorubicin.
Sau đó, nghiên cứu đánh giá ảnh hưởng của siRNA lên mức độ đáp ứng thuốc của tế bào
UTG với Doxorubicin. Sự ức chế tăng sinh tế bào của Doxorubicin phối hợp với các siRNA được
theo dõi ở các thời điểm khác nhau. Tỉ lệ ức chế tăng sinh tế bào cũng được xác định bằng phương
pháp WST-1. Kết quả làm cơ sở đánh giá hiệu quả ức chế tăng sinh hay tiêu diệt tế bào UTG in
vitro khi phối hợp Doxorubicin với siRNA. Bên cạnh đó, nghiên cứu cũng đánh giá sự thay đổi biểu
hiện một số nhân tố ảnh hưởng tới mức độ đáp ứng thuốc của tế bào, bao gồm BCL-2, Survivin và
Caspase-3/-7. Sự thay đổi biểu hiện của các nhân tố này được đánh giá ở mức độ mRNA và protein.
4


3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
3.1. Kết quả lựa chọn trình tự VEGF-siRNA và KSP-siRNA
3.1.1. Sự biểu hiện của gen VEGF và KSP trên các dòng tế bào ung thư gan và tế bào gan
Trong nghiên cứu này, sự biểu hiện của các gen VEGF và KSP trên các dòng tế bào UTG
Hep3B, HepG2, Huh-7 và dòng tế bào gan THLE-3 được xác định ở mức độ mRNA và protein.
RNA tổng số, protein tổng số và dịch nuôi cấy tế bào được thu nhận từ các dòng tế bào khác nhau.

Hình 3.1. Sự biểu hiện mRNA VEGF và mRNA KSP của các dòng tế bào khác nhau. Đồ thị biểu diễn mức
độ biểu hiện mRNA VEGF (a) và mRNA KSP (b) của tế bào THLE-3 (sử dụng làm chuẩn), Hep3B, HepG2
và Huh-7 được xác định bằng phương pháp real-time qRT-PCR. Gen β-actin được sử dụng làm chứng nội
và dùng để chuẩn hóa kết quả. Kết quả được biểu thị bằng giá trị trung bình ± độ lệch chuẩn của ba lần lặp
lại thí nghiệm (**p < 0,01 khi so sánh với tế bào đối chứng THLE-3).

Hình 3.2. Sự biểu hiện protein VEGF và protein KSP của các dòng tế bào khác nhau. Mức độ biểu hiện
protein VEGF và protein KSP của tế bào THLE-3 (sử dụng làm chuẩn), Hep3B, HepG2 và Huh-7 được xác
định bằng phương pháp Western blot (a). Đồ thị biểu diễn kết quả bán định lượng protein VEGF và protein
KSP của các dòng tế bào khác nhau được xác định bằng phần mềm Image J (b, c). β-actin được sử dụng làm
chứng nội và dùng để chuẩn hóa kết quả. Đồ thị biểu diễn kết quả định lượng protein tiết VEGF bằng
phương pháp ELISA (d). Kết quả được biểu thị bằng giá trị trung bình ± độ lệch chuẩn của ba lần lặp lại thí
nghiệm (**p < 0,01 khi so sánh với tế bào đối chứng THLE-3).
5


Kết quả phân tích real-time qRT-PCR cho thấy mức độ biểu hiện mRNA VEGF và mRNA
KSP của tế bào gan THLE-3 là thấp nhất. Do vậy, mức độ biểu hiện này được sử dụng làm chuẩn
(giá trị bằng 1) khi so sánh với mức độ biểu hiện mRNA của các tế bào UTG. Kết quả cũng cho
thấy mức độ biểu hiện mRNA VEGF và mRNA KSP của các tế bào UTG cao hơn so với tế bào gan
(p < 0,01; Hình 3.1).
Mức độ biểu hiện mRNA phù hợp với mức độ biểu hiện protein tương ứng của các gen mục
tiêu khi phân tích bằng phương pháp Western blot (đối với protein VEGF và protein KSP) và
phương pháp ELISA (đối với protein VEGF). Mức độ biểu hiện protein VEGF và protein KSP của
các tế bào UTG cao hơn khi so sánh với tế bào gan (p < 0,01; Hình 3.2). Ngoài ra, các kết quả phân
tích cũng cho thấy mức độ biểu hiện các gen VEGF và KSP của các dòng tế bào UTG là khác nhau.
Trong đó, dòng tế bào Hep3B và Huh-7 biểu hiện các gen này mạnh hơn so với dòng tế bào HepG2.
Dựa trên kết quả này, nghiên cứu lựa chọn dòng tế bào Hep3B làm mô hình nghiên cứu đánh giá
hiệu quả chuyển siRNA vào tế bào UTG.

3.1.2. Hiệu quả chuyển siRNA trên dòng tế bào ung thư gan Hep3B
Để đánh giá mức độ gây độc cho tế bào được chuyển, CONT-siRNA và FITC – CONTsiRNA được chuyển vào tế bào Hep3B ở các nồng độ khác nhau gồm: 0, 10, 25, 50, 100, 200 nM.
Sau 24 giờ chuyển các siRNA, tỉ lệ tế bào sống được xác định bằng phương pháp WST-1. Kết quả
cho thấy ở nồng độ 10 nM, 25 nM và 50 nM của CONT-siRNA, tỉ lệ tế bào sống là tương đương và
cao nhất. Ngược lại, ở nồng độ siRNA cao hơn, tỉ lệ tế bào sống giảm mạnh. Kết quả tương tự đạt
được khi chuyển FITC – CONT-siRNA. Tỉ lệ tế bào sống cao nhất ở nồng độ 10 nM, 25 nM, 50 nM
và giảm dần khi tăng nồng độ của FITC – CONT-siRNA (Hình 3.3). Kết quả này cho thấy siRNA ít
ảnh hưởng tới tế bào khi được chuyển ở các nồng độ 10 nM, 25 nM và 50 nM.

Hình 3.3. Ảnh hưởng của nồng độ siRNA lên khả sống của tế bào Hep3B khi chuyển CONT-siRNA và
FITC – CONT-siRNA. Khả năng sống của tế bào Hep3B sau khi chuyển các siRNA được xác định bằng
phương pháp WST-1. Đồ thị biểu diễn tỉ lệ tế bào sống khi chuyển CONT-siRNA (a) và FITC – CONTsiRNA (b) sau 24 giờ. Tế bào chỉ được xử lý với lipofectamine (0 nM siRNA) được sử dụng làm chuẩn và
chuẩn hóa kết quả. Kết quả biểu thị bằng giá trị trung bình ± độ lệch chuẩn của ba lần lặp lại thí nghiệm (**p
< 0,01 khi so sánh với tế bào chuyển siRNA với nồng độ 200 nM).

Để đánh giá lượng siRNA có thể chuyển được vào trong tế bào, FITC – CONT-siRNA được
chuyển vào tế bào Hep3B cũng ở các nồng độ khác nhau: 0, 10, 25, 50, 100, 200 nM trong 24 giờ.
Hiệu quả chuyển được đánh giá thông qua tỉ lệ tế bào phát huỳnh quang bằng kỹ thuật FACS. Kết
quả phân tích cho thấy tỉ lệ tế bào phát huỳnh quang cao nhất đạt khi chuyển FITC – CONT-siRNA
với nồng độ 25 nM. Như vậy, nghiên cứu lựa chọn nồng độ siRNA tối ưu là 25 nM. Tiếp theo,
nghiên cứu đánh giá lượng siRNA được chuyển vào tế bào theo thời gian (khoảng 120 giờ). Hiệu
quả chuyển cũng được đánh giá thông qua tỉ lệ tế bào phát huỳnh quang bằng kỹ thuật FACS. Kết
quả cho thấy tín hiệu huỳnh quang được phát hiện thấy trong các tế bào sau 6 giờ, tăng mạnh và duy
trì trong khoảng 24-72 giờ (Hình 3.4).
6


Hình 3.4. Hiệu quả chuyển siRNA vào tế bào Hep3B theo nồng độ và thời gian chuyển. Đồ thị biểu diễn tỉ
lệ tế bào phát huỳnh quang được phát hiện bằng phương pháp FACS sau khi chuyển FITC – CONT-siRNA
theo các nồng độ khác nhau (a) và thời điểm khác nhau (b). Kết quả được biểu thị bằng giá trị trung bình ±

độ lệch chuẩn của ba lần lặp lại thí nghiệm (**p < 0,01 và *p < 0,05 khi so sánh với tế bào chuyển 200 nM
siRNA (a) và tế bào chuyển siRNA sau 120 giờ (b).

Ngoài ra, khi quan sát dưới kính hiển vi huỳnh quang, tế bào phát tín hiệu huỳnh quang cũng
được phát hiện thấy sau 6 giờ chuyển siRNA. Cường độ huỳnh quang tăng dần tới 72 giờ và giảm
dần sau 96 giờ chuyển siRNA (Hình 3.5). Như vậy, nghiên cứu lựa chọn nồng độ chuyển siRNA là
25 nM và thời gian đánh giá hiệu quả của siRNA là 24-72 giờ cho các nghiên cứu tiếp theo.

Hình 3.5. Hiệu quả chuyển FITC – CONT-siRNA vào tế bào Hep3B theo thời gian. Mức độ phát huỳnh
quang của tế bào sau khi chuyển siRNA được quan sát dưới kính hiển vi huỳnh quang tại các thời điểm.

3.1.3. Hiệu quả ức chế sự biểu hiện của VEGF hay KSP bởi các siRNA trên tế bào Hep3B
Các trình tự siRNA ban đầu được chuyển lần lượt vào tế bào Hep3B. Mức độ biểu hiện
mRNA VEGF và mRNA KSP sau 72 giờ được đánh giá bằng phương pháp real-time qRT-PCR.

Hình 3.6. Ảnh hưởng của các siRNA khác nhau lên sự biểu hiện mRNA VEGF và mRNA KSP của tế bào
Hep3B. Đồ thị biểu diễn mức độ biểu hiện mRNA VEGF (a) và mRNA KSP (b) của tế bào sau khi chuyển
các siRNA được xác định bằng phương pháp real-time qRT-PCR. Gen β-actin được sử dụng làm chứng nội
và chuẩn hóa kết quả. Kết quả biểu thị bằng giá trị trung bình ± độ lệch chuẩn của ba lần lặp lại thí nghiệm
(**p < 0,01 và *p < 0,05 khi so sánh với đối chứng).

Theo Hình 3.6, các siRNA đều làm giảm mức độ biểu hiện mRNA VEGF và mRNA KSP
của tế bào Hep3B khi so sánh với đối chứng (p < 0,01 và p < 0,05; Hình 3.6). Ngoài ra, kết quả
cũng cho thấy không có sự khác biệt về mức độ biểu hiện mRNA VEGF và mRNA KSP giữa tế bào
đối chứng và tế bào được chuyển CONT-siRNA (p > 0,05; Hình 3.6). Trong số các siRNA, VEGF-

7


siRNA#1 và KSP-siRNA#2 ức chế sự biểu hiện VEGF và KSP hiệu quả nhất. Do vậy, các trình tự

siRNA này được lựa chọn cho các nghiên cứu tiếp theo với tên gọi VEGF-siRNA và KSP-siRNA.

Hình 3.7. Ảnh hưởng của các siRNA lên sự biểu hiện mRNA VEGF và mRNA KSP của tế bào Hep3B theo
thời gian. Đồ thị biểu diễn mức độ biểu hiện mRNA VEGF (a) và mRNA KSP (b) của tế bào tại các thời
điểm được xác định bằng phương pháp real-time qRT-PCR. Gen β-actin được sử dụng làm chứng nội và
chuẩn hóa kết quả. Kết quả biểu thị bằng giá trị trung bình ± độ lệch chuẩn của ba lần lặp lại thí nghiệm (**p
< 0,01 và *p < 0,05 khi so sánh với đối chứng).

Hình 3.8. Ảnh hưởng của các siRNA lên sự biểu hiện protein VEGF và protein KSP của tế bào Hep3B theo
thời gian. Mức độ biểu hiện protein VEGF và protein KSP của tế bào tại các thời điểm sau khi chuyển
siRNA được xác định bằng phương pháp Western blot (a). Đồ thị biểu diễn kết quả bán định lượng protein
VEGF và protein KSP của tế bào được xác định bằng phần mềm Image J (b, c). β-actin được sử dụng làm
chứng nội và dùng để chuẩn hóa kết quả. Đồ thị biểu diễn kết quả định lượng protein tiết VEGF được xác
định bằng phương pháp ELISA (d). Kết quả biểu thị bằng giá trị trung bình ± độ lệch chuẩn của ba lần lặp
lại thí nghiệm (**p < 0,01 và *p < 0,05 khi so sánh với đối chứng).

Tiếp theo, nghiên cứu đánh giá hiệu quả ức chế sự biểu hiện gen đích theo thời gian bởi các
siRNA được lựa chọn. Thời gian khảo sát dựa trên kết quả đánh giá hiệu quả chuyển siRNA vào tế
bào Hep3B theo thời gian (24-72 giờ). Đối với gen VEGF, kết quả phân tích real-time qRT-PCR
8


cho thấy mức độ biểu hiện mRNAVEGF của tế bào giảm mạnh ở thời điểm 48 giờ và 72 giờ sau khi
chuyển VEGF-siRNA so với đối chứng (p < 0,01; Hình 3.7). Trong khi đó, mức độ biểu hiện
mRNAVEGF thay đổi không đáng kể ở tế bào chuyển CONT-siRNA sau 72 giờ (p > 0,05; Hình
3.7). Ảnh hưởng ức chế của VEGF-siRNA lên sự biểu hiện protein VEGF trong tế bào cho kết quả
tương tự khi xác định bằng phương pháp Western blot và ELISA (p < 0,01; Hình 3.8). Tương tự với
gen KSP, mức độ biểu hiện mRNA KSP của tế bào bắt đầu thay đổi sau 24 giờ và giảm mạnh sau
48, 72 giờ khi so sánh với đối chứng (p < 0,01; Hình 3.7). Ảnh hưởng của KSP-siRNA lên sự biểu
hiện protein KSP trong tế bào cho kết quả tương tự khi phân tích bằng phương pháp Western blot (p

< 0,01 và p < 0,05; Hình 3.8).
Như vậy, các kết quả trên cho thấy hiệu quả ức chế sự biểu hiện của VEGF và KSP trên tế
bào Hep3B bởi VEGF-siRNA và KSP-siRNA tăng mạnh sau 48-72 giờ chuyển siRNA.
3.2. Kết quả đánh giá ảnh hưởng của siRNA lên các tế bào ung thư gan người
3.2.1. Hiệu quả ức chế đồng thời hay riêng biệt sự biểu hiện của VEGF và KSP bởi các
siRNA trên các tế bào ung thư gan và tế bào gan người
Để làm rõ hơn hiệu quả ức chế sự biểu hiện các gen mục tiêu bởi siRNA, nghiên cứu đánh
giá hiệu quả ức chế đồng thời hay riêng biệt sự biểu hiện của VEGF và KSP trên các dòng tế bào
UTG khác nhau gồm Hep3B, HepG2, Huh-7 và dòng tế bào gan THLE-3. Sự thay đổi biểu hiện của
gen đích được xác định ở mức độ mRNA và protein sau 72 giờ chuyển siRNA.
Theo Hình 3.9, khi so sánh với đối chứng, mức độ biểu hiện mRNA VEGF của tế bào
Hep3B, HepG2 và Huh-7 sau khi chuyển VEGF-siRNA lần lượt là 24,68 ± 3,03%; 54,99 ± 1,94%
và 20,29 ± 1,35% (p < 0,01; Hình 3.9). Hiệu quả ức chế sự biểu hiện protein VEGF bởi VEGFsiRNA trên các dòng tế bào UTG cũng cho kết quả tương tự khi phân tích bằng phương pháp
Western blot (p < 0,01; Hình 3.10) và ELISA (Hình 3.11). Tuy nhiên, hiệu quả ức chế sự biểu hiện
của gen VEGF bởi VEGF-siRNA trong tế bào HepG2 thấp hơn khi so sánh với tế bào Hep3B và
Huh-7. Ngoài ra, hiệu quả ức chế sự biểu hiện mRNA VEGF trong tế bào THLE-3 bởi VEGFsiRNA gần như không phát hiện khi so sánh với đối chứng (p > 0,05; Hình 3.9). Nghiên cứu phát
hiện thấy một điểm thú vị trên cả 3 dòng tế bào Hep3B, HepG2 và Huh-7 sau khi chuyển VEGFsiRNA. Bên cạnh sự biểu hiện của VEGF bị ức chế bởi VEGF-siRNA, sự biểu hiện của KSP cũng
bị ức chế một phần bởi VEGF-siRNA. Tuy nhiên, tác động ức chế của VEGF-siRNA lên sự biểu
hiện của KSP cũng không giống nhau giữa các dòng tế bào UTG. Khi so sánh với đối chứng, mức
độ biểu hiện mRNA KSP trong tế bào Hep3B, HepG2 và Huh-7 sau khi chuyển VEGF-siRNA lần
lượt là 59,34 ± 2,96%; 76,74 ± 4,37% và 62,17 ± 2,65% (p < 0,01 và p < 0,05; Hình 3.9). Mức độ
ức chế sự biểu hiện protein KSP trên các dòng tế bào bởi VEGF-siRNA cho kết quả tương tự khi
phân tích bằng phương pháp Western blot (Hình 3.10) và ELISA (Hình 3.11).
Tương tự, sự biểu hiện của gen KSP trên các tế bào Hep3B, HepG2 và Huh-7 bị ức chế mạnh
bởi KSP-siRNA (p < 0,01; Hình 3.9 và Hình 3.10). Trong khi đó, KSP-siRNA chỉ ức chế một phần
nhỏ sự biểu hiện mRNA KSP của tế bào THLE-3. Mức độ biểu hiện mRNA KSP của tế bào THLE3 sau khi chuyển KSP-siRNA là 89,72 ± 2,01% (p > 0,05; Hình 3.9). Ngoài ra, kết quả kiểm tra ở
mức độ mRNA và protein của VEGF cho thấy KSP-siRNA không ảnh hưởng tới sự biểu hiện của
gen VEGF trên cả ba dòng tế bào UTG được sử dụng trong nghiên cứu này.
Bên cạnh đó, kết quả cũng cho thấy hiệu quả ức chế đồng thời sự biểu hiện các gen đích bởi
cocktail siRNA trên các tế bào UTG. Mức độ biểu hiện của mRNA VEGF không có khác biệt giữa

cocktail siRNA và VEGF-siRNA trên cả 3 dòng tế bào (Hình 3.9). Kết quả này phù hợp với kết quả
định lượng protein VEGF bằng phương pháp Western blot và ELISA (Hình 3.10 và Hình 3.11).
Ngược lại, cocktail siRNA ức chế sự biểu hiện KSP mạnh hơn KSP-siRNA trên dòng tế bào Hep3B
9


và Huh-7 (p < 0,05; Hình 3.9 và Hình 3.10). Tuy nhiên, kết quả này không lặp lại trên dòng tế bào
HepG2 (p > 0,05; Hình 3.9 và Hình 3.10).

Hình 3.9. Ảnh hưởng của các siRNA lên sự biểu hiện mRNA VEGF và mRNA KSP của các dòng tế bào
gan khác nhau. Đồ thị biểu diễn mức độ biểu hiện mRNA VEGF và mRNA KSP của tế bào Hep3B (a),
HepG2 (b), Huh-7(c) và THLE-3 (d) sau khi chuyển siRNA được xác định bằng phương pháp real-time
qRT-PCR. Gen β-actin được sử dụng làm chứng nội và dùng để chuẩn hóa kết quả. Kết quả biểu thị bằng
giá trị trung bình ± độ lệch chuẩn của ba lần lặp lại thí nghiệm (**p < 0,01 và *p < 0,05 khi so sánh với đối
chứng. #p < 0,05 khi so sánh với cocktail siRNA).
10


Hình 3.10. Ảnh hưởng của các siRNA lên sự biểu hiện protein VEGF và protein KSP của các tế bào UTG.
Mức độ biểu hiện protein VEGF và KSP của tế bào Hep3B, HepG2 và Huh-7 sau khi chuyển siRNA được
xác định bằng phương pháp Western blot (a). Đồ thị biểu diễn kết quả bán định lượng protein VEGF và KSP
của tế bào Hep3B (b), HepG2 (c) và Huh-7 (d) bằng phần mềm Image J. β-actin được sử dụng làm chứng
nội và dùng để chuẩn hóa kết quả. Kết quả biểu thị bằng giá trị trung bình ± độ lệch chuẩn của ba lần lặp lại
thí nghiệm (**p < 0,01; *p < 0,05 khi so sánh với đối chứng và #p < 0,05 khi so sánh với cocktail siRNA).

Như vậy, kết quả cho thấy các siRNA không ảnh hưởng tới sự biểu hiện của VEGF và KSP
trên dòng tế bào gan. Ngược lại, KSP-siRNA ức chế mạnh sự biểu hiện của KSP, VEGF-siRNA ức
chế sự biểu hiện của VEGF và một phần sự biểu hiện của KSP trên cả ba dòng tế bào UTG Hep3B,
HepG2 và Huh-7. Trong đó, cocktail siRNA ức chế sự biểu hiện của KSP mạnh hơn so với KSPsiRNA và VEGF-siRNA. Tuy nhiên, hiệu quả ức chế này là khác biệt giữa các tế bào UTG.
11

Hình 3.11. Ảnh hưởng của các siRNA lên mức độ tiết protein VEGF của các dòng tế bào UTG. Đồ thị biểu
diễn hàm lượng protein tiết VEGF của tế bào Hep3B, HepG2 và Huh-7 sau khi chuyển các siRNA được xác
định bằng phương pháp ELISA. Kết quả biểu thị bằng giá trị trung bình ± độ lệch chuẩn của ba lần lặp lại thí
nghiệm (**p < 0,01 khi so sánh với đối chứng).

3.2.2. Ảnh hưởng của các siRNA lên sự tăng sinh của tế bào ung thư gan và tế bào gan
Sự giảm điều hòa biểu hiện của các gen đích có thể ảnh hưởng tới sự tăng sinh của tế bào. Để
đánh giá tác động của siRNA lên sự tăng sinh của tế bào, các tế bào UTG được chuyển riêng biệt
hay đồng thời các siRNA. Tế bào gan THLE-3 được xử lý tương tự làm đối chứng. Mức độ ức chế
tăng sinh của tế bào được xác định thông qua giá trị hấp thu OD bằng phương pháp WST-1.

Hình 3.12. Ảnh hưởng của các siRNA lên khả năng tăng sinh của các dòng tế bào. Biểu đồ biểu diễn sự tăng
sinh của tế bào Hep3B, HepG2, Huh-7 và THLE-3 sau khi chuyển siRNA được xác định bằng phương pháp
WST-1 tại các thời điểm khác. Kết quả biểu thị bằng giá trị trung bình ± độ lệch chuẩn của ba lần lặp lại thí
nghiệm (**p < 0,01 và *p < 0,05 khi so sánh với đối chứng, #p < 0,05 khi so sánh với cocktail siRNA).

Kết quả cho thấy trên hai dòng tế bào Hep3B và Huh-7, giá trị OD của tế bào ở 48 giờ và 72
giờ sau khi chuyển VEGF-siRNA thấp hơn so với giá trị OD của tế bào đối chứng (p < 0,01; Hình
12


3.12). Điều này chứng tỏ sự giảm điều hòa biểu hiện của VEGF ức chế đáng kể sự tăng sinh của tế
bào. Kết quả đạt được tương tự với KSP-siRNA (p < 0,01; Hình 3.12). Trong khi đó, giá trị OD của
tế bào được chuyển cocktail siRNA thấp nhất khi so sánh với các giá trị OD của tế bào được chuyển
VEGF-siRNA hay KSP-siRNA tại thời điểm 48 giờ và 72 giờ (p < 0,05; Hình 3.12). Điều này cho
thấy cocktail siRNA ức chế sự tăng sinh của tế bào hiệu quả nhất. Tuy nhiên, các kết quả có sự khác
biệt khi lặp lại thí nghiệm trên tế bào HepG2 và THLE-3. Với tế bào HepG2, KSP-siRNA ức chế sự
tăng sinh của tế bào tại các thời điểm 48 giờ và 72 giờ sau khi so sánh với đối chứng (p < 0,01;

Hình 3.12). Ngược lại, hiệu quả ức chế tăng sinh tế bào bởi VEGF-siRNA khá thấp và chỉ quan sát
thấy sau 72 giờ chuyển siRNA (p < 0,05; Hình 3.12). Với tế bào THLE-3, VEGF-siRNA và KSPsiRNA không ảnh hưởng tới sự tăng sinh của tế bào gan (p > 0,05; Hình 3.12).
Như vậy, việc chuyển đồng thời hay riêng biệt VEGF-siRNA và KSP-siRNA đều ức chế tăng
sinh của các tế bào UTG ở mức độ khác nhau. Trong đó, việc chuyển đồng thời các siRNA có hiệu
quả ức chế sự tăng sinh tế bào cao nhất. Tuy nhiên, siRNA không ảnh hưởng tới sự tăng sinh của tế
bào gan. Kết quả đánh giá ảnh hưởng của các siRNA lên sự tăng sinh của tế bào phù hợp với kết
quả đánh giá hiệu quả ức chế sự biểu hiện của VEGF và KSP trên các dòng tế bào khác nhau.
3.2.3. Ảnh hưởng của siRNA lên sự cảm ứng apoptosis của tế bào ung thư gan và tế bào gan
Sự ức chế biểu hiện gen đích bởi các siRNA làm giảm sự tăng sinh của tế bào. Sự ức chế
tăng sinh của tế bào có thể liên quan tới sự cảm ứng apoptosis của tế bào sau khi chuyển siRNA. Do
vậy, để đánh giá sự cảm ứng apoptosis của siRNA trên các dòng tế bào, tế bào được nhuộm đồng
thời với protein Annexin-V-FITC và chất nhuộm nhân huỳnh quang PI. Tỉ lệ tế bào apoptosis được
xác định bằng kỹ thuật FACS trên hệ thống flow cytometry.
Kết quả nghiên cứu trên cho thấy hiệu quả ức chế sự biểu hiện của VEGF và KSP bởi siRNA
trên tế bào Hep3B theo thời gian. Do vậy, nghiên cứu đánh giá ảnh hưởng của các siRNA lên sự
cảm ứng apoptosis của tế bào Hep3B theo thời gian. Kết quả cho thấy tỉ lệ apoptosis của tế bào
được chuyển VEGF-siRNA bắt đầu thay đổi sau 24 giờ, tăng mạnh sau 48 giờ (14,02 ± 1,97%) và
72 giờ (23,32 ± 2,36%) khi so sánh với đối chứng (4,15 ± 1,59%) (p < 0,01; Hình 3.13). Tương tự
như vậy, mức độ cảm ứng apoptosis của tế bào Hep3B cũng tăng dần theo thời gian sau khi chuyển
KSP-siRNA (p < 0,01; Hình 3.13). Như vậy, VEGF-siRNA và KSP-siRNA có thể cảm ứng
apoptosis ở tế bào Hep3B và tỉ lệ apoptosis tăng dần theo thời gian khi so sánh với đối chứng. Kết
quả này phù hợp với kết quả đánh giá sự giảm điều hòa biểu hiện của VEGF và KSP trong tế bào
Hep3B bởi các siRNA theo thời gian.

Hình 3.13. Ảnh hưởng của các siRNA lên sự cảm ứng apoptosis của tế bào Hep3B theo thời gian. Đồ thị
biểu diễn tỉ lệ apoptosis của tế bào Hep3B sau khi chuyển VEGF-siRNA (a) hay KSP-siRNA (b) tại các thời
điểm khác nhau. Kết quả biểu thị bằng giá trị trung bình ± độ lệch chuẩn của ba lần lặp lại thí nghiệm (**p <
0,01 khi so sánh với đối chứng).
13

Tiếp theo, nghiên cứu đánh giá sự cảm ứng apoptosis khi chuyển đồng thời hay riêng biệt các
siRNA trên tế bào UTG và tế bào gan. Kết quả phân tích FACS cho thấy các siRNA làm tăng tỉ lệ
apoptosis của tế bào Hep3B (21,89 ± 1,50% với VEGF-siRNA; 17,66 ± 2,53% với KSP-siRNA và
30,87 ± 1,65% với cocktail siRNA) khi so sánh với đối chứng (p < 0,01; Hình 3.14). Trong đó,
cocktail siRNA làm tăng tỉ lệ apoptosis cao nhất (p < 0,05; Hình 3.14). Kết quả đạt được tương tự
trên tế bào Huh-7 (p < 0,01; Hình 3.14). Tuy nhiên, với tế bào HepG2, VEGF-siRNA làm tăng tỉ lệ
tế bào apoptosis (10,91 ± 0,75%) thấp hơn so với KSP-siRNA (20,57 ± 0,89%) và cocktail siRNA
(19,30 ± 2,23%), mặc dù các tỉ lệ này vẫn cao hơn khi so sánh với đối chứng (p < 0,05 và p < 0,01;
Hình 3.14). Kết quả cũng cho thấy không có sự khác biệt về tỉ lệ apoptosis của tế bào HepG2 khi tế
bào được chuyển KSP-siRNA và cocktail siRNA (p > 0,05; Hình 3.14). Ngược lại, các siRNA
không ảnh hưởng đến sự cảm ứng apoptosis trên tế bào gan THLE-3 (p > 0,05; Hình 3.14).

Hình 3.14. Ảnh hưởng của các siRNA lên sự cảm ứng apoptosis của các dòng tế bào khác nhau. Đồ thị biểu
diễn tỉ lệ apoptosis của tế bào Hep3B, HepG2, Huh-7 và THLE-3 sau khi chuyển siRNA. Kết quả biểu thị
bằng giá trị trung bình ± độ lệch chuẩn của ba lần lặp lại thí nghiệm (**p < 0,01 và *p < 0,05 khi so sánh với
đối chứng, #p < 0,05 khi so sánh với cocktail siRNA).

Như vậy, sự giảm điều hòa biểu hiện đồng thời hay riêng biệt các gen đích bởi các siRNA có
thể cảm ứng apoptosis trên các tế bào UTG. Hơn nữa, mức độ cảm ứng apoptosis bởi việc ức chế
đồng thời sự biểu hiện của VEGF và KSP trên các tế bào UTG cao hơn so với sự ức chế riêng biệt
từng gen. Tuy nhiên, ảnh hưởng này có sự khác biệt trên mỗi dòng tế bào. Các kết quả này phù hợp
với kết quả đánh giá ảnh hưởng của siRNA lên sự tăng sinh của các tế bào UTG và tế bào gan.
3.2.4. Sự thay đổi biểu hiện các nhân tố ảnh hưởng đến sự tăng sinh và cảm ứng apoptosis
của tế bào sau khi chuyển các siRNA
Ở cấp độ tế bào, sự ức chế biểu hiện của gen VEGF và KSP ảnh hưởng mạnh tới sự tăng sinh
và cảm ứng apoptosis của tế bào UTG. Ở cấp độ phân tử, các siRNA ảnh hưởng như thế nào tới sự
biểu hiện một số nhân tố kiểm soát quá trình apoptosis – tăng sinh của tế bào. Vì vậy, nghiên cứu
đánh giá sự thay đổi biểu hiện của một số gen ảnh hưởng tới quá trình apoptosis của tế bào, bao
gồm gen kháng apoptosis (BCL-2, Survivin) và gen cảm ứng apoptosis (Caspase-3, Caspase-7). Sự

thay đổi biểu hiện của các gen này trong tế bào Hep3B sau 72 giờ chuyển siRNA được đánh giá ở
mức độ mRNA và protein.
Kết quả nghiên cứu cho thấy mức độ biểu hiện của mRNA BCL-2 và mRNA Survivin trong
tế bào Hep3B được xử lý với VEGF-siRNA, KSP-siRNA và cocktail siRNA lần lượt là 52,43 ±
2,21%; 56,22 ± 4,16%; 39,26 ± 5,20% (với mRNA BCL-2) và 42,36 ± 4,05%; 53,25 ± 5,03%;
29,88 ± 4,26% (với mRNA Survivin). Điều này chứng tỏ các siRNA ức chế sự biểu hiện của mRNA
BCL-2 và mRNA Survivin trong tế bào Hep3B khi so sánh với đối chứng (p < 0,01; Hình 3.15).
Trong đó, cocktail siRNA cho hiệu quả ức chế biểu hiện cao nhất. Tuy nhiên, không có khác biệt về
14


mức độ biểu hiện mRNA của BCL-2 và Survivin giữa CONT-siRNA và đối chứng (p > 0,05; Hình
3.15). Kết quả lặp lại tương tự khi kiểm tra mức độ biểu hiện protein BCL-2 và protein Survivin
trong tế bào Hep3B bằng phương pháp Western blot (Hình 3.15).

Hình 3.15. Ảnh hưởng của siRNA lên sự biểu hiện BCL-2 và Survivin trong tế bào Hep3B. Đồ thị biểu diễn
mức độ biểu hiện mRNA BCL-2 (a) và mRNA Survivin (b) của tế bào được xác định bằng phương pháp
real-time qRT-PCR. Sự biểu hiện protein được xác định bằng phương pháp Western blot (c). Đồ thị biểu
diễn kết quả bán định lượng protein BCL-2 (d) và protein Survivin (e) bằng phần mềm Image J. Gen β-actin
được sử dụng làm chứng nội và chuẩn hóa kết quả. Kết quả biểu thị bằng giá trị trung bình ± độ lệch chuẩn
của ba lần lặp lại thí nghiệm (**p < 0,01 khi so sánh với đối chứng. #p < 0,05 và ##p < 0,01 khi so sánh với
cocktail siRNA).

Bên cạnh đó, sự biểu hiện các gen cảm ứng apoptosis Caspase-3/-7 được kiểm tra theo sau
sự giảm biểu hiện của VEGF và KSP trong tế bào Hep3B. Kết quả cho thấy khi so sánh với đối
chứng, mức độ biểu hiện mRNA trong tế bào được xử lý với VEGF-siRNA, KSP-siRNA và
cocktail siRNA lần lượt cao gấp 1,71 ± 0,08 lần; 1,55 ± 0,13 lần; 1,99 ± 0,07 lần đối với Caspase-3
và 1,34 ± 0,07 lần; 1,41 ± 0,09 lần; 1,66 ± 0,07 lần đối với Caspase-7. Điều này chứng tỏ các
siRNA làm tăng mức độ biểu hiện của mRNA Caspase-3/-7 trong tế bào Hep3B. Trong đó, cocktail
siRNA làm tăng biểu hiện mRNA Caspase-3/-7 cao nhất (p < 0,05 và p < 0,01; Hình 3.16). Ngoài

ra, sự thay đổi protein Caspase-3/-7 cho kết quả tương tự khi kiểm tra hoạt tính tương đối của
Caspase-3/-7 trong tế bào Hep3B (p < 0,05; Hình 3.16). Tuy nhiên, không có sự khác biệt về hoạt
tính của Caspase-3/-7 giữa tế bào được chuyển cocktail siRNA và tế bào được chuyển VEGFsiRNA hay KSP-siRNA (p > 0,05; Hình 3.16).
15


Hình 3.16. Ảnh hưởng của các siRNA sự biểu hiện của Caspase-3/-7 trong tế bào Hep3B. Đồ thị biểu diễn
mức độ biểu hiện mRNA Caspase-3 (a) và mRNA Caspase-7 (b) của tế bào được xác định bằng phương
pháp real-time qRT-PCR. Đồ thị biểu diễn kết quả định lượng hoạt tính tương đối của protein Caspase-3/-7
trong tế bào được xác định bằng phương pháp đo cường độ quang (c). Kết quả biểu thị bằng giá trị trung
bình ± độ lệch chuẩn của ba lần lặp lại thí nghiệm (**p < 0,01 và *p < 0,05 khi so sánh với đối chứng, #p <
0,05 khi so sánh với cocktail siRNA).

Như vậy, sự ức chế biểu hiện của VEGF hay KSP làm tăng mức độ biểu hiện của Caspase-3
và Caspase-7. Đây cũng có thể là yếu tố dẫn tới làm tăng tỉ lệ apoptosis và gây chết tế bào Hep3B
sau khi chuyển các siRNA.
3.2.5. Ảnh hưởng của các siRNA lên một số đặc tính khác của các tế bào ung thư gan người
3.2.5.1. Ảnh hưởng của các siRNA lên khả năng sống của tế bào ung thư gan người
Bên cạnh hiệu quả ức chế tăng sinh và cảm ứng apoptosis trên các tế bào UTG bởi siRNA,
nghiên cứu cũng đánh giá ảnh hưởng của siRNA lên một số đặc tính sinh học khác của tế bào ung
thư như khả năng sống, khả năng di cư, di căn và khả năng kích thích tế bào nội mô tạo mạch.
Hiệu quả ức chế khả năng sống của tế bào sau khi chuyển siRNA được kiểm tra bằng thử
nghiệm hình thành bào lạc từ tế bào đơn khi nuôi cấy ở mật độ thấp. So với đối chứng, khả năng
hình thành bào lạc của các tế bào UTG giảm đáng kể khi ức chế đồng thời hay riêng biệt sự biểu
hiện của VEGF và KSP (p < 0,05 và p < 0,01, Hình 3.17). Tuy nhiên, số lượng bào lạc hình thành
từ tế bào ức chế đồng thời VEGF và KSP thấp hơn so với tế bào ức chế riêng biệt mỗi gen chỉ quan
sát thấy trên tế bào Hep3B và Huh-7 (p < 0,05; Hình 3.17). Như vậy, hiệu quả ức chế khả năng
sống của tế bào tương đồng với hiệu quả ức chế sự biểu hiện của gen mục tiêu và ức chế tăng sinh tế
bào bởi siRNA trên các tế bào UTG.

Hình 3.17. Ảnh hưởng của siRNA lên sự hình thành bào lạc của các dòng tế bào UTG. Biểu đồ biểu diễn số
lượng bào lạc hình thành từ tế bào Hep3B, HepG2 và Huh-7 sau khi chuyển siRNA được xác định bằng
phương pháp pha loãng tới hạn. Kết quả biểu thị bằng giá trị trung bình ± độ lệch chuẩn của ba lần lặp lại thí
nghiệm (**p < 0,01 và *p < 0,05 khi so sánh với đối chứng, #p < 0,05 khi so sánh với cocktail siRNA).
16


3.2.5.2. Ảnh hưởng của siRNA lên khả năng di cư, di căn in vitro của các tế bào ung thư gan
Khả năng di cư, di căn là một trong những đặc tính sinh học đặc trưng của tế bào ung thư.
Đặc tính này phụ thuộc vào các yếu tố như khả năng sống và tăng sinh của tế bào, sự tương tác giữa
tế bào với tế bào và giữa tế bào với môi trường ngoại bào… Do vậy, sự ức chế khả năng sống và
tăng sinh của tế bào bởi siRNA có thể ảnh hưởng tới sự di cư, di căn của tế bào UTG. Sự di căn của
các tế bào UTG sau khi chuyển siRNA được đánh giá thông qua thử nghiệm di căn in vitro trên mô
hình đĩa nuôi cấy có hai khoang được ngăn cách bởi cấu trúc màng nhân tạo (transwell plate).
Theo Hình 3.18, dòng tế bào Hep3B và Huh-7 được chuyển đồng thời hay riêng biệt các
siRNA có số lượng tế bào di căn thấp hơn so với tế bào đối chứng (p < 0,01 và p < 0,05; Hình
3.18). Trong đó, số lượng tế bào di căn thấp nhất ở nhóm tế bào được chuyển đồng thời VEGFsiRNA và KSP-siRNA. Kết quả này chứng tỏ việc ức chế đồng thời hay riêng biệt sự biểu hiện của
VEGF và KSP đều làm giảm khả năng di căn in vitro của tế bào Hep3B và Huh-7. Tuy nhiên, kết
quả này không lặp lại khi thử nghiệm trên dòng tế bào HepG2. Kết quả cho thấy chỉ KSP-siRNA
làm giảm sự di căn in vitro của tế bào HepG2 khi so sánh với đối chứng (p < 0,05; Hình 3.18). Điều
này được làm rõ hơn khi so sánh số lượng tế bào HepG2 di căn giữa các nhóm tế bào được xử lý với
cocktail siRNA và KSP-siRNA. Ngoài ra, CONT-siRNA không ảnh hưởng tới số lượng tế bào di
căn ở cả ba dòng tế bào UTG.

Hình 3.18. Ảnh hưởng của các siRNA lên sự di căn in vitro của các tế bào UTG. Đồ thị biểu diễn số lượng
tế bào di căn của tế bào Hep3B, HepG2 và Huh-7 sau khi chuyển siRNA được xác định bằng phương pháp
đếm số lượng tế bào. Kết quả biểu thị bằng giá trị trung bình ± độ lệch chuẩn của ba lần lặp lại thí nghiệm
(**p < 0,01 và *p < 0,05 khi so sánh với đối chứng, #p < 0,05 khi so sánh với cocktail siRNA).

Bên cạnh việc đánh giá sự di căn in vitro của tế bào, nghiên cứu cũng đánh giá sự di cư in

vitro của tế bào sau khi chuyển siRNA dựa trên mô hình liền hóa các vết rạch. Mức độ di cư của tế
bào được xác định thông qua khoảng cách di chuyển của tế bào từ vị trí biên đến vị trị trung tâm của
vết rạch. Theo Hình 3.19, với thử nghiệm trên tế bào Hep3B, khoảng cách di chuyển của tế bào
được chuyển VEGF-siRNA, KSP-siRNA hay cocktail siRNA sau 48 giờ và 72 giờ ngắn hơn so với
đối chứng hoặc tế bào được chuyển CONT-siRNA. Trong đó, tế bào được xử lý với cocktail siRNA
có khoảng cách di chuyển thấp nhất (p < 0,01 và p < 0,05; Hình 3.19). Kết quả chứng tỏ các siRNA
ức chế sự di cư của tế bào Hep3B sau 48-72 giờ. Hơn nữa, cocktail siRNA làm giảm khả năng di cư
của tế bào cao nhất khi so sánh với VEGF-siRNA hay KSP-siRNA. Tương tự như vậy, các kết quả
này được lặp lại khi thử nghiêm trên dòng tế bào Huh-7. Tuy nhiên, có sự khác biệt khi lặp lại thí
nghiệm trên dòng tế bào HepG2. KSP-siRNA và cocktail siRNA có ảnh hưởng nhất định lên sự di
cư của tế bào sau 48-72 giờ. Ngược lại, ảnh hưởng của VEGF-siRNA lên sự di cư của tế bào HepG2
chỉ được quan sát thấy sau 72 giờ (p < 0,05; Hình 3.19). Ngoài ra, kết quả cho thấy không có sự
khác biệt về mức độ ức chế khả năng di cư của tế bào HepG2 bởi KSP-siRNA và cocktail siRNA.
17


Hình 3.19. Ảnh hưởng của các siRNA lên sự di cư in vitro của các dòng tế bào UTG. Đồ thị biểu diễn
khoảng cách di cư của tế bào Hep3B, HepG2 và Huh-7 sau khi chuyển siRNA được xác định bằng phương
pháp đo khoảng cách di chuyển tương đối của tế bào. Kết quả biểu thị bằng giá trị trung bình ± độ lệch
chuẩn của ba lần lặp lại thí nghiệm (**p < 0,01 và *p < 0,05 khi so sánh với đối chứng, ##p < 0,01 và #p <
0,05 khi so sánh với cocktail siRNA).

Như vậy, các siRNA có ảnh hưởng tới sự di cư và di căn in vitro của các tế bào, mặc dù ảnh
hưởng này có sự khác biệt giữa các dòng tế bào UTG. Kết quả đánh giá ảnh hưởng của siRNA lên
đặc tính di cư và di căn in vitro của tế bào phù hợp với kết quả đánh giá hiệu quả ức chế sự biểu
hiện của gen đích trên mỗi dòng tế bào UTG.
3.2.5.3. Ảnh hưởng của siRNA lên sự hình thành mạch in vitro của tế bào nội mô HUVEC
Khả năng kích thích các tế bào nội mô hình thành mạch cũng là một đặc tính sinh học cơ bản
của tế bào ung thư, đặc biệt là các tế bào biểu hiện mạnh VEGF như tế bào UTG. Do vậy, nghiên
cứu tiến hành cảm ứng tế bào nội mô HUVEC với môi trường nuôi cấy tế bào Hep3B đã được xử lý

với các siRNA. Hiệu quả kích thích tế bào nội mô hình thành mạch được đánh giá thông qua số
lượng điểm nhánh (ngã ba) hình thành khi tế bào nội mô được nuôi cấy trên môi trường bán rắn.
Kết quả nghiên cứu cho thấy khi so sánh với đối chứng, sự hình thành cấu trúc mạch in vitro
của tế bào nội mô HUVEC trên nền gel matrix chỉ giảm khi tế bào được nuôi cấy trong dịch nuôi
cấy từ tế bào Hep3B được xử lý với VEGF-siRNA hoặc cocktail siRNA (p < 0,05; Hình 3.20). Tuy
nhiên, hiệu quả ức này không có khác biệt giữa cocktail siRNA và VEGF-siRNA (p > 0,05; Hình
3.20). Ngược lại, khả năng hình thành mạch của tế bào HUVEC khi cảm ứng bằng dịch nuôi cấy từ
tế bào Hep3B được xử lý với KSP-siRNA hay CONT-siRNA là tương đương với đối chứng (p >
0,05; Hình 3.20). Điều này chứng tỏ rằng chỉ có VEGF-siRNA ức chế khả năng hình thành mạch
của tế bào HUVEC thông qua sự ức chế biểu hiện gen VEGF và giảm lượng VEGF được tiết ra môi
trường nuôi cấy. Ngược lại, KSP-siRNA không ảnh hưởng tới sự tạo mạch của tế bào HUVEC.
18


Hình 3.20. Sự ức chế hình thành cấu trúc mạch bởi các siRNA được phát hiện trên mô hình tế bào nội mô
HUVEC. Đồ thị biểu diễn số lượng điểm nhánh (ngã ba) được ghi nhận ở các nghiệm thức. Kết quả biểu thị
bằng giá trị trung bình ± độ lệch chuẩn của ba lần lặp lại thí nghiệm *p < 0,05 khi so sánh với đối chứng.

Để làm rõ sự tác động của VEGF tiết ra từ tế bào Hep3B ảnh hưởng lên sự hình thành mạch
của tế bào HUVEC, sự biểu hiện protein thụ thể của VEGF (VEGFR2) được kiểm tra trên tế bào
UTG và tế bào HUVEC. Ngoài ra, sự biểu hiện của ANG2 trong tế bào HUVEC cũng được đánh giá
ở hai mức độ mRNA và protein. Kết quả phân tích Western lot cho thấy các tế bào UTG và tế bào
HUVEC đều biểu hiện VEGFR2 (Hình 3.21). Điều này chứng tỏ VEGF tiết ra bởi tế bào UTG có
thể tác động lên tế bào nội mô và chính tế bào UTG thông qua tương tác giữa VEGF và VEGFR2.

Hình 3.21. Sự biểu hiện protein VEGFR2 trên các dòng tế bào và ảnh hưởng của các siRNA lên sự biểu
hiện của ANG2 trên tế bào HUVEC. Sự biểu hiện protein VEGFR2 và ANG2 được xác định bằng phương
pháp Western blot (a, c). Đồ thị biểu diễn mức độ biểu hiện mRNA ANG2 được xác định bằng phương pháp
real-time qRT-PCR (b). Đồ thị biểu diễn kết quả bán định lượng protein ANG2 bằng phần mềm Image J (d).
Gen β-actin được sử dụng làm chứng nội và dùng để chuẩn hóa kết quả. Kết quả biểu thị bằng giá trị trung

bình ± độ lệch chuẩn của ba lần lặp lại thí nghiệm **p < 0,01 khi so sánh với đối chứng).
19


Ngoài ra, VEGF-siRNA hay cocktail siRNA ức chế sự biểu hiện của ANG2 trong tế bào
HUVEC. Cụ thể, mức độ biểu hiện ANG2 của tế bào HUVEC khi nuôi cấy trong môi trường thông
thường không có VEGF (đối chứng âm) thấp hơn so với khi nuôi cấy trong dịch nuôi cấy tế bào
Hep3B đối chứng. Trong khi đó, khi nuôi cấy với dịch môi trường tế bào được chuyển VEGFsiRNA, mức độ biểu hiện ANG2 của tế bào giảm đáng kể khi so sánh với đối chứng (p < 0,01; Hình
3.21). Kết quả đạt được tương tự khi nuôi cấy tế bào HUVEC với dịch nuôi cấy của tế bào Hep3B
được xử lý với cocktail siRNA. Ngược lại, dịch nuôi cấy tế bào Hep3B xử lý với KSP-siRNA hay
CONT-siRNA không ảnh hưởng tới sự biểu hiện ANG2 của tế bào HUVEC (p > 0,05; Hình 3.21).
Như vậy, VEGF-siRNA hay cocktail siRNA có thể ức chế sự biểu hiện của ANG2 trong tế
bào HUVEC thông qua việc tác động lên protein tiết VEGF của tế bào UTG, dẫn tới ức chế sự hình
thành cấu trúc mạch của tế bào nội mô.
3.3. Kết quả đánh giá hiệu quả ức chế tăng sinh tế bào ung thư gan người in vitro khi phối
hợp siRNA với Doxorubicin
3.3.1. Mức độ đáp ứng thuốc của các tế bào ung thư gan với Doxorubicin
Để đánh giá mức độ đáp ứng thuốc của tế bào, các tế bào UTG được xử lý với Doxorubicin ở
các nồng độ khác nhau (0, 1, 2 và 4 µg/ml) theo thời gian (5 ngày). Mức độ đáp ứng thuốc của tế
bào được đánh giá thông qua sự ức chế tăng sinh tế bào bởi Doxorubicin bằng phương pháp WST-1.
Theo Hình 3.22, Doxorubicin không ảnh hưởng tới sự tăng sinh của các tế bào UTG khi tế
bào được xử lý với thuốc ở nồng độ thấp (1 và 2 µg/ml) trong thời gian ngắn (1-2 ngày). Tuy nhiên,
ở nồng độ cao hơn (4 µg/ml), sự ức chế tăng sinh của tế bào bởi Doxorubicin có thể quan sát thấy
sau 1-2 ngày. Mức độ ức chế tăng sinh của tế bào tăng dần khi tăng thời gian xử lý với thuốc (3-5
ngày). Điều này chứng tỏ hiệu quả ức chế sự tăng sinh tế bào UTG của Doxorubicin phụ thuộc vào
nồng độ và thời gian xử lý (p < 0,01 và p < 0,05; Hình 3.22). Ngoài ra, kết quả cũng cho thấy
Doxorubicin ức chế sự tăng sinh của tế bào Huh-7 hiệu quả hơn so với tế bào HepG2 và Hep3B.

Hình 3.22. Ảnh hưởng của Doxorubicin lên khả năng tăng sinh của các tế bào UTG. Đồ thị biểu diễn tỉ lệ ức
chế tăng sinh của tế bào Hep3B, HepG2 và Huh-7 khi xử lý với Doxorubicin ở các nồng độ khác nhau theo

thời gian được xác định bằng phương pháp WST-1. Kết quả biểu thị bằng giá trị trung bình ± độ lệch chuẩn
của ba lần lặp lại thí nghiệm (**p < 0,01 và *p < 0,05 khi so sánh với đối chứng).

Như vậy, mức độ đáp ứng thuốc của tế bào UTG với Doxorubicin phụ thuộc vào nồng độ và
thời gian xử lý thuốc. Ngoài ra, mức độ đáp ứng với thuốc có sự khác biệt giữa các tế vào UTG.
Trong đó, tế bào HepG2 và Hep3B có mức độ đáp ứng với thuốc kém hơn so với tế bào Huh-7.
3.3.2. Ảnh hưởng của các siRNA lên sự đáp ứng thuốc của tế bào Hep3B với Doxorubicin
Dựa trên kết quả đánh giá hiệu quả ức chế sự biểu hiện của VEGF và KSP bởi các siRNA và
mức độ đáp ứng thuốc của các dòng tế bào UTG, nghiên cứu tiếp tục sử dụng mô hình tế bào
Hep3B để tìm hiểu sơ bộ ảnh hưởng của VEGF-siRNA hay KSP-siRNA lên mức độ đáp ứng thuốc
của tế bào UTG với Doxorubicin. Tế bào Hep3B sau khi chuyển VEGF-siRNA hay KSP-siRNA
được xử lý với Doxorubicin ở các nồng độ khác nhau theo thời gian.
20


Hình 3.23. Ảnh hưởng của các siRNA và Doxorubicin lên khả năng tăng sinh của tế bào Hep3B. Đồ thị biểu
diễn tỉ lệ ức chế tăng sinh của tế bào Hep3B khi xử lý với KSP-siRNA kết hợp với Doxorubicin (a) hay
VEGF-siRNA kết hợp với Doxorubicin (b) ở các nồng độ khác nhau theo thời gian được xác định bằng
phương pháp WST-1. Kết quả biểu thị bằng giá trị trung bình ± độ lệch chuẩn của ba lần lặp lại thí nghiệm
(**p < 0,01 và *p < 0,05 khi so sánh với đối chứng).

Kết quả cho thấy Doxorubicin ức chế sự tăng sinh của tế bào được xử lý kết hợp với KSPsiRNA. Theo Hình 3.23, sau 5 ngày xử lý với thuốc, KSP-siRNA kết hợp với 1 µg/ml Doxorubicin
làm tăng tỉ lệ ức chế tăng sinh của tế bào khi so sánh với KSP-siRNA hay Doxorubicin (p < 0,01;
Hình 3.23). Tuy nhiên, sự ức chế tăng sinh của tế bào không có khác biệt giữa tế bào xử lý với
CONT-siRNA bổ sung 1 µg/ml Doxorubicin và tế bào chỉ xử lý với Doxorubicin (p > 0,05; Hình
3.23). Để xác định rõ hơn hiệu quả làm tăng mức độ đáp ứng thuốc của tế bào với Doxorubicin bởi
KSP-siRNA, tế bào được xử lý với Doxorubicin ở nồng độ cao hơn (2 và 4 µg/ml). Sau 5 ngày, với
nhóm tế bào được xử lý với KSP-siRNA bổ sung 2 µg/ml hay 4 µg/ml Doxorubicin, tỉ lệ ức chế
tăng sinh tế bào lần lượt là 82,64 ± 2,87% và 90,91 ± 3,98%. Với nhóm tế bào được xử lý với
CONT-siRNA bổ sung 2 µg/ml hay 4 µg/ml Doxorubicin, tỉ lệ ức chế tăng sinh tế bào thấp hơn lần

lượt là 29,75 ± 2,57% và 56,20 ± 3,47%. Trong khi đó, nhóm tế bào được xử lý chỉ với 2 µg/ml hay
4 µg/ml Doxorubicin, tỉ lệ ức chế tăng sinh tế bào tương đương nhóm xử lý CONT-siRNA (Hình
3.23). Kết quả đạt được tương tự khi kết hợp VEGF-siRNA với Doxorubicin.
Như vậy, các siRNA làm tăng mức độ đáp ứng thuốc của tế bào Hep3B với Doxorubicin,
thậm chí khi tế bào được xử lý với thuốc ở nồng độ thấp. Hơn nữa, sự phối hợp giữa siRNA và
Doxorubicin cho thấy hiệu quả ức chế tăng sinh tế bào tốt hơn so với việc chỉ sử dụng Doxorubicin.
3.3.3. Ảnh hưởng của siRNA lên sự đáp ứng thuốc của tế bào ung thư gan với Doxorubicin
Các siRNA làm tăng mức độ đáp ứng thuốc của tế bào Hep3B. Việc ức chế đồng thời sự biểu
hiện các gen đích có làm tăng mức độ đáp ứng thuốc của tế bào cao hơn so với việc ức chế riêng
biệt mỗi gen hay không? Do vậy, tế bào sau khi chuyển siRNA được xử lý với Doxorubicin (1
µg/ml). Việc ức chế đồng thời hay riêng biệt sự biểu hiện của VEGF và KSP ảnh hưởng lên mức độ
đáp ứng thuốc của tế bào được kiểm tra và so sánh thông qua sự ức chế tế bào tăng sinh.
21


Hình 3.24. Ảnh hưởng của các siRNA và Doxorubicin lên khả năng tăng sinh của các tế bào UTG. Đồ thị
biểu diễn tỉ lệ ức chế tăng sinh của tế bào Hep3B, HepG2 và Huh-7 sau khi xử lý riêng biệt hay kết hợp các
siRNA với Doxorubicin theo thời gian được xác định bằng phương pháp WST-1. Kết quả biểu thị bằng giá
trị trung bình ± độ lệch chuẩn của ba lần lặp lại thí nghiệm (**p < 0,01 và *p < 0,05 khi so sánh với đối
chứng; #p < 0,05 khi so sánh với cocktail siRNA hay cocktail siRNA + Dox).

Kết quả cho thấy Doxorubicin kết hợp với các siRNA làm giảm đáng kể khả năng tăng sinh
của tế bào Hep3B và Huh-7 khi so sánh với đối chứng (p < 0,01 và p < 0,05; Hình 3.24). Trong đó,
Doxorubicin đạt hiệu quả ức chế tăng sinh mạnh nhất khi tế bào Hep3B và Huh-7 được xử lý với
cocktail siRNA. Tác động này được quan sát thấy rõ sau 2-5 ngày xử lý với thuốc. Tuy nhiên, kết
quả tương tự không lặp lại khi thử nghiệm trên dòng tế bào HepG2. Kết quả cho thấy khi so sánh
với đối chứng, Doxorubicin chỉ ức chế mạnh sự tăng sinh của tế bào HepG2 khi phối hợp với KSPsiRNA hoặc cocktail siRNA (p < 0,01; Hình 3.24). Ngoài ra, tỉ lệ ức chế tăng sinh của tế bào
HepG2 không có khác biệt khi so sánh giữa Doxorubicin kết hợp với cocktail siRNA và
Doxorubicin kết hợp với KSP-siRNA (p > 0,05; Hình 3.24).
Như vậy, các siRNA làm tăng đáng kể mức độ đáp ứng thuốc của các dòng tế bào UTG với

Doxorubicin. Trong đó, Doxorubicin phối hợp với cocktail siRNA cho hiệu quả ức chế cao nhất.
Tuy nhiên, các ảnh hưởng này có sự khác biệt giữa các dòng tế bào UTG.
3.3.4. Sự thay đổi biểu hiện các nhân tố ảnh hưởng tới đáp ứng thuốc của tế bào ung thư gan
Các siRNA làm tăng hiệu quả ức chế tăng sinh tế bào của Doxorubicin. Tác động này có thể
liên quan tới quá trình apoptosis của tế bào. Do vậy, nghiên cứu kiểm tra sự thay đổi biểu hiện của
các gen kiểm soát quá trình apoptosis trong tế bào sau khi được xử lý với siRNA và Doxorubicin.
3.3.4.1. Sự điều hòa biểu hiện các nhân tố kháng apoptosis
Để đánh giá siRNA có làm tăng mức độ đáp ứng thuốc của tế bào Hep3B với Doxorubicin
thông qua việc điều hòa biểu hiện BCL-2 và Survivin hay không, tế bào sau khi chuyển siRNA được
xử lý với Doxorubicin. Sự biểu hiện của các gen này được xác định ở mức độ mRNA và protein.
Kết quả nghiên cứu cho thấy Doxorubicin làm giảm nhẹ mức độ biểu hiện BCL-2 khi so sánh
với đối chứng (p < 0,05; Hình 3.25). Mức độ biểu hiện của BCL-2 giảm mạnh hơn khi phối hợp
Doxorubicin với VEGF-siRNA hay KSP-siRNA (p < 0,01; Hình 3.25). Trong đó, Doxorubicin kết
22


hợp VEGF-siRNA ức chế sự biểu hiện của BCL-2 mạnh hơn so với VEGF-siRNA. Kết quả đạt
được tương tự khi kết hợp Doxorubicin với KSP-siRNA. Ngoài ra, Doxorubicin kết hợp cocktail
siRNA ức chế sự biểu hiện BCL-2 cao nhất khi so sánh với Doxorubicin kết hợp VEGF-siRNA hay
KSP-siRNA. Tuy nhiên, mức độ giảm biểu hiện của BCL-2 không có sự khác biệt giữa nhóm tế bào
xử lý với cocktail siRNA có và không có kết hợp với Doxorubicin (p > 0,05; Hình 3.25).

Hình 3.25. Ảnh hưởng của các siRNA và Doxorubicin lên sự biểu hiện của BCL-2 và Survivin trong tế bào
Hep3B. Đồ thị biểu diễn mức độ biểu hiện mRNA BCL-2 (a) và mRNA Survivin (b) của tế bào được xác
định bằng phương pháp real-time qRT-PCR. Sự biểu hiện protein được xác định bằng phương pháp Western
blot (c). Đồ thị biểu diễn kết quả bán định lượng protein BCL-2 (d) và protein Survivin (e) bằng phần mềm
Image J. Gen β-actin được sử dụng làm chứng nội và chuẩn hóa kết quả. Kết quả biểu thị bằng giá trị trung
bình ± độ lệch chuẩn của ba lần lặp lại thí nghiệm (**p < 0,01 và *p < 0,05 khi so sánh với đối chứng hay
Dox; ##p < 0,01 và #p < 0,05 khi so sánh với cocktail siRNA hay cocktail siRNA + Dox; ++p < 0,01 và +p <
0,05 khi so sánh với tế bào chỉ xử lý với siRNA tương ứng).

Trái ngược với BCL-2, Doxorubicin làm tăng nhẹ mức độ biểu hiện Survivin khi so sánh với
đối chứng. Ngược lại, mức độ biểu hiện của Survivin giảm khi phối hợp Doxorubicin với VEGFsiRNA (p < 0,01 và p < 0,05; Hình 3.25). Kết quả đạt được tương tự với nhóm tế bào được xử lý
với Doxorubicin phối hợp với KSP-siRNA. Hơn nữa, khi so sánh với cocktail siRNA và các nhóm
còn lại, Doxorubicin kết hợp với cocktail siRNA ức chế Survivin mạnh nhất (p < 0,05; Hình 3.25).
23


Như vậy, sự ức chế biểu hiện của BCL-2 và Survivin bởi các siRNA có thể là một trong các
yếu tố góp phần làm tăng mức độ đáp ứng thuốc của tế bào Hep3B với Doxorubicin.
3.3.4.2. Sự điều hòa biểu hiện nhân tố cảm ứng apoptosis
Để đánh giá có hay không siRNA làm tăng mức độ đáp ứng thuốc của tế bào Hep3B thông
qua việc hoạt hóa con đường Caspase, dẫn tới cảm ứng quá trình apoptosis, sự biểu hiện của
Caspase-3 và Caspase-7 được kiểm tra trong tế bào sau khi xử lý với siRNA và Doxorubicin.

Hình 3.26. Ảnh hưởng của các siRNA và Doxorubicin lên sự biểu hiện của Caspase-3 và Caspase-7 trong
tế bào Hep3B. Đồ thị biểu diễn mức độ biểu hiện mRNA Caspase-3 (a) và mRNA Caspase-7 (b) của tế bào
được xác định bằng phương pháp real-time qRT-PCR. Đồ thị biểu diễn kết quả định lượng hoạt tính tương
đối của protein Caspase-3/-7 trong tế bào được xác định bằng phương pháp đo cường độ quang (c). Kết quả
biểu thị bằng giá trị trung bình ± độ lệch chuẩn của ba lần lặp lại thí nghiệm (**p < 0,01 và *p < 0,05 khi so
sánh với đối chứng hay Dox; #p < 0,05 khi so sánh với cocktail siRNA hay cocktail siRNA + Dox; +p < 0,05
khi so sánh với tế bào chỉ xử lý với siRNA tương ứng).

Theo Hình 3.26, Doxorubicin không ảnh hưởng đến mức độ biểu hiện của Caspase-3 và
Caspase-7 trong tế bào Hep3B khi so sánh với đối chứng (p > 0,05; Hình 3.26). Ngược lại, mức độ
biểu hiện mRNA Caspase-3 và Caspase-7 tăng lên khi phối hợp Doxorubicin với các siRNA. Khi so
sánh với đối chứng, mức độ biểu hiện mRNA Caspase-3 và mRNA Caspase-7 lần lượt cao gấp 1,94
± 0,11 lần và 1,58 ± 0,09 lần khi Doxorubicin kết hợp với VEGF-siRNA; 1,76 ± 0,10 lần và 1,46 ±
0,12 lần khi Doxorubicin kết hợp với KSP-siRNA; 2,25 ± 0,09 lần và 1,71 ± 0,05 lần khi
Doxorubicin kết hợp với cocktail siRNA. P < 0,01 và p < 0,05; Hình 3.26). Kết quả đạt được tương

tự khi kiểm tra mức độ biểu hiện protein Caspase-3/-7 thông qua hoạt tính tương đối của Caspase3/-7. Doxorubicin kết hợp với VEGF-siRNA hay cocktail siRNA làm tăng hoạt tính tương đối của
Caspase-3/-7 cao hơn so với VEGF-siRNA hay cocktail siRNA (p < 0,05; Hình 3.26).
Các kết quả này chứng tỏ sự ức chế biểu hiện của VEGF và KSP làm tăng mức độ đáp ứng
thuốc của tế bào với Doxorubicin thông qua việc hoạt hóa gen Caspase-3 và Caspase-7. Đây cũng
có thể là một trong các yếu tố góp phần làm tăng mức độ đáp ứng thuốc của tế bào.
3.3.4.3. Sự cảm ứng apoptosis của tế bào
Sự ức chế biểu hiện các gen đích làm tăng mức độ đáp ứng thuốc của tế bào thông qua sự ức
chế biểu hiện các gen kháng apoptosis, đồng thời tăng điều hòa biểu hiện các gen cảm ứng
apoptosis. Sự thay đổi biểu hiện các gen này có thể ảnh hưởng tới sự cảm ứng apoptosis của tế bào.
Do vậy, để đánh giá siRNA có làm tăng mức độ đáp ứng thuốc của tế bào Hep3B với Doxorubicin
thông qua việc thúc đẩy quá trình apoptosis hay không, tế bào sau khi xử lý được nhuộm đồng thời
với Annexin V-FITC và PI. Tỉ lệ tế bào apoptosis được xác định bằng kỹ thuật FACS.
Theo Hình 3.27, so với đối chứng, Doxorubicin không ảnh hưởng tới sự cảm ứng apoptosis
của tế bào. Tuy nhiên, Doxorubicin kết hợp với VEGF-siRNA làm tăng tỉ lệ tế bào apoptosis khi so
24


sánh với VEGF-siRNA hoặc Doxorubicin (p < 0,01; Hình 3.27). Tương tự, Doxorubicin kết hợp
với KSP-siRNA có tỉ lệ tế bào apoptosis cao hơn khi so sánh với KSP-siRNA hoặc Doxorubicin (p
< 0,01; Hình 3.27). Ngoài ra, Doxorubicin phối hợp với cocktail siRNA cảm ứng apoptosis hiệu
quả nhất. Tuy nhiên, kết quả này không lặp lại khi phối hợp CONT-siRNA với Doxorubicin.

Hình 3.27. Ảnh hưởng của siRNA và Doxorubicin lên sự cảm ứng apoptosis của tế bào Hep3B. Đồ thị biểu
diễn tỉ lệ apoptosis của tế bào được xử lý với siRNA và Doxorubicin. Kết quả biểu thị bằng giá trị trung bình
± độ lệch chuẩn của ba lần lặp lại thí nghiệm (**p < 0,01 khi so sánh với đối chứng hay Dox; #p < 0,05 khi
so sánh với cocktail siRNA hay cocktail siRNA + Dox; ++p < 0,01 khi so sánh với tế bào chỉ xử lý với
siRNA tương ứng).

Như vậy, việc ức chế riêng biệt hay đồng thời sự biểu hiện của VEGF và KSP bởi siRNA làm
tăng mức độ đáp ứng thuốc của tế bào thông qua việc gia tăng tỉ lệ tế bào cảm ứng apoptosis.

4. KẾT LUẬN
Với kết quả đạt được, nghiên cứu đưa ra các kết luận tương ứng với các nội dung nghiên cứu:
1. Với nồng độ (25 nM) và thời gian chuyển siRNA (24-72 giờ) được tối ưu, các trình tự siRNA đều
ức chế thành công sự biểu hiện của gen VEGF và KSP trên tế bào UTG. Trong đó, trình tự VEGFsiRNA#1 và KSP-siRNA#2 ức chế sự biểu hiện của gen đích hiệu quả nhất.
2. VEGF-siRNA ức chế sự biểu hiện của VEGF, đồng thời ức chế một phần sự biểu hiện của KSP.
Ngược lại, KSP-siRNA chỉ ức chế sự biểu hiện của KSP trên cả ba dòng tế bào UTG. Ngoài ra, việc
chuyển đồng thời VEGF-siRNA và KSP-siRNA cho hiệu quả ức chế sự biểu hiện của KSP cao nhất.
Tuy nhiên, hiệu quả này là khác biệt giữa các dòng tế bào UTG.
3. Việc ức chế đồng thời hay riêng biệt sự biểu hiện của VEGF và KSP bởi các siRNA đều làm giảm
khả năng sống, tăng sinh, di cư và cảm ứng apoptosis của tế bào UTG. Hơn nữa, sự giảm điều hòa
biểu hiện đồng thời VEGF và KSP cho hiệu quả tác động cao nhất, mặc dù tác động này có khác
biệt giữa các dòng tế bào. Ngược lại, các siRNA không ảnh hưởng tới tế bào gan THLE-3. Ngoài ra,
sự giảm điều hòa biểu hiện VEGF của tế bào Hep3B dẫn đến ức chế sự biểu hiện của ANG2 và sự
hình thành mạch in vitro của tế bào nội mô HUVEC khi được cảm ứng với dịch nuôi cấy của tế bào
Hep3B.
4. Các siRNA ức chế sự tăng sinh và cảm ứng apoptosis của tế bào UTG thông qua sự giảm điều
hòa biểu hiện của một số nhân tố kháng apoptosis như BCL-2, Survivin và sự hoạt hóa nhân tố cảm
ứng apoptosis như Caspase-3 và Caspase -7.
5. Mức độ đáp ứng thuốc của các dòng tế bào UTG với Doxorubicin là khác nhau và phụ thuộc vào
nồng độ và thời gian xử lý thuốc. Mức độ đáp ứng thuốc của tế bào UTG tăng mạnh khi được xử lý
25