Đánh giá biến lượng di truyền quần thể con lai cây cao su của tổ hợp lai

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC
------- o0o -------






KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP


ĐÁNH GIÁ BIẾN LƢỢNG DI TRUYỀN QUẦN THỂ
CON LAI CÂY CAO SU CỦA TỔ HỢP LAI
PB260 X RO44/268 BẰNG
KỸ THUẬT RAPD


Ngành học: CÔNG NGHỆ SINH HỌC
Niên khóa: 2003 - 2007
Sinh viên thực hiện: PHẠM NGỌC CHINH






Tháng 08/2007

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

**************





ĐÁNH GIÁ BIẾN LƢỢNG DI TRUYỀN QUẦN THỂ
CON LAI CÂY CAO SU CỦA TỔ HỢP LAI
PB260 X RO44/268 BẰNG
KỸ THUẬT RAPD




Giáo viên hƣớng dẫn: Sinh viên thực hiện:
TS. BÙI MINH TRÍ PHẠM NGỌC CHINH
ThS. LẠI VĂN LÂM Khóa: 2003-2007
KS. TRẦN THANH






Tháng 08/2007

iii

LỜI CẢM TẠ

Chân thành cảm ơn:
Ban Giám Hiệu trường Đại Học Nông Lâm Tp. Hồ Chí Minh, Ban Chủ Nhiệm Bộ
Môn Công Nghệ Sinh Học, cùng tất cả quý Thầy Cô đã truyền đạt những kiến thức
quý báu cho tôi trong suốt thời gian học tại trường.
Ban giám đốc Viện Nghiên Cứu Cao Su Việt Nam đã tạo điều kiện thuận lợi cho tôi
thực tập và hoàn thành tốt khóa luận tốt nghiệp .
TS. Bùi Minh Trí, ThS. Lại Văn Lâm và KS. Trần Thanh đã tận tình hướng dẫn,
giúp đỡ tôi hoàn thành khóa luận.
KS. Vũ Thị Quỳnh Chi đã có những chỉ dẫn, động viên giúp tôi thực hiện tốt khóa
luận này.
ThS. Lê Mậu Túy/ Trưởng Bộ Môn Giống Viện Nghiên Cứu Cao Su Việt Nam cùng
các cô chú, anh chị là cán bộ công nhân viên Bộ Môn Giống/Viện Nghiên Cứu Cao
Su đã nhiệt tình giúp đỡ và hướng dẫn tôi trong suốt thời gian thực tập tại Viện
Nghiên Cứu Cao Su Việt Nam.
Những người bạn đã giúp đỡ tôi rất nhiều trong suốt những năm học cũng như thời
gian thực tập tốt nghiệp.
Và con xin thành kính ghi ơn Cha Mẹ đã sinh thành, dưỡng dục con nên người, để
con được như ngày hôm nay.

iv
TÓM TẮT

PHẠM NGỌC CHINH, Đại Học Nông Lâm Tp. Hồ Chí Minh. Tháng
8/2007. “ĐÁNH GIÁ BIẾN LƢỢNG DI TRUYỀN QUẦN THỂ CON LAI CÂY
CAO SU CỦA TỔ HỢP LAI PB260 x RO44/268 BẰNG KỸ THUẬT RAPD “
Giáo viên hƣớng dẫn:
TS. BÙI MINH TRÍ
ThS. LẠI VĂN LÂM
KS. TRẦN THANH
Cây cao su là cây công nghiệp cây có hiệu quả kinh tế cao, ổn định và góp
phần cải thiện kinh tế, xã hội và môi trƣờng. Chính vì vậy, công tác cải tiến giống
để phục vụ nhu cầu phát triển cây cao su là rất quan trọng. Tuy nhiên, sự giới hạn
về nguồn gen ở các nƣớc châu Á đã gây trở ngại cho công tác chọn tạo giống cao
su. Để khắc phục trở ngại này hiện nay, Viện Nghiên Cứu Cao Su Việt Nam đã đƣa
nguồn gen cây cao su từ vùng bản địa Amazon vào các chƣơng trình lai tạo giống.
Do đó, chúng tôi tiến hành nghiên cứu biến lƣợng, đặc điểm di truyền của các con
lai để tạo nguồn tƣ liệu giúp cải tiến chƣơng trình tạo tuyển giống cao su với nguồn
di truyền cao su hoang dại Amazon.
Những kết quả đạt đƣợc:
- Kết quả thí nghiệm trên 2 primer cho quy trình phản ứng RAPD nhận thấy
Primer A18 có 10 băng đa hình (chiếm 83,33%) trong tổng số 12 băng đƣợc khuếch
đại, primer OPB12 có 11 băng đa hình (chiếm 91,67%) trong tổng số 12 băng đƣợc
khuếch đại
- Kết quả phân tích hệ số tƣơng đồng di truyền dựa trên chỉ số DICE của 20 con
lai của tổ hợp PB260 x RO44/268 có giá trị từ 0,522 đến 0,976. Giá trị này cũng có
nghĩa là khoảng cách di truyền giữa các con lai trong quần thể biến thiên từ 0,024

v
đến 0,478. Kết quả này cho thấy quần thể con lai của tổ hợp PB260 x RO44/268 có
biến lƣợng di truyền khá rộng.
- Kết quả phân nhóm di truyền dựa trên dữ liệu RAPD cho thấy chƣa có mối
liên hệ nào đƣợc phát hiện giữa các đặc tính nông học (sinh trƣởng hoặc sản lƣợng)
và marker RAPD thông qua 2 primer A18 và OPB12.
Qua kết quả trên, bƣớc đầu cho thấy marker RAPD đã phản ánh đƣợc biến
lƣợng di truyền trong quần thể con lai của tổ hợp PB260 x RO44/268.
Kết quả đề tài góp phần tạo tƣ liệu nghiên cứu di truyền nhằm nhằm sử dụng
hiệu quả nguồn di truyền Amazone vào chƣơng trình cải tiến giống cây cao su
Hevea.















vi
MỤC LỤC

LỜI CẢM TẠ ....................................................................................................... iii

TÓM TẮT ............................................................................................................. iv
MỤC LỤC ............................................................................................................. vi
DANH SÁCH CHỮ VIẾT TẮT ........................................................................... ix
DANH SÁCH CÁC BẢNG ................................................................................... x
DANH SÁCH CÁC HÌNH ................................................................................... xi
CHƢƠNG 1: MỞ ĐẦU ......................................................................................... 1
1.1 ĐẶT VẤN ĐỀ .................................................................................................. 1
1.2 MỤC TIÊU – YÊU CẦU ................................................................................. 2
1.2.1 Mục tiêu ..................................................................................................... 2
1.2.2 Yêu cầu ...................................................................................................... 2
1.3 GIỚI HẠN ĐỀ TÀI .......................................................................................... 3
CHƢƠNG 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU ................................................................ 4
2.1 GIỚI THIỆU TỔNG QUÁT VỀ CÂY CAO SU ............................................. 4
2.1.1 Nguồn gốc và phân bố tự nhiên ................................................................. 4
2.1.2 Sự phân bố và sản xuất cao su trên thế giới .............................................. 4
2.1.3 Đặc điểm sinh học của cây cao su ............................................................. 5
2.1.4 Một số đặc điểm di truyền của cây cao su ................................................. 8
2.1.5 Quá trình cải tiến giống cao su .................................................................. 9
2.2 NGUYÊN TẮC VÀ ỨNG DỤNG CỦA MỘT SỐ PHƢƠNG PHÁP DÙNG
TRONG NGHIÊN CỨU DI TRUYỀN PHÂN TỬ ............................................. 11
2.2.1 Chỉ thị hình thái ....................................................................................... 11
2.2.2 Chỉ thị isozyme ........................................................................................ 11

vii
2.2.3 Chỉ thị DNA ............................................................................................ 12
2.2.3.1 Kỹ Thuật RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphisms) .... 12
2.2.3.2 Kỹ thuật SSCP (Single – Strand Conformation Polymorphism) ...... 12
2.2.3.3 Kỹ thuật STS (Sequence - Tagged Sites) ......................................... 13
2.2.3.4 Kỹ thuật Microsatellites (SSR – Simple Sequences Repeat) ........... 13
2.2.3.5 Kỹ thuật AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism) ........ 13

2.2.3.6 Kỹ thuật RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA) ............... 14
2.2.4 Kỹ thuật PCR (Polymerase Chain Reaction) .......................................... 14

2.3 ỨNG DỤNG KỸ THUẬT RAPD TRONG NGHIÊN CỨU CÂY CAO SU19
CHƢƠNG 3: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ....................... 21
3.1 VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU ........................................................................... 21
3.1.1 Vật liệu di truyền ..................................................................................... 21
3.1.2 Hóa chất thí nghiệm................................................................................. 21
3.1.2.1 Hoá chất ly trích DNA ...................................................................... 21
3.1.2.2 Hóa chất sử dụng trong kỹ thuật RAPD ........................................... 21
3.1.3 Thiết bị, dụng cụ thí nghiệm ................................................................... 22
3.2 THỜI GIAN VÀ ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU ............................................... 22
3.2.1 Thời gian nghiên cứu ............................................................................... 22
3.2.2 Địa điểm nghiên cứu ............................................................................... 22
3.3 PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .................................................................. 22
3.3.1 Phƣơng pháp lấy mẫu và ly trích DNA ................................................... 22
3.3.2 Phƣơng pháp kiểm tra hàm lƣợng và độ tinh sạch của DNA mẫu .......... 23
3.3.3 Phƣơng pháp khuếch đại DNA ................................................................ 24
3.3.4 Phƣơng pháp điện di sản phẩm DNA sau khi khuếch đại ....................... 24
3.3.5 Phƣơng pháp phân tích kết quả ............................................................... 24
CHƢƠNG 4: KẾT QUẢ - THẢO LUẬN ........................................................... 25
4.1 LY TRÍCH DNA ............................................................................................ 25

viii
4.1.1 Định tính DNA mẫu bằng phƣơng pháp điện di trên gel agarose ........... 25
4.1.2 Định lƣợng DNA mẫu bằng phƣơng pháp đo mật độ quang (Optical
Density) ............................................................................................................ 26
4.2 KHUẾCH ĐẠI DNA BẰNG KỸ THUẬT RAPD ........................................ 26
4.3 ĐIỆN DI TRÊN GEL AGAROSE ................................................................. 27
4.4 ĐÁNH GIÁ SỰ ĐA HÌNH CỦA CÁC PRIMER ......................................... 29

4.5 ĐÁNH GIÁ BIẾN LƢỢNG DI TRUYỀN CỦA CÁC CON LAI ................ 29
4.6 PHÂN NHÓM DI TRUYỀN CÁC CON LAI ............................................... 34
CHƢƠNG 5: KẾT LUẬN – ĐỀ NGHỊ ............................................................... 37
5.1 KẾT LUẬN .................................................................................................... 37
5.2 ĐỀ NGHỊ ....................................................................................................... 38
TÀI LIỆU THAM KHẢO .................................................................................... 39
PHỤ LỤC ............................................................................................................. 43














ix
DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT

AFLP: Amplified Fragment Length Polymorphism
bp: base pair
Ctv: cộng tác viên
DNA: Deoxyribonuleotide acid
dNTP: 2’- dideoxynucleotide - 5’- triphosphate
Kb: kilo base

NTSYSpc: Numercial Taxonomy System
OD: Optical density
PCR: Polymerase Chain Reaction
RFLP: Restriction Fragment Length Polymorphism
RAPD: Random Amplified Polymorphic DNA
SSR: Simple Sequence Repeat (microsatellite)
STS: Sequence-Tagged Sites
SSCP: Single – Strand Conformation Polymorphism
Taq: Thermus aquaticus
UPGMA: Unweighted pair group method using arithmetic average
UV: Ultra violet
VNCCSVN: Viện Nghiên Cứu Cao Su Việt Nam
SALB: South American Leave Blight









x
DANH SÁCH CÁC BẢNG

BẢNG TRANG
Bảng 4.1: Tỷ lệ và nồng độ các hóa chất tham gia phản ứng RAPD ................... 27
Bảng 4.2: Chu trình nhiệt cho phản ứng RAPD ................................................. 27
Bảng 4.3: Số băng DNA đƣợc khuếch đại ở các primer ...................................... 29
Bảng 4.4: Số băng DNA đƣợc khuếch đại của các con lai nghiên cứu ............... 30

Bảng 4.5: Hệ số tƣơng đồng di truyền của các con lai nghiên cứu ...................... 31
Bảng 4.6: Hệ số tƣơng đồng di truyền giữa các con lai với mẹ (PB260) và bố
(RO44/268) của chúng. ........................................................................................ 32
Bảng 4.7: Các băng DNA chỉ xuất hiện ở bố và các con lai. ............................... 33
Bảng 4.8: Các băng DNA chỉ xuất hiện ở mẹ và các con lai .............................. 33
Bảng 4.9: Phân nhóm thành tích sinh trƣởng và sản lƣợng của các con lai ....... 35












xi

DANH SÁCH CÁC HÌNH

HÌNH TRANG
Hình 2.1: Mô tả phản ứng PCR ............................................................................. 16
Hình 4.1: DNA của các dòng vô tính cao su trên gel agarose 1% ........................ 25
Hình 4.2-A: Băng DNA của các con lai đƣợc khuếch đại với primer A18 .......... 28
Hình 4.2-B: Băng DNA của các con lai đƣợc khuếch đại với primer OPB12 ..... 28
Hình 4.2-C: Băng DNA của các con lai còn lại đƣợc khuếch đại với cả 2 primer
............................................................................................................................... 29
Hình 4.3: Cây phân nhóm di truyền của các con lai đƣợc thiết lập dựa trên cơ sở dữ

liệu phân tích RAPD, sử dụng phƣơng pháp phân tích cluster UPGMA ............. 36











1

Chƣơng 1
MỞ ĐẦU

1.1 ĐẶT VẤN ĐỀ
Cây cao su, Hevea brasiliensis Muell. Arg thuộc chi Hevea, họ
Euphorbiaceae có nguồn gốc từ vùng rừng thuộc lƣu vực sông Amazon, Nam Mỹ.
Vùng sinh thái tự nhiên của cây cao su thuộc khí hậu nhiệt đới ẩm. (Trần Thị Thúy
Hoa, 1998).
Cây cao su là cây công nghiệp có hiệu quả kinh tế cao, ổn định và góp phần
cải thiện kinh tế, xã hội và môi trƣờng. Cây cao su là loài cây cung cấp nguồn
nguyên liệu quan trọng cho nhiều ngành công nghiệp, đƣợc xếp sau dầu hỏa, than
đá và gang thép. Bên cạnh các sản phẩm truyền thống từ mủ cao su, cây cao su còn
có khả năng cung cấp một khối lƣợng gỗ có giá trị kinh tế cao sau chu kỳ kinh
doanh. Mặt khác, hiện nay cây cao su còn đƣợc xem là thành phần trong cơ cấu cây
trồng có thể đáp ứng chủ trƣơng phủ xanh đất trống, đồi trọc, tái tạo rừng, cải tạo
môi sinh. Tuy nhiên, sự giới hạn nguồn gen ở các nƣớc châu Á là yếu tố quan trọng

nhất gây trở ngại cho công tác chọn tạo giống cao su (Lại Văn Lâm và ctv, 2006).
Chính vì vậy, các nƣớc trồng cao su trên thế giới đã cố gắng giải quyết vấn đề này
bằng cách di nhập bổ sung nguồn vật liệu giống hoang dại của các loài trong chi
Hevea từ vùng nguyên quán Amazon.
Tại Việt Nam từ năm 1997, một số kiểu di truyền Amazon triển vọng đã
đƣợc đƣa vào các chƣơng trình lai tạo giống nhằm mở rộng nguồn gen trong công
tác chọn tạo giống cao su (Lại Văn Lâm và ctv, 2006).


2
Những nghiên cứu về di truyền trên cây cao su có thể giúp cho các nhà chọn
giống trong việc chọn bố mẹ, định hƣớng chƣơng trình cải tiến giống và khả năng
sử dụng các chỉ tiêu tuyển non cho nghiên cứu di truyền để phát hiện ngay ở giai
đoạn non những dòng vô tính có thể làm bố mẹ tốt (Sherpherd, 1969; Simmonds,
1969; Gilbert và ctv, 1973; Nga và Subramaniam, 1976; Tan, 1987; Tan và ctv,
1979; Kavitha K. M. và ctv, 1990; Licy J., 1992; Lê M. T., 1998; Goncalve và ctv,
1998, 2004; Lại Văn Lâm và ctv trích dẫn, 2006). Bên cạnh đó, một số nghiên cứu
di truyền đã đƣợc tiến hành trên nguồn gen Amazon để ƣớc lƣợng các thông số di
truyền, đánh giá độ lớn và bản chất của các biến lƣợng di truyền, định lƣợng tiến bộ
di truyền và dự đoán phƣơng pháp chọn giống tốt nhất (Lại Văn Lâm và ctv trích
dẫn, 2006).
Hiện nay, Viện Nghiên Cứu Cao Su Việt Nam đã đƣa nguồn gen Amazon
vào các chƣơng trình lai tạo giống. Do đó, vấn đề đặt ra là cần nghiên cứu biến
lƣợng, đặc điểm di truyền của các con lai để tạo nguồn tƣ liệu giúp cải tiến chƣơng
trình tạo tuyển giống cao su với nguồn di truyền cao su hoang dại Amazon. Từ thực
tế đó chúng tôi tiến hành thực hiên đề tài “Đánh giá biến lƣợng di truyền quần thể
con lai cây cao su của tổ hợp lai PB260 x RO44/268 bằng kỹ thuật RAPD”.
1.2 MỤC TIÊU – YÊU CẦU
1.2.1 Mục tiêu
Đánh giá biến lƣợng di truyền của các con lai của tổ hợp PB260 x RO44/268

bằng marker RAPD. Qua đó cung cấp tƣ liệu cho chƣơng trình tạo tuyển giống cao
su với nguồn di truyền Amazon.
1.2.2 Yêu cầu
- Ly trích DNA của các con lai, đảm bảo hàm lƣợng và độ tinh sạch cao, làm
nguyên liệu cho phản ứng RAPD.
- Đánh giá đƣợc biến lƣợng di truyền của các con lai của tổ hợp PB260 x
RO44/268 qua việc phân tích RAPD.

3
- Đánh giá mối liên hệ giữa marker RAPD và các đặc tính sinh trƣởng hoặc
sản lƣợng của các con lai.
- Nắm vững kỹ thuật PCR, thao tác chính xác, hạn chế sai sót trong quá trình
thực hiện.
- Sử sụng thành thạo các phần mềm xử lý thống kê sinh học nhƣ: NTSYS-pc,
Excel.
1.3 GIỚI HẠN ĐỀ TÀI
Do giới hạn về thời gian nên các nghiên cứu của đề tài chỉ phân tích RAPD
dựa trên 2 primer A18 và OPB12.

4

Chƣơng 2
TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 GIỚI THIỆU TỔNG QUÁT VỀ CÂY CAO SU
2.1.1 Nguồn gốc và phân bố tự nhiên
Cây cao su (Hevea brasiliensis Muell. Arg) là một loài thuộc chi Hevea, họ
Euphorbiaceae. Trong chi Hevea, còn có 9 loài Hevea khác: H. benthamiana, H.
camargona, H. camporum, H. guianensis, H. nitida, H. microphylla, H. pauciflora,
H. rigidifolia và H. spruceana. Mặc dù tất cả các loài Hevea đều có mủ cao su

nhƣng chỉ có loài Hevea brasiliensis là có ý nghĩa về kinh tế và đựợc trồng rộng rãi
nhất. Cây cao su mọc tự nhiên ở vùng rừng thuộc lƣu vực sông Amazon, Nam Mỹ,
trải rộng từ vĩ tuyến 15
0
Nam đến vĩ tuyến 6
0
Bắc và kinh tuyến 46
0
- 77
0
Tây, bao
gồm các nƣớc: Brazil, Bolivia, Colombia, Peru, Ecuador, Venezuela, French
Guiana, Surinam và Guyana (Trần Thị Thuý Hoa, 1998). Ngoài vùng xuất xứ trên,
ngƣời ta không thấy cây cao su mọc tự nhiên ở nơi nào khác trên thế giới (Trần Thị
Thuý Hoa, 1998).
Vùng sinh thái của cây cao su thuộc khí hậu nhiệt đới ẩm, khá đa dạng với
lƣợng mƣa trung bình từ 1.500 - 2.000 mm/năm, không có mùa khô hoặc mùa khô
từ 1 đến 5 tháng, nhiệt độ trung bình 28
0
C. Trong vùng Amazon, cây cao su phát
triển chủ yếu trên nền đất sét giàu dinh dƣỡng, có độ pH dao động từ 4,5 - 5,5 với
tầng đất canh tác sâu, thoát nƣớc trung bình (Nguyễn Thị Huệ, 1997).
2.1.2 Sự phân bố và sản xuất cao su trên thế giới
Năm 1876 đã mở đầu cho công cuộc phát triển cao su trồng với sự thành
công trong việc đƣa hạt cao su từ Brazil sang các nƣớc châu Á của Henry Wickham.

5
Từ đó cây cao su đã phát triển rộng rãi ở nhiều vùng nhiệt đới châu Á, châu
Phi và một phần nhỏ ở châu Mỹ La tinh (Võ Thị Thu Hà, 1996). Sau năm 1889, các
vƣờn cao su châu Á bắt đầu sản xuất mủ, sản lƣợng mủ cao su ở các nƣớc này

nhanh chóng giữ vị trí chủ đạo, đứng đầu là Thái Lan. Theo thống kê năm 2002,
tổng diện tích cao su trên toàn thế giới khoảng 9 triệu ha và sản lƣợng khoảng 7,4
triệu tấn, trong đó các nƣớc châu Á chiếm khoảng 94% tổng sản lƣợng, gồm các
nƣớc: Thái Lan (28,7%), Indonesia (24,9%), Malaysia (16,9%), Ấn Độ (10%),
Trung Quốc (6,1%), Việt Nam (3,3%), Srilanka (2,1%), các nƣớc châu Á khác
(2,1%), châu Phi chiếm khoảng 4,4% và châu Mỹ là 1% tổng sản lƣợng cao su trên
thế giới. Năng suất cao su trung bình biến thiên từ 1.500 - 1.800 kg/ha/năm tuỳ
thuộc vào trình độ ứng dụng tiến bộ khoa học kỹ thuật và quản lý của từng quốc gia
trồng cao su (Phạm Hải Dƣơng, 2002).
Đến năm 2005, tổng diện tích cao su Việt Nam đạt khoảng 480.200 ha, tổng
sản lƣợng đạt 468.600 tấn, năng suất bình quân đạt 1.480 kg/ha/năm, trong đó bình
quân năng suất của Tổng Công ty Cao su Việt Nam là 1.728 kg/ha (Trần Thị Thúy
Hoa, 2006)
2.1.3 Đặc điểm sinh học của cây cao su
Cây cao su là loài đại mộc, trong tự nhiên có thể sống đến 100 năm và cao từ
30 – 50 m, chiếm diện tích từ 20 – 40 m
2
, vòng thân có thể đạt 3 – 5 m, thƣờng là
1,5 m. Tuy nhiên, trên các vƣờn sản xuất, mức độ sinh trƣởng của cây cao su bị hạn
chế, ít khi cao hơn 25 m, vòng thân khoảng 1 - 1,2 m do mật độ trồng dày, lại bị
khai thác mủ liên tục và thƣờng bị cƣa đốn để tái canh sau 25 - 30 năm.
Cây cao su có 3 lá chét, hoa nhỏ màu vàng, đơn tính đồng chu với tỷ lệ hoa
đực gấp 60 lần hoa cái, thụ phấn chéo và tự thụ đều có thể xảy ra, quả có 3 mảnh vỏ
chứa 3 hạt, quả tự khai, hạt khá lớn với kích thƣớc khoảng 2 cm, trong hạt có chứa
nhiều dầu, dễ mất sức nẩy mầm. Khi trên 4 - 5 tuổi, cây cao su bắt đầu ra hoa sau
thời kỳ thay lá. Ở Việt Nam, vụ hoa vào khoảng tháng 2 – 3 hàng năm, có khi rải
rác trong tháng 4 – 6. Trong tự nhiên, cây cao su thụ phấn nhờ gió và côn trùng. Tỷ

6
lệ đậu trái trong tự nhiên rất thấp – dƣới 3%, có thể sự cạnh tranh dinh dƣỡng và

nƣớc làm trái non rụng nhiều (Võ Thị Thu Hà, 1996; Trần Thị Thuý Hoa, 1998).
Cây cao su có thời kỳ qua đông, lá rụng hoàn toàn sau đó nảy lộc phát triển
bộ lá mới. Cây thay lá sớm hay muộn, từng phần hay toàn phần phụ thuộc vào đặc
tính của giống và điều kiện môi trƣờng. Trong điều kiện Việt Nam, cây rụng lá qua
đông vào khoảng giữa tháng 12 và tháng 2, ở Tây Nguyên và Miền Trung cây rụng
lá qua đông sớm hơn. Sau đó cây ra hoa vào tháng 3, trái rụng trong tháng 8 - 9
hàng năm. Ở độ tuổi 7 – 8, rễ cọc phát triển sâu đến 2,4 m, rễ hút tập trung chủ yếu
ở tầng đất từ 0 – 30 cm; rễ bàng cao su phát triển rất rộng, tối đa lên đến 10 – 15 m;
ở cây trƣởng thành, bộ rễ có thể chiếm đến 15% tổng sinh khối của cây (Võ Thị Thu
Hà, 1996; Nguyễn Thị Huệ, 1997).
Cây cao su phát triển thích hợp ở nhiệt độ trung bình 25
0
C - 28
0
C. Nếu trong
điều kiện nhiệt độ thấp hơn sẽ làm cho cây phát triển chậm, thời gian kiến thiết cơ
bản kéo dài. Khi nhiệt độ xuống đến 4
0
C - 5
0
C cây bắt đầu bị tổn hại vì lạnh, cây bị
khô lá và chết chồi non, trong trƣờng hợp nghiêm trọng cây có thể chết hoàn toàn.
Lƣợng mƣa tối thiểu cần cho cây sinh trƣởng và phát triển bình thƣờng là
1.500 mm/năm, lƣợng mƣa phân bố đều trong năm thì cây sẽ phát triển tốt nhất;
ngƣợc lại, lƣợng mƣa phân bố không đều trong năm sẽ ảnh hƣởng lớn đến sản
lƣợng. Bên cạnh đó, điều kiện khô hạn sẽ gây tác hại rất lớn đối với cây cao su ở
giai đoạn non. Tuy nhiên, sức chịu đựng khô hạn ở cây cao su sẽ tốt hơn khi cây ở
giai đoạn trƣởng thành. Mặt khác, độ cao cũng có ảnh hƣởng rất lớn đến sự sinh
trƣởng và phát triển của cây cao su. Thông thƣờng, cây cao su sẽ phát triển tốt ở độ
cao dƣới 200 m, độ cao càng lớn cây càng chậm sinh trƣởng phát triển, thời gian

kiến thiết cơ bản kéo dài hơn. Cây cao su ƣa đất hơi chua (pH đất thích hợp từ 4,5 -
5,5). Yêu cầu hóa tính đất cho việc trồng cao su không khắt khe nhƣng lý tính đòi
hỏi phải tốt, tầng đất dày, không úng và địa hình ít dốc là tốt nhất. Cây cao su phát
triển bình thƣờng ở nơi có tối thiểu 1600 giờ nắng/năm, phát triển tốt ở điều kiện
gió nhẹ (vận tốc gió khoảng 3 m/s), nếu vận tốc gió lớn hơn 17 m/s cây bị gãy thân,
cành. Nếu tốc độ gió lớn hơn 25 m/s cây sẽ gãy thân và lật gốc. Mức độ thiệt hại do

7
gió phụ thuộc vào đặc tính di truyền giống và kỹ thuật canh tác. Tuy nhiên, nhờ
những thành công trong công tác tuyển chọn giống và các biện pháp nông học, hiện
nay cây cao su đã và đang phát triển ra ngoài vùng truyền thống với độ cao lớn, vĩ
độ lớn.
Mủ cao su là sản phẩm chính đƣợc thu hoạch, hình thành từ các sản phẩm
của quang hợp. Mủ cao su hiện diện trong nhiều bộ phận của cây, nhƣng quan trọng
nhất là ở các vòng ống mủ nằm trong vỏ thân. Khi khai thác, các vết cắt làm đứt hệ
thống ống mủ và cao su chảy ra ngoài, sau vài giờ sẽ ngƣng lại. Dòng mủ sẽ tiếp tục
chảy với sản lƣợng tƣơng đƣơng ở lần cạo kế tiếp cách ít nhất một ngày đến vài
ngày. Khả năng tái sinh mủ cao su phụ thuộc chủ yếu vào đặc tính di truyền giống.
Chu kỳ sinh trƣởng và phát triển của cây cao su đƣợc chia làm 2 giai đoạn
chính:
- Thời kỳ chƣa trƣởng thành (giai đoạn kiến thiết cơ bản): giai đoạn này bắt
đầu từ khi trồng đến khi khai thác mủ (vòng thân đo cách mặt đất 1m đạt khoảng 50
cm). Tốc độ sinh trƣởng của cây trong giai đoạn này là rất nhanh, kích thƣớc vòng
thân có thể tăng 7 – 10 cm/năm. Cây chuyển sang thời kỳ trƣởng thành khi hoa xuất
hiện sau 5 - 6 tuổi. Thông thƣờng, giai đoạn kiến thiết cơ bản của cây cao su từ 5 - 7
năm, tùy thuộc vào đặc tính của giống, điều kiện chăm sóc và điều kiện môi trƣờng.
- Thời kỳ trƣởng thành (giai đoạn kinh doanh): là giai đoạn khai thác mủ,
thông thƣờng giai đoạn này kéo dài khoảng 20 - 30 năm cho đến khi cƣa đốn do
hiệu quả kinh tế giảm. Diễn biến sản lƣợng mủ tùy thuộc vào đặc tính giống và điều
kiện canh tác, phần lớn các giống sẽ cho năng suất cao nhất ở tuổi trung niên khi

cây ở độ tuổi từ 15 – 30, sau đó năng suất giảm rất nhanh do mật độ cây khai thác
giảm vì bệnh, gãy đổ, sức sản xuất kém, vỏ khó cạo. Trong giai đoạn này, tốc độ
sinh trƣởng của cây cao su chậm lại, vanh thân chỉ tăng 2 – 5 cm/năm. Ở cây cao su,
hiện tƣợng thay lá xuất hiện hàng năm khi cây trên 4 tuổi, lá cũ rụng toàn bộ hoặc
từng phần trong khoảng một tháng, sau đó lá mới xuất hiện và ổn định trong khoảng

8
1 - 1,5 tháng. Trong thời gian thay lá, sản lƣợng mủ sẽ giảm mạnh khi lá non mới
mọc (Trần Thị Thúy Hoa,1998).
Về bệnh hại, cây cao su bị trên 550 loài vi sinh vật tấn công, trong đó 24 loài
có ảnh hƣởng nghiêm trọng về phƣơng diện kinh tế. Ngoại trừ bệnh cháy lá Nam
Mỹ – SALB (South American Leave Blight) – do nấm Microcylus ulei gây ra chỉ
xuất hiện ở Nam Mỹ, cây cao su Việt Nam bị gây hại bởi một số bệnh hại chính nhƣ
bệnh phấn trắng, bệnh nấm hồng, bệnh héo đen đầu lá, bệnh rụng lá mùa mƣa, loét
sọc miệng cạo.(Võ Thị Thu Hà trích dẫn, 1996).
Trong tự nhiên cây cao su nhân giống bằng hạt. Trong điều kiện kinh doanh,
cây cao su đƣợc nhân giống vô tính bằng phƣơng pháp ghép mắt cửa sổ.
2.1.4 Một số đặc điểm di truyền của cây cao su
Đặc điểm chung của các loài thuộc chi Hevea là có cùng số nhiễm sắc thể 2n
= 36. Một số tác giả cho rằng cây cao su là một dạng tứ bội với số lƣợng nhiễm sắc
thể cơ bản n = 9 vì số nhiễm sắc thể của cây cao su gấp đôi các loài khác thuộc họ
Euphorbiaceae. Các nghiên cứu điện di enzyme cho thấy cây cao su không phải là
đồng tứ bội thể mà có lẽ là dị tứ bội thể có tính thích ứng gần giống dạng nhị bội
(Trần Thị Thuý Hoa trích dẫn, 1998). Ở cây cao su, các tính trạng kinh tế chính nhƣ
sinh trƣởng, sản lƣợng mủ, khả năng kháng bệnh… đều do những tính trạng đa gen
qui định, di truyền theo phƣơng thức tác động cộng hợp.
Cây cao su có hoa đơn tính đồng chu, hoa cái và hoa đực phân bố trên cùng
một chùm hoa. Ở cây cao su, thụ phấn chéo chiếm ƣu thế hơn so với tự thụ, do đó tỷ
lệ dị hợp tử cao hơn so với đồng hợp tử. Do là cây giao phấn chéo và nhân giống vô
tính dễ dàng nên phƣơng pháp cơ bản để cải tiến giống cao su là cho lai giữa hai cha

mẹ dị hợp tử để tạo ra các con lai F1, sau đó sẽ tiến hành chọn lọc một số cá thể F1
xuất sắc để tạo thành những dòng vô tính đồng đều về kiểu hình và cố định đƣợc
kiểu gen. Cho đến nay, những thử nghiệm lai hoa nhân tạo giữa các loài cao su khác
nhau cho thấy không có sự cản trở về di truyền. Trong thực tế, ngƣời ta đã tạo ra

9
nhiều tổ hợp lai khác loài cho mục đích nghiên cứu cũng nhƣ tìm thấy nhiều dạng
lai khác loài Hevea trong tự nhiên (Trần Thị Thuý Hoa, 1998).
2.1.5 Quá trình cải tiến giống cao su
Nguồn hạt do Wickham thu thập ở Brazil chuyển về trồng ở Singapore đƣợc
xem là thủy tổ của hầu hết diện tích cao su của châu Á và châu Phi hiện nay. Trong
thời kỳ này cao su đƣợc trồng bằng hạt thực sinh không chọn lọc nên sản lƣợng rất
thấp dƣới 500 kg/ha (Võ Thị Thu Hà, 1996). Theo báo cáo của Cramer năm 1910,
trong vƣờn cao su thực sinh có sự biến thiên rất lớn về sản lƣợng giữa các cá thể,
qua phân tích sự biến thiên ông nhận thấy khoảng 70% sản lƣợng của cả vƣờn cây
là từ khoảng 30% số cây trong vƣờn cung cấp. Từ đó ông khuyến cáo chọn lọc cây
đầu dòng đƣợc trồng từ những hạt thực sinh của những cây cho năng suất cao trên
vƣờn. Kết quả thu đƣợc từ vƣờn trồng có chọn lọc đã đƣa năng suất bình quân lên
630 – 704 kg/ha (Phạm Hải Dƣơng, 2002). Sau đó các nguyên tắc chọn lọc giống
cao su lần đầu tiên đã đƣợc công bố tại hội nghị ở Batavia (Indonesia) vào năm
1914. Năm 1917, Van Helten đã thành công trong phƣơng pháp nhân giống vô tính
cây cao su bằng kỹ thuật ghép mầm ngủ trên gốc thực sinh. Phƣơng pháp này đã mở
ra một hƣớng đi mới trong tạo tuyển giống cao su là tạo các dòng vô tính. Qua các
giai đoạn tuyển chọn, các dòng vô tính xuất sắc sẽ đƣợc khuyến cáo cho sản xuất
đại trà.
Mục tiêu chung của các nƣớc trồng cao su trong công tác chọn tạo giống là
nâng cao sản lƣợng, đồng thời cải tiến những đặc tính có liên quan đến sản lƣợng
nhƣ: sinh trƣởng, kháng bệnh, kháng gió,… Những phƣơng pháp cải tiến giống
thƣờng đƣợc sử dụng trên thế giới bao gồm chọn lọc cây đầu dòng, lai hoa nhân tạo,
lai hoa tự do, đột biến và đa bội hóa nhiễm sắc thể. Ngoài ra, kỹ thuật nuôi cấy in-

vitro cũng đã đƣợc áp dụng trong việc nhân giống vô tính cây cao su. Bên cạnh đó,
phƣơng pháp chuyển gen cũng đang đƣợc nghiên cúu và ứng dụng tại một số Viện
Nghiên cứu Cao su trên thế giới. Tuy nhiên, cho đến nay phƣơng pháp lai hoa nhân

10
tạo vẫn là phƣơng pháp có hiệu quả nhất và đƣợc hầu hết các nƣớc trên thế giới áp
dụng.
Ở Việt Nam, vận dụng những kinh nghiệm nghiên cứu từ Viện Nghiên Cứu
Cao su Malaysia, Viện Nghiên cứu Cao su Châu Phi kết hợp với những cải tiến,
phƣơng pháp tạo tuyển giống cao su của Việt Nam là lai hoa hữu tính từ cha mẹ có
chọn lọc, phƣơng pháp tuyển giống trải qua bốn giai đoạn bao gồm tuyển non, sơ
tuyển, chung tuyển và sản xuất thử. Cho đến nay công tác cải tiến giống cao su tại
Việt Nam đã đạt đƣợc nhiều thành tựu nhờ vào việc nghiên cứu, ứng dụng các tiến
bộ kỹ thuật vào các chƣơng trình lai tạo giống mới cũng nhƣ bƣớc đầu ứng dụng có
hiệu quả một số kỹ thuật sinh học phân tử trong việc hổ trợ công tác nghiên cứu,
chọn tạo giống cao su.
Tuy nhiên, công tác giống cao su trên thế giới vẫn còn tồn tại một số vấn đề.
Nguồn vật liệu giống ban đầu do Wickham sƣu tập rất giới hạn về mặt di truyền vì
chỉ xuất phát từ một vùng nhỏ so với diện tích phân bố tự nhiên của cây cao su, do
đó không đại diện đầy đủ cho nguồn gen của cây cao su (Wycherley, P.R. 1968).
Nguồn di truyền hạn hẹp này còn bị xói mòn nghiêm trọng vì mục tiêu cải tiến
giống chỉ nhằm vào sản lƣợng mủ. Bên cạnh đó, sự cận thân giữa các dòng vô tính
vẫn còn tồn tại, khó tránh khỏi giao phối cận huyết ở những chu kỳ kế tiếp. Chính vì
vậy, việc mở rộng biến lƣợng di truyền con lai thông qua công tác lai tạo giữa
nguồn gen Wickham với nguồn gen hoang dại Amazon cũng nhƣ việc tăng cƣờng
các nghiên cứu về di truyền phân tử hỗ trợ trong công tác lai tạo giống đã và đang
đƣợc các Viện Nghiên cứu Cao su thế giới tiến hành nhằm chọn lọc ra các tổ hợp lai
tốt, có giá trị cao về mặt di truyền.

11
2.2 NGUYÊN TẮC VÀ ỨNG DỤNG CỦA MỘT SỐ PHƢƠNG PHÁP DÙNG
TRONG NGHIÊN CỨU ĐA DẠNG DI TRUYỀN BẰNG CHỈ THỊ
2.2.1 Chỉ thị hình thái
Về mặt nguyên tắc, một tính trạng hình thái nào đó do một locus kiểm soát
mà sự biểu hiện của nó không bị ảnh hƣởng do tác động của môi trƣờng, có thể
đƣợc dùng làm chỉ thị hình thái trong quá trình chọn lọc (Lê Duy Thành, 2000).
Mặc dù chỉ thị hình thái rất tiện lợi, dễ xác định do đo trực tiếp trên kiểu hình
nhƣng chúng lại có những hạn chế nhất định nhƣ cho kết quả sai lệch do tƣơng tác
kiểu gen với môi trƣờng, số lƣợng marker có giới hạn, chỉ ở qui mô hình thái và chỉ
thể hiện ở những giai đoạn nhất định của quá trình phát triển cá thể (Bùi Chí Bửu và
Nguyễn Thị Lang, 2004).
2.2.2 Chỉ thị isozyme
Trong nghiên cứu di truyền học phân tử, isozyme là một trong hai loại
marker cơ bản. Isozyme là chỉ thị sinh hoá, chúng là những enzyme có cùng chức
năng xúc tác cho một phản ứng (hoạt tính xúc tác tƣơng tự hoặc giống nhau) nhƣng
lại bị ức chế bởi những phân tử khác nhau. Hoạt tính của chúng đặc trƣng với một
cơ chất và trợ enzyme nhất định. Về mặt di truyền có thể chia isozyme thành hai
dạng (Hồ Huỳnh Thùy Dƣơng, 1997):
- Isozyme đơn gen: các isozyme này chịu sự kiểm soát của một gen, mặc dù
chúng chúng đều đƣợc hình thành từ chuỗi polypeptide đơn nhƣng có thể có các
kiểu phân tử khác nhau (do sự khác nhau về thành phần và trật tự các acid amin), và
do vậy có thể phân tách chúng bằng điện di.
- Isozyme đa gen: các isozyme này đƣợc mã hoá bởi hai hay nhiều gen và
chúng có thể đƣợc phân biệt bằng các đặc điểm hoá miễn dịch hoặc bằng đặc tính
enzyme (Hồ Huỳnh Thùy Dƣơng, 1997).

12
2.2.3 Chỉ thị DNA
Là những chỉ thị phân tử DNA đƣợc tạo ra nhờ những kỹ thuật sinh học phân
tử. Ngày nay các kỹ thuật sinh học phân tử đƣợc phát minh ngày càng nhiều và
ngày càng tỏ ra là công cụ đắc lực cho công tác nghiên cứu di truyền học phân tử.
Nó tạo ra số lƣợng chỉ thị nhiều hơn hẳn so với chỉ thị hình thái và chỉ thị isozyme,
độ tin cậy cao hơn và thuận tiện hơn nhiều. Ngày càng có nhiều kỹ thuật sinh học
phân tử đƣợc ứng dụng trong các nghiên cứu, đánh giá đa dạng di truyền và phát
hiện các chỉ thị liên kết với tính trạng,… Các kỹ thuật này có thể chia ra làm 2
nhóm chính:
- Những kỹ thuật dựa trên kỹ thuật PCR (PCR - based) nhƣ: RAPD, STS,
SSR, SSCP, AFLP, (Bùi Chí Bửu và Nguyễn Thị Lang, 1999).
- Những kỹ thuật dựa trên kỹ thuật lai DNA – DNA (Non - PCR based): điển
hình là RFLP (Bùi Chí Bửu và Nguyễn Thị Lang, 1999).
2.2.3.1 Kỹ Thuật RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphisms)
Đây là kỹ thuật sinh học phân tử nhằm phát hiện sự khác nhau về di truyền
giữa các cá thể, giữa các giống trong cùng một loài dựa vào sự khác nhau về số
lƣợng và kích thƣớc của những đoạn DNA đƣợc tạo ra do sử dụng những enzyme
cắt giới hạn (restriction enzymes). Sử dụng enzyme cắt giới hạn cắt toàn bộ bộ gen
của những cá thể hay giống đƣợc nghiên cứu, sau đó sản phẩm cắt đƣợc nhận biết
bằng cách lai với những probe phát huỳnh quang. Nguyên lý của kỹ thuật này dựa
vào hiện tƣợng đột biến làm mất hay xuất hiện một vị trí cắt giới hạn, vì vậy kỹ
thuật RFLP có thể phát hiện đột biến mặc dù mức độ tin cậy không cao (Bùi Chí
Bửu và Nguyễn Thị Lang, 1999).
2.2.3.2 Kỹ thuật SSCP (Single – Strand Conformation Polymorphism)
Kỹ thuật này dựa trên giả thuyết: sự khác biệt giữa các DNA do sự thay đổi
cấu trúc của dây đơn DNA có cấu trúc hình học khác nhau, làm cho DNA di chuyển
trên gel với tốc độ và khoảng cách di chuyển khác nhau. Sau khi thực hiện phản ứng

13

PCR, làm biến tính DNA thành dây đơn, điện di và nhuộm bạc. Kỹ thuật SSCP có
quy trình thực hiện khó nhƣng kết quả có độ tin cậy không cao (Bùi Chí Bửu và
Nguyễn Thị Lang, 1999).
2.2.3.3 Kỹ thuật STS (Sequence - Tagged Sites)
Do Olson và ctv đề xuất năm 1989, STS là đoạn ngắn DNA giúp phân tích
bộ gen thông qua kỹ thuật phân tích di truyền phân tử là PCR. Kỹ thuật này dựa trên
nguyên lý: trình tự một đoạn DNA chuyên biệt cho loài, thông qua kỹ thuật PCR
nhân bản đoạn DNA đó lên hàng triệu lần và phát hiện qua điện di (Nguyễn Thị
Lang, 2002). Kỹ thuật này có nhƣợc điểm là phải biết trình tự gen của đối tƣợng
nghiên cứu.
2.2.3.4 Kỹ thuật Microsatellites (SSR – Simple Sequences Repeat)
Nguyên lý của kỹ thuật này là giữa những giống khác nhau có một đoạn
DNA ổn định và chuyên biệt có trình tự đơn giản gồm khoảng 2 – 6 nucleotides
đƣợc lặp lại nhiều lần (simple sequence repeat), tiến hành phản ứng PCR sử dụng
các primer chuyên biệt nhân bản đoạn DNA chuyên biệt này lên. Điều quan trọng là
phải biết đƣợc những trình tự lặp lại chuyên biệt này để thiết kế primer cho từng
giống. Kỹ thuật SSR có độ tin cậy cao, chủ yếu đƣợc dùng để định danh những
giống hay những loài rất gần nhau về mặt di truyền (Nguyễn Thị Lang, 2002).
2.2.3.5 Kỹ thuật AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism)
Kỹ thuật AFLP là kỹ thuật sinh học phân tử hiện đại do Zebeau và Vos phát
minh năm 1993, sau đó đƣợc Vos và ctv (1995), Vos và Kuiper (1997) tiếp tục phát
triển. Kỹ thuật này dựa trên nền tảng kỹ thuật PCR, bằng cách sử dụng những cặp
primer đặc biệt đƣợc thiết kế sẵn, điều kiện phản ứng PCR đƣợc thiết lập nghiêm
ngặt giúp nhân bản một cách có chọn lọc những đoạn DNA đƣợc cắt giới hạn từ bộ
gen của đối tƣợng nghiên cứu. Những đoạn DNA đƣợc nhân bản có độ dài khoảng
từ 60 – 500 basepairs. Kỹ thuật AFLP giúp đánh giá mức độ đa dạng di truyền của
quần thể và phát hiện chỉ thị phân tử với độ tin cậy cao (Bùi Chí Bửu và Nguyễn
Thị Lang, 1999; Nguyễn Thị Lang, 2002).

14

2.2.3.6 Kỹ thuật RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA)
RAPD là đoạn trình tự DNA ngắn, do sự tổng hợp một cách ngẫu nhiên, giúp
phân tích bộ gen thông qua kỹ thuật phân tích di truyền phân tử là PCR. Kỹ thuật
RAPD sử dụng những primer ngắn (khoảng 10 nucleotide) có trình tự biết trƣớc, bắt
cặp và nhân bản ngẫu nhiên những đoạn DNA có trình tự bổ sung với trình tự của
các primer. Theo nguyên tắc, khi 2 cá thể hoàn toàn giống nhau, sau khi thực hiện
phản ứng RAPD ở điều kiện nhƣ nhau sẽ tạo ra số lƣợng các đoạn bằng nhau và
chiều dài các đoạn tƣơng ứng bằng nhau. Khi có đột biến làm xuất hiện hay mất đi
một vị trí bắt cặp ngẫu nhiên sẽ tạo ra số lƣợng và chiếu dài các đoạn DNA khác
nhau giữa các cá thể, vì vậy kỹ thuật RAPD có thể phát hiện đột biến. Kỹ thuật
RAPD giúp nhận diện những chỉ thị phân tử trội (Bùi Chí Bửu và Nguyễn Thị
Lang, 1999; Nguyễn Thị Lang, 2002). Kỹ thuật RAPD cho phép tiến hành nghiên
cứu di truyền phân tử mà không cần biết trƣớc về trình tự của chuỗi mã di truyền
cần nghiên cứu. Một số ƣu điểm khác của kỹ thuật RAPD là: cho kết qua nhanh,thời
gian để thực hiện phản ứng RAPD chỉ khoảng 14 giờ, cần một số lƣợng DNA mẫu
rất nhỏ (25 ng), Kỹ thuật RAPD có thể dùng để nghiên cứu những trình tự có kích
thƣớc nhỏ (10 kb). Tuy nhiên kỹ thuật RAPD lại có nhƣợc điểm là độ chính xác
không cao.
2.2.4 Kỹ thuật PCR (Polymerase Chain Reaction)
Kỹ thuật PCR do Kary Mullis và ctv phát minh năm 1990 đƣợc sử dụng rộng
rãi nhất trong số các ứng dụng của sinh học phân tử. Về thực chất đây là phƣơng
pháp tạo dòng in vitro không cần sự hiện diện của các tế bào (Hồ Huỳnh Thuỳ
Dƣơng, 2000)
Kỹ thuật PCR là một phƣơng pháp tổng hợp DNA dựa trên mạch khuôn là
một trình tự đích DNA ban đầu, khuếch đại, nhân số lƣợng bản sao của khuôn này
thành hàng triệu bản sao nhờ hoạt động của enzyme polymerase và một cặp mồi đặc
hiệu cho đoạn DNA này. Hiện nay, kỹ thuật này đƣợc sử dụng rộng rãi để phát hiện,