Nghiên cứu nhân giống cây dâu tây bằng phương pháp nuôi cấy mô

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM
-------------------------

NGUYỄN DUY GIANG

Tên đề tài:

NGHIÊN CỨU NHÂN GIỐNG CÂY DÂU TÂY (Fragaria vesca L.)
BẰNG PHƯƠNG PHÁP NUÔI CẤY MÔ

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

Hệ đào tạo

: Chính quy

Chuyên ngành: Công nghệ Sinh học
Khoa

: CNSH & CNTP

Khóa học

: 2010 - 2014

Thái Nguyên, 2014


ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM

-------------------------

NGUYỄN DUY GIANG

Tên đề tài:

NGHIÊN CỨU NHÂN GIỐNG CÂY DÂU TÂY (Fragaria vesca L.)
BẰNG PHƯƠNG PHÁP NUÔI CẤY MÔ

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
Hệ đào tạo

: Chính quy

Chuyên ngành

: Công nghệ Thực phẩm

Khoa

: CNSH & CNTP

Lớp

: 42 - CNSH

Khóa học

: 2010 - 2014

Giảng viên hướng dẫn: 1. ThS. Nguyễn Thị Tình
Khoa CNSH & CNTP - Trường Đại học Nông lâm Thái Nguyên
2. ThS. Đào Duy Hưng
Viện Khoa học Sự sống - Trường Đại học Nông lâm Thái Nguyên

Thái Nguyên, 2014


LỜI CẢM ƠN
Được sự nhất trí của Ban giám hiệu nhà trường, Ban chủ nhịêm khoa Công nghệ
Sinh học và Công nghệ Thực phẩm em đã tiến hành thực hiện đề tài: “Nghiên cứu nhân
giống cây Dâu Tây (Fragaria vesca L.) bằng phương pháp nuôi cấy mô”.
Qua thời gian làm việc tại Phòng thí nghiệm Khu Công nghệ Tế bào, Viện
Khoa học Sự sống, Đại học Nông Lâm Thái Nguyên đến nay em đã hoàn thành đề tài.
Để đạt được kết quả như ngày hôm nay em xin chân thành cảm ơn Ban Giám hiệu nhà
trường, Ban chủ nhiệm Khoa cùng các thầy cô giáo và các anh chị trong Bộ môn đã
tạo điều kiện giúp đỡ em trong suốt thời gian qua.
Em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới: ThS. Nguyễn Thị Tình, ThS. Đào Duy
Hưng đã tận tình chỉ bảo, hướng dẫn em trong thời gian thực hiện đề tài.
Cuối cùng, em xin chân thành cảm ơn gia đình, bạn bè đã hết lòng động viên,
giúp đỡ tạo điều kiện về vật chất và tinh thần cho em trong quá trình học tập và nghiên
cứu.
Em rất mong nhận được sự đóng góp ý kiến của thầy cô và các bạn để đề tài
của em được hoàn thiện hơn.
Em xin chân thành cảm ơn !
Thái Nguyên, ngày tháng năm 2014
Sinh viên thực hiện

Nguyễn Duy Giang

DANH MỤC CÁC BẢNG
Trang
Bảng 4.1. Ảnh hưởng của nồng độ Kinetin đến khả năng nhân nhanh chồi cây Dâu Tây
(theo dõi sau 45 ngày) .............................................................................................. 21
Bảng 4.2. Ảnh hưởng của nồng độ BAP đến khả năng nhân nhanh chồi cây Dâu Tây (
theo dõi sau 45 ngày) ................................................................................................ 23
Bảng 4.3. Ảnh hưởng kết hợp của nồng độ BAP và IBA đến khả năng nhân nhanh chồi
cây Dâu Tây ( theo dõi sau 45 ngày) ........................................................................ 25
Bảng 4.4. Ảnh hưởng của sự kết hợp nồng độ BAP và IAA đến khả năng nhân nhanh
chồi cây Dâu Tây ( theo dõi sau 45 ngày) ................................................................ 27
Bảng 4.5. Ảnh hưởng của nồng độ IBA đến khả năng ra rễ của chồi cây Dâu Tây

(

theo dõi sau 30 ngày) ................................................................................................ 29
Bảng 4.6. Ảnh hưởng của nồng độ NAA đến khả năng ra rễ của cây Dâu Tây ...... 31
(theo dõi sau 30 ngày) .............................................................................................. 31
Bảng 4.7. Ảnh hưởng của một số loại giá thể đến tỷ lệ sống của cây Dâu Tây ngoài
vườn ươm (theo dõi sau 30 ngày) ............................................................................. 32


DANH MỤC CÁC HÌNH
Trang
Hình 2.1. Sơ đồ quá trình phân hoá và phản phân hoá của tế bào thực vật ............... 6
Biểu đồ 4.1: Ảnh hưởng của nồng độ Kinetin đến khả năng nhân nhanh chồi cây Dâu
Tây ............................................................................................................................ 21
Hình 4.1.1. Chồi cấy trong công thức 1 (ĐC) ......................................................... 22
Hình 4.1.2. Chồi cấy trong công thức 4 .................................................................. 22
Biểu đồ 4.2. Ảnh hưởng của nồng độ BAP đến khả năng nhân nhanh chồi cây Dâu

Tây ............................................................................................................................ 23
Hình 4.2.1. Chồi cấy trong công thức 1 (ĐC) ......................................................... 24
Hình 4.2.2. Chồi cấy trong công thức 2 .................................................................. 24
Biểu đồ 4.3. Ảnh hưởng củasự kết hợp nồng độ BAP và IBA đến khả năng nhân nhanh
chồi cây Dâu Tây ...................................................................................................... 25
Hình 4.3.1. Chồi cấy trong công thức 1 (ĐC) ......................................................... 26
Hình 4.3.2. Chồi cấy trong công thức 3 .................................................................. 26
Biểu đồ 4.4. Ảnh hưởng của sự kết hợp nồng độ BAP và IAA đến khả năng nhân
nhanh chồi cây Dâu Tây ........................................................................................... 27
Hình 4.4.1. Chồi cấy trong công thức 1 (ĐC) ......................................................... 28
Hình 4.4.2. Chồi cấy trong công thức 5 .................................................................. 28
Biểu đồ 4.5. Ảnh hưởng của nồng độ IBA đến khả năng ra rễ của chồi cây Dâu Tây29
Hình 4.5.1. Chồi cấy trong công thức 1 (ĐC) ......................................................... 30
Hình 4.5.2. Chồi cấy trong công thức 2 .................................................................. 30
Biểu đồ 4.6. Ảnh hưởng của nồng độ NAA đến khả năng ra rễ của cây Dâu Tây .. 31
Hình 4.6.1. Chồi cấy trong CT 1 (ĐC) .................................................................... 31
Hình 4.6.2. Chồi cấy trong CT 2 ............................................................................. 31
Biểu đồ 4.7. Ảnh hưởng của một số loại giá thể đến tỷ lệ sống của cây Dâu Tây ngoài
vườn ươm.................................................................................................................. 33
Hình 4.7.1. Cây trồng trên giá thể đất màu .............................................................. 33
Hình 4.7.2. Cây trồng trên giá thể 1 Đất màu +1 Trấu hun ...................................... 33
DANH MỤC TỪ, CỤM TỪ VIẾT TẮT


ADN

: Acid deoxyribonucleic

B1

: Thiamin

B3

: Nicotinic acid

B5

: Gamborg’s

B6

: Pyridoxine

BA

: 6-Benzylaminopurine

CV

: Coefficient of Variation

ĐC

: Đối chứng

IAA

: Indol axetic acid

Kinetin
LSD

: 6-Furfurylaminopurine
: Least Significant Difference Test

MS

: Murashige and Skoog’s

NAA

: α - Naphlene axetic acid

TN

: Thí nghiệm

WPM

: Woody Plant Medium

(A/C)

: Auxin/Cytokinin

MS

: (Murashinge &Skoog , 1962)

IBA

: Indole - 3 - butiric acid

BAP

: 6 - benzylaminopurine

ETDA

: Ethylen Diamin Tetraacetic Acid


MỤC LỤC
Trang

PHẦN 1. MỞ ĐẦU .......................................................................................... 1
1.1. Đặt vấn đề................................................................................................... 1
1.2. Mục đích nghiên cứu .................................................................................. 1
1.3. Yêu cầu của đề tài ...................................................................................... 2
1.4. Ý nghĩa của đề tài ....................................................................................... 2
PHẦN 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ............................................................... 3
2.1. Giới thiệu và phân loại ............................................................................... 3
2.1.1 . Nguồn gốc .............................................................................................. 3
2.1.2. Phân loại .................................................................................................. 3
2.1.3. Đặc điểm thực vật học của cây ............................................................... 3
2.1.4. Tác dụng của cây ..................................................................................... 4
2.2. Cơ sở khoa học của phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật ................ 5
2.2.1. Tính toàn năng của tế bào ....................................................................... 5
2.2.2. Sự phân hoá và phản phân hoá của tế bào .............................................. 5

2.3. Các yếu tố ảnh hưởng đến nuôi cấy mô tế bào .......................................... 6
2.3.1. Môi trường nuôi cấy mô tế bào thực vật ................................................. 6
2.3.2. Yếu tố vô trùng ..................................................................................... 10
2.4. Các công đoạn của nuôi cấy mô tế bào .................................................... 12
2.5. Tình hình nghiên cứu cây Dâu Tây trên Thế Giới và ở Việt Nam .......... 14
2.5.1. Tình hình nghiên cứu trên Thế Giới...................................................... 14
2.5.2. Tình hình nghiên cứu trong nước .......................................................... 14
PHẦN 3. VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU15
3.1. Vật liệu và phạm vi nghiên cứu ............................................................... 15
3.1.1. Vật liệu nghiên cứu ............................................................................... 15
3.1.2. Phạm vi nghiên cứu ............................................................................... 15
3.2. Địa điểm và thời gian nghiên cứu ............................................................ 15


3.3. Nội dung nghiên cứu ................................................................................ 15
3.4. Phương pháp nghiên cứu .......................................................................... 15
3.4.1. Phương pháp nghiên cứu nội dung 1 ................................................... 15
3.4.2. Phương pháp nghiên cứu nội dung 2 ................................................... 17
3.4.3. Phương pháp nghiên cứu nội dung 3 ................................................... 18
3.5. Xử lý số liệu ............................................................................................. 19
PHẦN 4. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN ........................... 21
4.1. Nghiên cứu ảnh hưởng đơn lẻ hoặc kết hợp của một số chất kích thích sinh
trưởng (BAP, Kinetin, IAA, IBA) đến khả năng nhân nhanh chồi cây Dâu Tây21
4.1.1. Ảnh hưởng của nồng độ Kinetin đến khả năng nhân nhanh chồi ......... 21
4.1.2. Ảnh hưởng của nồng độ BAP đến khả năng nhân nhanh chồi cây Dâu Tây
......................................................................................................................... 23
4.1.3. Ảnh hưởng kết hợp của nồng độ BAP và IBA đến khả năng nhân nhanh
chồi cây Dâu Tây............................................................................................. 25
4.1.4. Ảnh hưởng của sự kết hợp nồng độ BAP và IAA đến khả năng nhân
nhanh chồi cây Dâu Tây .................................................................................. 27

4.2. Ảnh hưởng của nồng độ IBA và NAA đến khả năng ra rễ của chồi cây Dâu
Tây ................................................................................................................... 29
4.2.1. Ảnh hưởng của nồng độ IBA đến khả năng ra rễ của chồi cây Dâu Tây29
4.2.2. Ảnh hưởng của nồng độ NAA đến khả năng ra rễ của chồi cây Dâu Tây31
4.3. Ảnh hưởng của một số loại giá thể đến tỷ lệ sống của cây Dâu Tây ngoài
vườn ươm ........................................................................................................ 32
PHẦN 5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ........................................................... 35
5.1. Kết luận .................................................................................................... 35
5.2. Đề nghị ..................................................................................................... 35
TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................ 36


1

PHẦN 1
MỞ ĐẦU
1.1. Đặt vấn đề
Cây Dâu tây (Fragaria vesca L.) thuộc họ hoa hồng (Rosaceae) [4], được
trồng đầu tiên ở châu Âu cuối thế kỷ XV, là kết quả của sự lai ghép giống F.
chiloensis duch và F. virgiana duch [17].
Là loài cây thân thảo, quả giả do nhiều quả đóng tập hợp trên đế hoa lồi nạc,
mọng nước [9]. Quả có vị ngọt, chua se, tính mát, cung cấp nhiều loại vitamin cần
thiết cho cơ thể con người như vitamin A, B1, B2 và đặc biệt là lượng vitamin C
khá cao, hơn cả cam, dưa hấu. Ngoài ra còn có tác dụng lợi tiểu, chữa sỏi tiết niệu,
dùng làm rượu bổ [6].
Cây Dâu tây được trồng trên đất ở nhiều nước trên khắp thế giới, đồng thời
cây Dâu tây cũng được sản xuất trong nhà kính bằng công nghệ nhân giống vô tính
bằng kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào là một trong những phương pháp nhân giống
vô tính với những ưu điểm nổi trội là: Cho hệ số nhân giống rất cao, sản xuất
quanh năm không phụ thuộc vào mùa vụ, cần ít diện tích sản xuất và vật liệu

nhân giống ban đầu, cây giống sản xuất hoàn toàn sạch bệnh, đồng nhất về mặt
di truyền, việc vận chuyển cây giống đi xa thuận tiện, tổn thất ít, chất lượng cây
được đảm bảo do đó đáp ứng được các yêu cầu về sản xuất cây giống với số
lượng mang tính công nghiệp. Ở nước ta, Dâu tây còn mới mẻ so với những cây
trồng khác và là một loại cây trồng có giá trị kinh tế đang được chú ý phát triển hiện
nay. Đây cũng là một loại cây trồng tiềm năng và được trồng chủ yếu ở Đà Lạt
(Lâm Đồng) và một số tỉnh phía Bắc. Cây có thể nhân giống bằng nhiều cách như
gieo hạt, tách chồi, tách thân bò, giâm hom. Các phương pháp này cho hệ số nhân
giống thấp, cây không đồng đều và hiệu quả thấp. Trong những năm gần đây, nhằm
tạo ra các giống cây trồng chất lượng tốt, không phụ thuộc vào mùa vụ, nhiều địa
phương trong cả nước đã ứng dụng phương pháp giâm hom vào công tác nhân giống.
Tuy nhiên phương pháp này cho kết quả không cao ở nhiều đối tuợng cây trồng và
không đáp ứng số lượng lớn cây giống [11].
Trên cơ sở đó, chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài: “Nghiên cứu nhân
giống cây Dâu tây (Fragaria vesca L.) bằng phương pháp nuôi cấy mô ”.
1.2. Mục đích nghiên cứu
- Nghiên cứu khả năng nhân giống cây Dâu tây (Fragaria vesca L.) bằng
phương pháp nuôi cấy mô tế bào.


2

1.3. Yêu cầu của đề tài
- Nghiên cứu được ảnh hưởng riêng rẽ và kết hợp của một số chất điều tiết
sinh trưởng (Kinetin, BAP, IAA, IBA) đến khả năng nhân nhanh chồi .
- Nghiên cứu được ảnh hưởng của nồng độ IBA và NAA đến khả năng ra rễ
của cây .
- Nghiên cứu ảnh hưởng một số loại giá thể đến sinh trưởng phát triển của
cây ngoài vườn ươm.
1.4. Ý nghĩa của đề tài

- Ý nghĩa trong học tập và nghiên cứu
+ Giúp sinh viên củng cố lại kiến thức đã học và nghiên cứu khoa học
+ Thông qua đề tài, tìm hiểu được vai trò của một số chất điều tiết sinh trưởng
đối với quá trình tái sinh, nhân nhanh và tạo rễ cho chồi của cây .
+ Biết được phương pháp nghiên cứu một vấn đề khoa học, xử lí và phân
tích số liệu, biết cách trình bày một báo cáo khoa học.
- Ý nghĩa thực tiễn
+ Cung cấp cho công tác nuôi cấy mô các môi trường nuôi cấy tối ưu cho
quá trình nhân chồi, tạo cây hoàn chỉnh trong phòng thí nghiệm và phát triển của
cây ngoài vườn ươm.
+ Tạo tiền đề cho việc sản xuất số lượng lớn cây giống có chất lượng cao,
đồng đều cho sản xuất.


3

PHẦN 2
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1. Giới thiệu và phân loại
2.1.1 . Nguồn gốc
Cây Dâu Tây có tên khoa học là Fragaria vesca L., là kết quả của sự lai ghép
giống F. chiloensis duch và F. virgiana duch. Xuất sứ từ châu Mỹ và được các nhà
làm vườn châu Âu lai tạo thế kỷ 18 và tạo ra giống dâu ngày nay. Cuối thế kỷ XVI,
ba loài của Châu Âu được ghi nhận là Fragaria vesca, Fragaria moschata và
Fragaria viridis [17]. Người Anh gọi là "Strawberry", người Pháp gọi là "Fraisier",
khi du nhập qua Việt Nam vì có nguồn gốc từ Pháp nên được gọi là Dâu Tây.
2.1.2. Phân loại
Theo hệ thống thực vật học mới nhất, cây được phân loại như sau:
Giới: Plantea (thực vật)
Ngành: Angiospermae (hạt kín)

Lớp: Rosids (hoa hồng)
Bộ: Rosales (hoa hồng)
Họ: Rosaceae (hoa hồng)

Chi: Fragaria
Loài: Fragaria L. (có hơn 20 loài trên thế giới)
2.1.3. Đặc điểm thực vật học của cây
2.1.3.1. Rễ
Rễ cây thuộc loại rễ chùm, chỉ khi cây thực sinh còn nhỏ mới có rễ chính rõ
ràng. Đầu chóp rễ có sức phân nhánh mạnh. Rễ cây phát triển tốt nhất trong điều
kiện khi nhiệt độ đất là 25oC. Rễ có vai trò cố định cây và giúp cây hấp thu nước và
dinh dưỡng. Rễ có chu kỳ sống từ vài ngày đến vài tuần [3].
2.1.3.2. Thân
Cây thuộc loài cây thân thảo, có 2 kiểu thân là thân chính và thân bò [9].
Thân bò bắt đầu từ cổ rễ vươn dài trên mặt đất và tận cùng là một chồi. Chồi này
phát triển thành một vòng lá mới, mọc rễ mới, từ đó sinh ra một thân bò lan khác và
cứ tiếp tục như thế. Gióng của thân bò đó có thể chết đi hoặc bị cắt đứt nhưng chồi
mới được hình thành vẫn sống độc lập.
Thường thì từ thân chính sẽ phát sinh thêm 1 đến 2 thân con nữa và các
nhánh này góp phần vào năng suất của cây sau này.


4

2.1.3.3. Lá
Lá phát sinh xung quanh thân, cây có nhiều lá bao quanh thân, lá có cuống
dài, lá kép lông chim có 3 lá chét. Lá có dạng ô van. Số lá cũng như diện tích lá
giảm xuống vào đầu đông, có lẽ điều này có mối quan hệ với việc ra hoa vào mùa
xuân. Mỗi lá tồn tại 1 đến 3 tháng tùy vào thời tiết.
2.1.3.4. Hoa

Lá đài của hoa nhỏ và có mùa xanh, lá được bố trí bên dưới những cánh hoa
màu trắng, những cánh hoa xếp khít với nhau khi hoa ở trạng thái nụ. Hoa có 5
cánh, có 25 đến 30 nhị màu vàng, 50 đến 500 nhụy, đế hoa hình nón. Hoa là hoa
lưỡng tính vì vậy là cây tự thụ.
2.1.3.5. Quả
Thực chất quả vẫn thường gọi là quả giả, chứa các mô ngoài noãn, nó được
phình ra từ đế hoa. Quả thật là những quả bế gọi là hạt. Số lượng quả bế nhiều, nhỏ,
hình elip bao phủ bề mặt quả [9].
Quả thường phát triển sau khi hoa nở và chín sau đó khoảng 20 đến 30 ngày,
số lượng quả bé cũng ít hơn. Thường thì ra quả theo chùm, xếp hình xim gồm quả
đầu tiên, thứ cấp và sau thứ cấp vì vậy kích thước cũng như thời gian chín cũng
khác nhau. Quả đầu có kích thước lớn nhất, quả thứ cấp có kích thước nhỏ hơn, số
lượng quả bế cũng ít hơn, nhưng là quả thu hoạch chính làm nên năng suất. Mùa vụ
thu hoạch quả bắt đầu từ tháng 11, 12 đến tháng 3, 4 năm sau.
2.1.4. Tác dụng của cây
Quả có vị ngọt, chua se, tính mát, cung cấp nhiều loại vitamin cần thiết cho
cơ thể con người như vitamin A, B1, B2, đặc biệt lượng vitamin C khá cao, hơn cả
cam, dưa hấu. Quả có tác dụng lợi tiểu, chữa sỏi tiết niệu, dùng làm rươu bổ [6].
dùng chữa các chứng như ho do phổi nóng, cổ họng sưng đau, chán ăn, tiểu ngắn,
tiểu gắt, thiếu máu suy nhược, ung nhọt, say rượu [4].
Dâu tươi mới hái hàm lượng vitamin C và đường fructose đều rất cao, trong
đó hàm lượng chất khoáng như K, Na, Fe... cũng rất phong phú, cho nên ăn nhiều
giúp thúc đẩy chuyển hóa các chất trong cơ thể, làm máu huyết lưu thông, đồng thời
có tác dụng trấn tĩnh an thần và phòng chống lão hóa [18]. Ngoài ra còn có tác dụng
với tim mạch [16].


5

2.2. Cơ sở khoa học của phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật

2.2.1. Tính toàn năng của tế bào
Cuối thế kỷ 19 đầu thế kỷ 20 nhà sinh lý thực vật người Đức Haberlandt
(1902) đã phát biểu tính toàn năng của tế bào như sau: Mỗi tế bào bất kỳ của một cơ
thể sinh vật đa bào đều có khả năng tiềm tàng để phát triển thành một cá thể hoàn
chỉnh [1], [14], [19], [20].
Theo quan niệm của sinh học hiện đại thì mỗi tế bào riêng rẽ đã phân hoá
đều mang toàn bộ lượng thông tin di truyền cần thiết và đủ của cả cơ thể sinh vật
đó. Khi gặp điều kiện thích hợp, mỗi tế bào đều có thể phát triển thành một cá thể
hoàn chỉnh. Cho đến nay con người đã hoàn toàn chứng minh được khả năng tái
sinh một cơ thể thực vật hoàn chỉnh từ một tế bào riêng rẽ [5].
Trong nuôi cấy in vitro, tế bào thực vật thể hiện tính toàn năng thông qua sự
phản phân hoá và phân hoá của tế bào.
2.2.2. Sự phân hoá và phản phân hoá của tế bào
Cơ thể thực vật trưởng thành là một chính thể thống nhất bao gồm nhiều cơ
quan chức năng khác nhau. Tuy nhiên tất cả các loại tế bào đó đều bắt nguồn từ một
tế bào đầu tiên (tế bào hợp tử). Ở giai đoạn đầu, tế bào hợp tử tiếp tục phân chia
hình thành nhiều tế bào phôi sinh chưa mang chức năng riêng biệt (chuyên hoá).
Sau đó từ các tế bào phôi sinh này chúng tiếp tục được biến đổi thành các tế bào
chuyên hoá đặc hiệu cho các mô, cơ quan có chức năng khác nhau [7].
Sự phân hoá tế bào là sự chuyển các tế bào phôi sinh thành các tế bào mô
chuyên hoá, đảm nhận các chức năng khác nhau của cơ thể.
TB phôi sinh

Tế bào dãn

TB phân hoá có chức năng riêng biệt

Tuy nhiên, khi tế bào đã phân hoá thành các tế bào có chức năng chuyên,
chúng không hoàn toàn mất khả năng biến đổi của mình.Trong trường hợp cần thiết,
ở điều kiện thích hợp, chúng lại có thể trở về dạng tế bào phôi sinh và phân chia

mạnh mẽ cho ra các tế bào mới có khả năng tái sinh thành cây hoàn chỉnh. Quá
trình đó gọi là phản phân hoá tế bào, ngược lại với sự phân hoá tế bào.
Sự giãn tế bào: Tế bào giãn ra cả về chiều ngang và chiều dọc làm tăng kích
thước của từng cơ quan nói riêng và toàn bộ cơ thể nói chung. Sau hai giai đoạn này
cùng với quá trình biệt hoá tế bào phân hoá thành các mô chức năng chuyên hoá
chuyên biệt, đảm nhận các vai trò khác nhau trong cùng một cơ thể sống.


6

Phân hoá

Tế bào phôi sinh

Tế bào dãn

Tế bào chuyển hoá

Phản phân hoá
Hình 2.1. Sơ đồ quá trình phân hoá và phản phân hoá của tế bào thực vật
Về bản chất thì sự phân hoá và phản phân hoá là một quá trình hoạt hoá, ức
chế các gen. Tại một thời điểm nào đó trong quá trình phát triển cá thể, có một số
gen được hoạt hoá (mà vốn trước nay bị ức chế) để cho ta tính trạng mới, còn một
số gen khác lại bị đình chỉ hoạt động. Điều này xảy ra theo một chương trình đã
được mã hoá trong cấu trúc của phân tử ADN của mỗi tế bào khiến quá trình sinh
trưởng phát triển của cơ thể thực vật luôn được hài hoà. Mặt khác, khi tế bào nằm
trong một khối mô của cơ thể thường bị ức chế bởi các tế bào xung quanh. Khi tách
riêng từng tế bào hoặc giảm kích thước của khối mô sẽ tạo điều kiện thuận lợi cho
sự hoạt hoá các gen của tế bào [5], [14].
Quá trình phát sinh hình thái trong nuôi cấy mô, tế bào thực vật thực chất là

kết quả của quá trình phân hoá và phản phân hoá tế bào .
2.3. Các yếu tố ảnh hưởng đến nuôi cấy mô tế bào
2.3.1. Môi trường nuôi cấy mô tế bào thực vật
Một trong nghững yếu tố quan trọng nhất đối với sự tăng trưởng và phát sinh
hình thái của tế bào và mô thực vật trong nuôi cấy là thành phần môi trường. Thành
phần này thay đổi tùy theo loài và bộ phận nuôi cấy. Đối với cùng một mẫu cấy
nhưng tùy theo mục đích thí nghiệm mà thành phần môi trường cũng thay đổi.
Thành phần các môi trường nuôi cấy bao gồm 5 phần chính: khoáng đa lượng,
khoáng vi lượng, vitamin, đường (nguồn carbon) và các chất điều hòa sinh trưởng
thực vật.
2.3.1.1. Khoáng đa lượng
Bao gồm các nguyên tố khoáng được sử dụng ở nồng độ trên 30mg/l. Những
nguyên tố đó là: N, S, P, K, Mg và Ca. Riêng Na và Cl cũng được sử dụng trong
một vài môi trường, nhưng chưa rõ vai trò của chúng.


7

+ Nitơ (N): Được sử dụng ở hai dạng NO3- và NH4+ riêng rẽ hoặc phối hợp
với nhau. Tùy thuộc vào từng loại cây, từng bộ phận nuôi cấy, mục đích nuôi cấy
mà ta sử dụng dạng nào cho phù hợp với sự phát triển của cây. Các dạng muối cung
cấp nitơ là: Ca(NO3)2, KNO3, NaNO3, NH4NO3 [26].
+ Lưu huỳnh (S): Chủ yếu và tốt nhất là muối SO4-2. Các dạng ion khác như
SO32- hoặc SO22- thường kém tác dụng, thậm chí còn độc.
+ Phospho (P): Mô và tế bào thực vật nuôi cấy có nhu cầu về phospho rất
cao. Phospho là một trong những thành phần cấu trúc của phân tử acid nucleic,
photpholipit và các co-enzyme. Phospho được hấp thụ ở 2 dạng: H2PO4- và HPO4-2
quá trình hấp thụ mất năng lượng, trong môi trường nuôi cấy photpho được cung
cấp dưới dạng KHPO4 hoặc KH2PO4 [26].
2.3.1.2. Khoáng vi lượng

Là những nguyên tố được sử dụng ở nồng độ thấp hơn 30 ppm. Đó là Fe, B,
Mn, I, Mo, Cu, Zn, Ni, Co.
+ Sắt (Fe): Thiếu sắt, tế bào mất khả năng phân chia. Fe thường tạo phức hợp
với các thành phần khác và khi pH môi trường thay đổi, phức hợp này thường mất
khả năng giải phóng Fe cho các nhu cầu trao đổi chất trong tế bào. Từ các phức chất
này Fe được giải phóng ra trong một phạm vi pH khá rộng. Cung cấp Fe ở các dạng:
FeSO4.7H2O, Fe(SO4)3, FeCL2...Nên sử dụng Fe ở dạng phức chelat với citrat hoặc
với ETDA cây hấp thụ dễ dàng nhất [26].
+ Mangan (Mn): Thiếu Mn cũng làm cho hàm lượng các amino acid tự do và
ADN tăng lên, nhưng lượng ARN và sinh tổng hợp protein giảm dẫn đến kém phân
bào. Mn được cung cấp cho môi trường ở dạng: MnSO4.4H2O [26].
+ Bo (B): Thiếu B trong môi trường gây lên biểu hiện như thừa auxin vì thực
chất B làm cho các chất ức chế auxin oxydase trong tế bào giảm. Mô nuôi cấy có biểu
hiện mô sẹo hóa mạnh, nhưng thường là mô sẹo xốp, mọng nước, kém tái sinh [1].
2.3.1.3. Carbon và nguồn năng lượng
Đường là thành phần dinh dưỡng quan trọng không thể thiếu trong bất kỳ
môi trường dinh dưỡng nào. Nó được sử dụng làm nguồn cacbon cung cấp năng
lượng trong nuôi cấy, đồng thời đóng vai trò duy trì áp suất thẩm thấu của môi
trường [13].
Loại đường được sử dụng phổ biến là saccarose với hàm lượng từ 2-6%.
Những loại đường khác như: fructose, glucose, maltose, . . . chỉ dùng trong những


8

trường hợp cá biệt. Trong nuôi cấy chồi cây Dâu tằm, môi trường có fructose cho
kết quả tốt hơn những loại đường khác [14].
2.3.1.4. Vitamin
Thông thường thực vật tổng hợp các vitamin cần thiết cho sự tăng trưởng và
phát triển của chúng. Chúng cần vitamin để xúc tác nhiều quá trình biến dưỡng khác

nhau. Khi tế bào và mô được nuôi cấy in vitro thì một vài vitamin trở thành yếu tố
giới hạn cho sự phát triển của chúng. Trong các loại vitamin, B1 được xem là
vitamin quan trọng nhất cho sự phát triển của thực vật. Axit nicotinic (B3) và
pyridoxin (B6) cũng có thể được bổ sung vào môi trường nuôi cấy nhằm tăng
cường sức sống cho mô [2].
2.3.1.5. Các chất điều hòa sinh trưởng thực vật
Trong nuôi cấy mô thực vật có 5 nhóm chất điều hòa quan trọng trong nuôi
cấy mô thực vật: auxin, gibberellin, cytokinin, abscisic acid và ethylen. Miller là
người đầu tiên nhận thấy tỉ lệ auxin và cytokinin bổ sung vào môi trường để kích
thích sự phát sinh hình thái và tỷ lệ phytohormone sử dụng để kích thích sự tạo chồi
hay sự tạo rễ không giống nhau.
Auxin: Chất auxin tự nhiên được tìm thấy nhiều ở thực vật là indol axetic
axit (IAA). IAA có tác dụng kích thích sinh trưởng kéo dài tế bào, điều khiển sự
hình thành rễ. Ngoài IAA, còn có những dẫn xuất khác là naphtyl axetic axit (NAA)
và 2,4 – diclophenoxyl axetic axit (2,4-D). Các chất này cũng đóng vai trò quan
trọng trong sự phân chia mô và trong quá trình tạo rễ [10], [13], [21], [22].
NAA, IBA, 2,4-D là những auxin tổng hợp, có hoạt tính mạnh hơn auxin tự
nhiên IAA. Chúng có vai trò quan trọng đối với phân chia tế bào và tạo rễ. Tuy
nhiên, ở nồng độ cao auxin cản trở sự phát triển của các phát thể chồi vừa được
thành lập hay các chồi nách (các chồi ở trạng thái tiềm sinh), auxin ở nồng độ cao
kích thích sự tạo sơ khỏi rễ (phát thể non của rễ) nhưng cũng cản trở sự tăng trưởng
của các sơ khởi này. Trong sự tạo rễ auxin cần phối hợp với các vitamin (như
thiamine mà rễ không tạo được), amino acid (như arginin), và nhất là các hợp chất
othordiphenollic (như cafeic acid, chlorogenic acid). IAA kích thích sự ra rễ và kìm
hãm sự phát triển callus. Ngược lại, 2,4-D kích thích sự hình thành callus và kìm
hãm sự hình thành rễ trong môi trường nuôi cấy. Mặc dù cùng nhóm chất auxin
nhưng hai chất IAA và 2,4-D lại có tính chất đối kháng.
NAA được Went và Thimann tìm ra 1937. Chất này có tác dụng làm tăng hô
hấp của tế bào và mô nuôi cấy, tăng hoạt tính enzyme và ảnh hưởng mạnh đến trao
đổi chất của nitơ, tăng khả năng tiếp nhận và sử dụng đường trong môi trường nuôi

cấy [10], [13], [21], [22].


9

Cytokinin: là chất điều tiết sinh trưởng có tác dụng làm tăng sự phân chia tế
bào. Các cytokinin thường gặp là BAP, Kinetin, BA, Zeotine, TDZ. Kinetin được
Shoog phát hiện ngẫu nhiên trong khi chiết xuất axit nucleic. Kinetin là dẫn xuất
của base nitơ adenin. BAP là cytokinin tổng hợp nhân tạo nhưng có hoạt tính mạnh
hơn kinetin.
Kinetin và BAP cùng có tác dụng kích thích phân chia tế bào, kéo dài thời gian
hoạt động của tế bào phân sinh và làm hạn chế sự hóa già của tế bào. Ngoài ra các
chất này có tác dụng lên quá trình trao đổi chất, quá trình tổng hợp ADN, tổng hợp
protein và tăng cường hoạt động của một số enzyme [10], [21], [22].
Benjamin và cs., (1987) đã cho rằng nồng độ BA cao (1-5ppm) kích thích sự
phát triển của chồi đỉnh và đầu rễ của cây Atropa belladona. Lat và cs., (1988) cho
rằng khi sử dụng kinetin để nhân nhanh cây Picrohiza kurroa phải dùng nồng độ từ 15mg/l.
Những nghiên cứu của Miller và Skoog (1963) đã cho thấy không phải các
chất điều tiết sinh trưởng ngoại sinh tác dụng độc lập với các chất điều tiết sinh
trưởng nội sinh. Tác động phối hợp của auxin và cytokinin có tác dụng quyết định
đến sự phát triển và phát sinh hình thái của tế bào và mô. Ngoài ra các chất này có
tác dụng lên quá trình trao đổi chất, quá trình tổng hợp ADN, tổng hợp protein và làm
tăng cường hoạt tính của một số enzyme. Cơ chế tác dụng của auxin ở mức độ phân tử
trong tế bào thể hiện bằng tác dụng tương hỗ của cytokinin với các nucleoprotein làm
yếu mối liên kết của histon với ADN, tạo điều kiện cho sự tổng hợp ADN [14], [15].
Trong các nghiên cứu nuôi cấy mô thực vật, tỷ lệ (A/C) là một yếu tố rất
quan trọng: A/C cao kích thích sự tạo rễ, A/C thấp kích thích sự tạo chồi, vậy
cytokinin hỗ trợ auxin trong tăng trưởng nhưng đồng thời nhưng đồng thời cũng có
sự đối kháng giữa auxin (giúp tạo rễ) và cytokinin giúp tạo chồi. Sự cân bằng giữa 2
phytohormone này là một trong những yếu tố kiểm soát phát triển.

Ngoài 5 thành phần cơ bản trên người ta còn bổ sung một số chất hữu cơ có
thành phần xác định (amino acid, ETDA...) và một số chất có thành phần không xác
định như nước dừa, dịch chiết nấm men... vào môi trường nuôi cấy.
2.3.1.6. Các chất bổ sung
Bổ sung nhiều chất hữu cơ khác nhau vào môi trường nuôi cấy mang lại kết
quả thuận lợi cho sự tăng trưởng mô. Chất bổ sung là: protein hydrolysate, nước
dừa, dịch chiết nấm men, dịch chiết lúa mạch, chuối, nước cam, cà chua.
Nước dừa: Nước dừa đã được sử dụng để kích thích phân hoá và nhân nhanh
chồi ở nhiều loại cây. Nước dừa đã được xác định là rất giàu các hợp chất hữu cơ, chất
khoáng và chất kích thích sinh trưởng (George, 1993) [18]. Nước dừa thường sử dụng


10

với nồng độ 5-20% thể tích môi trường, kích thích phân hoá và nhân nhanh chồi
[12].
Dịch chiết nấm men: Có tác dụng kích thích sự sinh trưởng và phát triển của
mô và tế bào. Dịch chiết nấm men là chế phẩm thường dùng trong nuôi cấy vi sinh
vật, mô tế bào động vật với nồng độ thích hợp.
Ngoài ra, có thể sử dụng dịch thủy phân casein hydrolyase (0,1 - 1%) hoặc
bột chuối với hàm lượng 40g nhằm tăng cường sự phát triển của mô sẹo hay cơ
quan nuôi cấy.
Agarose: Trong môi trường nuôi cấy đặc, người ta thường sử dụng agarose
để làm rắn hoá môi trường. Nồng độ agarose sử dụng thường là 0,6-1%, đây là loại
agarose được đặc chế từ rong biển để tránh hiện tượng mô chìm trong môi trường
hoặc bị chết vì thiếu O2 nếu nuôi trong môi trường lỏng và tĩnh [1].
2.3.2. Yếu tố vô trùng
2.3.2.1. Ý nghĩa của việc nuôi cấy vô trùng tế bào nuôi cấy mô tế bào thực vật
- Môi trường nuôi cấy mô tế bào thực vật chứa đường, các chất khoáng,
vitamin… là điều kiện thuận lợi để các vi sinh vật phát triển mạnh mẽ.

- Do tế bào nấm và vi khuẩn nhiều hơn so với tế bào thực vật nên chỉ cần
nhiễm một vài bào tử nấm hoặc vi khuẩn, thì chúng nhanh chóng phủ đầy bề mặt môi
trường, bề mặt mô tế bào thực vật. Các vi sinh vật lấn át tế bào nuôi cấy mô tế bào
thực vật sẽ làm mô tế bào thực vật phát triển chậm lại và chết dần. Nếu không đảm
bảo điều kiện vô trùng mẫu nuôi cấy hoặc môi trường bị nhiễm mẫu sẽ bị chết. Điều
kiện vô trùng có ý nghĩa quyết định đến sự thành bại của nuôi cấy mô in vitro [12].
2.3.2.2. Nguồn tạp nhiễm
- Có 3 nguồn tạp nhiễm chính:
+ Dụng cụ, nút đậy, môi trường nuôi cấy không được vô trùng tuyệt đối.
+ Trên bề mặt mô có chứa các sợi nấm, bào tử nấm và bào tử vi khuẩn.
+ Trong quá trình thao tác làm nhiễm các bào tử nấm hoặc vi khuẩn vào môi
trường nuôi cấy.
2.3.2.3. Kỹ thuật vô trùng
- Vô trùng thuỷ tinh, nút đậy, môi trường
Dụng cụ thuỷ tinh: thông thường dụng cụ thuỷ tinh dùng trong các phòng thí
nghiệm bằng dung dịch sulfocromate một lần trước khi đưa vào sử dụng, về sau chỉ
cần rửa sạch để ráo trước khi sử dụng .


11

Trong trường hợp các dụng cụ thủy tinh dùng trong thí nghiệm nuôi cấy mô
và tế bào thực vật đòi hỏi phải vô trùng, có thể khử trùng bằng cách đưa vào tủ sấy
sấy trong nhiều giờ dụng cụ phải được gói trong giấy nhôm hoặc cất trong hộp kim
loại để tránh bị nhiễm trở lại sau khi khử trùng.
Nút đậy: thường là nút đậy không thấm nước. Nút đậy phải chặt để bụi đi
qua được đồng thời nước ở môi trường cũng không bốc hơi dễ dàng trong quá trình
nuôi cấy. Bông thấm nước là một loại chất đơn giản nhất nhưng có những nhược
điểm sau:
- Nếu khi nút bông bị ướt hoặc dính môi trường thì sẽ bị nấm nhất là đối với

những thí nghiệm lâu dài.
- Thao tác nút bông chậm không thể sản xuất trên quy mô lớn.
- Chỉ dùng vài lần rồi bỏ.
Môi trường: Môi trường nuôi vấy thường được hấp khử trùng, khử trùng
bằng áp suất hơi bão hòa. Thời gian thường 15 -30 phút ở áp suất 1atm nhiệt độ
121oC.
Việc khử trùng này không hợp với các chất nhạy cảm với nhiều như: acid
amin, các vitamin, hormone tăng trưởng, các chất kháng sinh.
Các chất này thường được khử bằng cách lọc qua màng lọc polyethylen hoặc
sợi cellulose, các lỗ màng này có thể giữ lại các vi sinh vật.
- Khử trùng nơi thao tác và dụng cụ cấy
Nguồn nhiễm tạp quan trọng và thường xuyên nhất là bụi rơi vào dụng cụ
thuỷ tinh chứa môi trường trong khi mở nắp hoặc nút bông trong khi thao tác cấy.
Người ta áp dụng nhiều biện pháp khác nhau để chống lại nguồn nhiễm tạp này.
Phòng cấy thường là buồng có diện tích hẹp, rộng từ 10-15m2, có hai lớp cửa để
tránh không khí chuyển động từ bên ngoài trực tiếp đưa bụi vào. Sàn và tường lát
gạch men để có thể lau chùi thường xuyên.
Vô trùng phòng cấy:
Trước khi đưa vào sử dụng hoặc cứ sau 2-3 tháng, phòng cấy phải được xử lý
hơi formol bằng cách rót formol 40% ra một số đĩa petri để rải rác vài nơi trong phòng
cho bốc hơi tự do, đóng kín cửa phòng cấy trong 24h, sau đó bỏ formalin đi và khử hơi
formalin thừa bằng dung dịch amoniac 25% cũng để rải rác trong phòng 24h.
Để đảm bảo mức độ vô trùng cao, trong phòng cấy ngoài đèn tử ngoại trong
box cần có 4 đèn tử ngoại 40W trên trần. Chỉ cho các đèn tử ngoại làm việc khi
không có người làm việc trong box cấy. Nên bật đèn tử ngoại 30 phút và tắt trước
30 phút trước khi làm việc hoặc bật sau khi đã ngưng làm việc. Cần hạn chế chuyển


12

động không khí trong phòng cấy đến mức tối thiểu. Các dụng cụ làm việc phải
chuẩn bị đầy đủ, bố trí hợp lý, thuận tiện để làm việc và hạn chế đi lại khi cấy, ra
vào buồng cấy, đóng cửa cẩn thận.
Phòng nuôi cũng phải được khử trùng trước bằng xà bông bột, sau đó lau
bằng dung dịch calcium hypochlorite loãng hoặc cồn 70%. Trần, sàn đều phải được
lau như vậy mỗi tuần, không được khuấy động những nơi bị nhiễm để tránh phát tán
bào tử.
Khử trùng các dụng cụ kim loại và môi trường khoáng:
Các dụng cụ kim loại được khử trùng bằng không khí nóng (130oC – 170oC).
Các dụng cụ này phải được gói kín trước khi khử trùng, nên gói trong giấy nhôm là
tốt nhất. Không nên hấp khử trùng dụng cụ kim loại vì điều kiện nóng ẩm sẽ làm
kim loại bị rỉ sét và bị ăn mòn.
Autoclave là phương pháp khử trùng bằng hơi nước dưới một áp suất nhất
định nút gòn, khăn vải, các vật dụng phòng thí nghiệm bằng thủy tinh, các bình nuôi
cấy bằng plastic, nút cao su, các bộ lọc, nước, môi trường khoáng đều có thể khử
trùng bằng nồi hấp. Các vi sinh vật đều bị tiêu diệt bởi hơi nước trong nồi hấp thời
gian từ 10 - 30 phút ở nhiệt độ 121oC, 1atm.
Môi trường sau khi pha chế có thể chuyển vào bình cấy với lượng cần thiết
trước khi hấp tiệt trùng, cũng có thể hấp trước với khối lượng lớn và rót chuyển vào
bình cấy trong box cấy. Thời gian hấp tiệt trùng phụ thuộc dung tích môi trường
trong dụng cụ đựng khi hấp ở nhiệt độ 121oC, 1atm.
Thời gian tối thiểu này gồm cả thời gian cần thiết để nhiệt độ nồi hấp đạt đến
o
121 C và 15 phút tiệt trùng.
Đối với môi trường khoáng, áp suất không nên cao quá 1atm vì áp suất cao
sẽ làm phân hủy carbohydrate và các phức hợp nhạy cảm với nhiệt độ.
Sau khi tiệt trùng, môi trường được chuyển ngay sang phòng cấy để làm nguội
và sử dụng theo yêu cầu. Nếu là môi trường thạch hấp với khối lượng lớn trước khi
chia vào bình cấy, thì chuyển ngay vào box cấy đã được vô trùng để tránh nhiễm.
Trên bàn thường xuyên có một đèn cồn để sử dụng khi cấy và cốc đựng cồn

90% để nhúng các dụng cụ làm việc. Các dụng cụ khác để cấy như bình môi trường,
ống nghiệm, bình đựng mẫu cấy chuyền… Đều được xử lý khử trùng bề mặt bằng
cách lau bằng cồn 70% trước khi đưa vào trong box cấy.
2.4. Các công đoạn của nuôi cấy mô tế bào
Trong nuôi cấy mô tế bào thực vật gồm 5 giai đoạn sau:
- Giai đoạn 1: Giai đoạn chuẩn bị


13

Đây là giai đoạn quan trọng quyết định toàn bộ quy trình nhân giống in vitro.
Mục đích của giai đoạn này là phải tạo được nguyên liệu thực vật vô trùng để đưa
vào nuôi cấy.
Mẫu đưa từ bên ngoài vào phải đảm bảo các yêu cầu sau: Tỷ lệ nhiễm thấp,
tỷ lệ sống cao, tốc độ sinh trưởng nhanh.
Kết quả của giai đoạn này phụ thuộc vào cách lấy mẫu, nồng độ và thời gian
xử lý diệt khuẩn. Vật liệu thường được chọn và đưa vào nuôi cấy là: Đỉnh sinh
trưởng, chồi nách, hoa tự, hoa, đoạn thân, mảnh, lá, rễ.
- Giai đoạn 2: Tái sinh mẫu nuôi cấy
Mục đích của giai đoạn này là tái sinh một cách định hướng sự phát triển của
mô nuôi cấy. Quá trình này được điều khiển chủ yếu bằng các chất kích thích sinh
trưởng (A/C) đưa vào môi trường nuôi cấy.
Tuy nhiên bên cạnh đó cũng phải quan tâm đến tuổi của mẫu đem vào nuôi
cấy. Thường các mô non, chưa phân hoá có khả năng tái sinh cao hơn những mô đã
chuyển hoá.
- Giai đoạn 3: Giai đoạn nhân nhanh chồi
Mục đích của giai đoạn này là tạo hệ số cao nhất. Chính vì thế giai đoạn này
được coi là giai đoạn then chốt của quá trình nuôi cấy. Để tăng hệ số người ta
thường đưa vào môi trường nuôi cấy các chất kích thích sinh trưởng (Auxin,
Cytokinin…), các chất bổ sung khác như nước dừa, dịch chiết nấm men… Kết hợp

với các yếu tố ánh sáng, nhiệt độ thích hợp. Tuỳ thuộc vào đối tượng nuôi cấy,
người ta có thể nhân nhanh bằng cách kích thích sự hình thành các cụm chồi (nhân
cụm chồi), hay kích thích sự phát triển của các chồi nách hoặc thông qua việc tạo
thành cây từ phôi vô tính.
- Giai đoạn 4: Tạo cây hoàn chỉnh
Khi đạt được kích thước nhất định các chồi được chuyển sang môi trường ra
rễ. Thường sau 2-3 tuần, các chồi riêng lẻ này sẽ ra rễ và trở thành cây hoàn chỉnh. Ở
giai đoạn này người ta bổ sung vào môi trường nuôi cấy các chất kích thích sinh
trưởng thuộc nhóm Auxin, là nhóm hoocmon thực vật quan trọng có chức năng tạo rễ
phụ từ mô nuôi cấy. Trong nhóm này các chất IAA, IBA, NAA, 2,4-D được nghiên
cứu và sử dụng nhiều nhất để tạo rễ cho chồi.
- Giai đoạn 5: Giai đoạn đưa cây ra đất
Đây là giai đoạn cuối cùng của quá trình và nó quyết định khả năng ứng
dụng của quá trình nhân giống in vitro trong thực tiễn sản xuất. Đây là giai đoạn


14

chuyển cây từ môi trường dị dưỡng sang môi trường tự dưỡng hoàn toàn. Do đó
phải đảm bảo các điều kiện ngoại cảnh thích hợp để cây có thể đạt tỷ lệ sống cao
trong vườn ươm cũng như trong sản xuất [2].
2.5. Tình hình nghiên cứu cây Dâu Tây trên Thế Giới và ở Việt Nam
2.5.1. Tình hình nghiên cứu trên Thế Giới
Do có giá trị kinh tế, giá trị sử dụng cao mà trên thế giới có rất nhiều nước đi
sâu nghiên cứu kỹ thuật nhân giống, cũng như chọn lọc và tạo giống mới.
Một trong những nhân tố tạo nên thành công cho ngành sản xuất dây tây ở
một số nước trên thế giới là đã sử dụng công nghệ nhân giống in vitro để sản xuất
cây giống. Ngoài chồi đỉnh, nhiều nhà nghiên cứu sử dụng các bộ phận khác của
cây để nuôi cấy như đoạn thân, mẩu lá, cánh hoa. Tạo cây Dâu tây bằng phương
pháp nuôi cấy mô tế bào và tái sinh cây dâu lá đơn thành công [11]. Tạo cây Dâu

Tây sạch bệnh và virut nhờ nuôi cấy mô phân sinh đỉnh [23]. Nghiên cứu ảnh
hưởng của ánh sáng và nhiệt độ đến quang hợp của cây Dây Tây [25].
Chất lượng chồi cây giống in vitro là yếu tố có ảnh hưởng quan trọng đến
hiệu quả sản xuất cây giống tiêu chuẩn cũng như khả năng sinh trưởng. Để hoàn
thiện quy trình nuôi cấy mô cây Dâu Tây, việc nghiên cứu giai đoạn cuối cùng là
đưa cây in vitro ra ngoài đất cũng rất quan trọng [24].
2.5.2. Tình hình nghiên cứu trong nước
Cây Dâu Tây là cây có nhiều nguồn lợi kinh tế, chính vì nguồn lợi kinh tế đó
mà việc đầu tư cho những nghiên cứu tại các Cơ quan nghiên cứu nhiều tiêu biểu
trong đó có Phân viện Sinh học Tây nguyên, Trung tâm Nghiên cứu Khoai tây Rau
và Hoa, Trung tâm nghiên cứu và ứng dụng nông nghiệp Lâm Đồng…
Dự án “Hoàn thiện quy trình nhân giống và cung cấp cây giống sạch bệnh,
số lượng lớn cho các vùng trồng trong tỉnh Lâm Đồng” do Viện Sinh học Tây
Nguyên chủ trì đã đặt ra mục tiêu: Hoàn thiện công nghệ nhân giống và trồng, tạo ra
cây giống dâu sạch bệnh có chất lượng tốt đồng thời, xây dựng một số mô hình
trong dân, Do PGS.TS Dương Tấn Nhựt - Phó Viện trưởng Viện Sinh học Tây
Nguyên chủ nhiệm. Qua dự án này dựa trên trên Công nghệ nuôi cấy mô tế bào thực
vật làm nền tảng thu hút nhiều quan tâm của các nhà khoa học tại đây. Sau nhiều
năm thực hiện dự án việc tạo giống dâu bằng mô tế bào đã thành công [8].


15

PHẦN 3
VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.1. Vật liệu và phạm vi nghiên cứu
3.1.1. Vật liệu nghiên cứu
Mẫu cây Dâu Tây đang ở giai đoạn nhân nhanh trong điều kiện vô trùng
được nuôi cấy tại Bộ môn Công nghệ Tế Bào, Viện Khoa học Sự sống, Đại học
Nông Lâm Thái Nguyên.

3.1.2. Phạm vi nghiên cứu
Nghiên cứu nhân giống in vitro (nhân nhanh cụm chồi, ra rễ tạo cây hoàn
chỉnh, ra cây trong vườn ươm) cây Dâu Tây (Fragaria vesca L.).
3.2. Địa điểm và thời gian nghiên cứu
- Địa điểm: Phòng thí nghiệm Khu Công Nghệ Tế Bào, Viện Khoa Học Sự
sống, Đại Học Nông Lâm Thái Nguyên.
- Thời gian: Từ 12/2013 đến 6/2014
3.3. Nội dung nghiên cứu
Nội dung 1: Nghiên cứu ảnh hưởng đơn lẻ hoặc kết hợp của một số chất
kích thích sinh trưởng (BAP, Kinetin, IAA, IBA) đến khả năng nhân nhanh chồi
Dâu Tây .
Nội dung 2: Nghiên cứu ảnh hưởng của một số chất kích thích sinh trưởng
(IBA, NAA) đến khả năng ra rễ của chồi Dâu Tây.
Nội dung 3: Nghiên cứu ảnh hưởng một số loại giá thể đến sinh trưởng phát
triển của cây ngoài điều kiện tự nhiên.
3.4. Phương pháp nghiên cứu
3.4.1. Phương pháp nghiên cứu nội dung 1
Nghiên cứu ảnh hưởng đơn lẻ hoặc kết hợp của một số chất kích thích sinh
trưởng (BAP, Kinetin, IAA, IBA) đến khả năng nhân nhanh chồi Dâu Tây.
* Các bước tiến hành
- Phương pháp nhân nhanh in vitro:
+ Sử dụng dao (lưỡi dao số 11 đã được khử trùng) tách chồi đã tái sinh.
+ Sử dụng chồi sạch bệnh, sinh trưởng tốt có chiều dài từ 1-1,5cm, dùng
pank đã được khử trùng trên ngọn lửa đèn cồn, chờ nguội rồi gắp chồi đưa vào môi
trường đã được chuẩn bị trước.


16

+ Cấy chồi trên bề mặt môi trường với mật độ đồng đều, sau khi cấy xong

đưa vào phòng nuôi. Sau đó tiến hành theo dõi số chồi và chất lượng chồi (quan sát
bằng mắt thường).
- Môi trường nền :
+ Sử dụng môi trường MS bổ sung 30g/l đường saccarose; 30g/l chuối xanh
; Myo Inositol 100mg/l; 6,5g/l agar làm môi trường nền với pH= 5,6-5,8.
+ Các chất kích thích sinh trưởng sử dụng thuộc nhóm cytokinin (BAP,
Kinetin, IAA, IBA) bổ sung vào môi trường nuôi cấy với nồng độ khác nhau.
*Bố trí thí nghiệm
Thí nghiệm được bố trí gồm 5 công thức, với 3 lần lặp lại ngẫu nhiên, mỗi
công thức 90 mẫu.
- Thí nghiệm 1: Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ Kinetin đến khả năng
nhân nhanh chồi
CT1 (Đ/C): MT nền + Kinetin 0,0 mg/l
CT2: MT nền + Kinetin 0,5 mg/l
CT3: MT nền + Kinetin 1,0 mg/l
CT4: MT nền + Kinetin 1,5 mg/l
CT5: MT nền + Kinetin 2,0 mg/l
- Thí nghiệm 2: Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ BAP đến khả năng nhân
nhanh chồi
CT1 (Đ/C): MT nền + BAP 0,0 mg/l
CT2: MT nền + BAP 0,5 mg/l
CT3: MT nền + BAP 1,0 mg/l
CT4: MT nền + BAP 1,5 mg/l
CT5: MT nền + BAP 2,0 mg/l
Công thức có hàm lượng (BAP hoặc Kinetin) tốt nhất cho nhân nhanh chồi
cây kí hiệu là CT*.
Thí nghiệm 3: Nghiên cứu ảnh hưởng của sự kết hợp (BAP hoặc Kinetin) và
IBA đến khả năng nhân nhanh chồi .
CT1(Đ/C): CT* + IBA 0,0 mg/l
CT2: CT* + IBA 0,1 mg/l

CT3: CT* + IBA 0,2 mg/l
CT4: CT* + IBA 0,3 mg/l
CT5: CT* + IBA 0,4 mg/l


17

Thí nghiệm 4: Nghiên cứu ảnh hưởng của sự kết hợp (BAP hoặc Kinetin) và
IAA đến khả năng nhân nhanh chồi .
CT1(Đ/C): CT* + IAA 0,0 mg/l
CT2: CT* + IAA 0,1mg/l
CT3: CT* + IAA 0,2 mg/l
CT4: CT* + IAA 0,3 mg/l
CT5: CT* + IAA 0,4 mg/l
* Các chỉ tiêu theo dõi( theo dõi sau 45 ngày):
- Chỉ tiêu quan sát: Số chồi thu được, chất lượng chồi.
- Chỉ tiêu theo dõi: Hệ số nhân chồi, trung bình số lá/chồi, chất lượng chồi.
∑ Số chồi tạo thành (Chồi)
+ Hệ số nhân chồi (lần) =
∑ Số chồi ban đầu (Chồi)

+ Trung bình số lá/chồi (lá) =

∑ số lá thu được (Lá)
∑ số chồi thu được (Lá)

+ Chất lượng chồi:
+++: Chồi tốt (Chồi mập, lá xanh thẫm)
++: Chồi trung bình (Chồi gầy, lá xanh)
+: Chồi kém (Chồi gầy, lá xanh nhạt hoặc chồi bị dị dạng)

3.4.2. Phương pháp nghiên cứu nội dung 2
Nghiên cứu ảnh hưởng của một số chất kích thích sinh trưởng (IBA, NAA )
đến khả năng ra rễ của chồi Dâu Tây.
* Các bước tiến hành
- Mẫu nuôi cây: mẫu chồi cây khỏe mạnh từ quá trình nhân nhanh
- MT nền = 1/2MS + Saccarose 30g/l + agar 6,5g/l + Myo Inositol 100mg/l,
pH= 5,6 -5,8.
- Các chất kích thích sinh trưởng sử dụng thuộc nhóm auxin (IBA, NAA)
bổ sung vào môi trường nuôi cấy với nồng độ khác nhau.
*Bố trí thí nghiệm
- Thí nghiệm đươc bố trí gồm 5 công thức, với 3 lần lặp lại ngẫu nhiên, mỗi
công thức cấy 90 mẫu.