Bước đầu nghiên cứu, xây dựng quy trình nhân nhanh in vitro giống hoa cát tường (eustoma grantdiflorum (raf ) shinn)

§å ¸n tèt nghiÖp

Khoa: CNSH & MT
PHẦN I: MỞ ĐẦU

1.1. Đặt vấn đề
Cùng với sự phát triển của đời sống xã hội, đời sống của con người ngày
một được nâng cao, nhu cầu làm đẹp cho cuộc sống cũng theo đó mà tăng mạnh
mẽ. Hoa được coi là thứ trang sức không thể thiếu trong cuộc sống hàng ngày
của con người, nó mang lại cho cuộc sống thêm màu sắc rực rỡ, hương thơm
ngọt ngào. Những bông hoa tươi thắm còn mang trong mình một sức mạnh to
lớn, nó là cầu nối giữa những người yêu thương để gửi đến nhau những thông
điệp tốt đẹp. Mỗi một loài mang trong mình một vẻ đep riêng và ngoài vẻ đẹp
riêng chúng còn mang trong mình những ý nghĩa riêng. Trong muôn vàn loài
hoa có một loài hoa trông giống như hoa Hồng nhưng khi hoa nở rộ thì mang vẻ
đẹp rất riêng , đó là loài hoa mang cái tên Cát Tường. Giống hoa Cát Tường mọc
dại tại Texas ở Mỹ, đã được nhân giống trồng nhiều nơi trên thế giới, hoa có rất
nhiều màu sắc đa dạng như: kem, tím, vàng, hồng, hồng phai, tím đậm, trắng
viền tím…Không thơm lừng hay kiêu sa như hoa hồng để rồi nhanh héo úa. Cát
tường vẫn hằng ngày ban phát cho đời sống sự dịu dàng đằm thắm trong sắc
màu của mình.
Khác với những loại hoa thông thường khác, hoa cát tường khó trồng hơn.
Người trồng hoa mua giống nhập từ Nhật, từ Mỹ về. Đem ủ giống trong mảnh
đất tốt, tơi xốp và giàu đạm để đảm bảo hoa có thể nảy mầm, phát triển. Một
luống hoa cát tường trồng khoảng 5, đến 6 tháng là thu hoạch đợt đầu, khoảng 3
tháng sau thu hoạch đợt sau. Luống hoa chỉ thu hoạch trong 1 năm, khoảng 3
đợt, sau đó phải cuốc lên bỏ hết để trồng luống mới.
Hoa cát tường là giống hoa có khả năng chịu lạnh tốt, du nhập vào Đà Lạt
nước ta lần đầu tiên khoảng chục năm về trước với nhiều chủng loại khác nhau.
Hoa Cát tường rất được ưa chuộng, vì màu sắc và kiểu dáng của hoa rất đẹp, vì
tên gọi của nó, mang đến ý nghĩa vạn sự như ý, may mắn, an lành, chúng được

tiêu thụ nhiều nhất vào dịp tết, ai cũng muốn cả năm, mình và gia đình được cát
tường.

Chu TuÊn Thµnh

1

MSSV: 506301072


§å ¸n tèt nghiÖp

Khoa: CNSH & MT

Hoa Cát tường là một giống hoa mới du nhập vào nước ta, nguồn giống
chủ yếu là nhập ngoại nên giá hoa thành phẩm khá cao, chưa đáp ứng được nhu
cầu của người chơi hoa, hơn nữa Cây hoa Cát tường là loài cây khá khó tính, cần
kỹ thuật chăm sóc cẩn thận. Việc nhân giống bằng hạt cho hiệu quả thấp, hệ số
nhân thấp, chất lượng cây không tốt, cây dễ bị thoái hoá. Rõ ràng việc tìm ra
phương pháp nhân nhanh nhằm tạo ra được lượng cây giống lớn trong thời gian
ngắn, đồng thời duy trì được những đặc tính quý của giống là việc làm hết sức
có ý nghĩa. Vì vậy, để hạn chế được khó khăn công tác chọn tạo, nhân giống,
các kỹ thuật gieo trồng hoa Cát tường ở Việt Nam đã bước đầu được nghiên
cứu. Để có thể triển khai trên quy mô lớn, giảm giá thành, hiện nay kỹ thuật
nhân giống vô tính in vitro đã được áp dụng thành công trên rất nhiều đối tượng.
Phương pháp này cho phép từ một lượng nhỏ giống ban đầu được nhân nhanh có
thể cung cấp được một lượng cây giống lớn, đồng nhất, sạch bệnh, duy trì được
đặc tính của cây mẹ ban đầu. Trên cơ sở đó trong thời gian thực tập tốt nghiệp
tại Viện di truyền nông nghiệp chúng tôi đã tiến hành nghiên cứu đề tài:
“ Bước đầu nghiên cứu, xây dựng quy trình nhân nhanh in vitro giống hoa

Cát tường (Eustoma grantdiflorum (Raf.) Shinn).
1.2.Mục đích và yêu cầu của đề tài
1.2.1 Mục đích
Bước đầu nghiên cứu, xây dựng quy trình nhân nhanh giống hoa Cát
tường (Eustoma grantdiflorum (Raf.) Shinn) bằng phương pháp nuôi cấy mô tế
bào nhằm cung cấp một số lượng lớn cây con cho sản xuất phục vụ nhu cầu sử
dụng hoa Cát tường ở Hà Nội và các vùng lân cận.
1.2.2. Yêu cầu
- Nghiên cứu phương pháp khử trùng mẫu để tạo nguyên liệu khởi đầu
cho nhân giống vô tính in vitro cây hoa Cát tường
- Nghiên cứu khả năng phát sinh hình thái của các mẫu nuôi cấy

Chu TuÊn Thµnh

2

MSSV: 506301072


§å ¸n tèt nghiÖp

Khoa: CNSH & MT

- Nghiên cứu được ảnh hưởng của các chất điều tiết sinh trưởng đến khả
năng nhân nhanh, hình thành rễ và tạo cây hoàn chỉnh
- Nghiên cứu được ảnh hưởng của các giá thể đến tỷ lệ sống của cây ở
giai đoạn vườn ươm
1.3. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài
1.3.1 Ý nghĩa khoa học
Tìm ra ảnh hưởng của các chất điều hoà sinh trưởng ở các nồng độ khác

nhau và các chất phụ gia thích hợp cho sự tái sinh chồi, nhân nhanh chồi, tạo rễ
ở cây hoa Cát tường.
1.3.2 Ý nghĩa thực tiễn
Tạo ra cây con hoa Cát tường hoàn chỉnh ra ngoài vườn ươm, làm cơ sở
cho việc cung cấp giống cho sản xuất.

Chu TuÊn Thµnh

3

MSSV: 506301072


§å ¸n tèt nghiÖp

Khoa: CNSH & MT
PHẦN II: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1. Tình hình sản xuất và tiêu thụ hoa
Sản xuất hoa cây cảnh trên thế giới đang phát triển một cách mạnh mẽ và
đang trở thành một ngành thương mại cao. sản xuất hoa cây cảnh đã mang lại lợi
ích to lớn cho nền kinh tế các nước trồng hoa cây cảnh.
Hiện nay, sản xuất hoa ở nước ta được thực hiện bởi 2 đối tượng chính:
nông dân sản xuất tự phát theo xu hướng nhu cầu thị trường trong nước và bởi
các doanh nghiệp tư nhân trong nước, liên doanh với nước ngoài hoặc 100% vốn
nước ngoài sản xuất hoa chủ yếu cho xuất khẩu. Hoa tiêu thụ trong nước chủng
loại đa dạng và cung cấp ra thị trường theo mùa vụ, chất lượng từ thấp đến cao,
giá cả vừa phải, hiệu quả kinh tế không cao, sản xuất nhỏ lẻ và thiếu ổn định.
Các doanh nghiệp sản xuất hoa xuất khẩu lượng hoa nhiều hơn mang tính hàng
hoá, chất lượng hoa cao hơn và được sản xuất trong điều kiện kỹ thuật cao, sản

phẩm được tiêu thụ theo hợp đồng. Hiện nay, Việt Nam đã xuất khẩu được các
sản phẩm hoa cắt cành như hồng, phong lan, cúc, đồng tiền, cẩm chướng, ly ly,
sao tím...sang Trung Quốc, Hồng Kông, Đài Loan, Nhật bản, Singapore.
Australia, ảrập; vạn niên thanh, mai chiếu thủy, mai cảnh... sang Trung Quốc,
Hoa Kỳ, Nhật Bản. Tuy nhiên, số lượng xuất khẩu không nhiều, với doanh thu
hơn 10 triệu USD/năm. Sở dĩ, sản phẩm hoa, cây cảnh của Việt Nam khó thâm
nhập thị trường thế giới là do chủng loại, chất lượng, kích cỡ không đồng đều,
chưa đáp ứng được thị hiếu của khách hàng quốc tế. Trong khi đó, tiêu thụ trong
nước lại có xu hướng chạy theo mùa vụ (rằm, lễ, Tết, các ngày kỷ niệm) là
chính. [19]
Đà Lạt là vùng sản xuất hoa nổi tiếng và là vùng có tiềm năng lớn nhất về
sản xuất hoa của cả nước. Hiện nay công ty TNHH Đà Lạt - Hasfarm 100% vốn
nước ngoài đang áp dụng công nghệ sản xuất hoa tiên tiến với qui mô diện tích
15 ha sản xuất trong nhà kính và 2 ha nhà thép; có hệ thống tự động điều chỉnh
nhiệt độ, ẩm độ, hệ thống tưới nhỏ giọt bằng nguồn nước sạch hòa tan với phân
bón, thuốc bảo vệ thực vật. Các chủng loại hoa Công ty Đà Lạt - Hasfarm đang

Chu TuÊn Thµnh

4

MSSV: 506301072


§å ¸n tèt nghiÖp

Khoa: CNSH & MT

sản xuất bao gồm hoa hồng, cúc, cẩm chướng, ly ly, đồng tiền và lá hoa trang
trí. Sản lượng hoa xuất khẩu sang các nước Hồng Kông, Nhật, Đài Loan,

Singapore... chiếm 55%, phần còn lại dành cho tiêu thụ nội địa. Quy trình sản
xuất được thực hiện khép kín từ gieo trồng đến thu hoạch, kể cả công nghệ sau
thu hoạch như xử lý dung dịch giữ hoa, đóng gói, bảo quản và vận chuyển trong
ngày để gửi đến nơi tiêu thụ. [19]
Hiện nay ở nước ta, nhu cầu về hoa Cát tường ngày càng tăng nhưng thực
tiễn sản xuất và kinh doanh loại hoa này còn nhiều yếu kém cả về năng suất, sản
lượng cũng như chất lượng hoa. Lý do xuất phát của những hạn chế đó là khó
khăn về chủng loại, số lượng, chất lượng giống cũng như kỹ thuật nhân giống.
Để giải quyết được những khó khăn đó thì việc áp dụng kỹ nuôi cấy mô in vitro
trên cây hoa Cát tường là rất cần thiết.
2.2. Một số hạn chế trong sản xuất hoa hiện nay ở Việt Nam
Nhìn chung sản xuất hoa ở nước ta bị hạn chế rất lớn về thời vụ do điều
kiện khí hậu không thích hợp: ở phía Bắc, hầu hết các loại hoa có chất lượng cao
chỉ có thể sản xuất được với chất lượng khá trong vụ Đông Xuân; còn ở các tỉnh
phía Nam khí hậu lại càng ít thuận lợi hơn (trừ một số vùng đặc thù).
Về quy mô và tổ chức sản xuất: Hầu hết những cơ sở sản xuất hoa cắt
cành ở nước ta còn ở quy mô nông hộ nhỏ, tổ chức sản xuất đơn lẻ, với diện tích
trung bình từ 2.000 đến 3.000 m2 /hộ. Hộ sản xuất hoa lớn cũng chỉ từ 1 đến 2
ha. Ở quy mô sản xuất này không thể áp dụng những kỹ thuật tiến bộ như nhà
kính, nhà lưới, sân bãi, mặt bằng, dây chuyền chế biến, bảo quản vận chuyển
lạnh,…để đưa ngành sản xuất hoa trở thành sản xuất công nghiệp. Từng hộ nông
dân sản xuất nhỏ lẻ, thiếu hợp tác là trở ngại lớn cho việc tạo nguồn hàng hóa
lớn và đa dạng với chất lượng cao, đồng nhất. Trên thực tế, đã có nhiều hợp
đồng xuất khẩu không thể thực hiện được do không thể tổ chức cung cấp sản
phẩm theo yêu cầu, trong khi tiềm năng sản xuất là rất lớn.

Chu TuÊn Thµnh

5

MSSV: 506301072


§å ¸n tèt nghiÖp

Khoa: CNSH & MT

Kỹ thuật trồng hoa ở nhiều nơi vẫn chủ yếu dựa vào kinh nghiệm và
phương pháp nhân giống cổ truyền như gieo từ hạt, trồng từ củ, mầm, nhánh.
Các phương pháp này dễ trồng, giá thành cây giống thấp nhưng chất lượng
giống không cao, dễ bị thoái hóa, làm giảm chất lượng hoa vì vậy tuy chủng loại
hoa của Việt Nam khá phong phú nhưng thiếu giống hoa đẹp, chất lượng cao.
Về ứng dụng công nghệ cao: Đã được cải thiện đáng kể, như thay đổi cơ
cấu giống, nuôi cấy mô, kỹ thuật canh tác và bảo vệ thực vật tiên tiến; áp dụng
công nghệ nhà lưới có mái che sáng... Tuy nhiên, sự thay đổi này diễn ra không
đồng đều giữa các vùng sản xuất vì nhiều lý do (khí hậu thời tiết, trình độ thâm
canh, khả năng đầu tư, khả năng tiếp cận kỹ thuật tiến bộ và thị trường…). Đà
Lạt có thể coi là địa bàn có tiến bộ nhanh nhất trong cả nước về phát triển sản
xuất hoa cắt cành. [19]
2.3. Giới thiệu chung về hoa cát tường Hoa cát tường
2.3.1 Vị trí, tên gọi và xuất xứ
- Giới: Plantae
- Ngành: Magnoliophyta
- Lớp: Magnoliopsida
- Lớp phụ: Asteridae
- Bộ: Gentianales
- Họ: Gentianaceae
- Giống: Eustoma
- Tên khoa học: Eustoma grandiflorum
- Tên khác: Lisianthus, Prairie Gentian,Texas bluebell, Tulip Gentian, Bluebell,

Lire de san pedro
- Tên Việt Nam: Cát tường
Cát tường- tên khoa học Eustoma grandiflorum (Raf.) Shinn có nguồn gốc
từ miền tây nước Mỹ, có khả năng chịu lạnh tốt, du nhập vào Đà Lạt nước ta lần

Chu TuÊn Thµnh

6

MSSV: 506301072


§å ¸n tèt nghiÖp

Khoa: CNSH & MT

đầu tiên khoảng hơn chục năm về trước với nhiều chủng loại và màu sắc đa
dạng như: kem, tím, vàng, hồng, hồng phai, tím đậm, trắng viền tím…
Hiện tại cát tường là giống hoa được người tiêu dùng rất ưa chuộng và
đang được sản xuất làm hoa thương phẩm. Hoa cát tường được sản xuất nhiều ở
Đà Lạt vì điều kiện khí hậu và thổ nhưỡng nơi đây rất phù hợp với đặc điểm
sinh trưởng của nó. Ngoài ra, cát tường còn được coi là hoa chủ lực và làm lên
thương hiệu nhiều vườn hoa như vườn hoa Lang Biang Farm.... Tại đây, với
diện tích trồng hoa 6ha thì trồng hoa cát tường là chủ yếu đã cho những cành
hoa thân cao, hoa lớn. Đó chính là điểm mạnh đưa hoa cát tường của Lang
Biang Farm không chỉ nổi tiếng ở Đà Lạt mà cả ở TP. Hồ Chí Minh.
Hiện nay, do nhu cầu chơi hoa Cát tường ngày càng tăng, hoa sản xuất ra
không đủ cầu. Vì vậy, năm vừa qua, Hiệp hội hoa Đà Lạt đã tổ chức hội thảo
chuyên đề về qui trình kỹ thuật canh tác, thu hoạch hoa Cát tường với sự có mặt
của 10 nhà khoa học và hơn 40 người trồng hoa trên địa bàn Đà Lạt để trồng hoa

cát tường có hiệu quả và cung cấp tốt nhất nhu cầu của người tiêu dùng. [19]
2.3.2. Đặc điểm thực vật học
2.3.2.1. Rễ:
Rễ của hoa cát tường thuộc loại rễ cọc, có nguồn gốc từ mầm rễ của hạt.
Rễ của cây phát triển theo chiều sâu mà ít phát triển theo chiều ngang do vậy
cây có khả năng chịu hạn cao.
2.3.2.2. Thân:
Thân thảo, đứng, có khả năng phân nhánh mạnh. Có nhiều đốt, giòn, dễ
gẫy, thân cây càng lớn càng cứng.. Các đốt sát gốc thường to và ngắn hơn các
đốt trên ngọn. Các đốt ở ngọn cây dài và nhỏ. Cây cao từ 15 – 60 cm
2.3.2.3. Lá:
Lá đơn mọc đối, không có lá kèm. Lá có hình ôvan hoặc hình bầu dục dài
tuỳ từng giống, đầu lá nhọn, lá không có cuống mà ôm sát lấy thân. Mép lá
không có răng cưa. Phiến lá có thể to hay nhỏ tuỳ thuộc vào đặc điểm từng

Chu TuÊn Thµnh

7

MSSV: 506301072


§å ¸n tèt nghiÖp

Khoa: CNSH & MT

giống. Từ mỗi nách lá thường phát sinh một mầm nhánh. Lá cát tường có màu
xanh biếc, mảnh dẻ, mọng nước, bề mặt lá có phủ một lớp sáp mỏng. Trên lá có
từ 3 – 5 gân, gân lá song song., trong đó gân giữa ăn sâu và rõ hơn cả.
Ở cát tường góc lá có sự thay đổi theo tuổi của lá, các lá mới hình thành

có góc lá đứng, sau đó các lá mở ngang và rũ xuống
2.3.2.4. Hoa:
Hoa đối xứng, lưỡng tính. Đài hoa, cánh hoa liền nhau. Các nhị hoa trên
tràng nằm so le với các thuỳ tràng hoa. Đáy nhụy hoa có một đĩa mật. Các hoa
đính noãn vách bên. Cụm hoa hình xim. Tràng hoa có nhiều màu sắc khác nhau,
có loại cánh đơn và loại cánh kép tuỳ từng giống.
2.3.2.5. Quả:
Quả nang tự nở. nhìn màu lá có thể xác định màu của quả
2.3.2.6. Hạt:
Có kích thước nhỏ, với nội nhũ nhiều dầu. Phôi mầm lớn. Nảy mầm kém.
2.3.3 Đặc điểm sinh trưởng
Hoa cát tường phát triển tốt ở điều kiện 70 - 80 Klux ánh sáng tự nhiên.
Do vậy vào mùa xuân hay mùa hè có cường độ ánh sáng cao nên thường phải
che lưới cho hoa. Hoa cát tường thích hợp với vụ dài ngày, có số giờ chiếu sáng
trong ngày tối ưu là 16 giờ trong ngày thì sẽ cho chất lượng bông cao nhất. Tính
cả thời gian từ lúc gieo hạt cho đến khi cây ra hoa là từ 20 – 23 tuần.
Nhiệt độ tối thích cho hoa cát tường sinh trưởng và phát triển là từ 18 –
20oC vào ban ngày và 15 – 18 oC vào ban đêm. Nhiệt độ vào ban đêm thấp hơn
15oC sẽ làm trì trệ quá trình sinh trưởng của cây. Vào ban ngày, khi nhiệt độ cao
hơn 28 oC sẽ làm cho hoa nở sớm, rút ngắn quá trình sinh trưởng của hoa và cho
hoa kém chất lượng. Tùy theo từng chủng loại giống mà có yêu cầu về nhiệt độ
và quang chu kỳ khác nhau, do vậy trước khi trồng nên tìm hiểu chủng loại
giống mà bố trí mùa vụ thích hợp.

Chu TuÊn Thµnh

8

MSSV: 506301072

§å ¸n tèt nghiÖp

Khoa: CNSH & MT

2.3.4 Phân loại hoa cát tường
Giống hoa cát tường gồm có hai loại: Giống hoa kép và hoa đơn
2. 3.4.1.Giống hoa kép

- Nhóm Avilia: nhóm này thích hợp ở điều kiện ánh sáng yếu và nhiệt độ
mát. Do vậy nhóm giống này thường trồng vào vụ đông. Các màu thường là
trắng ngà, viền xanh, hồng cánh sen, đỏ tía.
- Nhóm Balboa: nhóm này thích hợp nhiệt độ và cường độ ánh sáng cao
hơn. Thích hợp trồng vụ xuân đến hè. Phát triển tốt ở điều kiện quang chu kỳ
ngày dài. Các màu thường là xanh, viền xanh, xanh tía.
- Nhóm Catalina: thích hợp với điều kiện ngày dài và thời tiết ấm áp. Các
màu thường là xanh tía và màu vàng.
- Nhóm Candy: thích hợp với cường độ ánh sáng trung bình và quang chu
kỳ ngày ngắn. Nhóm này cho hoa nở đồng loạt và có nhiều màu để chọn lựa.
- Nhóm Echo: Nhóm này là nhóm phổ biến trong giống hoa cát tường.
Không thích hợp với cường độ ánh sáng quá cao hay thấp, thích hợp cho vụ
đông xuân. Các màu phổ biến trong giống này là xanh bóng, xanh tía, hồng,
hồng tía, trắng tuyền.
- Nhóm Mariachi: Nhóm này thích hợp trồng trong chậu. Đặc điểm giống
này là có số cánh hoa nhiều, cánh hoa mỏng hơn các giống khác nên nhìn rất
đẹp. Các màu phổ biến trong giống này là trắng, hồng, hồng nhạt, xanh………

Chu TuÊn Thµnh

9

MSSV: 506301072


§å ¸n tèt nghiÖp

Khoa: CNSH & MT

2.3.4.2. Giống hoa đơn

- Nhóm Flamenco: là nhóm thích hợp với cường độ ánh sáng cao và
quang chu kỳ ngày dài. Thân hoa dài và mảnh. Các màu là xanh bóng, hồng,
vàng, trắng.
- Nhóm Heidi: thích hợp với cường độ ánh sáng trung bình và quang chu
kỳ ngày ngắn. Có nhiều màu để chọn lựa.
- Nhóm Laguna: là nhóm thích hợp với cường độ ánh sáng cao và quang
chu kỳ ngày dài. Thân hoa dài khoảng 48 cm, một cây trung bình có ba thân và
25 nụ hoa. Có hai màu là xanh đậm và xanh tía.
- Nhóm Malibu: thích hợp với cường độ ánh sáng trung bình và trong mùa
xuân và mùa thu. Có nhiều màu là hoa cà, xanh đậm, trắng, hồng, trắng viền
xanh.
- Nhóm Yodel: Thân hoa dài khoảng 45 - 50cm. Có nhiều màu là xanh
đậm, xanh, hoa cà, hồng phấn, hồng, trắng. [19]
2.4. Sơ lược về nuôi cấy mô tế bào thực vật
Nuôi cấy mô tế bào thực vật là lĩnh vực nuôi cấy mô, tế bào và các cơ
quan hoàn toàn sạch các vi sinh vật trên môi trường dinh dưỡng nhân tạo trong
điều kiện vô trùng.
Cơ sở khoa học của kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật chính là tính
toàn năng và khả năng phân hoá, phản phân hoá của tế bào thực vật. Tế bào
được coi là đơn vị cấu trúc và chức năng của mọi cơ thể sinh vật. Sự phân hoá,

phản phân hoá tế bào cùng với đặc tính vốn có của nó là “ tính toàn năng”, là cơ
sở lý luận vững chắc để xây dựng kỹ thuật nuôi cấy mô, tế bào nhằm tái sinh cây

Chu TuÊn Thµnh

10

MSSV: 506301072


§å ¸n tèt nghiÖp

Khoa: CNSH & MT

hoàn chỉnh từ các tế bào tách rời, có khả năng sống và phát triển độc lập. Dựa
trên cơ sở đó mà công nghệ nuôi cấy mô, tế bào thực vật ra đời.
Năm 1992, Haberlandt lần đầu tiên đã quan niệm rằng mỗi một tế bào bất
kỳ của một cơ thể sinh vật đa bào đều có khả năng tiềm tàng để phát triển thành
một cơ thể hoàn chỉnh. Theo quan niệm sinh học hiện đại thì mỗi tế bào riêng rẽ
đã được phân hoá đều chứa toàn bộ lượng thông tin di truyền (ADN) cần thiết
của cả cơ thể thực vật đó và nếu gặp điều kiện thích hợp thì mỗi tế bào đó đều
có thể phát triển thành một cá thể hoàn chỉnh gọi là “tính toàn năng” của tế bào
thực vật [12]. Biểu hiện của tính toàn năng chính là sự phân hoá và phản phân
hoá, và thực chất sự phân hoá và phản phân hoá tế bào là kết quả của sự hoạt
hoá, phân hoá các gen vốn có trong tế bào tại thời điểm nào đó trong quá trình
phát triển cá thể hay trong điều kiện nhất định, một số gen được hoạt hoá để tạo
nên các đặc tính mới và ngược lại, một số gen khác có thể bị đình chỉ hoạt động
làm mất đi những đặc tính vốn có trước đó của tế bào. Điều này xảy ra theo một
chương trình đã được mã hoá trong cấu trúc của phân tử AND của mỗi tế bào
khiến quá trình sinh trưởng phát triển của cơ thể thực vật luôn được hài hoà.

Quá trình phát sinh hình thái trong nuôi cấy mô tế bào thực vật thực chất
là kết quả của quá trình phân hoá tế bào. Kỹ thuật nuôi cây mô, tế bào xét cho
cùng đến cùng là kỹ thuật điều khiển sự phát sinh hình thái của tế bào thực vật
(khi nuôi cấy tách rời trong điều kiện nhân tạo và vô trùng) một cách định
hướng dựa vào sự phân hoá và phản phân hoá của tế bào trên cơ sở tính toàn
năng của tế bào thực vật. Để điều khiển sự phát sinh hình thái của mô nuôi cấy,
người ta thường bổ sung vào mộ trường nuôi cấy hai nhóm chất điều tiết sinh
trưởng thực vật là auxin và cytokinin. [9]
2.5. Ứng dụng nuôi cấy mô tế bào thực vật
+ Duy trì và nhân nhanh các kiểu gen quý làm vật liệu cho công tác giống
+ Nhân nhanh các loài hoa, cây cảnh khó trồng bằng hạt
+ Duy trì nhân nhanh các dòng bố mẹ và các dòng lai để tạo hạt giống
cây, cây hoa và cây trồng khác

Chu TuÊn Thµnh

11

MSSV: 506301072


§å ¸n tèt nghiÖp

Khoa: CNSH & MT

+ Nhân nhanh kết hợp làm sạch virus
+ Bảo quản tập đoàn gen.
2.6. Kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào và ứng dụng trong nhân nhanh giống cây
trồng
2.6.1. Giới thiệu quy trình nhân giống vô tính in vitro

Ngày nay, hầu hết các nhà nghiên cứu đều thống nhất rằng thành công của
vi nhân giống chỉ đạt được khi nó trải qua 5 giai đoạn, chứa không phải 3 giai
đoạn như Murashige (1974) đã nêu ra trước đây. Trong đó giai đoạn 0 (giai đoạn
chuẩn bị) là đặc biệt quan trọng. [11]
Giai đoạn 0: Khử trùng mô cấy
Đây là giai đoạn tối quan trọng, thậm chí quyết định toàn bộ quy trình nhân
giống in vitro. Mục đích của giai đoạn này là tạo được vật liệu thực vật vô trùng
vào nuôi cấy in vitro. Khử trùng mô thực vật người ta thường sử dụng một số
chất hoá học như HgCl2, Ca(OCL)2, NaOCL, H2O2. tuỳ thuộc từng loại mô thực
vật mà lựa chọn nồng độ và thời gian xử lý hoá chất thích hợp.
Giai đoạn 1: Tái sinh mô nuôi cấy
Trong nhân giống in vitro, mẫu nuôi cấy thường sử dụng là chồi đỉnh hoặc
chồi nách của cây mẹ. Ngoài ra tùy từng đối tượng mà người ta còn sử dụng các
mẫu nuôi cấy là thân, rễ, lá, đài hoa, cánh hoa… Mục đích của giai đoạn này là
tái sinh một cách định hướng các mô nuôi cấy. Quá trình này được điều khiển
chủ yếu dựa vào tỷ lệ thích hợp chất auxin/cytokinin ngoại sinh đưa vào môi
trường nuôi cấy. tuy nhiên, cần phải quan tâm đến tuổi sinh lý mẫu cấy. Thường
các mô non chưa phân hoá có khả năng tái sinh cao hơn các mô trưởng thành đã
chuyên hóa sâu. Theo Anderson mẫu cấy của cây được lấy vào thời kỳ sinh
trưởng mạnh cho kết quả rất khả quan trong tái sinh chồi.
Giai đoạn 2: Nhân nhanh chồi
Để tăng hệ số nhân, người ta thường đưa thêm vào môi trường dinh
dưỡng nhân tạo các chất điều hoà sinh trưởng (auxin, cytokinin, gibberellin…)
các chất bổ sung khác như nước dừa, nước chiết nấm men, dịch thuỷ phân

Chu TuÊn Thµnh

12

MSSV: 506301072

§å ¸n tèt nghiÖp

Khoa: CNSH & MT

casein… kết hợp với các yếu tố nhiệt độ, ánh sáng thích hợp. Tuỳ thuộc vào
từng đối tượng nuôi cấy người ta có thể nhân nhanh bằng sự kích thích cụm chồi
(nhân cụm chồi), hay kích thích sự phát triển của các chồi nách, hoặc thông qua
việc tạo cây từ phôi vô tính.
Giai đoạn 3: Tạo cây hoàn chỉnh
Khi đạt kích thước nhất định các chồi được chuyển từ môi trường ở giai
đoạn 3 sang môi trường ra rễ. Thường sau 1-2 tuần, từ những chồi riêng lẻ này
sẽ xuất hiện rễ và chở thành cây hoàn chỉnh. Ở giai đoạn này người ta thường bổ
sung vào môi trường nuôi cấy các chất auxin, vì auxin là hoocmon thực vật quan
trọng có chức năng tạo rễ phụ từ mô nuôi cấy, trong nhóm này, các chất IAA,
IBA, 2,4D, NAA được sử dụng nhiều nhất, nghiên cứu nhiều nhất [16]
Giai đoạn 4: Đưa cây ra đất
Giai đoạn đưa cây hoàn chỉnh (có đủ thân, rễ, lá) từ ống nghiệm ra đất là
bước cuối cùng của quá trình nhân giống in vitro, là bước quyết định khả năng
ứng dụng quá trình này trong thực tiễn sản xuất.
Cây lấy từ ống nghiệm phải rửa sạch agar bám trên bề mặt rễ để tránh sự
xâm nhập của côn trùng và nấm mốc.
Đây là giai đoạn chuyển cây con từ trạng thái sống dị dưỡng sang sống
hoàn toàn tự dưỡng. Do đó để đảm bảo cho cây có tỷ lệ sống cao thì cần phải
đưa cây vào vườn ươm, ươm trên các giá thể từ 10-15 ngày. Lúc này rễ mới
được sinh ra, lá non bắt đầu hình thành. Sau đó, chuyển cây ra đất với chế độ
chăm sóc bình thường.
2.6.2. Một số yếu tố ảnh hưởng đến quá trình nhân giống vô tính in vitro
2.6.2.1. Ảnh hưởng của các nhân tố vật lý

* Ảnh hưởng của nhiệt độ
Nhiệt độ là yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến sự phân chia tế bào và quá
trình trao đổi chất. Trong nuôi cây in vitro, mỗi loài có biên độ nhiệt độ thích
nghi khác nhau.

Chu TuÊn Thµnh

13

MSSV: 506301072


§å ¸n tèt nghiÖp

Khoa: CNSH & MT

Nhiệt độ trong bình nuôi cấy thường cao hơn nhiệt độ ngoài bình một vài
độ và phần đáy bình thường sẽ ấm hơn so với phần nắp bình.
Nhiệt độ trung bình của bình nuôi cho nhiều loại cây thường là 25 oC
( giao động từ 17-30oC). Các cây nhiệt đới cần nhiệt độ trung bình của buồng
nuôi ở mức cao hơn khoảng 27 oC (giao động 24-32 oC).
Sự chênh lệch nhiệt độ ban ngày (khi chiếu sáng) thường được duy trì
giảm 4-8 oC so với nhiệt độ ban ngày. Ví dụ nhiệt độ ban ngày là 25 oC, ban đêm
là 20 oC, hay nhiệt độ ban ngày là 28 oC, ban đêm là 24oC. Sự chênh lệch nhiệt
độ như vậy hỗ trợ sự trao đổi khí của bình nuôi và cải thiện sự sinh trưởng của
cây nuôi cấy.
Với mỗi loài cây khác nhau có khoảng nhiệt độ thích hợp khác nhau. Ví
dụ: cây khoai tây sinh trưởng rất nhanh ở nhiệt độ ngày/đêm là 22 oC /18oC, khi
nhiệt độ ngày đêm là 27oC /22oC cây sinh trưởng chậm hẳn.
Tốc độ sinh trưởng của mẫu cấy thường giảm dần khi nhiệt độ buồng nuôi

thấp hơn nhiệt độ tối thích nhưnng giảm xuống rất nhanh khi nhiệt độ buồng
nuôi cao hơn nhiệt độ tối thích [9]
* Ảnh hưởng của ánh sáng
Quá trình nuôi cấy mô tế bào diễn ra dưới ánh sáng nhân tạo trong buồng
nuôi có nhiệt độ được kiểm soát.
Nguồn ánh sáng được sử dụng là đèn huỳnh quang. Thông thường trên giá
đặt bình nuôi cấy khoảng cách từ đèn chiếu sáng cho đến nắp bình nuôi cấy là
45-50 oC, đảm bảo sự khuếch tán ánh sáng được đều khắp.
Ánh sáng trong bình và ngoài bình khác nhau rất nhiều. Sự phân bố ánh
sáng trong bình phụ thuộc vào điện tích nắp bình, loại bình và sự sắp xếp bình
trên giá đặt bình nuôi.
Thông thường cường độ ánh sáng trong buồng nuôi thấp hơn 10 lần so với
ánh sáng tự nhiên ban ngày, dao động trong khoảng 40-140mmol/m²/s (tương
đương 3.000- 10.000 lux). Việc sử dụng cường độ chiếu sáng thấp trong nuôi

Chu TuÊn Thµnh

14

MSSV: 506301072


§å ¸n tèt nghiÖp

Khoa: CNSH & MT

cấy in vitro nhằm tiết kiệm chi phí năng lượng, giảm hiệu ứng nhà kính và do
mẫu cấy chủ yếu sống theo phương thức dị dưỡng.
Tỷ lệ quang tử của vùng ánh sáng màu đỏ/ gần đỏ và xanh/ đỏ ảnh hưởng
đến sự phát sinh hình thái. sự phát sinh hình thái xảy ra khi ánh sáng có bước

sóng thuộc vùng ánh sáng màu xanh (400- 600nm), màu đỏ (620- 680nm), gần
màu đỏ (700- 800nm) và gần màu tím (300- 400nm)
Quang chu kỳ trong buồng nuôi thường được duy trì ở chế độ 16 giờ
chiếu sáng/ngày [9]
* Ảnh hưởng của nồng độ khí CO2
Nồng độ CO2 trong bình nuôi cấy các cây có diệp lục thường giảm thấp
hơn điểm bù CO2 (50- 100mmol/mol) trong hầu hết các chế độ quang chu kỳ.
Nồng độ CO2 gia tăng trong giai đoạn tối (510mmol/mol) nhưng giảm sau
thời gian chiếu sáng (100mmol/mol) trong vài giờ, khi được đưa lại và trong tối
thì nồng độ CO2 lại gia tăng trở lại. Ngay cả trong trường hợp thay nắp đậy có
khả năng trao đổi khí, nồng độ CO2 giảm xuống còn 100-200 mmol/mol trong
thời gian có chiếu sáng. Do đó cây in vitro sống dị dưỡng. [9]
2.6.2.2. Ảnh hưởng của các yếu tố môi trường nuôi cấy
Trong nuôi cấy mô tế bào thực vật. môi trường có vai trò rất quan trọng vì
nó cung cấp chất dinh dưỡng đảm bảo cho sự sinh trưởng, phát triển của mô
nuôi cấy. Nhu cầu xinh dưỡng cho sự phát triển bình thường của mô nuôi cấy rất
khác nhau. Tuỳ thuộc vào loài, giống, thậm chí các mô được lấy từ những cơ
quan khác nhau trên cùng cơ thể thực vật cũng có nhu cầu dinh dưỡng khác
nhau [14]
Cho đến nay người ta đã tìm ra nhiều loại môi trường dinh dưỡng khác
nhau như: White (1934), Heller (1953), MS (Murashige and Skoog) (1968),
Nish (1969), Knop (1977), Anderson (1984). Trong đó môi trường MS được
nhiều tác giả công nhận là thích hợp cho nhiều loài thực vật
Các công thức môi trường có nhiều điểm khác nhau nhưng chúng thường
gồm các thành phần cơ bản sau:

Chu TuÊn Thµnh

15

MSSV: 506301072


§å ¸n tèt nghiÖp

Khoa: CNSH & MT

* Nguồn Cacbon hữu cơ
Khi nuôi cấy in vitro tế bào, mô thực vật sống chủ yếu theo phương thức
dị dưỡng. Vì vậy, cần nguồn cacbon hữu cơ và thường dùng là đường saccaroza
và với liều lượng 10-20g/l. Trong một số trường hợp đặc biệt, có thể sử dụng
nguồn đường khác như glucoza, maltoza, galactoza va lactoza. [9]
* Các nguyên tố đa lượng
Các nguyên tố khoáng chất cần thiết cho thực vật khi nồng độ lớn hơn
0,5mM/l gọi là nguyên tố đa lượng.
Các nguyên tố: N, P, K, S, Mg, Ca là cần thiết và thay đổi tuỳ theo đối
tượng nuôi cấy. Nói chung, nồng độ mỗi nguyên tố nói trên trong môi trường
lớn hơn 30g/l. Chúng là nguyên liệu để tế bào xây dựng nên thành phần cấu trúc
của mình. [9]
* Các nguyên tố vi lượng
Các nguyên tố khoáng cần thiết cho thực vật có nồng độ nhỏ hơn 0,5mM/l
gọi là nguyên tố vi lượng
Các nguyên tố vi lượng thường dùng trong môi trường nuôi cấy in vitro:
Fe, Cu, Zn, Mn, Bo, Mo, I, Co. Các nguyên tố này đóng vai trò quan trọng trong
các hoạt động của enzim. Chúng được dùng với nồng độ mỗi nguyên tố nhỏ hơn
30mg/l và tuỳ thuộc vào loại môi trường mà hàm lượng và tỷ lệ của chúng sẽ
thay đổi.
Trong đó môi trường nuôi cấy Fe thường được dung dưới dạng muối phức
(chetat): Fe- EDTA, Fe- citrate. [9]
* Các Vitamin

Mô, tế bào nuôi cấy in vitro có thể tự tổng hợp vitamin nhưng không đủ
cho hoạt động sống của chúng nên cần bổ sung thêm vitamin vào môi trường
nuôi cấy.
Đáng chú ý là các vitamin: thiamin (B1), axit nicotinic (B3), pyridoxine
(B6), riboflavin. Nồng độ thường dùng khoảng 1mg/l. Các vitamin này đóng vai
trò quan trọng trong tế bào vì chúng là các co-enzim.

Chu TuÊn Thµnh

16

MSSV: 506301072


§å ¸n tèt nghiÖp

Khoa: CNSH & MT

Myo-inositol cần được bổ sung vào một lượng khá lớn 50-100mg/l, chất
này tỏ ra có tác dụng khá rõ đến sự phân chia của tế bào. [9]
* Các chất điều tiết sinh trưởng
Các chất điều tiết sinh trưởng thực vật (phytohoocmon) là các chất hữu cơ
có bản chất hoá học rất khác nhau được tổng hợp với một lượng rất nhỏ ở các cơ
quan, bộ phận nhất định của cây và từ đấy vận chuyển đến tất cả các cơ quan,
các bộ phận khác nhau để điều tiết cho hoạt động sinh lý, các quá trính sinh
trưởng, phát triển của cây và đảm bảo mối quan hệ hài hoà giữa cơ quan, bộ
phận trong cơ thể. Vì vậy nó là thành phần quan trọng bậc nhất trong môi trường
nuôi cấy. Nhờ các chất này các nhà nghiên cứu có thể chủ động điều khiển quá
trình phát sinh hình thái thực vật in vitro. Có hai nhóm chất được sử dụng rộng
rãi là auxin và cytokynin.

- Nhóm auxin gồm một số hợp chất có chứa nhân indol trong phân tử
Auxin gây ra một loạt các biến đổi sinh trưởng của mẫu qua sự hoạt hoá phân
chia và giãn nở tế bào, kích thích các quá trình tổng hợp và trao đổi chất, tham
gia sự điều chỉnh phân hóa rễ, chồi… Trong vài trường hợp mẫu đã tạo đủ lượng
auxin nội sinh cho nhu cầu của chúng không cần bổ sung auxin ngoại sinh.
Các auxin thường có hiệu quả sinh lý ở nồng độ thấp, phạm vi sử dụng là
0,1-1,0mg/l tuỳ theo mục đích và vật liệu nuôi cấy. Các auxin được thêm vào sẽ
kết hợp với auxin nội sinh để điều khiển chiều hướng và cường độ quá trình sinh
trưởng.
Những chất thuộc nhóm auxin hay dụng: NAA (Napthalene acetic acid),
IBA (Idol acetic acid), IAA (ido acetic acid), 2,4D (2,4 Dichlophenoxy acetic
acid). Chất NAA, IAA dụng cho quá trình ra rễ ở đa số thực vật, và do IAA kém
bền nhiệt nên ít dùng. 2,4D sử dụng rất hiệu quả trong việc tạo mô sẹo (callus) ở
nhiều loại thực vật, nó không dùng trong phương pháp tái sinh cơ quan. Auxin
thường hoà tan trong etanol hoặc NaOH loãng. [11]
- Cytokinin là nhóm các chất điều hoà sinh trưởng dẫn xuất là ađênin, có
vai trò sinh lý tương tự nhau. Trong phôi, quả non và trong rễ cytokinin có hàm

Chu TuÊn Thµnh

17

MSSV: 506301072


§å ¸n tèt nghiÖp

Khoa: CNSH & MT

lượng cao nhất. Cytokinin liên quan chặt chẽ với sự phân bào, duy trì sự trẻ hoá

của các cơ quan, làm giảm hiện tượng ưu thế ngọn, kích thích sự phân hoá chồi
từ các mô sẹo nuôi cấy, gây tạo phôi vô tính, tăng cường phát sinh chồi phụ…
Vì thế trong giai đoạn đầu của của phát sinh phôi soma sự có mặt của auxin là
cần thiết những giai đoạn sau phôi phải được nuôi cấy trên môi trường có
cytokinin để biệt hoá chồi
Các cytokinin thường sử dụng trong nuôi cấy là: BAP (N6- Benzyl amino
purin), kinetin (6- Furfurry amino purin) với nồng độ biến đổi từ 1-2mg/l thích
hợp cho nhiều loại mô nuôi cấy. Các mức độ thấp hơn của cytokinin biểu hiện
hiệu quả kích thích kém, dẫn đến sự tạo chồi và sinh trưởng của chồi giảm. Hàm
lượng cytokinin cao sẽ hoạt hoá hình thành chồi bất định, chồi nhiều nhưng có
kích thước nhỏ, để kéo dài chồi phải chuyển chúng sang môi trường có nồng độ
cytokinin thấp hơn và có thể bổ sung thêm cả GA3 (Gibbebrellic acid). Ngoài ra
nồng độ cao của cytokinin có thể kìm hãm sự hình thành và phát triển của rễ.
[11] [15]
- Ngoài ra trong nuôi cấy mô, tế bào thực vật người ta còn sử dụng một số
chất điều hoà sinh trưởng khác như GA (Gibberellin acid), ABA (Abxixic acid)
…
Đặc điểm cơ bản của các GA là kích thích kéo dài dóng, đốt và sự sinh
trưởng của cây. Phản ứng kéo dài thân chủ yếu do sự tăng trưởng của tế bào, bên
cạnh đó mầm của hạt mà bản chất là hoạt hoá các quá trình tổng hợp enzim thuỷ
phân tinh bột. So với auxin và cytokinin thì GA là nhóm ít dùng vì có biểu hiện
ức chế sinh trưởng và phát sinh hình thái thực vật in vitro, đặc biệt với mô tế bào
một lá mầm GA được đưa vào môi trường trong trường hợp cần thiết để kéo dài
chồi bất định hoặc kích thích tái sinh chồi ở một số loài thực vật. [15]
Trong nuôi cấy mô tế bào, ABA có tác dụng tạo phôi vô tính, kích thích
sự chín của phôi, kích thích sự phát sinh chồi ở nhiều loài thực vật. Các tác dụng
cơ bản của ABA: Tham gia vào sự rụng lá, hoa, quả ở hầu hết các cây trồng và
gây ra sự nứt quả. ABA cần được sản sinh khi các yếu tố ức chế cây trồng như

Chu TuÊn Thµnh

18

MSSV: 506301072


§å ¸n tèt nghiÖp

Khoa: CNSH & MT

mất nước và nhiệt độ thấp đóng băng. Tham gia vào sự ngủ nghỉ, kéo dài thời
gian ngủ nghỉ và làm chậm sự nảy mầm của hạt. Ức chế sự kéo dài thân và được
sử dụng để kiểm soát sự kéo dài cành, gây ra sự đóng khí khổng. Vì vậy ABA
được sử dụng nhằm kìm hãm sinh trưởng của chồi hoặc tham gia bảo quản
lương thực và quỹ gen in vitro. Trong nuôi cấy phôi, thêm ABA vào môi trường
là rất cần thiết do ABA giúp phôi chống lại sự khô hoá. Ngoài ra, ABA còn kích
thích sự dữ trữ lipit, protein và và cacbonhydrat cần thiết cho phôi nảy mầm.
[11]
* Các hợp chất tự nhiên
Là thành phần được sử dụng nhưng không phải là thành phần bắt buộc.
Chúng làm tăng thành phần dinh dưỡng và chất có hoạt tính sinh lý cho môi
trường nên kích thích sự sinh trưởng và phân hoá của mẫu cây. Thường bao
gồm:
- Nước dừa: Thường chứa các axit amin, axit hữu cơ, đường, ARN, AND.
Đặc biệt trong nước dừa có chứa những hợp chất quan trọng cho nuôi cấy in
vitro đó là: myoinositol, các hợp chất có hoạt tính auxin, các glucosit của
cytokinin.
Dịch nghiền của một số rau, quả tươi (khoai tây, cà rốt, chuối, táo…).
Thành phần hoá học có: đường, axit nucleic, axit amin, vitamin, khoáng…
Dịch thuỷ phân casein (casein hydrolysat) hay peptone chủ yếu được sử

dụng làm nguồn bổ sung axit amin
Bột chuối khô hoặc bột nghiền từ chuối xanh được sử dụng trong nuôi cấy
mô một số cây trồng như: phong lan…[9]
* Chất làm đông cứng môi trường- Agar
Agar là một loại polysaccarit của táo. Ở 80 oC thạch ngậm nước chuyển
sang trạng thái sol, còn ở 40oC thì trở về trạng thái gel. Khả năng ngậm nước
của thạch khá cao: 6- 12g/l nước. Thạch ở dạng gel nhưng vẫn để cho các ion
vận chuyển dễ dàng và có độ thoáng khí cao. Nồng độ trung bình 6-8g/l
* Độ pH của môi trường

Chu TuÊn Thµnh

19

MSSV: 506301072


§å ¸n tèt nghiÖp

Khoa: CNSH & MT

pH môi trường nuôi cấy thích hợp cho đa số loại cây dao động từ 5,5-6,0
Trường hợp pH thấp thạch có thể không đông sau khi khử trùng, môi
trường pH cao làm cứng môi trường
Khi pH<4 và pH>7 sẽ làm kết tủa một số muối vô cơ và phân giải một số
chất hữu cơ dẫn đến làm chết mẫu cấy. [9]

Chu TuÊn Thµnh

20

MSSV: 506301072


§å ¸n tèt nghiÖp

Khoa: CNSH & MT

PHẦN III: VẬT LIỆU, NỘI DUNG, PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN
CỨU
3.1. Đối tượng, vật liệu, địa điểm và thời gian nghiên cứu
3.1.1. Đối tượng nghiên cứu
Đối tượng nghiên cứu là cây hoa Cát tường (Eustoma grantdiflorum
(Raf.)
3.1.2. Vật liệu nghiên cứu
Vật liệu vào mẫu ban đầu là chồi, lá của cây hoa Cát tường
3.1.3. Địa điểm nghiên cứu
Các thí nghiệm thuộc giai đoạn in vitro được tiến hành tại phòng nuôi cấy
mô trong điều kiện nhân tạo chủ động điều chỉnh ánh sáng, nhiệt độ, độ ẩm
Các thí nghiệm thuộc giai đoạn in vivo được tiến hành tại khu vườn thí
nghiệm có mái che, thoáng mát, chế độ tưới sương mù của Viện Di truyền Nông
nghiệp
3.1.4. Thời gian nghiên cứu
Đề tài được thực hiện trong khoảng thời gian 12/01/2010 -> 16/05/2010
3.2. Nội dung, phương pháp nghiên cứu
Môi trường sử dụng trong thí nghiệm là môi trường MS (MurashigeSkoog, 1962) có bổ sung 3% saccarose+ 6,8 g/l agar+ 100 mg/l Inositol và các
chất điều khiển sinh trưởng thực vật theo yêu cầu của mỗi thí nghiệm
Thí nghiệm được bố trí ngẫu nhiên và nhắc lại 3 lần
- Giai đoạn 1: Giai đoạn tạo nguồn mẫu ban đầu
Thí nghiệm 1: Ảnh hưởng của chất khử trùng và thời gian khử trùng đến tỷ lệ

sống của mẫu
Các chồi, lá của cây hoa cát tường được rửa sạch bằng nước thường rồi
ngâm trong nước xà phòng lắc kỹ trong 2-3phút. Sau đó rửa dưới vòi nước cho
hết xà phòng rồi tráng lại bằng nước cất cho vào bình tam giác rồi đưa vào
buồng cấy vô trùng. Tại đây mẫu được rửa bằng nước cất đã khử trùng (2-3 lần)

Chu TuÊn Thµnh

21

MSSV: 506301072


§å ¸n tèt nghiÖp

Khoa: CNSH & MT

được khử trùng sơ bộ bằng cồn 70% trong 30 giây, việc này còn làm tăng khả
năng tiếp xúc giữa tế bào và hóa chất khử trùng. Sau khi loại bỏ nước trong bình
tam giác chứa mẫu ta khử trùng bằng HgCl 2 theo công thức thí nghiệm (bảng
3.1). Lấy mẫu ra khỏi dung dịch khử trùng, tráng 3-5 lần bằng nước cất (đã khử
trùng) rồi cấy vào môi trường.
Bảng 3.1: Nghiên cứu các phương pháp khử trùng mẫu
Chất khử
trùng

Công thức

Nồng độ

Thời gian khử trùng

(%)

(phút)

HgCl2
CT1
0,1
3
HgCl2
CT2
0,1
5
HgCl2
CT3
0,1
7
HgCl2
CT4
0,1
10
HgCl2
CT5
0,1
15
Các mẫu sau khi khử trùng được cấy vào môi trường:

Số mẫu
đưa

vào
30
30
30
30
30

MS+ 3% đường+ 6,8g/l agar+ 100mg/l Inositol (Công thức đối chứng)
- Giai đoạn 2: Giai đoạn tái sinh và nhân nhanh
Ảnh hưởng của phytohoocmon lên khả năng tái sinh và nhân nhanh chồi
Thí nghiệm 2: Ảnh hưởng của nồng độ BAP tới tái sinh và nhân nhanh chồi
Bảng 3.2: Ảnh hưởng của BAP đến tái sinh và nhân nhanh chồi của cây hoa
Cát tường
Công thức
Nồng độ BAP (mg/l)
Số mẫu cấy
CT1
0
90
CT2
0,3
90
CT3
0,5
90
CT4
0,7
90
CT5
1,0

90
Môi trường cơ bản: MS+ 3% đường+ 6,8g/l agar+ 100mg/l Inositol
Thí nghiệm 3: Ảnh hưởng của nồng độ kinetin tới tái sinh và nhân nhanh chồi
Bảng 3.3: Ảnh hưởng của Kinetin đến tái sinh và nhân nhanh chồi của cây
hoa Cát tường

Chu TuÊn Thµnh

22

MSSV: 506301072


§å ¸n tèt nghiÖp

Khoa: CNSH & MT

Công thức

Nồng độ Kinetin (mg/l)

Số mẫu cấy

CT1

0

90

CT2

0,3

90

CT3

0,5

90

CT4

0,7

90

CT5
1,0
90
Môi trường cơ bản: MS+ 3% đường+ 6,8g/l agar+ 100mg/l Inositol
Thí nghiệm 4: Ảnh hưởng của tổ hợp BAP và NAA tới sự tái sinh và nhân
nhanh chồi
Bảng 3.4: Ảnh hưởng của tổ hợp BAP và NAA tới sự tái sinh và nhân
nhanh chồi của cây hoa Cát tường
Công thức

Nồng độ BAP

Nồng độ NAA

Số mẫu cấy

(mg/l)
(mg/l
CT1
0,5
0,1
90
CT2
0,5
0,2
90
CT3
0,5
0,3
90
CT4
0,5
0,4
90
CT5
0,5
0.5
90
Môi trường cơ bản: MS+ 3% đường+ 6,8g/l agar+ 100mg/l Inositol
- Giai đoạn 3: Ra rễ tạo cây hoàn chỉnh

Thí nghiệm 5: Ảnh hưởng của NAA đến khả năng ra rễ và tạo cây hoàn chỉnh
Bảng 3.5: Ảnh hưởng của α-NAA đến khả năng ra rễ và tạo cây hoàn chỉnh

Công thức
CT1
CT2
CT3
CT4

Chu TuÊn Thµnh

Nồng độ α-NAA (mg/l)
0,1
0,2
0,3
0,4

23

Số mẫu cấy
60
60
60
60

MSSV: 506301072


§å ¸n tèt nghiÖp

Khoa: CNSH & MT

Môi trường cơ bản: MS+ 3% đường+ 6,8g/l agar+ 100mg/l Inositol

Thí nghiệm 6: Ảnh hưởng của IBA đến khả năng ra rễ và tạo cây hoàn chỉnh
Bảng 3.6: Ảnh hưởng của tổ hợp α-NAA và IBA tới quá trình ra rễ
Công thức

Nồng độ IBA

Nồng độ α-NAA

Số mẫu cấy

(mg/l)
(mg/l)
CT1
0,05
0,3
60
CT2
0,10
0,3
60
CT3
0,15
0,3
60
CT4
0,20
0,3
60
Môi trường cơ bản: MS+ 3% đường+ 6,8g/l agar+ 100mg/l Inositol
- Giai đoạn 4: Giai đoạn vườn ươm

Thí nghiệm 7: Ảnh hưởng của giá thể đến tỷ lệ sống của cây in vitro
Bảng 3.7: Ảnh hưởng của các loại giá thể đến khả năng sinh trưởng, tỷ lệ
sống của cây hoa Cát tường
Giá thể
GT1
GT2
GT3
GT4

Thành phần
Cát
Trấu hun
Mùn xơ dừa
Cát + trấu hun (1:1)

Số cây đưa ra trồng
90
90
90
90

3.3. Điều kiện thí nghiệm
Quá trình nuôi cấy ở điều kiện ánh sáng nhân tạo có:
+ Cường độ chiếu sáng: 2000- 3000 lux
+ Thời gian chiếu sáng: 10 h/ngày
+ Nhiệt độ phòng nuôi cấy luôn ổn định từ 24 – 27 oC
+ Ẩm độ trong phòng nuôi cấy: 60 – 70 %

3.4. Các chỉ tiêu theo dõi
* Thí nghiệm in vitro

Chu TuÊn Thµnh

24

MSSV: 506301072


§å ¸n tèt nghiÖp

Khoa: CNSH & MT

Đánh giá kết quả của các thí nghiệm in vitro được theo dõi qua các chỉ
tiêu:
Tổng số mẫu nhiễm
Tỷ lệ mẫu nhiễm (%) =

x100

Tổng số mẫu khử trùng
Tổng số mẫu sống

Tỷ lệ mẫu sống (%) =

Tỷ lễ mẫu chết (%) =

Hệ số nhân =

Chiều cao TB của chồi(cm) =

Tỷ lệ ra rễ (%) =

Chiều dài TB rễ dài nhất(cm) =

x100

Tổng số mẫu sống
Tổng số mẫu chết

x100

Tổng số mẫu sạch
Tổng số chồi tạo thành

x100

Tổng số chồi nuôi cấy
Chiều cao chồi

x100

Tổng số chồi theo dõi
Tổng số rễ

x100

Tổng số chồi ra rễ
Tổng chiều dài rễ dài nhất
Tổng số rễ dài nhất

x100

* Thí nghiệm ngoài vườn ươm
Để đánh giá kết quả ngoài vườn ươm được theo dõi theo chỉ tiêu sau:
Tổng số cây sống
Tỷ lệ sống (%) =

x100
Tổng số cây đưa ra giá thể

Chu TuÊn Thµnh

25

MSSV: 506301072