Nguyên tắc và ứng dụng phân tích trình tự của nucleic acid

GVHD:
GVHD:TS.
TS.NGUYỄN
NGUYỄNVĂN
VĂNDUY
DUY
NHÓM
NHÓM::88
LỚP:
LỚP:52CNSH
52CNSH


TỔNG QUAN

NGUYÊN TẮC XÁC ĐỊNH TRÌNH TỰ DNA

CÁC PHƯƠNG PHÁP THỰC HIỆN

ỨNG DỤNG CỦA PHƯƠNG PHÁP


A. Khái niệm:
 Trong thuật ngữ di truyền học, xác định trình tự DNA
là quá trình xác định trật tự nucleotide của một đoạn
DNA
 Trình tự của DNA mã hóa các thông tin cần thiết để
cho các cơ thể sống có thể tồn tại và tái sản sinh
 Giải mã trình tự các nucleotit có thể xem là việc đánh
dấu mẫu dò triệt để nhất của một hệ gen với tính chọn
lọc cao.

B. Mục đích:
 Xác định chính xác trật tự sắp xếp của các cặp trọng
một đoạn DNA
Phân tích trình tự của các đơn vị mang thông tin di
truyền.
Lí giải tại sao và bằng cách nào mà các cơ thể tồn tại
Hiểu biết về trình tự DNA có thể trở nên hữu ích với
các nghiên cứu sinh học và ứng dụng
So sánh giữa tương đồng gen giữa các loài và xác
định đột biến


 Là kĩ thuật xác định tất cả những hợp phần do nucleotide
hình thành nên phân tử DNA
 Các công trình đầu tiên về “DNA sequencing” được công bố
bởi Maxam va Gilbert (1977), Sanger và cộng sự (1977)
 Cấu trúc của chuỗi DNA là một chuỗi xoắn kép, hai mạch
đơn liên kết với nhau bởi liên kết hidro. Trên mỗi dãy có
một chuỗi các base, tập hợp của bốn nucleotide : A, T, C, G
 Kĩ thuật DNA sequencing sử dụng kĩ thuật điện di với gel
loại polyacrylamide có độ phân giải cao.


PHƯƠNG PHÁP HÓA HỌC

3 TYPE

PHƯƠNG PHÁP ENZYME

PYROSEQUENCING


 Dựa vào sự thủy giải đặc
trưng phân tử DNA cần xác
định trình tự bằng phương
pháp hóa học
 Nguyên tắc của phương
pháp hoá học của Allan
Maxam và Walter Gilbert
là sử dụng phương pháp
đánh dấu phóng xạ (P32),
xử lí hoá học để phá huỷ 1
nucleotit tạo ra hàng loạt
các đoạn ADN có kích
thước khác nhau.


STEPS
Step 1

Step 2

Step 3

Step 4

DNA sợi kép
biến tính

thành dạng
sợi đơn

Đánh dấu
phóng xạ
(P32) ở đầu
5'

Sử dụng hoá
chất phá huỷ
một loại
nucleotit nhất
định

điện di trên
gel
poliacrylamid


Hóa chất
Dimethyl sulfate pH 8

Base bị ảnh hưởng
G

Piperidine formate pH 2

A+G

Hydrazine

A+ T

Hydrazine + 1,5 M NaCl
Nhiệt độ cao (900C), 1,2 M
NaOH

C
A >C



 Nguyên tắc của phương pháp
này là sử dụng deoxynucleotit
không có nhóm OH ở vị trí 3'
do vậy trong quá trình kéo dài
chuỗi polinucleotit enzyme
polimerase gắn chúng vào chuỗi
polinucleotit thì quá trình tổng
hợp bị dừng lại. Kết quả tạo ra
các đoạn DNA có kích thước
hơn kém nhau một nucleotit,
trên cơ sở đó xác định được
trình tự nucleotit.

Frederick Sanger



STEPS

Step 1

Step 2

Step 3

Step 4

DNA sợi kép
biến tính
thành dạng
sợi đơn

Mồi tiếp hợp
với DNA sợi
đơn.

Phản ứng
tổng hợp
chuỗi
polinucleotit

điện di trên
gel
poliacrylamid


 Một hỗn hợp các
dNTPs trong đó có
một loại dNTP

được đánh nhãn
phóng xạ hoặc được
nhuộm màu huỳnh
quang tùy theo từng
lọ; ví dụ lọ 1 thì có
dATP được đánh
nhãn phóng xạ, lọ 2
thì dCTP, lọ 3 dTTP
và lọ 4 là dGTP.


 Mỗi loại ddNTP A, T, C, G được thêm vào mỗi
lọ thí nghiệm độc lập ở trên


 Tăng nhiệt độ trong lọ lên khoảng 92oC đến 96oC khi
đó chuỗi DNA sẽ tách ra thành 2 sợi đơn, một trong 2
sợi sẽ làm sợi khuôn(DNA template).


 Sau đó nhiệt độ trong lọ sẽ được hạ thấp xuống
khoảng 600C ,lúc này primer sẽ lại gắn vào DNA
template tương ứng với nó và DNA polymerase III
sẽ xúc tác cho quá trình sao chép và quá trình tổng
hợp bắt đầu.

 Quá trình tổng hợp để tạo ra chuỗi DNA mới sẽ
diễn ra cho tới khi có một ddNTP tới bổ sung vào
chuỗi mới thì phản ứng lúc này cũng dừng lại

 Tùy thuộc vào thời điểm ddNTP gắn vào mà đoạn
DNA (DNA fragments) thu được sẽ có chiều dài
ngắn khác nhau


Xác định trình tự DNA template
 Trình tự của chuỗi DNA template có thể xác định
gián tiếp thông qua trình tự của chuỗi DNA mới
tạo thành, dựa trên nguyên lí bổ sung cho nhau

 Nung nóng ở mỗi lọ để tách các DNA fragments
mới ra khỏi DNA template.
 DNA fragments sẽ được đưa riêng rẽ vào một môi
trường gọi là polyacrylamide gel để điện di


ĐIỆN DI


...VÀ ĐỌC KẾT QUẢ


Việc xác định trình tự Nucleotide đơn giản hơn
khi xử dụng các hệ thống tự động
 Dựa trên phương pháp Sanger
 Với kỹ thuật này thì primer hay các ddNTP được đánh
dấu phóng xạ và các sản phẩm DNA được khuếch đại
tương tự như trong kỹ thuật PCR. Chỉ cần một phản ứng
duy nhất và sản phẩm tạo ra là một dãy các phân tử

DNA mà phân tử này dài hơn phân tử kia một
nucleotide.



 Trong kĩ thuật này, không dùng các đồng vị
phóng xạ, thay vào đó là các hóa chất có khả
năng phát huỳnh quang (fluochrome).
 Mỗi loại Dideoxynucleotide được đánh dấu bằng
fluochrome có màu khác nhau.
 Tất cả các oligonucleotide cùng chấm dứt tại một
loại Dideoxynucleotide sẽ có cùng một màu.
 Điện di kết quả được đọc nhờ hệ thống vi tính.