Nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình thu nhận chế phẩm invertase từ nấm men bia

I HC THI NGUYấN
TRNG I HC NễNG LM

DNG TH HUYN

Tờn ti:

NGHIÊN CứU CáC YếU Tố ảNH HƯởNG ĐếN QUá TRìNH
THU NHậN CHế PHẩM INVERTASE Từ NấM MEN BIA

KHóA LUậN TốT NGHIệP ĐạI HọC

H o to

: Chớnh quy

Chuyờn ngnh

: Cụng ngh Thc phm

Lp

: K42 - CNTP

Khoa

: CNSH - CNTP

Khúa hc

: 2010-2014

Ging viờn hng dn : ThS. Nguyn Hu Ngh
Ging viờn khoa CNSH - CNTP - i hc Nụng Lõm Thỏi Nguyờn

Thỏi Nguyờn, 2014


LỜI CẢM ƠN
Trong thời gian thực hiện đề tài em đã nhận được sự tạo điều kiện, quan
tâm giúp đỡ của các thầy cô giáo, bạn bè và gia đình. Em đã hoàn thành khóa
luận tốt nghiệp của mình tại phòng thí nghiệm Vi sinh khoa Công nghệ Sinh
học & Công nghệ Thực phẩm - trường Đại học Nông lâm Thái Nguyên.
Em xin gửi lời cảm ơn chân thành và sâu sắc nhất tới Ths. Nguyễn Hữu Nghị,
giảng viên khoa Công nghệ Sinh học & Công nghệ Thực phẩm, trường Đại học
Nông lâm Thái Nguyên đã tận tình giúp đỡ và hướng dẫn giúp em hoàn thành tốt
khóa luận tốt nghiệp đại học này.
Em cũng xin cảm ơn các cô, chú, anh, chị đang làm việc tại công ty bia
VICOBA - Thái Nguyên, các thầy cô đang làm việc tại Viện Khoa học sự sống đã
tạo điều kiện giúp đỡ em trong quá trình em thực hiện đề tài tốt nghiệp.
Em xin gửi lời cảm ơn đến toàn thể các thầy cô trong khoa Công nghệ
Sinh học & Công nghệ Thực phẩm đã giảng dạy và chỉ bảo cho em rất nhiều
trong quá trình học tập và thực hiện đề tài này.
Cuối cùng em xin gửi lời cảm ơn đến bố, mẹ, gia đình và bạn bè đã động
viên, giúp đỡ giành thời gian cho em để có thể hoàn thành khóa luận tốt
nghiệp trên.
Do trình độ và điều kiện thời gian thực hiện đề tài có hạn nên đề tài
không tránh khỏi những sai sót. Em rất mong nhận được sự góp ý của các
thầy cô và các bạn để đề tài hoàn thiện hơn.
Em xin chân thành cảm ơn!

Thái nguyên, ngày 06 tháng 06 năm 2014
Sinh viên thực hiện đề tài

Dương Thị Huyền


DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 2.1 Một số enzyme quan trọng trong nấm men ..................................... 15
Bảng 4.1. Kết quả hoạt tình enzyme thu được theo thiết kế Box- Behnken
(BBD), 3 cấp độ, 4 nhân tố , 3 điểm trung tâm, 27 thí nghiệm ............ 34
Bảng 4.2. Kết quả phân tích ANOVA cho mô hình hoạt tính enzyme........... 35
Bảng 4.3. Bảng điều kiện của các nhân tố để thu được hoạt tính enzyme cao
nhất ....................................................................................................... 37


DANH MỤC CÁC HÌNH
Hình 2.1. Cấu tạo mặt cắt của vi khuẩn gram âm và gram dương có chứa
periplasmic ................................................................................................ 5
Hình 2.2. Cấu tạo tế bào nấm men ................................................................... 8
Hình 4.1. Ảnh hưởng của tỷ lệ nấm men và dung môi trong quá trình tự phân
đến hoạt tính enzyme .............................................................................. 29
Hình 4.2. Ảnh hưởng của nhiệt độ tự phân đến hoạt tính enzyme ................. 30
Hình 4.3. Ảnh hưởng của pH ban đầu của mẫu nấm men tự phân đến hoạt tính
enzyme .................................................................................................... 31
Hình 4.4. Ảnh hưởng của thời gian tự phân đến hoạt tính chế phẩm enzyme
thu nhận từ nấm men bia ......................................................................... 33
Hình 4.5. Hình ảnh 3D ảnh hưởng của nhiệt độ và tỷ lệ nấm men/ dung môi
đến hoạt tính enzyme invertase thu được trong dịch tự phân ................. 39
Hình 4.6. Hình ảnh 3D ảnh hưởng của thời gian và nhiệt độ đến hoạt tính
enzyme invertase thu được trong dịch tự phân ....................................... 39

Hình 4.7. Hình ảnh 3D ảnh hưởng của pH và tỷ lệ nấm men/ dung môi đến
hoạt tính enzyme invertase thu được trong dịch tự phân ........................ 40
Hình 4.8. Hình ảnh 3D ảnh hưởng của pH và nhiệt độ đến hoạt tính enzyme
invertase thu được trong dịch tự phân..................................................... 40
Hình 4.9. Hình ảnh 3D ảnh hưởng của thời gian và tỷ lệ nấm men/ dung môi
đến hoạt tính enzyme invartse thu được trong dịch tự phân ................... 41
Hình 4.10. Hình ảnh 3D ảnh hưởng của thời gian và pH đến hoạt tính enzyme
invertase thu được trong dịch tự phân..................................................... 41


DANH MỤC CÁC TỪ, CÁC CỤM TỪ VIẾT TẮT
RNA

: Ribonucleic acid

GT

: Giá trị

BBD

: Box- Behnken

ĐVHT

: Đơn vị hoạt tính


MỤC LỤC
PHẦN 1: MỞ ĐẦU....................................................................................................1

1.1. Đặt vấn đề .........................................................................................................1
1.2. Mục đích và yêu cầu .........................................................................................2
1.2.1. Mục đích ........................................................................................................2
1.2.1. Yêu cầu ..........................................................................................................2
1.3. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài .........................................................2
1.3.1. Ý nghĩa khoa học ...........................................................................................2
1.3.2. Ý nghĩa thực tiễn ...........................................................................................2
PHẦN 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU.........................................................................3
2.1. Khái quát về enzyme ........................................................................................3
2.1.1. Khái niệm ......................................................................................................3
2.1.2. Các đơn vị hoạt độ enzyme ...........................................................................3
2.1.3. Khu trú của enzyme .......................................................................................4
2.1.4. Nguồn nguyên liệu thu enzyme .....................................................................5
2.2. Giới thiệu chung về nấm men ..........................................................................6
2.2.1. Thành phần hóa học, hình dạng và kích thước nấm men ..............................6
2.2.2. Cấu tạo tế bào nấm men ................................................................................7
2.2.3. Nguồn thức ăn chủ yếu cho nấm men .........................................................11
2.2.4. Sự hấp phụ chất dinh dưỡng của tế bào nấm men. ......................................11
2.3. Nấm men trong công nghệ sản xuất bia .........................................................12
2.3.1. Nấm men chìm và nấm men nổi. .................................................................12
2.3.2. Quá trình lên men đường tạo rượu ethylic và CO2 ......................................13
2.3.3. Các hướng tận dụng nấm men bia. ..............................................................14
2.3.4. Các enzyme thủy phân glucid đơn giản chính trong tế bào nấm men ........15
2.4. Khái quát về enzyme invertase .......................................................................15
2.4.1. Enzyme invertase.........................................................................................15
2.4.2. Qúa trình chuyển hóa đường sucrose thành đường nghịch đảo ..................16
2.4.3. Invertase trong tế bào nấm men ..................................................................17
2.4.4. Thu nhận chế phẩm enzyme invertase thô từ nấm men bằng phương pháp
tự phân. ..................................................................................................................18
2.4.5. Ứng dụng của invertase trong công nghệ thực phẩm ..................................19

2.5. Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước ....................................................20


2.5.1. Tình hình nghiên cứu trong nước ................................................................20
2.5.2. Tình hình nghiên cứu trên thế giới ..............................................................20
Phần 3: ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ......22
3.1. Đối tượng, phạm vi nghiên cứu ......................................................................22
3.1.1. Đối tượng nghiên cứu ..................................................................................22
3.1.2. Phạm vi nghiên cứu .....................................................................................22
3.2. Địa điểm và thời gian tiến hành nghiên cứu...................................................22
3.3. Hoá chất, thiết bị và môi trường sử dụng .......................................................22
3.3.1. Hoá chất .......................................................................................................22
3.3.2. Dụng cụ và thiết bị ......................................................................................23
3.4. Nội dung nghiên cứu ......................................................................................23
3.5. Phương pháp nghiên cứu ................................................................................23
3.5.1. Phương pháp thu nhận sinh khối nấm men và chế phẩm invertase ............23
3.5.2. Phương pháp bố trí thí nghiệm ....................................................................24
3.5.3. Phương pháp phân tích ................................................................................25
3.6. Phương pháp xử lý số liệu ..............................................................................27
PHẦN 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ................................................................28
4.1. Ảnh hưởng của tỷ lệ nấm men và dung môi trong quá trình tự phân nấm men
bia (w/w) ................................................................................................................28
4.2. Ảnh hưởng của nhiệt độ tự phân nấm men bia ..............................................29
4.3. Ảnh hưởng của pH ban đầu của mẫu nấm men trong quá trình tự phân ..............31
4.4. Ảnh hưởng của thời gian tự phân nấm men bia đến hoạt tính enzyme ..........32
4.5. Tối ưu hóa các điều kiện tự phân bã nấm men bia để thu nhận chế phẩm
invertase bằng phương pháp bề mặt chỉ tiêu (4 nhân tố) ......................................34
4.5.1. Xây dựng mô hình hoạt tính enzyme ..........................................................35
4.5.2. Tối ưu hóa điều kiện tự phân thu nhận chế phẩm enzyme. .........................37
PHẦN 5: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ................................................................42

5.1 Kết luận ...........................................................................................................42
5.2. Kiến nghị ........................................................................................................42
TÀI LIỆU THAM KHẢO ......................................................................................44


1

PHẦN 1
MỞ ĐẦU
1.1. Đặt vấn đề
Nấm men là một nhóm vi sinh vật đơn bào được con người sử dụng từ
hàng nghìn năm nay để sản xuất đồ uống có cồn (rượu, bia,…), bánh mì và
nhiều ứng dụng khác. Nấm men sinh sôi nhanh, tế bào có chứa hàm lượng
protein cao, nhiều vitamin, và các acid amin không thay thế…
Trong công nghệ sản xuất bia, nấm men sau mỗi mẻ lên men sẽ tăng
lên về sinh khối một cách đáng kể, người ta chỉ thu hồi và sử dụng một
phần men để tiếp cho mẻ sau, phần còn lại thường ở dạng lỏng hoặc sệt sẽ
được thải ra ngoài môi trường.
Lượng nấm men thải ra ngoài môi trường này có chứa một lượng lớn tế bào
nấm men, khi phân hủy sẽ gây ảnh hưởng đến môi trường sinh thái. Việc thu hồi và
tận dụng lượng nấm men này không những có ý nghĩa lớn về mặt kinh tế mà còn
giải quyết được vấn đề môi trường, một vấn đề mang tính chất bền vững.
Hiện nay, nấm men bia thường được sử dụng để sản xuất bột chiết nấm
men, dịch chiết nấm men, hoặc làm thức ăn gia súc…Sản xuất chế phẩm
invertase từ men bia là một hướng nghiên cứu mới tại Việt Nam [5].
Nấm men bia thuộc loài Saccharomyces carlsbergensis có hoạt tính
enzyme invertase. Enzyme này thường tập trung chủ yếu trong lớp không
gian chu chất của tế bào nấm men, khoảng không gian giữa thành tế bào và
màng nguyên sinh chất [22]. Nấm men thu được sau quá trình lên men bia có
đặc điểm là rất dễ bị tự phân. Lúc này vách tế bào không còn khả năng tự bảo

vệ và sẽ bị phá hủy bởi chính các enzyme trong tế bào. Chúng xúc tác phản
ứng phân giải các chất có trong thành tế bào nấm men và giải phóng enzyme
invertase ra ngoài tế bào.
Enzyme invertase (E. C. 3.2.1.26) thường được sử dụng để thủy phân
đường sucrose tạo thành hỗn hợp đường glucose và fructose [18] (đường
nghịch đảo) . Dung dịch đường nghịch đảo có độ ngọt cao hơn và ít bị hiện


2

tượng kết tinh đường hơn so với đường sucrose nên được sử dụng trong công
nghệ sản xuất kẹo, nước giải khát…
Việc nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng và tìm ra các điều kiện tối ưu cho
quá trình thu nhận chế phẩm invertase từ nấm men bia có ý nghĩa khoa học và
thực tiễn. Vì vậy tôi tiến hành đề tài: “Nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng đến
quá trình thu nhận chế phẩm invertase từ nấm men bia”.
1.2. Mục đích và yêu cầu
1.2.1. Mục đích
Nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình thu nhận chế phẩm
invertase từ nấm men bia.
1.2.1. Yêu cầu
- Nghiên cứu ảnh hưởng của tỷ lệ nấm men và dung môi trong quá trình
tự phân nấm men bia.
- Nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ tự phân nấm men bia.
- Nghiên cứu ảnh hưởng của pH ban đầu của mẫu nấm men trong quá
trình tự phân nấm men bia.
- Nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian tự phân nấm men bia.
- Tối ưu hóa điều kiện tự phân nấm men bia để thu nhận chế phẩm
invertase
1.3. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài

1.3.1. Ý nghĩa khoa học
Thực hiện đề tài giúp sinh viên bổ sung kiến thức thực tiễn quan trọng
cho lý thuyết đã học, có thêm kinh nghiệm và tiếp cận với công tác nghiên
cứu khoa học để phục vụ cho nghiên cứu và công tác sau này.
1.3.2. Ý nghĩa thực tiễn
Kết quả thu được của đề tài là cơ sở cho các nghiên cứu tiếp theo để có
thể tối ưu hóa các điều kiện thu nhận chế phẩm invertase từ nấm men bia
cũng như các chủng nấm men khác. Từ đó xây dựng quy trình công nghệ với
hiệu suất thu hồi enzyme hiệu quả nhất.


3

PHẦN 2
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1. Khái quát về enzyme
2.1.1. Khái niệm
Enzyme là chất xúc tác sinh học, có bản chất protein, hòa tan trong nước
và trong dung dịch muối loãng. Enzyme có phân tử lượng lớn từ 20.000 đến
1.000.000 dalton nên không qua được màng bán thấm. [8]
Enzyme có nhiều tính chất ưu việt hơn hẳn các chất xúc tác hóa học.
Enzyme có cường lực xúc tác rất lớn: ở điều kiện thích hợp hầu hết các
phản ứng có xúc tác enzyme xảy ra với vận tốc nhanh gấp 108 - 1011 lần so
với phản ứng không có chất xúc tác.
Enzyme có tính đặc hiệu cao: mỗi enzyme chỉ xúc tác làm chuyển hóa
được một hoặc một số cơ chất nhất định theo một kiểu phản ứng nhất định. Sự
tác dụng có tính chất lựa chọn này gọi là tính đặc hiệu của enzyme. Enzyme
có tính đặc hiệu cao nên không tạo ra những sản phẩm phụ.
Enzyme tác dụng trong điều kiện “êm dịu” . Enzyme thường tác dụng
thích hợp ở nhiệt độ 30 - 50oC, pH trung tính và ở áp suất thường, không cần

nồng độ acid hay nồng độ kiềm mạnh, áp suất cao, do đó không đòi hỏi các
thiết bị chịu acid, kiềm và chịu áp suất cao đắt tiền.
Tất cả các enzyme có nguồn gốc tự nhiên đều không độc. Điều này có ý
nghĩa quan trọng trong công nghệ thực phẩm và y học.
Các chế phẩm enzyme được sản xuất từ nguồn nguyên liệu dễ kiếm, rẻ tiền.
2.1.2. Các đơn vị hoạt độ enzyme
Đơn vị hoạt độ của một enzyme được coi là lượng enzyme có khả năng
xúc tác làm chuyển hóa được một lượng cơ chất nhất định trong một đơn vị
thời gian nhất định ở điều kiện tiêu chuẩn. [8]


4

Theo quy ước quốc tế có một số đơn vị hoạt độ sau:
Đơn vị IU (đơn vị quốc tế)
Là lượng enzyme có khả năng xúc tác chuyển hóa một micromol cơ chất
sau thời gian một phút ở điều kiện tiêu chuẩn.
1 IU = 1µM cơ chất (10-6 M/phút)
Đơn vị katal(kat)
Là lượng enzyme có khả năng xúc tác chuyển hóa một mol cơ chất sau
thời gian một giây ở điều kiện tiêu chuẩn.
1 kat = 1 Mol cơ chất /giây
Hoạt độ riêng
Hoạt độ riêng của một chế phẩm enzyme được biểu diễn bằng số đơn vị
hoạt độ enzyme trên đơn vị khối lượng protein.
IU / 1 mg (ml) protein hoặc kat / 1 mg (ml) protein
Hoạt độ phân tử (hoặc hoạt độ riêng phân tử)
Được biểu diễn bằng số phân tử cơ chất được chuyển hóa bởi một phân
tử enzyme sau một đơn vị thời gian (thường là phút).
Hoạt độ tâm xúc tác

Là số phân tử cơ chất bị chuyển hóa bởi một trung tâm hoạt động sau
một phút.
2.1.3. Khu trú của enzyme
Dựa vào vị trí khu trú của enzyme trong tế bào, người ta chia làm ba
nhóm chính [8]:
Enzyme ngoại bào: enzyme được sinh tổng hợp ra ở trong tế bào rồi sau
đó mới được tiết ra ngoài môi trường trong quá trình nuôi cấy chìm. Đó là
trường hợp các enzyme hydrolase.


5

Enzyme nội bào: enzyme được tổng hợp và sử dụng ở bên trong tế bào
Các enzyme periplasmic (là những enzyme nằm ở xoang ngoài màng
sinh chất nhưng trong màng tế bào).

(Nguồn: Lecture 3- cell structure and Function)[29]
Hình 2.1. Cấu tạo mặt cắt của vi khuẩn gram âm và gram dương có chứa
periplasmic
2.1.4. Nguồn nguyên liệu thu enzyme
Enzyme là những chất không thể điều chế được bằng phương pháp tổng
hợp hóa học, mà người ta thường thu nhận chúng từ nguồn tế bào động vật,
thực vật hoặc vi sinh vật [8].
Enzyme động vật
Một số mô động vật chứa nhiều enzyme: tụy tạng (amylase, maltase,
lipase, cholesterol esterase, pectinase, nuclease, trypsin,…), dạ dày (pepsin A,
B,…), ruột (kinase, lactase, maltase, nuclease, phosphatse…), gan, tuyến
nước bọt (amylase, kalicrein…), huyết thanh,…
Enzyme thực vật
Từ thực vật có thể thu được một số enzyme thủy phân như: papain từ nhựa

đu đủ; bromelin từ thân, lá và vỏ dứa, các α, β- amylase có trong malt đại mạch và
malt thóc; urease có trong giá đậu tương; lipase mầm hạt thầu dầu,…


6

Enzyme vi sinh vật
Nguồn enzyme vi sinh vật rất phong phú, từ vô số loài vi sinh vật, người
ta có thể thu được nhiều loại enzyme khác nhau, trong đó có những enzyme
mà cơ thể động vật và thực vật không thể tổng hợp được.
Hệ enzyme vi sinh vật có khả năng thay đổi bằng cách thay đổi điều kiện
nuôi cấy và dùng các tác nhân điều chỉnh, từ một loài vi sinh vật có khả năng
tổng hợp mạnh một hoặc một số loại enzyme nào đó theo ý muốn.
Vi sinh vật có khả năng sinh sản, phát triển và sinh tổng hợp enzyme với
vận tốc cực kỳ lớn, do đó cho phép thu được một lượng enzyme trong thời
gian ngắn một cách dễ dàng.
Enzyme vi sinh vật có hoạt tính rất mạnh, vượt xa enzyme từ các
nguồn khác.
Enzyme vi khuẩn: α - amylase (Bacillus), Asparaginase (Escherichia
coli), β- amylase (Bacillus), Glucose isomerase (Bacillus, Steptomyces),
Protease (Bacillus),...
Enzyme nấm sợi: α - amylase (Aspergillus), glucoamylase (Aspergillus,
Rhizopus), Cellulase (Trichoderma), Dextranase (Penicillium), Protease
(Aspergillus), Lipase (Rhizopus,...
Enzyme nấm men: invertase (Saccharomyces), lactase (Kluyveromyces),
Lipase (Candida), Raffinase (Saccharomyces),..
2.2. Giới thiệu chung về nấm men
2.2.1. Thành phần hóa học, hình dạng và kích thước nấm men
Nấm men là loài vi sinh vật đơn bào, có khả năng sống trong môi trường
dinh dưỡng có chứa đường, nitơ, photpho và các chất hữu cơ, vô cơ khác.

Chúng là các vi sinh vật dị dưỡng có khả năng sống trong cả điều kiện hiếu
khí và yếm khí.
Tế bào nấm men có chứa 80% là nước. Bởi vậy, trong nấm men bia ép tỉ
lệ giữa trọng lượng ướt và trọng lượng khô là 4:1. Nguyên tố chủ yếu là
cacbon chiếm < 50% chất khô. Các nguyên tố chính khác như oxy (30 - 35%),
nitơ (75%), hydro (5%), và photpho (1%). Hàm lượng chất khoáng tổng số
khoảng 5 - 10% chất khô của tế bào. Trong tế bào còn bao gồm rất nhiều
thành phần khác như: nhôm, sắt, chì, natri, lưu huỳnh, magie…[2]


7

Các nhóm thành phần chính gồm các chất cao phân tử, đó là các protein (40
đến 45% chất khô), cacbonhydrat (30 - 35%), axit nucleic (6 - 8%) và lipit (4 - 5%).
Thành phần chính xác của các nhóm chất cao phân tử trong mỗi chủng
nấm men khác nhau do điều kiện nuôi cấy, pha phát triển.
Nấm men có nhiều hình dáng khác nhau: hình cầu, hình trứng hoặc hình
ovan. Sự khác nhau về hình dáng cho phép phân biệt và phân loại nấm men.
Kích thước tế bào nấm men cũng rất khác nhau thường là (2,5 - 4,5µm) ×
(10,5 - 20µm), thể tích tế bào chiếm khoảng 50 - 500µm3. Môi trường sống
cũng ảnh hưởng rất lớn đến hình dáng và kích thước tế bào. Vì vậy, khi xác
định giống, loài cũng như hình dáng và kích thước nấm men người ta phải
nuôi cấy trên một môi trường ổn định, ở nhiệt độ từ 28 - 30oC. Ngoài ra, kích
thước nấm men còn phụ thuộc vào tuổi hay thời kì phát triển của tế bào, càng
trẻ tế bào có kích thước càng bé so với các tế bào thế hệ.
2.2.2. Cấu tạo tế bào nấm men
Các tế bào nấm men có cấu tạo tương đối phức tạp, các tế bào nấm men
khác nhau thì có cấu tạo và thành phần hóa học khác nhau.
Nhìn chung nấm men đều được cấu tạo gồm: thành tế bào, không gian
chu chất, màng nguyên sinh chất (màng tế bào chất), tế bào chất (nguyên sinh

chất), ti thể, nhân tế bào, không bào, thể Golgi, Riboxom, hạt lipit, bầu mô
(chồi), gluxit dự trữ…

(Nguồn: />Hình 2.2. Cấu tạo tế bào nấm men


8

Thành tế bào
Thành tế bào bao bọc xung quanh tế bào, có độ bền chắc cao, chiều dày
là 150 - 250nm. Trên thành tế bào có những lỗ nhỏ li ti với đường kính
khoảng 3,6 nm để nước, đường, các chất dinh dưỡng cần thiết cho tế bào có
thể đi qua được. Thành tế bào chiếm khoảng 20% tổng khối lượng chất khô
của tế bào [2].
Thành tế bào có khoảng 90% là carbohydrate, phần còn lại là protein.
Trong số các carbohydrate, glucan là nhiều nhất, chúng chiếm 30 - 50% tổng
lượng chất khô của thành. Đa số nấm men có thành tế bào cấu tạo bởi glucane
và manane, một số nấm men có thành tế bào chứa chitin và manane.
Trong thành tế bào còn có chứa protein, phần lớn các protein trong thành
tế bào đều kết hợp với mannose. Một số các protein là các chất nhận bề mặt,
còn một số lại là các enzyme. Các enzyme này thực hiện quá trình tổng hợp
và trao đổi chất.
Nhiệm vụ của thành tế bào là bảo vệ tế bào trước tác động bên ngoài,
khống chế các quá trình trao đổi chất và áp suất thẩm thấu ở trong và ngoài tế
bào. Chính thành tế bào quyết định hình dáng tế bào. Thành tế bào quyết định
sự tương tác giữa tế bào với môi trường bên ngoài.
Vỏ tế bào rất dễ bị phá hủy bởi các tác nhân cơ học (teo nguyên sinh
chất), lý học (nhiệt độ cao, tia Rơngen, tia tử ngoại, tia cực tím), hóa học (môi
trường quá axit hoặc quá kiềm sẽ phá vỡ hoặc ăn mòn vỏ tế bào), sinh lý học
(nhiễm vi sinh vật lạ, nhiễm vi sinh vật trong quá trình nuôi cấy, các vi sinh

vật này tiết ra các enzyme có khả năng phân hủy tế bào).
Không gian chu chất tế bào
Đây là khoảng không gian giữa thành tế bào và màng nguyên sinh chất.
Mặc dù đó không phải là cơ quan cụ thể, nhưng mọi chất dinh dưỡng đi vào
hay các sản phẩm trao đổi chất đi ra khỏi tế bào đều phải đi qua. Ở đây có
chứa một số enzyme như invertase, phosphatase, melibiase và nhiều các
protein bao bọc nữa. Đây là các sản phẩm ngoại bào, chúng đi ra ngoài màng
nguyên sinh chất nhưng bị giữ lại bởi kích thước quá lớn không qua được


9

thành tế bào. Các enzyme ở đây được sử dụng để thủy phân các chất dinh
dưỡng không đồng hóa được tạo ra lợi thế cạnh tranh với các sinh vật tiết ra
các enzyme ngoại bào. Hàm lượng ptotein trong khoảng không gian này đủ để
tạo nên chất lưu dạng gel. Như vậy, khoảng không chu chất cũng có chức
năng làm lớp bảo vệ giữa thành tế bào và màng nguyên sinh chất [2].
Màng nguyên sinh chất (màng tế bào chất)
Màng nguyên sinh chất bao quanh tế bào chất và là lớp rào cản bên trong
giữa thành tế bào và khoảng không gian chu chất. Thành phần chính của
màng tế bào chất là lipid và protein. Có nhiều protein khác nhau, nhưng chức
năng chính không phải là tạo cấu trúc. Chúng gồm các enzyme thực hiện các
quá trình tổng hợp trên thành tế bào, các quá trình này xúc tác cho các chất
dinh dưỡng thấm qua thành tế bào [6].
Chức năng chính của màng nguyên sinh chất là điều chỉnh sự thấm qua
tế bào cử các chất dinh dưỡng. Màng tế bào chất có tính chất thẩm thấm chọn
lọc. Một chức năng quan trọng khác là phát hiện và phản ứng với các kích
thích bên ngoài. Màng tế bào chất còn có những vùng chứa các enzyme liên
quan đến các chu trình tổng hợp khác nhau của tế bào, phân bố các vùng này
phù hợp với cấu trúc không gian và chức năng [2].

Tế bào chất
Tế bào chất hay còn gọi là nguyên sinh chất là phần của tế bào được bao
quanh bởi màng tế bào mà không phải các cơ quan tế bào được bao bọc bởi
màng khác. Tế bào chất là một dung dịch keo có chứa vô số các sản phẩm
trao đổi chất. Tế bào chất của nấm men đặc biệt chứa nhiều RNA- là một axit,
nên pH của tế bào chất khoảng 5,2; các hoạt động trao đổi chất có thể làm cho
môi trường xung quanh có tính axit mạnh hơn hoặc yếu hơn. Các enzyme của
một số chu trình trao đổi chất chính phân bố lẫn trong số các tế bào chất [2].
Tế bào chất có chứa glycogen, các phần tử lipid, các phần tử có nhân
triacyglycerol, các este steryl kỵ nước được bao quanh màng chứa phospholipid và
protein…


10

Ty lạp thể
Ty lạp thể có cấu tạo đa hình (dạng sợi, dạng hạt, dạng phân nhánh), với
số lượng 2 - 24 phân bố đều trong tế bào. Chức năng chính là thực hiện các
quá trình liên qua đến cung cấp năng lượng cho tế bào, các phản ứng oxy hóa,
quá trình tổng hợp các chất cần thiết cho tế bào.
Nhân tế bào
Nhân chứa rất nhiều các vật liệu gen của tế bào. Nhân có dạng hình cầu,
oval, dường kính 1 - 2µm và được bao bọc bởi nột màng kép. Trong nhân có
chứa AND, ARN, các gen…, do đó nhân đóng vai trò quan trọng trong sinh
sản di truyền lại dấu hiệu cho các đời sau.
Thể Golgi (mạng lưới nội chất)
Trong tế bào nấm men có chứa một hệ thống màng 2 lớp, được gọi là
mạng lưới nội chất bao gồm hàng dãy màng kép có gai cong dày, một số
màng có kết hợp với riboxom. Đôi khi đầu màng chuốt thành các bọng tròn và
rồi có thể từ đây tạo thành không bào.

Không bào
Không bào có dạng hình tròn, được bao bọc bởi một màng rất mỏng và
chứa các dịch bào. Trừ các chất điện phân trong nước, trong không bào còn
chứa các protid, hạt mỡ, carbon ở dạng keo và hệ thống enzyme.
Riboxom
Các riboxom là các cơ quan tế bào chất có chứa hàm lượng RNA cao và
một số protein. Vai trò của chúng là tập hợp các protein từ các amino acid đã
hoạt hóa thành chuỗi tương ứng với mã có trong các phân tử RNA truyền tin.
Trong hạt riboxom thường xảy ra các quá trình tổng hợp protid.
Hạt lipid
Hạt lipid được tích tụ do chuyển hóa các saccharide hoặc được tổng hợp trong
môi trường giàu lipid. Ở trong môi trường nguyên chất, các hạt lipid nằm ở dạng
các hạt nhỏ li ti. Thông thường, tỷ lệ hạt lipid chiểm 1 - 2% trọng lượng khô của tế
bào. Tuy nhiên, một số chủng có khả năng tích lũy chất béo từ các axit béo có trong
môi trường và đạt tới 40 - 50% trọng lượng khô của tế bào [2].


11

Bầu mô (chồi)
Bầu mô là vị trí tạo ra tế bào mới. Khi các tế bào phát triển đến mức nhất
định, bầu mô cũng lớn dần và phát triển thành chồi. Các chất dinh dưỡng
chuyển vào bầu mô, chồi phát triển đầy đủ tạo thành các tế bào con có kích
thước, thành phần hoàn toàn giống tế bào mẹ. Chồi có thể tách ra để tạo thành
tế bào mới hoặc nối tiếp tạo thành chồi.
Glucid dự trữ
Hạt glycogen là nơi dự trữ tinh bột trong nguyên sinh chất của tế bào
nấm men. Khi môi trường giàu chất dinh dưỡng, nhiều hạt glycogen được
hình thành. Khi môi trường nghèo chất dinh dưỡng, nấm men sẽ sử dụng hạt
glycogen dự trữ để cung cấp năng lượng cho quá trình trao đổi chất.

2.2.3. Nguồn thức ăn chủ yếu cho nấm men
Nước: nước rất cần thiết cho hoạt động sống của tế bào nấm men. Không
có nước không thể có quá trình đồng hóa thức ăn và quá trình trao đổi chất
bên trong tế bào.
Nguồn carbon: nguồn carbon là nguồn chủ yếu liên quan đến quá trình
trao đổi chất và chuyển hóa năng lượng. Nấm men có khả năng đồng hóa
hoàn toàn đường glucose, fructose và maltose. Đường disaccharide quan
trọng cần quan tâm tới là saccarose, lactose…[2, 6]
Nguồn nitơ: ý nghĩa chủ yếu của nguồn nitơ là cung cấp cho tế bào là
nguyên liệu để hình thành các nhóm amin (-NH2) và imin (- NH-) để tổng hợp
nên protein và các hợp chất khác của nguyên sinh chất. Nấm men đồng hóa
được các hợp chất axit amin và nitơ vô cơ [2].
Các chất khoáng: trong môi trường dinh dưỡng cần phải có một lượng
nhất định các chất khoáng để đảm bảo cho tế bào phát triển. Các chất khoáng:
K2HPO4, KH2PO4, CaCl2, Na2SO4...
Các chất kích thích sinh trưởng: thường là các vitamin và các axit amin.
2.2.4. Sự hấp phụ chất dinh dưỡng của tế bào nấm men.
Trong điều kiện nuôi cấy thuận lợi thì tế bào nấm men sinh sản và phát
triển, sinh khối tăng nhanh. Điều này có được khi các chất dinh dưỡng từ môi
trường nuôi cấy được thấm vào tế bào theo các định luật thẩm thấu (bằng


12

khuếch tán). Hướng di chuyển của các chất dinh dưỡng hòa tan trong nước
đước xác định theo từng chất phụ thuộc vào sự chênh lệch nồng độ của các
chất đó giữa môi trường và tế bào.
Quá trình khuếch tán (vận chuyển chủ động) được thực hiện như sau: khi
nồng độ các chất trong tế bào cao làm áp suất thẩm thấu trong tế bào cao hơn
của môi trường thì nước sẽ dẫn vào liên tục để làm cân bằng nồng độ, song để

tránh hiện tượng phá hủy tế bào thì tế bào phải đẩy ion Na+ ra ngoài. Ion Na+
là chất duy nhất di chuyển vào tế bào theo cơ chế bị động và chủ động. Khi
thâm nhập vào tế bào nấm men, nó kéo theo cả sucrose và các axit ngay cả
khi không có sự chênh lệch nồng độ các chất này. Như vậy, chỉ những cơ chất
được vận chuyển vào trong tế bào mới tham gia quá trình trao đổi chất [2].
2.3. Nấm men trong công nghệ sản xuất bia
2.3.1. Nấm men chìm và nấm men nổi.
Nấm men trong công nghệ sản xuất bia thường là chủng Sacchromyces.
Thuộc giới Fungi, ngành Ascomycota, phân ngành Saccharomycotina, lớp
Saccharomycetes, bộ Saccharomycetales, họ Saccharomycetaceae, chi
Saccharomyces. Xuất phát từ quan sát quá trình lên men, khả năng lên men các
loại đường, khả năng hô hấp khả năng trao đổi chất khi lên men và khả năng hình
thành bào tử, người ta chia thành hai loại chính là nấm men chìm Saccharomyces
carlsbergensis và nấm men nổi Saccharomyces cerevisiae [2].
Nấm men chìm là Saccharomyces carlsbergensis dùng trong sản xuất bia
lager. Hầu hết các tế bào sau khi nảy chồi thường đứng riêng lẻ hoặc cặp đôi,
hình dạng chủ yếu là hình cầu. Sinh trưởng và phát triển ở nhiệt độ thấp, nhiệt
độ lên men từ 0 - 10oC. Kết thúc quá trình lên men nấm men kết lắng xuống
đáy thiết bị, dễ lắng và dễ tách lớp. Do đó, quá trình lọc dễ hơn đồng thời tạo
điều kiện sử dụng lại nấm men.
Nấm men lên men nổi là Saccharomyces cerevisiae dùng trong sản xuất
bia ale. Tế bào nấm men mẹ và con sau khi nảy chồi thường dính lại với nhau
thành chuỗi các tế bào nấm men hình dạng chủ yếu là hình cầu hoặc hình oval


13

với kích thước từ 7 - 10 µm. Saccharomyces cerevisiae sinh trưởng và phát
triển ở nhiệt độ cao, lơ lửng trên bề mặt là chủ yếu, nhiệt độ lên men từ 14
đến 25oC. Khi quá trình lên men kết thúc, tế bào kết chùm, thành chuỗi tạo

lớp dày nổi lên bề mặt cùng với bọt bia làm cho khả năng tự trong của bia rất
chậm, khả năng lắng yếu nên phải lọc cẩn thận.
Thành tế bào có vai trò quan trọng trong việc xác định nấm men nổi lên
bề mặt (lên men nổi) hay chìm xuống dưới (lên men chìm) trong quá trình lên
men dịch đường. Thành tế bào của nấm men nổi kỵ nước hơn của tế bào nấm
men chìm. Người ta cho rằng nguyên do từ thành phần phosphate trên thành
tế bào phía bên ngoài. Các tế bào có tính kỵ nước cao (thành tế bào có hàm
lượng phosphate thấp) sẽ bám vào các bong bóng và bề mặt dung dịch mang
điện tích như dịch lên men.
2.3.2. Quá trình lên men đường tạo rượu ethylic và CO2
Trong quá trình lên men, nấm men thông qua con đường trao đổi
chất và năng lượng trong điều kiện kỹ thuật thích hợp để chuyển hóa
glucid phân tử lượng thấp (các đường, dextrin…) thành rượu ethylic,
CO2 theo sơ đồ phản ứng:
C6H12O6

C2H5OH + CO2 + H2O + Q (năng lượng)

Các loại đường có thể lên men được trong dịch chiết malt là maltose,
maltotriose, một ít đường sucrose, glucose, fructose. Đường sucrose được
thủy phân bên ngoài tế bào nhờ enzyme invertase thành glucose và fructose.
Enzyme này được định vị ngay trên màng tế bào và sẽ tiết vào môi trường khi
có đường sucrose. Glucose và fructose được chuyển vào tế bào để chuyển
hóa. Đường maltose và maltotriose đi vào trong tế bào và được thủy phân
thành đường glucose. Enzyme invertase có tác dụng thủy phân đường sucrose
được định vị trong màng tế bào, tuy nhiên enzyme này sẽ tiết vào trong môi
trường khi có đường sucrose trong đó [2].
Ngoài sản phẩm chính là rượu ethylic và CO2 còn có các quá trình sinh
hóa xảy ra do sự xúc tác sinh học của các enzyme được hình thành trong quá

14

trình lên men, một số sản phẩm phụ cũng được hình thành như các axit hữu
cơ, các este, các rượu bậc cao, aldehyde, glycerin…
2.3.3. Các hướng tận dụng nấm men bia.
Sau khi lên men bia, một lượng lớn nấm men bia được thải ra ngoài môi
trường. Lượng nấm men bia thải ra này thường ở dạng sánh lỏng, dễ thối
hỏng và rất khó sử dụng. Nấm men bia sau quá trình lên men bia thường có
đặc điểm là rất dễ bị tự phân, dễ hư hỏng và rất khó bảo quản.
Trong tế bào nấm men có chứa rất nhiều chất dinh dưỡng, vitamin,
protein..
Việc sử dụng men bia trong trị liệu y học đã có từ rất xa xưa, khoảng
4000 năm trước công nguyên tại Ai Cập cổ đại. Tuy đã nhận thấy tác dụng tốt
đối với sức khỏe con người, nhưng mãi đến thế kỷ XV, XVI men bia vẫn
chưa được sử dụng rộng rãi.
Đến năm 1930, tại Nhật Bản, nấm men bia được cô đặc xuất hiện trên thị
trường dưới dạng men khô.
Hiện nay, có hai phương pháp xử lý phế liệu nấm men bia là chế biến
men khô và men chiết xuất.
Men sấy khô có thể được sấy bằng nhiều loại máy sấy khác nhau như
máy sấy dạng trống, máy sấy phun…Men khô được sử dụng làm thuốc dạng
viên hay dạng bột mang lại hiều quả kinh tế cao. Men khô được sử dụng làm
nguyên liệu nuôi trồng và chế biến thực phẩm bổ dưỡng hay làm nguyên liệu
chế biến thức ăn chăn nuôi.
Men chiết xuất được dùng nhiều trong một số thực phẩm như: súp, các
loại nước chấm,… Bản chất của quá trình sản xuất men chiết xuất chính là
quá trình thủy phân nấm men thành hỗn hợp các chất như amino acid,
nucleotide, chuỗi peptide, protein, vitamin,…

15

Ngoài việc sử dụng nấm men bia để sản xuất bột chiết nấm men hoặc
làm thức ăn gia súc…Sản xuất các chế phẩm enzyme từ nấm men bia đang là
một hướng nghiên cứu mới hiện nay.
2.3.4. Các enzyme thủy phân glucid đơn giản chính trong tế bào nấm men
Trong tế bào nấm men có chứa một số enzyme quan trọng có tác dụng
xúc tác chuyển hóa các glucid đơn giản.
Bảng 2.1 Một số enzyme quan trọng trong nấm men
Enzyme

Cơ chất chuyển hóa

Trehalase

Trehalose

Glucoamylase
(amyloglucosidase)

Tinh bột, dextrin, α- glucoside

Maltase (α- glucosidase)

Maltose, sucrose, maltotriose, melezittose,
p- nitrophenyl- α- glucoside

Isomaltose (Oligo 1,6glucosidase)

Isomaltose sucrose, α- methyl glucoside, pnitrophenyl- α- glucoside

Invertase (β- fructofuranose)

Sucrose, Raffinose

Melibiose (α- galactosidase)

Melibiase, raffinose, p- nitrophenyl- αgalactoside

Zimase

Hệ enzyme chuyển hóa đường đơn giản
thành ethylic

Vì vậy, tùy theo loài nấm men thuộc chi Sacchromyces dùng trong công
nghệ sản xuất bia mà tỷ lệ cơ chất và các thành phần của glucid được chuyển
phụ thuộc nhiều vào thành phần và tỷ lệ các enzyme [2].
2.4. Khái quát về enzyme invertase
2.4.1. Enzyme invertase
Invertase có tên khoa học là β - D - fructofuranoside fructohydrolase
(E.C.3.2.1.26). Enzyme này xúc tác quá trình chuyển hóa đường sucrose
thành đường nghịch đảo (glucose và fructose).


16

Invertase có trong động vật, thực vật, vi sinh vật (đặc biệt là nấm men có
khả năng tổng hợp invertase cao). Enzyme invertase là enzyme có mặt trong
hầu hết các nấm men công nghiệp, như nấm men bia, men sản xuất rượu cồn,

men bánh mì...[8]. Saccharomyces hiện là vi sinh vật được quan tâm nhiều
nhất trong lĩnh vực lên men tạo invertase.
Nấm men sản xuất ra invertase (β - D- fructofuranoside fructohydrolase,
E. C. 3.2.1.26) nội bào và ngoại bào [22].
Enzyme invertase bao gồm một chuỗi polypeptide có khối lượng phân tử
là 60.000 dalton gắn với các đơn vị oligosacchride không đồng nhất, tạo ra
một tiểu đơn vị có khối lượng khoảng 75.000 daltons [22]. Enzyme nội bào có
khối lượng phân tử 135.000 daltons, enzyme ngoại bào có khối lượng 270.000
daltons [16, 22]. Invertase xoang màng sinh chất có nguồn gốc là oligomeric,
gặp chủ yếu dưới dạng dimers, tetramers, và octamers [22].
Invertase bền trong khảng pH = 3,5 - 5,5 hoạt động tốt ở pH = 4,5. Nồng độ
đường trong dung dịch ảnh hưởng lớn tới tính ổn định của enzyme, ở nồng độ
đường loãng nhiệt độ thích hợp cho invertse khoảng 55oC còn khi nhiệt độ lên tới
65 - 70oC thì nồng độ đường phải lớn hơn. Nhiệt độ tới hạn của enzyme là 59oC, ở
nhiệt độ này enzyme sẽ bị phá hủy nhanh chóng khi nồng độ đường loãng [8].
Thủy phân sucrose đạt vận tốc tối đa khi nồng độ dịch đường từ 2 - 8%,
khi nồng độ dịch đường đạt 70 - 80% thì vận tốc chỉ còn 1/4 vận tốc cực đại ở
pH = 4,5 [8].
Invertase của nấm men rất nhạy cảm với ion kim loại như Cu2+, Cd2+,
Hg2+…, đặc biệt là ion Ag+. Có thể là do ion Ag+ liên kết với histidin bên
trong phân tử enzyme, nhưng không liên kết với nhóm - SH [8].
2.4.2. Qúa trình chuyển hóa đường sucrose thành đường nghịch đảo
Nấm men phân cắt đường sucrose bằng invertase periplasmic (E.C.
3.2.1.26) để tạo thành glucose và fructose, là đường mà nấm men có thể
đồng hóa [18]. Ngoài ra invertase còn có khả năng phân giải một số
trisacchsride và tetrasaccharide, chúng tách các phân tử glucose và
fructose ở đầu và cuối mạch.


17

Nhiều sơ đồ động học khác nhau được đề xuất để mô tả quá trình thủy
phân sucrose khi có mặt enzyme invertase nấm men.
Sự thủy phân sucrose với sự có mặt của invertase hình thành glucose mạch
vòng và fructoase mạch vòng. Quá trình xúc tác thủy phân theo sơ đồ [18]:
Sucrose + enzyme

↔

Fructose - enzyme + glucose

Fructose - enzyme + sucrose ↔ Trisaccharide
Fructose - enzyme + H2O

↔

Fructose

+ enzyme
+ enzyme

Sơ đồ chung:

2.4.3. Invertase trong tế bào nấm men
Hiện nay, invertase có thể lấy từ các tế bào nấm men sống hoặc tế bào
nấm men đã chết. Nhưng phần lớn được lấy từ các tế bào nấm men sống [19].
Vị trí của invertase trong tế bào nấm men và tính thấm của màng tế bào
với sucrose đã là vấn đề gây tranh cãi kéo dài. Báo cáo của Friis và Ottolenghi
đã chỉ ra rằng, hầu hết invertase của các chủng nấm men, khi phát triển trên
môi trường có sucrose liên kết với thành tế bào, tuy nhiên một số cũng có mặt

trong tế bào. Với các tế bào đã trưởng thành, họ quan sát thấy chỉ có một
lượng thấp của invertase nội bào. Burger và cộng sự cho rằng, invertase có
mặt trong dạng hòa tan bên ngoài màng tế bào nhưng giữ lại bởi thành tế bào.


18

Theo Manfred Zech và Helmut Gorisch, enzyme invertase ngoại bào
nằm ở xoang màng sinh chất (periplasmic), khoảng không gian giữa thành tế
bào và màng nguyên sinh chất [22].
Enzyme invertase có tác dụng thủy phân đường sucrose được định vị
trong màng tế bào, tuy nhiên enzyme này sẽ tiết vào trong môi trường khi có
đường sucrose.
Invertase được tạo ra với một lượng lớn trong tế bào nấm men, chừng
nào vẫn còn sucrose. Ngay sau khi sucrose được hoàn toàn chuyển hóa, hàm
lượng invertase của nấm men được giảm với tốc độ rất nhanh.
2.4.4. Thu nhận chế phẩm enzyme invertase thô từ nấm men bằng phương
pháp tự phân.
Tự phân là quá trình xảy ra khi tế bào nấm men đã chết, vách tế bào
không còn khả năng tự bảo vệ và sẽ bị phá hủy bởi chính các enzyme trong tế
bào Chúng. xúc tác phản ứng phân giải các chất có trong thành tế bào nấm
men và giải phóng enzyme invertase ra ngoài tế bào. Lúc này các chất trong tế
bào chất như protein, nucleotide, carbohydrate,… cũng sẽ bị chính hệ thống
enzyme náy tấn công và phá hủy.
Quá trình tự phân nấm men bắt đầu với sự chết đi của tế bào. Lúc đầu,
mất tổ chức của hệ thống màng (màng tế bào chất và các bào quan khác) của
tế bào. Các enzyme phân giải protein tấn công và phá vỡ protein thành các
đơn vị nhỏ hơn (peptide và amino acid).
Các enzyme glucanase và proteinase làm suy giảm các thành phần tế bào
như glucans và mannoproteins, khi đó các tế bào trở nên xốp hơn. Các sản

phẩm của quá trình tự phân sẽ giải phóng ra ngoài môi trường.
Quá trình tự phân nấm men có thể chia làm hai phần [28]:
a. Sự thoái hóa các thành phần tế bào mà chủ yếu là sự phân giải protein
b. Sự thoái hóa của thành tế bào, cấu trúc vững chắc cấu thành nên hình
dạng của nấm men.