Đánh giá đa dạng di truyền quần thể của loài dầu nước (dipterocarpus alatus roxb ex g don) bằng chỉ thị phân tử SSR (SSRs) ở tỉnh đồng nai

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM

MAI THỊ NHUNG
Tên đề tài:
“ĐÁNH GIÁ ĐA DẠNG DI TRUYỀN QUẦN THỂ CỦA LOÀI DẦU
NƯỚC (Dipterocarpus Alatus Roxb.ex G. Don)
BẰNG CHỈ THỊ PHÂN TỬ SSR (SSRs)
Ở TỈNH ĐỒNG NAI”

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

Hệ đào tạo

: Chính quy

Chuyên ngành

: Công nghệ sinh học

Khoa

: CNSH - CNTP

Lớp

: LTK8 CNSH

Khoá học

: 2012 – 2014

Giáo viên hướng dẫn 1 : Th.S Vũ Đình Duy
Giáo viên hướng dẫn 2 : Th. S Lương Thị Thu Hườngáo
viên hướng dẫ:1.ThS. Vũ Đình Duy

Thái Nguyên, 2014


LỜI CẢM ƠN

Được sự đồng ý của ban giám hiệu nhà trường và Viện Hàn Lâm Khoa học và
Công nghệ Việt Nam, em đã thực hiện đề tài “Đánh giá đa dạng di truyền quần
thể của loài Dầu nước (Dipterocarpus alatus Roxb.ex G. Don) bằng chỉ thị phân
tử SSR (SSRs) ở tỉnh Đồng Nai”, tại phòng thí nghiệm “ Phân loại thực nghiệm và
Đa dạng nguồn gen”.
Em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới ThS.NCS. Vũ Đình Duy.
ThS Lương Thị Thu Hường đã tận tình hướng dẫn vào tạo mọi điều
kiện giúp đỡ em trong suốt thời gian thực tập để hoàn thành khóa luận này.
Em xin trân thành cảm ơn TS. Nguyễn Minh Tâm và toàn thể cán bộ phòng
“ Phân loại thực nghiệm và Đa dạng nguồn gen” đã chia sẻ, giúp đỡ nhiệt tình và tạo
mọi điều kiện thuận lợi trong suốt thời gian thực tập.
Cuối cùng em xin trân thành cảm ơn gia đình, bạn bè đã luôn động viên, là chỗ
dựa tinh thần cho em trong suốt quá trình hoàn thành khóa luận tốt nghiệp.

Thái nguyên, ngày

tháng

Sinh viên

Mai Thị Nhung

năm 2014


MỤC LỤC
Phần 1: MỞ ĐẦU ......................................................................................................1
1.1. Đặt vấn đề .........................................................................................................1
1.2. Mục tiêu nghiên cứu .........................................................................................2
1.3. Mục đích nghiên cứu ........................................................................................2
1.4. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài ..........................................................2
1.4.1. Ý nghĩa khoa học ........................................................................................2
1.4.2. Ý nghĩa thực tiễn ........................................................................................2
Phần 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU ...........................................................................3
2.1. Một số đặc điểm của loài Dầu nước .................................................................3
2.1.1. Phân loại khoa học .....................................................................................3
2.1.2. Đặc điểm sinh học – sinh thái ....................................................................4
2.1.3. Nơi sống .....................................................................................................5
2.1.4. Công dụng .................................................................................................5
2.1.5. Vấn đề bảo tồn nguồn gen cây Dầu nước..................................................6
2.2. Đa dạng di truyền quần thể thực vật .................................................................6
2.2.1. Khái niệm về đa dạng di truyền quần thể ...................................................6
2.2.2. Các yếu tố ảnh hưởng đến đa dạng di truyền .............................................7
2.3. Một số chỉ thị phân tử sử dụng trong nghiên cứu đa dạng di truyền ..............10
2.3.1. Chỉ thị AFLP ............................................................................................10
2.3.3. Chỉ thị SSR ...............................................................................................11
2.3.3. Chỉ thị RFLP ...........................................................................................11
2.3.4. Chỉ thị RAPD ...........................................................................................12
2.3.5. Chỉ thị ISSR..............................................................................................13
2.3.6. Sử dụng chỉ thị lục lạp trong nghiên cứu đa dạng di truyền thực vật ......14

2.4. Nghiên cứu trong và ngoài nước về đa dạng di truyền ...................................14
2.4.1. Tình hình nghiên cứu trong nước ............................................................14
2.4.2. Tình hình nghiên cứu trên thế giới ...........................................................15
Phần 3: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ................................16
3.1. Vật liệu nghiên cứu .........................................................................................16
3.2. Thiết bị, hóa chất và dụng cụ ..........................................................................17
3.2.1. Thiết bị .....................................................................................................17


4

3.2.2. Hóa chất ....................................................................................................18
3.2.3. Dụng cụ ....................................................................................................18
3.3. Địa điểm và thời gian nghiên cứu ...................................................................18
3.4. Nội dung nghiên cứu.......................................................................................18
3.5. Phương pháp nghiên cứu trong phòng thí nghiệm .........................................19
3.5.1. Phương pháp tách chiết và tinh sạch DNA tổng số ..................................19
3.5.2. Phương pháp điện di trên gel agarose 1% ................................................21
3.5.3. Nhân bản DNA bằng kỹ thuật PCR .........................................................21
3.5.4. Phương pháp điện di sản phẩm PCR - SSR trên gel polyacrylamide 5% 22
3.5.5. Phân tích số liệu .......................................................................................23
Phần 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ..................................................................24
4.1. Kết quả khuếch đại trình tự SSR của 4 quần thể Dầu nước…………………24
4.1.1. Kết quả tách chiết DNA tổng số ..................................................................24
4.1.2 Nhân bản DNA bằng kỹ thuật PCR - SSR và điện di sản phẩm PCR ..........27
4.2. Đa dạng di truyền quần thể và loài Dầu nước ...............................................28
4.2.1. Phân tích đa hình di truyền DNA các mẫu Dầu nước ..............................28
4.2.2. Phân tích đa dạng di truyền quần thể và loài Dầu nước ...........................29
4.2.3.Đề xuất một số giải pháp bảo tồn và phục hồi loài....................................34
Phần 5: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ .......................................................................37

5.1. Kết luận ...........................................................................................................37
5.2. Kiến nghị.........................................................................................................37
TÀI LIỆU THAM KHẢO ......................................................................................38


DANH MỤC, CỤM TỪ VIẾT TẮT
ADN
AFLP

: Axit deoxyribonucleit (Deoxyribonucleic acid)
: Đa hình độ dài các đoạn DNA nhân chọn lọc (Amplified Fragment
Length Polymorphism)

bp

: Cặp bazơ (base pair

CR

: Loài cực kỳ nguy cấp

ISSR

: Trình tự lặp đơn giản ngẫu nhiên (interal simple sequence repeat)

NJ

: Phương pháp kết nối liền kề (Neighbor Joining Method)

PCR

: Phản ứng chuỗi polymerase (Polymerase Chain Reaction)
: Đa hình các đoạn DNA nhân ngẫu nhiên (Random Amplified

RADP

Polymorphic DNA)
: Đa hình độ dài các đoạn DNA hạn chế (Restriction Fragment Length

RFLP

Polymorphism)

SSR

: Trình tự lặp đơn giản (Simple Sequence Repeats)

UPGMA

: Phân tích Unweighted Pair Group Method

UV

: Ánh sáng tử ngoại

VU

: Loài sẽ nguy cấp
Quần thể

NT

: Núi Tượng

DT

: Đào Tiên

MD

: Mã Đà

TP

: Tân Phú


DANH MỤC CÁC BẢNG BIỂU

Bảng 3.1. Địa điểm và số mẫu Dầu rái (D. alatus) được thu thập ........................... 16
Bảng 3.2. Danh sách các mồi SSR dùng trong nghiên cứu ..................................... 17
Bảng 3.3. Thành phần đệm rửa (washing buffer): pha trong 10ml nước cất
vô trùng ........................................................................................................... 20
Bảng 3.4. Thành phần đệm tách chiết (Extraction buffer): pha trong 10ml
nước cất vô trùng ............................................................................................ 20
Bảng 4.1. Kết quả đo độ hấp thụ bước sóng 260 nm, 280 nm và nồng độ
DNA tổng số của 45 mẫu nghiên cứu ............................................................. 26
Bảng 4.2. Giá trị PIC và tỉ lệ phân đoạn đa hình của 45 cá thể Dầu nước................ 29
Bảng 4.3. Đa dạng di truyền của 4 quần thể loài Dầu nước ..................................... 30
Bảng 4.4. Hệ số tương đồng (trên) và khoảng cách di truyền (dưới) theo

Nei (1972) cho các cặp quần thể của loài Dầu rái .......................................... 31


DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ

Hình 2.1. Cây Dầu nước (Dipterocarpus alatus) tại Vườn quốc gia Cát
Tiên, Đồng Nai ...................................................................................... 3
Hình 2.2. Dầu rái Dipterocarpus alatus roxb ex ............................................... 4
Hình 4.1. Kết quả điện di DNA tổng số đại diện của các mẫu Dầu nước
nghiên cứu ........................................................................................... 25
Hình 4.2. Điện di sản phẩm PCR - SSR trên gel Polyacrylamide 5 %
(A: Mồi P193, B: P214, C: P258, D: P226; M: marker phân tử
100bp; Giếng 1-14: tên các mẫu Dầu rái) ............................................. 28
Hình 4.3. Biểu đồ hình cây trên cơ sở khoảng cách di truyền của 45 cá
thể loài Dầu nước tính theo hệ số di truyền của Jaccard và kiểu
phân nhóm UPGMA ............................................................................ 32
Hình 4.4. Phân tích NJ trên cơ sở khoảng cách di truyền giữa các quần
thể loài Dầu nước................................................................................. 34


1

Phần 1
MỞ ĐẦU
1.1. Đặt vấn đề
Dầu nước hay còn gọi là Dầu rái (Dipterocarpus alatus Roxb. ex G. Don) là
loài thuộc chi Dầu (Dipterocarpus), họ Dầu (Dipterocarpaceae) hiện chỉ phân bố ở
miền trung và miền nam Việt Nam và mở rộng sang Campuchia, Lào, Myanmar,
Philippines, Thái Lan và Ấn Độ [10]. Dầu nước là một loài đóng vai trò chủ đạo
trong hệ sinh thái và kinh tế của khu rừng mưa vùng đất thấp tại phía Nam Việt

Nam. Dầu nước đang được sử dụng rộng rãi trong xây dựng và công nghiệp, chúng
cũng được sử dụng như nguồn tinh dầu có giá trị. Trong những năm gần đây, do giá
trị thương mại và nhu cầu sử dụng ngày càng nhiều của người dân địa phương đối
với loài thực vật này nên chúng đang bị khai thác quá mức. Hơn nữa, do áp lực tăng
trưởng kinh thế nên diện tích rừng đang ngày một suy giảm để phục vụ cho các mục
đích khác nhau của con người.Theo các tiêu chí mới của IUCN 2013 [30] loài Dầu
nước (Dipterocarpus alatus Roxb. ex G. Don) hiện được xếp ở bậc đe dọa ở mức độ
nguy cấp vì có phân bố hẹp, số cá thể trưởng thành còn lại quá ít và chất lượng cây
xấu, tái sinh tự nhiên ít, bị khai thác và chết dần vì môi trường sống bị xâm phạm và
thu hẹp. Cũng vì lý do trên, tại Việt Nam loài này đang nằm trong sách đỏ Việt
Nam năm 2007 ở mức độ nguy cấp[7].
Do có giá trị cao cả về mặt khoa học và kinh tế, vì vậy việc bảo tồn và phục
hồi loài Dầu nước là yêu cầu cấp thiết đặt ra cho các nhà khoa học cũng như các nhà
quản lý. Để góp phần đưa ra các giải pháp bảo tồn và phục hồi loài, đánh giá mức
độ đa dạng di truyền quần thể loài Dầu nước có ý nghĩa quan trọng. Mức độ đa
dạng di truyền không những chỉ ra khả năng tồn tại của loài ở hiện tại và tương lai,
mà còn chỉ ra tiềm năng tiến hoá của loài.
Hiện nay, có nhiều chỉ thị phân tử (RADP, RFLP, ISSR, SSR,...) đã được sử
dụng trong các nghiên cứu đa dạng di truyền quần thể và loài thực vật. Trong đó, kỹ
thuật SSR (SSRs) đã nhanh chóng trở thành kỹ thuật hữu hiệu và được sử dụng rộng
rãi trong các nghiên cứu.


2
Với việc ứng dụng chỉ thị SSR để nghiên cứu sâu về đa dạng di truyền, đề tài
“Đánh giá đa dạng di truyền quần thể cuả loài Dầu nước (Dipterocarpus alatus
Roxb.ex G. Don) bằng chỉ thị phân tử SSR (SSRs) ở tỉnh Đồng Nai” được thực
hiện. Mục tiêu của nghiên cứu này là sử dụng kỹ thuật phân tử SSR để điều tra mức
độ đa dạng di truyền trong và giữa các quần thể của loài Dầu rái (D. alatus) sống tự
nhiên tại tỉnh Đồng Nai và kết quả sẽ cung cấp các thông tin cần thiết cho việc đưa

ra các giải pháp hữu hiệu để bảo tồn loài, phục hồi và sử dụng bền vững loài của
cộng đồng dân cư địa phương.
1.2. Mục tiêu nghiên cứu
Hiểu rõ cơ chế làm xói mòn cấu trúc di truyền quần thể và loài dưới các tác
động của con người.
1.3. Mục đích nghiên cứu
Xác định được mức độ xói mòn tính đa dạng di truyền quần thể và loài Dầu
nước (Dipterocarpus alatus Roxb. ex G. Don) trong các điều kiện môi trường và
kích thước quần thể khác nhau.
1.4. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài
1.4.1. Ý nghĩa khoa học
Là cơ sở ban đầu nghiên cứu di truyền quần thể và loài, dự báo sinh thái và
kinh tế - xã hội để thống nhất lập ra các chiến lược bảo tồn loài bền vững.
Góp phần quan trọng trong chiến lược bảo tồn, kết hợp chặt chẽ giữa quản lý
quần thể và loài trong các hoạt động bảo tồn loài bằng chuyển vị và nguyên vị.
1.4.2. Ý nghĩa thực tiễn
Nâng cao kiến thức về bảo tồn đa dạng sinh học và giúp cho các nhà quản lý
đưa ra các giải pháp bảo vệ giá trị đa dạng sinh học một cách hiệu quả nhất, cùng
với người dân địa phương trong việc phục hồi nơi sống của các loài đang bị đe doạ
và bảo tồn loài.
Góp phần tăng thu nhập của người dân địa phương liên quan đến bảo tồn hiệu
quả giá trị đa dạng sinh học.


3

Phần 2
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1. Một số đặc điểm của loài Dầu nước
2.1.1. Phân loại khoa học [10]

Giới (regnum): Plantae
Ngành (phylum): Angiospermae
Lớp (class): Eudicots
Bộ (order): Malvales
Họ (familia): Dipterocarpaceae
Chi (genus): Dipterocarpus
Loài (species): alatus

Hình 2.1. Cây Dầu nước (Dipterocarpus alatus) tại Vườn quốc gia Cát Tiên,
Đồng Nai


4
2.1.2. Đặc điểm sinh học – sinh thái
Cây gỗ lớn, thân trụ thẳng, phân cành muộn, cao 40-45m, đường kinh đạt tới
2m hay hơn. Vỏ lúc non dày, màu xám trắng; khi già mỏng, màu xám nâu, nứt dọc
nhẹ. Cành màu nâu đỏ, có vết vòng lá kèm và có lông màu xám hay hung đỏ.

Hình 2.2. Dầu rái Dipterocarpus alatus roxb ex G.Don
Lá đơn mọc cách, mặt trên màu xanh thẫm, nhẵn bóng, mặt dưới xanh nhạt có
lông mịn, phiến lá hình bầu dục thuôn, kích thước 16-25x5-15cm, đầu nhọn, gốc tù
hay hình tim. Ở cây non lá có lông, sau nhẵn; gân bên 18-31 đôi, nổi rõ ở mặt dưới,
cuống lá dài 4 – 8cm, mảnh lá kèm bao chồi búp màu đỏ dài 15 – 20cm, rộng 2 4cm, phía ngoài có lông. Cụm hoa mọc ở nách lá, dạng chùm đơn, có lông, dài 1018cm, mang 6-8 hoa không cuống. Lá đài có ống dài 17mm, phía ngoài có 5 gờ dọc,
cánh hoa màu hồng, nhẵn, dài 5cm, nhị nhiều (khoảng 30). Quả có ống đài bao bọc
toàn phần, dài 3-4cm, rộng 2,5-2,8cm, có 5 gờ lớn chạy dọc, khi non màu xanh; trên
đầu mang các cánh do lá đài phát triển, với 2 cánh lớn dài 20- 23cm, rộng 3-4cm, có
3 gân gốc màu đỏ, khi già quà và cánh chuyển sang màu cánh dán.
Quả gần hình cầu, có 5 cạnh nổi rõ, đừng kính 1-1,5 cm. Quả có 5 cánh đài
nhẵn; hai cánh to, cánh dài từ 10-14 cm, rộng 1,5-2 cm, xếp song song, có màu

5
đỏ tươi khi quả non và chuyển thành màu vàng khi quả chín già; 3 cánh nhỏ có
kích thước 1,2-1,4 cm. Mỗi quả có 1 hạt. Mùa quả chín là tháng 3-4 hàng năm,
chín tập chung vào cuối tháng 3 đầu tháng 4 [10].
2.1.3. Nơi sống
Dầu nước thường mọc thành từng đám còn gọi là các “láng dầu” hoặc dải rác
ven sông suối, trong các khu rừng tự nhiên nhiệt đới. Cây thường mọc xen với các
loài cây họ đậu như Gỗ đỏ (Afzelia xylocarpa), Gụ mật (Sindora cochinchinensis),
các loài Cẩm lai (Dalbergia spp) và các loài cây lá rộng khác. Cây được sắp xếp
vào nhóm có tăng trưởng trung bình, cây 45 tuổi đạt đường kính ngang ngực 0.62
cm/năm và chiều cao vút ngọn đạt 0.60 m/năm (Phân viện điều tra quy hoạch II, Bộ
Lâm nghiệp 1994) [16] .
Dầu nước có phân bố rộng khắp Đông Nam Á kéo suốt từ Indonesia, Malaixia,
Philipin, Ấn Độ, Myanma, Thái Lan qua Lào và Căm-pu-chia sang Việt Nam. Các
vùng có Dầu nước phân bố nhiều nhất ở Việt Nam là:
- Lộc Ninh, Phước Long, Bù Đăng, Đồng Xoài (Bình Phước)
- Vĩnh An, Tân Phú, Xuân Lộc (Đồng Nai)
- Xuyên Mộc, Bình Châu – Phước Bửu, Côn Đảo (Bà Rịa – Vũng Tàu).
- Vườn quốc gia Cát Tiên
- Lâm Trường Tân Phú (Đồng Nai)
- Khu bảo tồn Bình Châu – Phước Bửu (Bà Rịa – Vũng Tàu)
- Vườn quốc gia Bù Gia Mập (Bình Phước)
- Vườn quốc gia Yokdon (Đăk lăk)
- Và rải rác trong các khu rừng nghèo, rừng phục hồi.
Năm 2011, một quần thể cây Dầu rái quý hiếm, nguyên sinh và thuần chủng
lớn nhất Việt Nam đã được phát hiện tại vươn quốc gia Phong Nha – Kẻ Bàng.
Cây Dầu rái phân bố trong rừng nhiệt đới ẩm ở Campuchia, Lào, Thái Lan và
Việt Nam. Tại Việt Nam, loài cây này thường quần tụ dọc bờ sông và là câu chủ
yếu tạo các khu rừng phục hồi dọc sông Đồng Nai và vườn quốc gia Cát Tiên.

2.1.4. Công dụng
Gỗ Dầu nước sử dụng nhiều trong công nghiệp và xây dựng như:


6

- Làm cột
- Ván
- Đồ dùng gia dụng
- Chế biến ván ép
- Ván sàn
Nhựa Dầu nước được khai thác làm sơn véc – ni, trát xuồng.
Ngoài ra cây Dầu nước có dáng đẹp nên còn được trồng làm cây cảnh quan
đường phố, cây bóng mát, trong công viên.
2.1.5. Vấn đề bảo tồn nguồn gen cây Dầu nước
Đối với chương trình bảo tồn nguồn gen, đa dạng di truyền ở các loài cây họ
Dầu có thể được duy trì trong rừng thông qua thu hái hạt giống. Khi so sánh với các
loài cây lá kim, chúng ta thấy có những khác biệt cần được quan tâm. Cây lá kim
thường tạo thành các quần thụ lớn và thụ phấn nhờ gió, nên khi thu hái hạt, thường
chỉ thu hái hạt của 5 cây mẹ cho mỗi vùng là đủ vì nó đảm bảo đa dạng di truyền
thông qua thụ phấn chéo nhờ gió với nguồn phấn hoa rất phong phú.
Ngược lại, cây họ Dầu cho thấy có một tỷ lệ các cây không thụ phấn chéo và
thụ phấn giữa hai cây mẹ gần nhau vì côn trùng thường quen thụ phấn cho các cây
trong cùng khu vực trước mà chưa thể bay đi xa. Do vậy, đa dạng di truyền nằm
trong lượng hạt thu thập được chưa đủ đại diện cho cả quần thể như các loài cây lá
kim. Để bảo tồn ex situ cây họ Dầu, nên thu hái hạt từ nhiều cây mẹ cách xa nhau.
2.2. Đa dạng di truyền quần thể thực vật
2.2.1. Khái niệm về đa dạng di truyền quần thể
Đa dạng di truyền là tập hợp tất cả các gen khác nhau của tất cả các cá thể
thực vật, động vật, nấm và vi sinh vật. Đa dạng di truyền tồn tại trong một loài và

giữa các loài khác nhau.
Đa dạng di truyền là sự đa dạng về thành phần gen giữa các cá thể trong cùng
một loài và giữa các loài khác nhau; là sự đa dạng về gen có thể di truyền được
trong một quần thể hoặc giữa các quần thể. Qua đó, sự đa dạng của các biến dị có
thể di truyền trong một loài, một quần xã hoặc giữa các loài, các quần xã được biểu
hiện. Vì vậy, đa dạng di truyền chính là biến dị của sự tổ hợp trình tự của bốn cặp


7
bazo cơ bản, thành phần của axit nucleic, tạo thành mã di truyền. Đa dạng di truyền
giúp cho các loài sinh vật đảm bảo sự sinh sản, chống chịu với bệnh tật và khả năng
thích nghi với điều kiện môi trường luôn thay đổi.
Bảo tồn nguồn gen không chỉ nhằm ngăn chặn sự tuyệt chủng của một loài mà
bảo tồn nguồn gen còn nhằm ngăn chặn sự mất mát của các gen, các phức hợp gen
và các genotype, ngăn chặn sự tuyệt chủng các nòi địa lý mà vốn gen của chúng bị
suy giảm nghiêm trọng tới mức một số gen và một số phức hợp gen có thể bị mất
đi, tiềm năng di truyền của loài bị giảm mạnh, và trong trường hợp cực đoan, đó là
sự tiệt chủng của loài.
- Ý nghĩa của nghiên cứu đa dạng di truyền
Nghiên cứu đa dạng di truyền giúp đánh giá sự đa dạng, thành phần các
kiểu gen trong tự nhiên, từ đó đề ra kế hoạch khai thác và bảo tồn hợp lý.
Nghiên cứu đa dạng di truyền giúp cho việc chọn giống và lai tạo giống
gốc có kiểu gen khác nhau.
Từ những hiểu biết về nghiên cứu đa dạng di truyền, là cơ sở cho việc tạo
ra đựơc những giống mới bằng công nghệ di truyền.
Sự đa dạng di truyền nói riêng, đa dạng sinh vật nói chung là điều kiện cho sự
phát triển và tồn tại lâu dài của sự sống trên trái đất, vì vậy bảo vệ và phát triển đa dạng
sinh học là bảo vệ chính chúng ta. Nhờ nghiên cứu đa dạng di truyền, giúp ta biết đựoc
tình trạng nguy cơ của các sinh vật hiện nay, dự đoán dự báo chiều hướng biến đổi, từ
đó con người có phương pháp khoa học tác động tích cực, phù hợp.

2.2.2. Các yếu tố ảnh hưởng đến đa dạng di truyền
2.2.2.1. Vai trò địa lý
Tính cách ly về địa lý được xem như là nhân tố chính liên quan đến đa dạng
di truyền và là bước đầu tiên của quá trình tiến hoá loài. Đối với quần thể lớn,
tần số di truyền khá ổn định. Ở đây, do thiếu vắng của sự trao đổi di truyền, đột
biến hoặc lựa chọn tự nhiên, tần số gene được duy trì không thay đổi từ thế hệ
này sang thế hệ khác.
Vào đầu những năm 1930, Wright (1931)[45] đã chỉ ra rằng các dòng địa
phương độc lập nhau với kích thước nhỏ được phân cắt từ quần thể lớn sẽ xuất hiện


8
sự khác nhau giữa chúng. Mức độ khác nhau giữa các địa phương càng lớn thì sự
khác nhau giữa các quần thể nhỏ càng cao và phụ thuộc vào điều kiện chọn lọc tự
nhiên tại mỗi địa phương. Kết quả của sự cô lập về mặt địa lý và quá trình chọn lọc
tự nhiên theo thời gian là nguồn gốc hình thành loài mới. Sự khác nhau giữa các
dòng độc lập với nhau về điều kiện địa lý và sinh thái được xác định chủ yếu các
kiểu gen đa hình, mỗi gen đều có ảnh hưởng nhỏ nhưng cộng hợp. Khi thụ thấn
chéo xảy ra giữa các dòng khác nhau, có sự tái tổ hợp giữa các gen này với nhau.
Như vậy, nhiều dạng mới xuất hiện và khả năng khác nhau giữa chúng sẽ lớn hơn.
Đột biến và phương thức sinh sản hữu tính được xem như là cơ chế để cung cấp
nguồn gen mới [25]. Cách biệt về địa lý với các điều kiện môi trường sống khác
nhau diễn ra trong nhiều thế hệ sẽ là hệ quả của tính độc lập về sinh sản giữa các
dòng thực vật và là sự tiến hoá theo các hướng khác nhau và thông qua sự tích luỹ
các gen khác nhau.
2.2.2.2. Phương thức sinh sản thực vật
Phương thức sinh sản ở thực vật được xác định bởi mối quan hệ sinh sản giữa
các cá thể trong quần thể. Có 2 phương thức sinh sản phổ biến, sinh dưỡng và hữu
tính [22]. Tỉ lệ thụ phấn cận noãn hoặc thụ phấn chéo đối với các loài sinh sản hữu
tính là khác nhau ở bất kỳ loài nào hoặc giữa các quần thể cùng loài. Đối với loài

sinh sản hữu tính, mỗi quần thể có thể khác nhau, nhưng giống nhau với các quần
thể sống gần nhau do sự trao đổi di truyền giữa các quần thể với nhau, nhưng đối
với loài sinh sản sinh dưỡng có xu hướng tồn tại như là những quần thể tương đồng
và thường khác nhau đáng kể do sự không có hoặc có rất thấp sự trao đổi di truyền
giữa chúng với nhau.
2.2.2.3. Đột biến và chọn lọc tự nhiên
Như đã biết, đa dạng di truyền thường đề cập đến sự khác nhau di truyền ở tất
cả các cá thể. Đột biến và lựa chọn tự nhiên xác định tính đa dạng tồn tại ở bất kỳ
thời gian nào. Mức độ đa dạng di truyền mới được sản sinh trong quần thể thực vật
bằng sự tái tổ hợp di truyền giữa các cá thể đực và cái và trong các cá thể được sản
sinh bởi các gen và đột biến nhiễm sắc thể.


9
Vật liệu di truyền là deoxyribonucleic acid (DNA) được tổng hợp từ 4 loại
nucleotide, có chứa các bazơ nitơ: 2 purine (adenine và guanine) và 2 pyrimidine
(cytosine và thymine), và đường 2-deoxyribose. Các nuleotide được liên kết với
nhau để tạo thành chuỗi polynucleotide. Mã gen gồm 3 nucleotide dọc theo phân tử,
mỗi đơn vị giải mã một amino acid. Mỗi trình tự 3 nucleotide trong phân tử được
gọi là codon. Gen gồm một loạt codon, mà chúng được đọc từ điểm bắt đầu của
codon đến điểm cuối tại điểm kết thúc và mã hóa cho cấu trúc một phân tử
polypeptide. Như vậy, có 3 cách để mã hóa trình tự nucleotide thành protein và phụ
thuộc vào điểm đầu. Điều này được gọi như là khung đọc. Sự liên kết hoặc loại bỏ
nucleotide sẽ làm thay đổi khung đọc cho trình tự tiếp theo. Thay đổi này gọi là xê
dịch khung. Như vậy, đột biến được mô tả như là sự thay đổi bất kỳ trong trình tự
ADN. Đột biến này sẽ làm thay đổi trình tự amino acid trong phân tử protein. Rõ
ràng, đột biến tạo nên tính đa dạng di truyền ở thực vật. Sản phẩm đột biến là nguồn
vật liệu cuối cùng của tính đa dạng di truyền và như vậy, đóng vai trò cơ bản trong
quá trình tiến hóa, bởi vì nó giúp cho việc duy trì nguồn cung cấp vật liệu di truyền
cho quá trình chọn lọc tự nhiên hoạt động.

2.2.2.4. Phân cắt nơi sống
Nơi sống của mỗi loài được thiết lập trong quá trình hình thành loài. Phân cắt
xảy ra khi nơi sống bị chia nhỏ và bị cô lập với nhau bằng ma trận các cảnh quan
khác không giống ban đầu và không phù hợp cho sự tồn tại của loài. Như vậy, phân
cắt tạo nên sự phá vỡ nơi sống. Tác nhân gây ra phân cắt bao gồm mở rộng đất nông
nghiệp, khai thác không hợp lý tài nguyên sinh vật, xây dựng khu dân cư và khai
thác khoáng sản. Diện tích nơi sống rộng lớn trước kia bị suy giảm, thậm chí nhỏ
hơn và làm tăng số lượng các mảnh độc lập với nhau với ảnh hưởng vùng biên phổ
biến. Phân cắt đe doạ đến tính thống nhất sinh thái của một vùng rộng lớn đã được
hình thành trong lịch sử phát triển loài và là một trong những nguyên nhân gây ra sự
tuyệt chủng. Suy giảm diện tích nơi sống ảnh hưởng đến kích thước quần thể và
phân bố lại các mảnh nơi sống còn lại sẽ ảnh hưởng đến sự phát tán của loài. Hậu
quả của quá trình phân cắt thường làm suy giảm chức năng hệ sinh thái và cuối
cùng mất nơi sống. Các quần thể nhỏ và bị cô lập trong các mảnh nơi sống còn lại


10
dễ bị tổn thương và ít có khả năng thích nghi khi điều kiện môi trường sống của
chúng bị thay đổi [31]. Tất nhiên, hậu quả sẽ dẫn đến mất tính đa dạng di truyền ở
cả 2 mức độ quần thể và loài và cuối cùng nhiều loài bị đe dọa tuyệt chủng.
2.2.2.5. Quần thể nhỏ và cô lập
Kích thước quần thể thực vật là kết quả của mối quan hệ phức tạp các nhân tố
khác nhau bao gồm lịch sử hình thành quần thể, điều kiện môi trường sống và đặc
điểm sinh thái của loài. Kích thước quần thể phản ánh quá trình thụ phấn, cấu trúc
di truyền và mức độ tiến hoá của loài và được ghi nhận lần đầu tiên bởi Wright
(1931) [45]. Phần lớn các loài đang bị đe doạ tuyệt chủng đều nhỏ về số cá thể trong
mỗi quần thể và số quần thể và tồn tại trong những mảnh rừng nhỏ và cô lập. Một
trong những hậu quả của quần thể nhỏ và cô lập là xuất hiện mối quan hệ cận noãn
giữa các cá thể trong quần thể [32]. Ảnh hưởng này có thể làm mất tính đa dạng di
truyền nếu tần số và cường độ quan hệ cận noãn cao và cuối cùng giảm khả năng

thích nghi của quần thể trong điều kiện môi trường biến đổi và tăng khả năng nhạy
cảm đối với dịch bệnh [23,29]. Sự phiêu bạt di truyền trong quần thể nhỏ và cô lập
thường làm tăng khả năng tuyệt chủng cục bộ của loài [31,32].
2.3. Một số chỉ thị phân tử sử dụng trong nghiên cứu đa dạng di truyền
2.3.1. Chỉ thị AFLP
AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism – Đa hình độ dài các đoạn
được nhân bản chọn lọc) do Vos và cộng sự (1993) [42] phát minh ra chỉ thị AFLP
là sự kết hợp của hai kĩ thuật RFLP và PCR, nguyên tác của AFLP giống như
nguyên tác của kĩ thuật RFLP đều dựa trên việc các enzyme cắt giới hạn DNA tại
những trình tự đặc hiệu, nhưng khác là không tiến hành lai Souther blots do vậy
thực hiện nhanh hơn. Kĩ thuật này sử dụng phản ứng PCR để nhân chọn lọc các
đoạn cắt giới hạn và tính đa hình được xác định nhờ sự khác nhau về độ dài của các
đoạn băng được cắt giới hạn được nhân [12].
Các bước tiến hành:
Bước 1: Cắt các mẫu DNA nghiên cứu bằng enzyme giới hạn chọn lọc.
Bước 2: Bổ xung đoạn nối có gắn các oligonucletotide phù hợp để sau đó các
mồi có thể bám vào các adapter này.


11
Bước 3: Dùng phản ứng PCR để khuếch đại các đoạn cắt giới hạn
Bước 4: Phân tích kết quả trên gel polyacrylamide
Kĩ thuật AFLP rất nhậy với phát hiện tính đa hình ở mức độ toàn bộ hệ gen.
Một phản ứng AFLP có thể phát hiện tính đa hình cao hơn một phản ứng RFLP hay
một phản ứng RAPD. Kĩ thuật AFLP được đánh giá là nhanh chóng có hiệu quả
trong việc xác định tính đa dạng ở cây trồng như lạc, lúa…. Tuy nhiên chi phí và
yêu cầu kĩ thuật để thực hiện AFLP là rất cao[34].
2.3.3. Chỉ thị SSR
Chỉ thị SSR (Single Sequence Repeat – khuếch đại các đoạn lặp lại đơn giản)
Microsatellite là chuỗi mã di truyền lặp lại rất đơn giản, xảy ra ngẫu nhiên

trong hầu hết genome thực vật, động vật và trên con người. Chiều dài thường 1 –
100bp. Do đó, SSR có thể khuếch đại trong ống nghiệm bằng phương pháp PCR với
tính phát triển của primer theo miền của hai bên trên một locus. Ứng dụng kỹ thuật
SSR chi phí ít hơn RFLP. Do đó, hiện nay SSR được dùng để thiết kế bản đồ gene
trong di truyền, chọn lọc giống, đa dạng hóa các vật liệu di truyền.
Các bước thực hiện:
Bước 1: Tách chiết và tinh sạch DNA
Bước 2: Thực hiện phản ứng PCR với các mồi đặc trưng cho các đoạn lặp đơn
giản.
Bước 3: Điện di kết quả trên gel agarose.
Bước 4: Xác định mức độ giống nhau giữa các đoạn lặp DNA, xử lý số liệu,
lập bản đồ di truyền và xây dựng cây phát sinh chủng loại.
2.3.3. Chỉ thị RFLP
RFLP (( Restriction fragment length polymorphism) là phương pháp được sử
dụng lần đầu tiên vào năm 1975 để xác định đa hình DNA nhằm lập bản đồ di
truyền của một đột biến mẫn cảm nhiệt độ của các serotype của adenovirus.
RFLP là phương pháp lai DNA (Southern blot hybridization) là một kĩ thuật
nhằm kết gắn có chọn lọc những đặc thù của những sợi DNA đơn hoặc RNA dựa
trên cơ sở gép cặp bổ sung những đoạn DNA sợi đơn tương ứng đã chuyển dính vào
màng Nitrocellulose [15].


12

2.3.4. Chỉ thị RAPD
RAPD (Random Amplified polymorphism DNA) là kĩ thuật được 2 nhóm
nghiên cứu Williams và cộng sự, (1990) và Welsh và cộng sự, (1991) [43,44] phát
minh ra một cách độc lập tại hai phòng thí nghiệm khác nhau.
Kĩ thuật RAPD dựa trên cơ sở của kĩ thuật PCR, sử dụng các đoạn mồi ngắn 4
– 10 nucleotide không đặc trưng để tiến hành phản ứng PCR. Thường mồi dài 10

nucleotide, có khoảng hàng nghìn mồi chứa 10 nucleotide nhưng số lượng mồi dùng
trong nghiên cứu là rất hạn chế, với mỗi đối tượng khác nhau ta cần phải tiến hành
sàng lọc để chọn một số mồi thích hợp. Sản phẩm PCR - RAPD khi dùng mồi ngẫu
nhiên rất đa dạng có chiều dài 100 – 5000 nucleotide và khi điện di trên gel agarose
được phân tách thành các phân đoạn khác nhau. Tính đa dạng thu được nhờ kĩ thuật
RAPD là do sự bắt cặp của mồi (do đột biến điểm) hoặc do sự thay đổi NST trong
các vùng được nhân bản. Sự mất đoạn NST hoặc sự thêm bớt điểm gắn mồi cũng
như sự xen vào của một gene nào đó sẽ làm thay đổi kích thước của đoạn DNA
được nhân bản. Mỗi đoạn mồi có thể tạo ra một vài đoạn khác nhau hình thành sự
đa dạng, có thể phát hiện được và cho ra phổ điện di đặc trưng [17].
Nguyên tắc của kĩ thuật RAPD: khi nhân gene bằng máy PCR với các mồi
ngẫu nhiên, các sinh vật có bộ gen giống nhau thì sau khi điện di sẽ cho số phân
đoạn và kích thước giống nhau. Ngược lại khi bộ gen của các mẫu kiểm tra khác
nhau sẽ cho kết quả khác nhau trên băng điện di, từ sự khác nhau này chúng ta có
thể tính toán được các hệ số để chỉ ra được mối quan hệ giữa chúng.
RAPD được thực hiện theo các bước:
Bước 1: Tách chiết DNA tổng số
Bước 2: Nhân DNA bằng máy PCR
Bước 3: Điện di sản phẩm trên gel agarose hoặc polyacrylamide
Bước 4: Xác định đa dạng di truyền bằng phần mềm chuyên dụng NTSpc2.0,
lập cây phả hệ.
Ưu và nhược điểm của kĩ thuật RAPD: Kĩ thuật này đơn giản vì không đòi
hỏi sự phân lập và đọc trình tự, không đắt vì mồi RAPD là mồi đơn, có thể phát
hiện ra nhiều locus một lúc, dễ dàng phân tích cho một số lượng mẫu lớn, không đòi


13
hỏi sự hiểu biết về trình tự của DNA nghiên cứu, chỉ đòi hỏi một lượng nhỏ DNA
khuôn, thời gian thực hiện nhanh, kĩ thuật phòng thí nghiệm đơn giản, dễ làm và ít
tốn kém [17].

Tuy nhiên chỉ thị RAPD có tính trội nên những kiểu gen điều khiển tính trạng
nào đó ở trạng thái lặn sẽ khó tìm thấy sự đa hình trên gel điện di, hơn nữa RAPD
có tính chất ngẫu nhiên nên việc lặp lại phân tích điện di trên gel thường không
thống nhất và thường có nhiều băng khó phân tích, dẫn đến việc phân tích kết quả
dễ sai lầm do đánh giá chủ quan của từng người. Tuy nhiên, phương pháp này dễ
làm và ít tốn kém nên vẫn được sử dụng khá phổ biến trong việc đánh giá đa dạng
di truyền ở nhiều loài [1, 2].
2.3.5. Chỉ thị ISSR
Chỉ thị ISSR (inter-simple sequence repeat) do Zeitkiewic và cộng sự, (1994)
phát minh [46].
Trong cấu trúc hệ gen của vi sinh vật nhân thật tồn tại một loại các trình tự
nucleotide lặp lại, chúng thường đặc trưng cho loài. SSR gồm từ 2 đến 5 nucleotide
lặp lại nhiều lần, ví dụ: (AT)n, (AG)n, (AGTC)n. SSR nằm rải rác trong hệ genome
của thực vật bậc cao. Kỹ thuật PCR sử dụng tính chất của SSRs để nhân bản các
đoạn gen nằm giữa SSR. Đoạn mồi được thiết kế là đoạn oligonucletide có trình tự
bổ sung với đoạn SSR. Số lần lặp lại nhiều lần làm cho các phân đoạn DNA được
nhân có độ dài ngắn khác nhau và đặc trưng cho mỗi cá thể [17].
Giống như chỉ thị RAPD, ISSR cũng dựa trên kỹ thuật PCR và chỉ dùng một
mồi đơn có độ dài từ 20 đến 30 nucleotide để nhân bản các trình tự đơn giản ở giữa
các trình tự lặp lại cho loài. Nhiều kết quả nghiên cứu đã chỉ ra chỉ thị ISSR phản
ánh mức độ phân nhóm di truyền của quy luật Mendel.
Ưu và nhược điểm: Đây là nhóm chỉ thị đồng trội có khả năng phát hiện tính
đa hình rất cao, có khả năng tự động hóa trong quá trình thực nghiệm. Tuy nhiên,
nhược điểm của chỉ thị này là quá trình thiết kế mồi đắt đỏ, mỗi một loại mồi chỉ
đặc trưng cho một loài.
Hiện nay chỉ thị ISSR cũng được sử dụng rất hiệu quả trong nghiên cứu đa
dạng DNA ở nhiều đối tượng cây trồng [34].


14

2.3.6. Sử dụng chỉ thị lục lạp trong nghiên cứu đa dạng di truyền thực vật
Chỉ thị lục lạp được nghiên cứu phát triển sử dụng để nhận dạng cho từng loài
do lục lạp có tính bảo thủ cao và tần số đột biến thấp hơn so với DNA nhân nên sự
đa hình của DNA lục lạp (cpDNA) được sử dụng trong nghiên cứu về sinh thái và
quan hệ di truyền giữa các loài thực vật. Việc ứng dụng các chỉ thị lục lạp vào
nghiên cứu đa dạng di truyền ở thực vật đã được nhiều tác giả quan tâm và đã được
tiến hành trên nhiều đối tượng khác nhau.
2.4. Nghiên cứu trong và ngoài nước về đa dạng di truyền
2.4.1. Tình hình nghiên cứu trong nước
Trong những năm gần đây, kỹ thuật sinh học phân tử đang được áp dụng rộng
rãi, có hiệu quả trong nghiên cứu tiến hoá, phân loại và đa dạng di truyền quần thể
sinh vật. Phương pháp chủ yếu dựa trên kỹ thuật phân tích DNA. Các chỉ thị
AFLP (Đa hình các đoạn nhân chọn lọc), RFLP (Đa hình độ dài các đoạn cắt
giới hạn), RADP (Đa hình các đoạn DNA nhân ngẫu nhiên), ISSR (Đa hình các
đoạn được nhân bản ngẫu nhiên), SSR (DNA vệ tinh hay trình tự lặp lại đơn
giản), cpSSR (trình tự lặp lại đơn giản genome lục lạp), gen mã hoá 18S
rRNA,… hay được sử dụng để đánh giá đa dạng di truyền, nhận dạng các đoạn
DNA hoặc các trình tự đặc trưng cho loài. Với số lượng bản sao lớn trong hệ
gen là điều kiện thuận lợi cho kỹ thuật PCR với các cặp mồi thích hợp [28, 37].
Gần đây, việc ứng dụng các kỹ thuật sinh học phân tử trong nghiên cứu đa
dạng di truyền, phân loại và nhận dạng mẫu sinh vật ở Việt Nam cũng đã đạt được
nhiều kết quả có giá trị. Những nghiên cứu về lĩnh vực này ở Việt Nam còn rất hạn
chế và tản mạn. Nghiên cứu khá đầy đủ có thể kể đến một số công trình của tác giả
Nguyễn Minh Tâm và cộng sự đã nghiên cứu một số loài Thiên Tuế đang bị đe doạ
tuyệt chủng như Cycas dolichophilla, C. balansae, C. ferruginea, C. hoabinhensis,
C. simplicipinna và C. chevalieri ở Việt Nam[14]. Các kết quả nghiên cứu đã cho
thấy mặc dù trong các quần thể nhỏ tính đa dạng di truyền cao ở một số loài Tuế có
thể liên quan đến phương thức sinh sản và môi trường sống đa dạng, hệ số sinh sản
cận noãn cao. Các kết quả phản ánh khả năng thích nghi với môi trường sống sẽ bị

suy giảm trong tương lai gần nếu chúng ta không có các biện pháp bảo vệ và phục
hồi loài hữu hiệu hơn. Nhóm tác giả khác cũng đã sử dụng chỉ thị phân tử SSR lục


15

lạp (cpSSR) để nghiên cứu mối quan hệ di truyền cho loài Thủy tùng, Thông đỏ bắc
và Thông đỏ lá dài làm cơ sở cho nghiên cứu bảo tồn[3,4]. Một số công trình nghiên
cứu khác cũng có thể kể đến như Đinh Thị Phòng và cộng sự (2009,2011); Vũ Thị
Thu Hiền và cộng sự (2009) cũng đã sử dụng chỉ thị thị RAPD, ISSR và cpSSR
để nghiên cứu mối quan hệ di truyền cho Pơ mu, Bách xanh và một số loài thuộc
chi Trắc Dabergia[5,6,11] Nguyễn Đức Thành và cộng sự (2005) nghiên cứu về
đa dạng di truyền một số loài cây Họ Dầu Dipterocarpaceae dựa trên đa hình
DNA genome và lục lạp[13]. Như vậy, những kết quả nghiên cứu này sẽ là cơ sở
khoa học quan trọng cho công tác bảo tồn nguồn gen và duy trì tiến hoá của một
số loài quý hiếm ở nước ta. Để có chiến lược bảo tồn loài hữu hiệu hơn, chúng ta
cần phải có thêm nhiều thông tin về lĩnh vực này.
2.4.2. Tình hình nghiên cứu trên thế giới
Trên thế giới có rất nhiều công trình nghiên cứu về di truyền quần thể và loài
phục vụ công tác bảo tồn và phục hồi[19,21,24,27,33,38]. Các tác giả đã phân tích
cấu trúc di truyền của một số loài quý hiếm và chỉ ra mức độ đa dạng di truyền bị
suy giảm rất cao liên quan đến khả năng tăng hệ số đồng hợp tử trong các quần thể
nhỏ và cô lập. Sự khác nhau về đa dạng di truyền giữa các quần thể là rất lớn. Tác
giả đã đưa ra một số biện pháp ứng dụng để phục hồi nguồn tài nguyên và đã đạt
hiệu quả cao. Nhiều nghiên cứu đã đề cập đến mức độ suy giảm tính đa dạng di
truyền trong và giữa các quần thể thực vật liên quan đến quá trình phân cắt nơi
sống[20,31,32]. Các tác giả đã chỉ ra rằng suy giảm tính đa dạng di truyền xảy ra
liên quan đến số lượng cá thể rất thấp trong quàn thể. Hệ số thụ phấn cận noãn cao
là yếu tố làm suy giảm tính đa dạng di truyền. Phân cắt nơi sống có thể hạn chế mức
độ trao đổi di truyền giữa các quần thể bị cô lập và làm tăng mức độ di truyền khác

nhau giữa chúng.
Một trong những hậu quả của quần thể nhỏ và cô lập là xuất hiện mối quan hệ
cận noãn giữa các cá thể trong quần thể [32]. Ảnh hưởng này có thể làm mất tính đa
dạng di truyền nếu tần số và cường độ quan hệ cận noãn cao và cuối cùng giảm khả
năng thích nghi của quần thể trong điều kiện môi trường biến đổi và tăng khả năng
nhạy cảm đối với dịch bệnh [23]. Sự phiêu bạt di truyền trong quần thể nhỏ và cô
lập thường làm tăng khả năng tuyệt chủng cục bộ của loài [23, 31].


16

Phần 3
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.1. Vật liệu nghiên cứu
Trong nghiên cứu này chúng tôi điều tra tính đa dạng di truyền của 45 cá thể
thu được tại 4 quần thể Dầu rái trong tỉnh Đồng Nai: khu rừng phòng hộ Tân Phú,
Khu dự trữ Thiên nhiên Vĩnh Cửu và Vườn Quốc gia Cát Tiên. Mẫu được ghi số
cùng với đặc điểm sinh học của cây lấy mẫu, bảo quản trong silicagel tại hiện
trường sau đó mẫu được chuyển về phòng Phân loại thực nghiệm và đa dạng nguồn
gen của Bảo tàng Thiên nhiên Việt Nam, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ
Việt Nam và được bảo quản ở -30oC trong tủ lạnh sâu.
Bảng 3.1. Địa điểm và số mẫu Dầu rái (D. alatus) được thu thập
Quần
thể
Mã Đà

Số
mẫu

11

Đảo Tiên 12

Địa điểm
Khu dự trữ Thiên nhiên
Vĩnh Cửu, Đồng Nai
Vườn Quốc gia Cát
Tiên, Đồng Nai

Độ cao
(m)

Vĩ độ

Kinh độ

129 m

11o12’N

107o09’E

120 m

11o44’N

107o27’E

80 m

11o05’N

107o24’E

130 m

11o25’N

107o17’E

Khu rừng phòng hộ Tân
Tân Phú

10

Phú, Định Quán, Đồng
Nai

Núi
Tượng

12

Vườn Quốc gia Cát
Tiên, Đồng Nai


17

Bảng 3.2. Danh sách các mồi SSR dùng trong nghiên cứu

[

Ký
hiệu

Trình tự
lặp

P193

(AG)15

P226

(GA)24

P214

(AG)15

P293

(GA)25

P258

(TA)8

P120

(AC)9

P170

(GA)6

Trình tự mồi

F-5’-CTTCCCTAAATTCCCCAATGTT-3’
R-5’-TAATGGTGTGTGTACCAGGCAT-3’
F-5’-ACAATGAAACTTGACCACCCAT-3’
R-5’-CAAAAGGACATACCAGCCTAGC-3’
F-5’-TAGGGCATATTGCTTTCTCATC-3’
R-5’-CTTATTGCAGTCATCAAGGGAA-3’
F-5’-TCTCAAAATCTGCAAAGACAGC-3’
R-5’-CCATAGTCATCACCTCTAATGGTC-3’
F-5’-TGGCAAACAAGCTACTGTTCAT-3’
R-5’-CATGGGTTTAGCAACCTACACA-3’
F-5’-CAGGAGGGGAATATGGAAAA-3’
R-5’-AAGTCGTCATCTTTGGATTGC-3’
F-5’-ATGCTTACCACCAATGTGAATG-3’
R-5’-CTCGCAGCAGAACAACTTTCTA-3’

Kích
thước
(bp)

Tm

193

55oC

226

56oC

214

55oC

293

55oC

258

55oC

120

54oC

170

55oC

169

54oC

166

54oC

Nguồn tài
liệu

Isagi et
al., 2002
Isagi et
al., 2002
Isagi et
al., 2002
Isagi et
al., 2002
Isagi et
al., 2002
Isagi et
al., 2002
Terauchi,
1994

(CT)8CA F-5’-ATGTC CATGT TTGAG TG-3’
(CT)5CA
Shc07

CCC(CT
CA)3CT(

R-5’-CATGG ACATA AGTGG AG-3’

Ujino et
al., 1998

CA)10
Shc11

(CT)4TT F-5’-ATCTG TTCTT CTACA AGCC-3’
(CT)5

R-5’-TTAGA ACTTG AGTCA GÂTC-3’

3.2. Thiết bị, hóa chất và dụng cụ
3.2.1. Thiết bị
- Máy li tâm lạnh
- Máy điện di
- Máy chụp ảnh gel
- Máy ổn nhiệt

Ujino et
al., 1998


18

- Máy soi UV
- Máy votex
3.2.2. Hóa chất
- Agarose gel 0.8%

- Nitơ lỏng
- Phenol : choloroform : isoamylalcohol ( 25:24:1)
- Isopropanol
- Sodium acetate 3M
- Ethanol 100%
- Ethanol 70%
- Đệm TE
- Rnase ( 10mg/ml)
- Nước cất đã khử ion
- Nước cất
3.2.3. Dụng cụ
- Cối, chày sứ, thìa vô trùng
- Giấy thâm vô trùng
- Ống eppendorf 2ml
- Ống eppendorf 1,5ml
- Đầu côn các loại
- Hộp đựng đá
3.3. Địa điểm và thời gian nghiên cứu
Các mẫu được lưu giữ tại phòng Phân loại thực nghiệm và đa dạng nguồn gen
của Bảo tàng thiên nhiên Việt Nam. Thí nghiệm sẽ được tiến hành tại phòng Phân
loại thực nghiệm và đa dạng nguồn gen của Bảo tàng thiên nhiên Việt Nam từ
01/03/2014 – 07/06/2014.
3.4. Nội dung nghiên cứu
Nội dung 1: Khuếch đại các trình tự SSR của 4 quần thể Dầu nước
-

Tách chiết DNA tổng số và điện di kiểm tra sản phẩm

-

Nhân các đoạn SSR của các mẫu Dầu nước bằng kỹ thuật PCR