Nghiên cứu khả năng tái sinh in vitro của một số giống đậu dải phục vụ cho tạo giống mới

§¹i häc Th¸i Nguyªn
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM

NGUYỄN VĂN CHIỂN
Tên đề tài:
″NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG TÁI SINH IN VITRO CỦA MỘT SỐ
GIỐNG ĐẬU DẢI (Cowpea - Vigna unguiculata (L.)) PHỤC VỤ
CHO TẠO GIỐNG MỚI″

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

Hệ đào tạo

: Chính quy

Chuyên ngành

: Công nghệ sinh học

Khoa

: CNSH - CNTP

Khóa học

: 2010 – 2014

Thái Nguyên - 2014


§¹i häc Th¸i Nguyªn

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM

NGUYỄN VĂN CHIỂN
Tên đề tài:
″NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG TÁI SINH IN VITRO CỦA MỘT SỐ
GIỐNG ĐẬU DẢI (Cowpea - Vigna unguiculata (L.)) PHỤC VỤ
CHO TẠO GIỐNG MỚI″

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
Hệ đào tạo
Chuyên ngành
Khoa
Khóa học

: Chính quy
: Công nghệ sinh học
: CNSH - CNTP
: 2010 – 2014

Giáo viên hướng dẫn:
1. TS. Hà Thị Thúy
Viện Di truyền nông nghiệp Việt Nam
2. Th.S Lương Thị Thu Hường
Khoa CNSH – CNTP – Trường ĐH Nông Lâm Thái Nguyên

Thái Nguyên - 2014


LỜI CẢM ƠN
Để hoàn thành khóa luận tốt nghiệp trước hết tôi xin được gửi lời cảm ơn

chân thành và sâu sắc tới TS. Hà Thị Thúy, phó Viện trưởng Viện Di Truyền Nông
Nghiệp. Cô đã tạo mọi điều kiện thuận lợi và tận tình hướng dẫn tôi trong toàn bộ
quá trình thực tập và hoàn thành khóa luận này.
Tôi xin được gửi lời cảm ơn tới cô ThS. Lương Thị Thu Hường khoa CNSHCNTP, trường ĐH Nông Lâm Thái Nguyên đã hướng dẫn, giúp tôi thực tập và hoàn
thành khóa luận.
Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới TS. Hoàng Thị Giang, ThS. Nguyễn
Thị Huế đã tận tình chỉ bảo tôi trong suốt thời gian thực tập khóa luân tại phòng thí
nghiệm trọng điểm quốc gia Công nghệ tế bào thực vật – Viện Di Truyền Nông
Nghiệp.
Tôi xin chân thành cảm ơn toàn thể các anh chị làm việc tại phòng thí
nghiệm trọng điểm quốc gia Công nghệ tế bào thực vật – Viện Di Truyền Nông
Nghiệp, đã giúp đỡ và tạo điều kiện tối đa cho tôi trong toàn bộ quá trình thực tập.
Tôi xin gửi lời cảm ơn và biết ơn sâu sắc nhất tới tập thể các thầy cô giảng
dạy tại khoa CNSH – CNTP, Trường ĐH Nông Lâm Thái Nguyên đã hướng dẫn,
giảng dạy tôi trong suốt quá trình học tập tại trường.
Cuối cùng tôi xin cảm ơn gia đình, bạn bè đã luôn ở bên động viên và tạo
mọi điều kiện giúp tôi hoàn thành khóa luận này.
Thái Nguyên, ngày 01 tháng 06 năm 2014
Sinh viên
Nguyễn Văn Chiển


DANH MỤC TỪ, CỤM TỪ VIẾT TẮT

ADN

: Acid deoxyribonucleic

BAP

: 6-Benzylaminopurine

B5

: Gamborg and Miller , 1968

CT

: Công thức

cs

: Cộng sự

CV

: Coefficient of Variation

Đậu đen

: Đậu đen quốc phòng Cao Bằng

Đậu thúa đắm

: Đậu Thúa đắm Nghệ An

IAA

: Indol axetic acid

IM

: Môi trường nền

LSD

: Least Significant Difference Test

MS

: Murashige and Skoog’s, 1962

MSB
NAA

: MS salts + B5 vitamins
: α - Naphlene axetic acid

USDA

: United States Department of Agriculture


DANH MỤC BẢNG
Trang
Bảng 4.1. Kết quả so sánh hiệu quả khử trùng bằng các hóa chất khác nhau
với thời gian xử lý khác nhau ........................................................ 16
Bảng 4.2. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của một số môi trường cơ bản tới
khả năng tái sinh cây đậu dải ......................................................... 18
Bảng 4.3. Kết quả đánh giá ảnh hưởng của BAP đến khả năng tái sinh in vitro

và nhân nhanh từ nốt lá mầm không kèm lá mầm ......................... 20
Bảng 4.4. Kết quả đánh giá ảnh hưởng của Kinetin đến khả năng tái sinh in
vitro và nhân nhanh từ nốt lá mầm không kèm lá mầm ................ 22
Bảng 4.5. Kết quả đánh giá ảnh hưởng của BAP đến khả năng tái sinh in vitro
và nhân nhanh từ nốt lá mầm kèm 1 lá mầm ................................. 24
Bảng 4.6. Kết quả đánh giá ảnh hưởng của Kinetin đến khả năng tái sinh in
vitro và nhân nhanh từ nốt lá mầm kèm 1 lá mầm ........................ 26
Bảng 4.7. Kết quả đánh giá ảnh hưởng của BAP đến khả năng tái sinh in vitro
và nhân nhanh từ lát cắt nốt lá mầm .............................................. 27
Bảng 4.8. Kết quả đánh giá ảnh hưởng của Kinetin đến khả năng tái sinh in
vitro và nhân nhanh từ lát cắt nốt lá mầm...................................... 28
Bảng 4.9. Đánh giá ảnh hưởng của loại mô cấy đến khả năng tái sinh và nhân
nhanh cây đậu dải........................................................................... 29


MỤC LỤC
Trang
PHẦN 1. MỞ ĐẦU .......................................................................................... 1
1.1. Tính cấp thiết của đề tài ............................................................................. 1
1.2. Mục đích nghiên cứu .................................................................................. 2
1.3. Yêu cầu của đề tài ...................................................................................... 2
1.4. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài ................................................... 2
1.4.1. Ý nghĩa khoa học .................................................................................... 2
1.4.2. Ý nghĩa thực tiễn ..................................................................................... 2
PHẦN 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU............................................................... 3
2.1. Giới thiệu chung về cây đậu dải (Vigna unguiculata (L.)) ........................ 3
2.1.1. Nguồn gốc và phân bố............................................................................. 3
2.1.2. Phân loại .................................................................................................. 3
2.1.3. Đặc điểm thực vật học của cây đậu dải (Vigna unguiculata (L.)) .......... 4
2.1.4. Giá trị của cây đậu dải (đậu đũa) (Vigna unguiculata (L.)).................... 5

2.1.5. Tình hình nghiên cứu tái sinh in vitro cây đậu dải ............................. 6
2.2. Cơ sở khoa học của nhân giống cây trồng bằng nuôi cấy mô tế bào ......... 8
2.2.1. Tính toàn năng của tế bào thực vật ......................................................... 8
2.2.2. Sự phân hóa và phản phân hóa................................................................ 8
2.3. Một số chất điều hòa sinh trưởng nuôi cấy mô tế bào thực vật ................. 9
2.3.1. Auxin ....................................................................................................... 9
2.3.2. Cytokinin ............................................................................................... 10
PHẦN 3: ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN
CỨU ...................................................................................................... 11
3.1. Đối tượng (vật liệu) và phạm vi nghiên cứu ............................................ 11
3.1.1. Vật liệu nghiên cứu ............................................................................... 11
3.1.2. Hóa chất sử dụng và phạm vi nghiên cứu ............................................. 11
3.1.3. Thiết bị sử dụng..................................................................................... 11


3.2. Địa điểm và thời gian tiến hành nghiên cứu ............................................ 11
3.3. Nội dung nghiên cứu ................................................................................ 11
3.4. Phương pháp nghiên cứu.......................................................................... 12
3.4.1. Nghiên cứu ảnh hưởng của các phương pháp khử trùng mẫu đến khả
năng nảy mầm của một số giống đậu dải (Vigna unguiculata (L.)) ..... 12
3.4.2. Nghiên cứu ảnh hưởng của một số môi trường cơ bản tới khả năng tái
sinh in vitro một số giống đậu dải ........................................................ 13
3.4.3. Nghiên cứu đánh giá ảnh hưởng của loại mô cấy và chất điều hòa sinh
trưởng đến tái sinh in vitro.................................................................... 14
PHẦM 4: KẾT QUẢ, NỘI DUNG NGHIÊN CỨU .................................. 16
4.1. Kết quả thí nghiệm 1 xác định phương pháp khử trùng mẫu ................. 16
4.2. Kết quả thí nghiệm 2 nghiên cứu ảnh hưởng của mốt số môi trường cơ
bản đến khả năng tái sinh in vitro ......................................................... 17
4.3. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của loại mô cấy và chất điều hòa sinh
trưởng đến khả năng tái sinh, nhân chồi. .............................................. 20

4.3.1. Kết quả đánh giá ảnh hưởng BAP và Kinetin đến khả năng tái sinh in
vitro và nhân nhanh từ nốt lá mầm không kèm lá mầm ....................... 20
4.3.2. Kết quả đánh giá ảnh hưởng của BAP và Kinetin đến khả năng tái sinh
in vitro và nhân nhanh từ nốt lá mầm kèm 1 lá mầm ........................... 23
4.3.3. Kết quả đánh giá ảnh hưởng của BAP và Kinetin đến khả năng tái sinh
in vitro và nhân nhanh từ lát cắt nốt lá mầm ........................................ 27
4.3.4. Kết quả đánh giá ảnh hưởng của loại mô cấy đến khả năng tái sinh và
nhân nhanh cây đậu dải ......................................................................... 29
PHẦN 5: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ..................................................... 31
5.1. Kết luận .................................................................................................... 31
5.2. Kiến nghị .................................................................................................. 32
TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................ 33
PHỤ LỤC


1

PHẦN 1
MỞ ĐẦU
1.1. Tính cấp thiết của đề tài
Cây đậu dải (Vigna unguiculata) được biết đến và trồng từ rất lâu đời.
Đậu dải hay còn gọi là đậu cowpea, là cây lương thực rất có tiềm năng trong
việc cung cấp nguồn protein cho người và gia súc. Hạt đậu chứa khoảng 2030% protein và gần 60% carbohydrate (Aurora, 1995) [6]; (Aguirre và cs,
1998) [5]; (Castro và cs, 2002) [11]. Đậu dải có thể là nguồn thức ăn quan
trọng cho phụ nữ mang thai vì hạt đậu rất giàu axit folic là dinh dưỡng cần
thiết cho phát triển thai nhi. Lá và quả đậu dải khi còn non có thể dùng làm
rau ăn rất ngon và bổ. Thân lá cây đậu sau thu hoạch có thể sử dụng để ủ làm
thức ăn cho gia súc. Đậu dải bao gồm có ba loài phụ: đậu đen (Vigna unguiculata
subsp. cylindrica), đậu đũa (Vigna unguiculata subsp. sesquipedalis) và đậu dải
trắng rốn nâu (Vigna unguiculata subsp. unguiculata). Đậu đũa là loại rau phổ

biến ở thị trường châu Á. Đậu dải được trồng phổ biến ở các vùng khí hậu
nóng ấm, nửa khô hạn như các nước châu Phi, Ấn Độ, Mexico, miền Nam
nước Mỹ. Việt Nam cũng thuộc vùng sinh thái thích hợp cho nhóm đậu này,
tuy nhiên lâu nay chúng ta vẫn phải nhập thêm đậu từ nước ngoài. Nghiên cứu
giải pháp gia tăng sản lượng đậu dải trong nước sẽ mang lại ích lợi kinh tế
cho đất nước, cải thiện sức khỏe cộng đồng.
Đậu dải có khả năng chịu hạn, cải tạo đất tốt hơn đậu cô ve (Phaseolus
vulgaris) do có bộ rễ ăn sâu hơn và cố định đạm mạnh hơn. Tuy nhiên theo
nghiên cứu nước ngoài, năng suất canh tác (trọng lượng thu hoạch từng đơn
vị diện tích) của các giống đậu dải hiện nay chỉ đạt 20-30% so với năng suất
thực thụ. Nguyên nhân gây giảm năng suất là do sâu bệnh như tuyến trùng,
bệnh thối rễ, nấm hại lá, côn trùng (bọ xít, rệp, sâu ăn lá...), thời tiết bất
thường v.v... (Duke , 1990) [14]. Việt Nam cũng không nằm ngoài những yếu


2

tố bất thuận này. Việc chọn tạo các giống đậu có khả năng chống chịu sẽ giúp
cải thiện năng suất đồng thời giảm thiểu sử dụng thuốc trừ sâu, phân bón, góp
phần tăng hiệu quả canh tác, bảo vệ môi trường.
Để phục vụ cho công tác chọn tạo giống bằng công nghệ tế bào đặc biệt là
chọn giống thông qua chuyển gen và đột biến tế bào sôma, tạo ra giống mới có
khả năng chống chịu, kháng bệnh, kháng sâu, kháng thuốc diệt cỏ tôi tiến hành
nghiên cứu đề tài ″Nghiên cứu khả năng tái sinh in vitro của một số giống
đậu dải (Cowpea - Vigna unguiculata (L.)) phục vụ cho tạo giống mới″.
1.2. Mục đích nghiên cứu
Xác định được điều kiện nuôi cấy in vitro phù hợp cho tái sinh một số
giống đậu dải.
1.3. Yêu cầu của đề tài
- Xác định phương pháp khử trùng cho tỉ lệ nảy mầm cao.

- Xác định môi trường nuôi cấy cơ bản phù hợp với một số giống đậu dải
nghiên cứu.
- Xác định ảnh hưởng của loại mô cấy và chất điều hòa sinh trưởng đến sự
tái sinh, tạo đa chồi.
1.4. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài
1.4.1. Ý nghĩa khoa học
- Bổ sung thêm vào phương pháp khử trùng cho tỉ lệ nảy mầm cao của
một số giống đậu dải.
- Đưa ra môi trường nuôi cấy cơ bản phù hợp với một số giống đậu dải
nghiên cứu.
- Góp phần xây dựng quy trình nuôi cấy in vitro phù hợp với một số giống
đậu dải.
1.4.2. Ý nghĩa thực tiễn
- Kết quả nghiên cứu là những đánh giá về khả năng tái sinh in vitro của
các giống đậu dải có giá trị của Việt Nam. Qua đó chọn ra được những giống
có khả năng tái sinh cao, phục vụ công tác chọn tạo giống, đặc biệt là chuyển
gen.


3

PHẦN 2
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1. Giới thiệu chung về cây đậu dải (Vigna unguiculata (L.))
2.1.1. Nguồn gốc và phân bố
- Loài đậu đũa hay đậu dải - cowpea (Vigna unguiculata) có nguồn gốc ở
Châu Phi, là loài đậu có quả dài, hạt to, có nhiều phân loài khác nhau với
dạng hạt có nhiều kích cỡ và màu sắc khác nhau (Rachie và cs, 1985) [24].
- Phân loài Đậu đũa (Vigna unguiculata subsp. Sesquipedalis) được
trồng phổ biến khắp thế giới như: nhiều nước ở Châu Phi, Châu Âu, Châu

Mỹ, Châu Á nhiệt đới (Ấn Độ, Bangladesh, Thái Lan, Việt Nam, Indonesia,
Malaysia, Philippines) và Châu Á ôn đới (Trung Quốc, Đài Loan) (Rachie và
cs, 1985) [24].
Đậu đũa bắt nguồn từ một trong bốn loài phụ của đậu cowpea (Vigna
unquiculata) được trồng nhiều ở Trung Quốc; vùng Đông Nam Châu Á như
Thái Lan, Philippines; Nam Châu Á như Bangladesh, Ấn Độ, Pakistan,
Indonesia và mở rộng sang Châu Phi (Rachie và cs, 1985) [24].
Đậu đũa là loại rau phổ biến ở thị trường Châu Á, nhu cầu của thị trường
nước ngoài trong những năm gần đây là tiêu thụ quả tươi và đông lạnh. Phẩm
chất quả dựa trên màu sắc và chiều dài quả. Tuy nhiên, yêu cầu nhập khẩu
đậu đũa rất thay đổi tùy mỗi thị trường (Rachie và cs, 1985) [24].
2.1.2.Phân loại
Phân loại khoa học (Rachie và cs, 1985) [24]:
Giới (regnum)
Plantae
Bộ (ordo)
Đậu (Fabales)
Họ (familia)
Đậu (Fabaceae)
Chi (genus)
Vigna
Loài (species)

V. unguiculata

Phân loài (subspecies)

Vigna unguiculata subsp. Sesquipedalis

Trong Hệ thống Cronquist năm 1981 và một số hệ thống phân loại thực

vật khác, bộ Đậu (Fabales) chỉ chứa mỗi họ Đậu (Fabaceae).


4

Trong Hệ thống phân loại APG II (Angiosperm Phylogeny Group II)
(2003):
+ Bộ đậu (Fabales) bao gồm 4 Họ, trong đó có Họ đậu.
+ Họ đậu (Fabaceae) gồm 4 Phân họ, đây là họ lớn thứ ba sau họ Phong
lan và họ Cúc, với khoảng 730 chi và 19.400 loài.
+ Phân họ Đậu (Faboideae) với 31 Tông, trên 400 chi và hàng ngàn loài.
+ Chi Đậu (đỗ) (Vigna) là một chi thực vật thuộc Phân họ Đậu (đỗ). Tên
Latin của chi này được đặt theo tên của Domenico Vigna, nhà thực vật học
người Ý ở thế kỉ 17.
+ Loài đậu đũa hay đậu dải - cowpea (Vigna unguiculata) là loài đậu có
quả dài, hạt to, có nhiều phân loài khác nhau. Trong loài này có 4 Phân loài
được công nhận là:
- Phân loài Đậu đen (Vigna unguiculata subsp. cylindrica).
- Phân loài Đậu đũa (Vigna unguiculata subsp. dekindtiana).
- Phân loài Đậu đũa (Vigna unguiculata subsp. sesquipedalis).
Phân
loài Đậu
dải
trắng
rốn
nâu (Vigna
unguiculata subsp. unguiculata).
2.1.3. Đặc điểm thực vật học của cây đậu dải (Vigna unguiculata (L.))
Cây đậu dải có những đặc điểm như sau (Rachie và cs, 1985) [24]:
- Đậu đũa là cây thân thảo hằng năm, hệ thống rễ phát triển rất mạnh.

- Thân: Thân bò, leo quấn, có góc cạnh, không lông, mắt thân thường có
màu tím.
- Lá: Lá kép 3 lá phụ với cuống dài, lá mọc xen kẽ, mặt lá ít lông tơ.
- Hoa: Phát hoa mọc ở nách lá, hoa màu vàng hay xanh lơ mọc thành
chùm ở đỉnh. Tràng hoa có 5 cánh rời, nhụy đực gồm 9 dính + 1 rời, bầu noãn
với 12 - 21 noãn. Hoa lưỡng tính, tỉ lệ thụ phấn chéo bởi côn trùng rất thấp
trong điều kiện khí hậu khô, nhưng trong điều kiện ẩm ướt tỉ lệ này có thể
tăng đến 40%.
- Quả: Quả giáp dài 20-100 cm, đường kính tròn, quả non thẳng, láng,
mềm; quả già co thắt lại, chứa 10 - 30 hạt. Quả tươi có giá trị dinh dưỡng
tương đối cao, giàu protein, chất bột đường và vitamin A.
- Hạt: Hạt hình quả thận, màu sắc và kích thước thay đổi.


5

Đậu đũa thích khí hậu nóng, nhiệt độ ban ngày thích hợp là 25 - 35oC và
nhiệt độ ban đêm không dưới 15oC. Đậu đũa phản ứng với độ dài ngày không
rõ rệt nhưng thiên về cây ngày ngắn. Đậu mọc tốt ở vùng đồng bằng và nơi có
cao độ trung bình, ở cao độ cao > 700m so với mặt nước biển sự ra hoa của
đậu bị hạn chế nhất là vào mùa có thời tiết lạnh.
Đậu đũa trồng được thích hợp trên đất nhiều hữu cơ, pH từ 5,5 - 6.
Đậu đũa chịu hạn giỏi đồng thời tăng trưởng tốt trong mùa mưa ẩm độ
cao. Nhu cầu nước cả vụ là 6 - 8 mm/ngày. Trồng trong mùa nắng có tưới đậu
mọc tốt như trong mùa mưa.
Sau khi nẩy mầm cây tăng trưởng nhanh, ra hoa 35 ngày sau khi gieo và
bắt đầu cho thu hoạch quả tươi 2 tuần sau khi hoa nở. Tùy theo sự tăng trưởng
và cường độ thu hái, cây ra hoa, kết trái kéo dài 1.5 - 2 tháng và cây tàn 3 - 4
tháng sau khi trồng (Rachie và cs, 1985) [24].
2.1.4. Giá trị của cây đậu dải (đậu đũa) (Vigna unguiculata (L.))

Theo Bộ Nông nghiệp Hoa Kỳ (USDA), giá trị dinh dưỡng trong 100g
quả đậu đũa tươi như sau (Bressani, 1985) [10]:
Giá trị dinh dưỡng trong 100 g đậu đũa tươi
Năng lượng

197 kJ (47 kcal)

Carbohydrate

8,35 g

Chất béo

0,4 g

Protein

2,8 g

Vitamin A equiv.

43 mg (5%)

Thiamine (vit. B1)

0,107 mg (9%)

Riboflavin (vit. B2)

0,11 mg (9%)

Niacin (vit. B3)

0,41 mg (3%)

Axit pantothenic (B 5)

0,55 mg (11%)

Vitamin B 6

0,024 mg (2%)

Folate (vit. B 9)

62 mg (16%)


6

Vitamin C

18,8 mg (23%)

Canxi

50 mg (5%)

Sắt

0,47 mg (4%)

Magiê

44 mg (12%)

Mangan

0.205 mg (10%)

Phốt pho

59 mg (8%)

Kali

240 mg (5%)

Natri

4 mg (0%)

Kẽm

0,37 mg (4%)

Ghi chú! Tỷ lệ % đáp ứng nhu cầu hàng ngày của người
lớn.
Nguồn: Cơ sở dữ liệu dinh dưỡng của USDA
Đậu đũa là cây lương thực rất có tiềm năng trong việc cung cấp nguồn

protein cho người và gia súc. Hạt đậu chứa 20-30% protein và gần 60%
carbohydrate (Aguirre và cs, 1998) [5]. Trong nghiên cứu của Castro và cs,
(2002) [11] cho thấy trong hạt đậu có nhiều sinh tố nhóm B, nhiều sắt và kali.
2.1.5. Tình hình nghiên cứu tái sinh in vitro cây đậu dải
Trong các nghiên cứu trên câu đậu dải thường sử dụng hạt đậu dải làm
nguồn vật liệu nghiên cứu. Trong nghiên cứu Bao và cs, (2006) [7] sử dụng
cồn 70o NaClO cho tỉ lệ nảy mầm cao và tỉ lệ nhiễm thấp. Trong nghiên cứu
của Diallo và cs (2008) [13] sử dụng phương pháp khử trùng bằng NaClO
cùng HCl để khử trùng một số giống đậu dải Châu Phi cũng cho tỉ lệ nảy
mầm cao và tỉ lệ nhiễm thấp.
Khả năng tái sinh in vitro của đậu dải phụ thuộc vào nhiều yếu tố, như
kiểu gen, loại mô và kích thước mô cấy, thành phần môi trường nuôi cấy, các
chất điều hòa sinh trưởng, chất kết đông môi trường v.v. Trong nghiên cứu
của Brar và cs, (1999) [9] cho thấy rõ ảnh hưởng của kiểu gen đến khả năng
tái sinh chồi từ lá mầm. Trong 36 giống đậu dải dùng làm nguồn vật liệu thì


7

chỉ có 17 giống có khả năng tái sinh với hiệu quả dao động từ 1% tới 11%.
Nhiều nghiên cứu chỉ ra rằng mắt lá mầm bao gồm cả hai lá mầm cho hiệu
quả tái sinh cao nhất, sau đó đến mắt lá mầm kèm 1 lá mầm (Chaudhury và
cs, 2007 [12]; Diallo và cs, 2008 [13]). Khi cắt bỏ lá mầm khỏi mắt lá mầm
thì tỷ lệ tái sinh giảm đi rõ rệt. Ngoài ảnh hưởng của loại mô cấy, một số
nghiên cứu cũng ghi nhận rằng tỷ lệ tái sinh phụ thuộc vào kích thước của mô
cấy (Hinchee và cs, 1988 [16]; Van Le và cs, 2002 [27]). Các môi trường
được sử dụng trong nghiên cứu khả năng tái sinh của đậu dải thường là MS
(Manoharmin và cs, 2008 [18]; Bao và cs, 2006 [7]), B5 (Muthukumar và cs,
1995 [21]; Diallo và cs, 2008 [13]) và MSB (muối MS và vitamin B5)
(Chaudhury và cs, 2007 [12]; Mao và cs, 2006 [19]). Diallo và cs, (2008) [13]

làm thí nghiệm so sánh khả năng tái sinh từ mắt lá mầm đậu dải trên các nền
môi trường dinh dưỡng khác nhau. Kết quả nghiên cứu cho thấy môi trường
B5 cho hệ số nhân chồi cao hơn và môi trường MS thì cho hiệu quả kéo dài
chồi tốt hơn. Môi trường MSB kết hợp được ưu điểm của cả hai loại môi
trường MS và B5 nên thường được sử dụng để tái sinh và chuyển gen đậu
cowpea (Diallo và cs, 2008 [13]).
Một số loại mẫu vật được dùng trong nuôi cấy mô đậu dải như là lá mầm
(Brar và cs, 1999 [9]; Mamadou và cs, 2008 [17]), mắt lá mầm (Popelka và
cs, 2006 [23]; Chaudhury và cs, 2007 [12]; Solleti và cs, 2008 [25]), lát cắt
nốt lá mầm (Van Le và cs, 2002) [27], mô phân sinh ngọn ( Mao và cs, 2006
[19]; Muhammad Aasim và cs, 2008 [20]), mô phân sinh mắt (Chaudhury và
cs, 2007 [12]; Adebola và cs, 2008 [4]), mô phân sinh rễ (Subramaniam và cs,
1968) [26], lá thật đầu tiên (Muthukumar và cs, 1995 [21]; Bao và cs, 2006
[7]), đỉnh chồi (Brar và cs, 1997 [8]; Aasim và cs, 2009 [3]), thân (Mao và cs,
2006 [19]; Bao và cs, 2006 [7]), phôi soma (Mao và cs, 2006 [19]). Một số
công trình nghiên cứu thành công về tái sinh cây đậu dải trước đây đã chỉ ra
rằng các mẫu vật giàu tế bào mô phân sinh như cuống lá mầm, nốt lá mầm,
mô phân sinh ngọn, đỉnh chồi và đỉnh sinh trưởng cho khả năng tái sinh tốt
hơn trong nuôi cấy in vitro. Trong số đó nốt lá mầm là loại mẫu vật phổ biến
nhất được sử dụng thành công trong chuyển gen vào cây đậu dải (Popelka và
cs, 2006 [23]; Chaudhury và cs, 2007 [12]). Hinchee và cs, (1988) cho rằng ở
nốt lá mầm có sẵn các tế bào mô phân sinh nách dẫn tới có phản ứng tái sinh


8

chồi cao hơn [16]. Các nghiên cứu sau đó cũng đã chỉ ra rằng sự có mặt của lá
mầm sẽ giúp cho khả năng hình thành chồi ở nốt lá mầm diễn ra thuận lợi
(Chaudhury và cs, 2007 [12]; Diallo và cs, 2008 [13]).
Ngoài tỷ lệ tái sinh thì số lượng chồi tái sinh trên mỗi mẫu cấy cũng khác

nhau một cách đáng kể giữa các kiểu gen nghiên cứu. Tuy nhiên, những kiểu
gen cho tỷ lệ tái sinh cao nhất lại không cho hệ số nhân chồi cao nhất (Brar và
cs, 1999) [10]. Một số nghiên cứu gần đây cũng khẳng định sự ảnh hưởng của
kiểu gen tới khả năng phát sinh đa chồi ở mẫu cấy là mô phân sinh mắt
(Chaudhury và cs, 2007 [12]; Adebola và cs, 2008 [4]). Gần đây hơn,
Manoharmin và cộng sự (2008) [18] đã công bố quy trình tái sinh in vitro từ
mô phân sinh ngọn của 4 loại kiểu gen đậu dải khác nhau. Các nhà nghiên
cứu này đã cải tiến hệ thống tái sinh bằng cách bổ sung nồng độ BA cao vào
môi trường nảy mầm hạt và giảm nồng độ BA xuống thấp hơn trong quá trình
tái sinh chồi để thu được phản ứng tái sinh giống nhau ở cả bốn kiểu gen và
chứng minh được quy trình tái sinh đậu dải không phụ thuộc vào kiểu gen
(Manoharmin và cs, 2008 [18]).
2.2. Cở sở khoa học của nhân giống cây trồng bằng nuôi cấy mô tế bào
2.2.1. Tính toàn năng của tế bào thực vật
Nguyên lí cơ bản của nhân giống nuôi cấy mô tế bào là tính toàn năng
của tế bào thực vật. Mỗi tế bào bất kì của cơ thể thực vật đều mang toàn bộ
lượng thông tin di truyền của toàn bộ cơ thể. Trong điều kiện thích hợp mỗi tế
bào đều có thể phát triển thành một cơ thể hoàn chỉnh. Tính toàn năng của tế
bào là cơ sở khoa học của phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật. Hiện
nay, người ta đã thực hiện được khả năng tạo ra một cơ thể hoàn chỉnh từ một
tế bào riêng rẽ (Trịnh Đình Đạt, 2009) [1].
2.2.2. Sự phân hóa và phản phân hóa
Cơ thể thực vật hình thành là một chính thể thống nhất bao gồm nhiều cơ
quan chức năng khác nhau, được hình thành từ nhiều loại tế bào khác nhau. Tuy
nhiên tất cả các loại tế bào đó đều bắt nguồn từ một tế bào đầu tiên (tế bào hợp
tử). Ở giai đoạn đầu, tế bào hợp tử tiếp tục phân chia hình thành nhiều tế bào
phôi sinh chưa mang chức năng riêng biệt (chuyên hóa). Sau đó, từ các tế bào


9

phôi sinh này chúng tiếp tục được biến đổi thành các tế bào chuyên hóa đặc hiệu
cho các mô, cơ quan có chức năng khác nhau (Trịnh Đình Đạt, 2009) [1].
Sự phân hóa tế bào là sự chuyển các tế bào phôi sinh thành các tế bào mô
chuyên hóa, đảm bảo các chức năng khác nhau. Quá trình phân hóa tế bào có thể
biểu thị:
Tế bào phôi sinh → Tế bào dãn → Tế bào phân hoá có chức năng riêng biệt
Tuy nhiên, khi tế bào đã phân hóa thành các tế bào có chức năng chuyên,
chúng không hoàn toàn mất khả năng biến đổi của mình. Trong trường hợp cần
thiết, ở điều kiện thích hợp, chúng có thể trở về dạng tế bào phôi sinh và phân
chia mạnh mẽ, quá trình đó gọi là phản phân hóa tế bào, ngược lại với sự phân
hóa tế bào.
phân hóa tế bào

tế bào phôi sinh

tế bào dãn

tế bào chuyên hóa

phản phân hóa tế bào

Về bản chất thì sự phân hóa và phản phân hóa là một quá trình hoạt hóa,
ức chế các gen. Tại một thời điểm nào đó trong quá trình phát triển cá thể, có
một số gen được hoạt hóa (mà vốn trước nay bị ức chế) để cho ta tính trạng
mới, còn một số gen khác lại bị đình chỉ hoạt động. Điều này xảy ra theo một
chương trình đã được mã hóa trong cấu trúc của phân tử ADN của mỗi tế bào
khiến cho quá trình sinh trưởng phát triển của cơ thể thực vật luôn được hài
hòa. Mặt khác, khi tế bào nằm trong một khối mô của cơ thể thường bị ức
chế bởi các tế bào xung quanh. Khi tách riêng từng tế bào hoặc giảm kích

thước của khối mô sẽ tạo điều kiện cho sự hoạt hóa các gen của tế bào
(Trịnh Đình Đạt, 2009) [1].
2.3. Một số chất điều hòa sinh trưởng nuôi cấy mô tế bào thực vật
2.3.1. Auxin


10

Chất auxin tự nhiên được tìm thấy nhiều ở thực vật là indol axetic acid
(IAA). IAA có tác dụng kích thích sinh trưởng kéo dài tế bào và điều khiển sự
hình thành rễ. Ngoài IAA, còn có các dẫn xuất của nó là naphthalene axetic
acid (NAA) và 2,4 - Diclophenoxy acid (2,4 D). Các chất này cũng đóng vai trò
quan trọng trong sự phân chia của mô và trong quá trình hình thành rễ. NAA có
tác dụng tăng hô hấp của tế bào và mô nuôi cấy, tăng hoạt tính enzyme và ảnh
hưởng mạnh đến trao đổi chất của nitơ, tăng khả năng tiếp nhận và sử dụng
đường trong môi trường. NAA là auxin nhân tạo, có hoạt tính mạnh hơn auxin tự
nhiên IAA, NAA có vai trò quan trọng đối với phân chia tế bào và tạo rễ (Vũ Văn
Vụ, 2009) [2].
2.3.2. Cytokinin
Cytokinin là chất điều hoà sinh trưởng có tác dụng làm tăng sự phân chia
tế bào. Các cytokinin thường gặp là kinetin, 6 - Benzyl aminopurin (BA).
Kinetin thực chất là một dẫn xuất của bazơ nitơ adenine. BA là cytokinin tổng
hợp nhân tạo nhưng có hoạt tính mạnh hơn nhiều kinetin. Kinetin và BA cùng
có tác dụng kích thích phân chia tế bào kéo dài thời gian hoạt động của tế bào
phân sinh và làm hạn chế sự già hoá của tế bào. Ngoài ra các chất này có tác
dụng lên quá trình trao đổi chất, quá trình tổng hợp ADN, tổng hợp protein và
làm tăng cường hoạt tính của một số enzyme. Cơ chế tác dụng của auxin ở
mức độ phân tử trong tế bào thể hiện bằng tác dụng tương hỗ của cytokinin
với các nucleoprotein làm yếu mối liên kết của histone với ADN, tạo điều
kiện cho sự tổng hợp ADN (Vũ Văn Vụ, 2009) [2].

11

PHẦN 3
ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.1. Đối tượng (vật liệu) và phạm vi nghiên cứu
3.1.1. Vật liệu nghiên cứu
- Bao gồm 3 nguồn gen đậu dải lấy ngẫu nhiên trong số những nguồn
gen được đánh giá là triển vọng: Đậu đen quốc phòng Cao Bằng (đậu đen),
đậu Thúa đắm Nghệ An (đậu thúa đắm), IT95M-190. Được cung cấp bởi
Viện Di Truyền Nông Nghiệp Việt Nam.
3.1.2. Hóa chất sử dụng và phạm vi nghiên cứu
- Hóa chất sử dụng:
+ NaClO, cồn, HCl.
+ Các muối khoáng đa lượng, vi lượng, vitamin là thành phần của môi
trường cơ bản MS, B5 và MSB (thành phần như ở phụ lục 3).
+ Chất kích thích sinh trưởng: BAP, Kinetin
+ Một số chất khác
- Phạm vi nghiên cứu:
Nghiên cứu tái sinh in vitro của một số giống đậu dải ở quy mô phòng
thí nghiệm.
3.1.3. Thiết bị sử dụng
- Tủ cấy vô trùng, nồi hấp vô trùng, cân phân tích,... một số trang thiết bị
khác của phòng nuôi cấy mô – Phòng thí nghiệm trọng điểm quốc gia Công
nghệ tế bào thực vật – Viện Di Truyền Nông Nghiệp.
3.2. Địa điểm và thời gian tiến hành nghiên cứu
- Địa điểm: Phòng thí nghiệm trọng điểm quốc gia Công nghệ tế bào
thực vật – Viện Di Truyền Nông Nghiệp.
- Thời gian tiến hành nghiên cứu: Tháng 12/2013- tháng 5/2014

3.3. Nội dung nghiên cứu
Nội dung 1: Nghiên cứu ảnh hưởng của các phương pháp khử trùng mẫu
đến khả năng nảy mầm của một số giống đậu dải.


12

Nội dung 2: Đánh giá ảnh hưởng của một số môi trường cơ bản tới khả
năng tái sinh in vitro của một số nguồn gen đậu dải đại diện.
Nội dung 3: Nghiên cứu ảnh hưởng của loại mô cấy (nốt lá mầm không
kèm lá mầm, nốt lá mầm kèm 1 lá mầm, lát cắt nốt lá mầm), chất điều hòa
sinh trưởng đến sự tái sinh in vitro.
3.4. Phương pháp nghiên cứu
3.4.1. Nghiên cứu ảnh hưởng của các phương pháp khử trùng mẫu đến
khả năng nảy mầm của một số giống đậu dải (Vigna unguiculata (L.))
Trong nghiên cứu này sử dụng các hóa chất là: NaClO, HCl, cồn 70º.
Các phương pháp khử trùng sử dụng là:
- CT 1: Khử trùng bằng cồn 70º và NaClO 3,5% trong 5 phút
Cách tiến hành:
Hạt đậu được rửa bằng cồn 70º trong 1 phút để sơ loại các mầm bệnh và
tăng hiệu quả khử trùng. Sau đó đổ bỏ cồn và ngâm hạt vào 70% dung dịch
khử trùng sodium hypochlorite nồng độ 3,5% với thời gian là 5 phút.
Cuối cùng, rửa sạch mẫu 5 lần bằng nước cất vô trùng. Cấy mẫu vào môi
trường nảy mầm (MS).
- CT 2: Khử trùng bằng cồn 70º và NaClO 3,5% trong 10 phút
Cách tiến hành:
Tiến hành như CT1 nhưng sử lý với thời gian 10 phút
- CT 3: Khử trùng bằng cồn 70º và NaClO 5% trong 5 phút
Cách tiến hành:
Tiến hành như CT1 nhưng sử dụng dung dịch khử trùng sodium

hypochlorite nồng độ 5% với 2 thời gian xử lý là 5 phút. Cấy mẫu vào môi
trường nảy mầm (MS).
- CT4: Khử trùng bằng cồn 70º và NaClO 5% trong 10 phút
Cách tiến hành:
Tiến hành như CT1 nhưng sử dụng dung dịch khử trùng sodium
hypochlorite nồng độ 5% với 2 thời gian xử lý là 10 phút. Cấy mẫu vào môi
trường nảy mầm (MS).
- CT 5: Khử trùng bằng NaClO 5% và HCl 12N trong16 giờ


13

Cách tiến hành:
Bỏ 1 lớp hạt vào đĩa petri. Mở nắp đĩa và đặt đĩa hạt vào trong máy hút
ẩm trong tủ hood.
Cho 100 ml dung dịch sodium hypochlorite nồng độ 5% vào ca định mức 250
ml đặt vào trong máy hút ẩm.
Sau đó thêm 4 ml HCl 12N, nhỏ vòng quanh ca định mức. Đóng máy
hút ẩm và để qua đêm. Sau 16 giờ, đóng nắp đĩa petri, mang đĩa ra box cấy.
Cấy mẫu vào môi trường nảy mầm (MS).
Các thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên và được nhắc lại 3 lần.
+ Chỉ tiêu đánh giá (sau 4-5 ngày đưa vào môi trường nảy mầm):

Tỷ lệ mẫu nhiễm (%)

Tỷ lệ mẫu nảy mầm (%)
=

=

Σ số mẫu nhiễm
Σ số mẫu cấy

x 100%

Σ số mẫu nảy mầm
Σ số mẫu cấy không
nhiễm

x 100%

+ Ký hiệu sử dụng
CT: Công thức.
3.4.2. Nghiên cứu ảnh hưởng của một số môi trường cơ bản tới khả năng
tái sinh in vitro một số giống đậu dải
Thí nghiệm tiến hành trên 3 loại môi trường cơ bản có bổ sung BAP 0,5
mg/l và phytagel 0,4 g/l:
- CT 1: Môi trường MS
- CT 2: Môi trường B5
- CT 3: Môi trường MSB (muối MS + vitamins B5)
+ Cách tiến hành: Cả 3 công thức thí nghiệm trên đều thực hiện theo
quy trình nuôi cấy sau:
Nốt lá mầm cắt từ cây đậu dải con 4 – 5 ngày tuổi (thí nghiệm: Nghiên
cứu ảnh hưởng của các phương pháp khử trùng mẫu đến khả năng nảy mầm
của một số giống đậu dải (Vigna unguiculata (L.)) sẽ được cấy vào môi
trường tái sinh chồi (môi trường cơ bản MS, B5, MSB) theo hướng trụ dưới lá


14

mầm và trụ trên lá mầm cách 2 mm trên và 3 – 5 mm dưới vị trí mắt thẳng
đứng, thời gian nuôi cấy là 2 tuần. Giữ nguyên 2 lá mầm trên nốt lá mầm, chỉ
cắt bỏ lá mầm. Sau 2 tuần, cắt bỏ 2 chồi nách và cắt bớt callus phát sinh,
chuyển mẫu cấy sang môi trường tái sinh chồi (môi trường cơ bản MS, B5,
MSB) mới. Nuôi cấy thêm 2 tuần và đánh giá các chỉ tiêu nghiên cứu.
Trong suốt quá trình thí nghiệm mẫu được nuôi trong điều kiện chiếu
sáng 16 giờ/ngày ở nhiệt độ 26 ± 2°C, cường độ chiếu sáng 2000 lux.
+ Bố trí thí nghiệm:
Thí nghiệm được bố trí theo kiểu ngẫu nhiên hoàn toàn, có 3 công thức
cấy 30 mẫu/công thức.
- Các chỉ tiêu đánh giá:
Σ số mẫu tái sinh
Tỷ lệ tái sinh(%) =
x 100%
Σ số mẫu cấy

Hệ số nhân chồi =

Σ số chồi
Σ số mẫu cấy

3.4.3. Nghiên cứu đánh giá ảnh hưởng của loại mô cấy và chất điều hòa
sinh trưởng đến tái sinh in vitro
3.4.3.1. Nghiên cứu ảnh hưởng của BAP và Kinetin tới khả năng tái sinh in
vitro từ nốt lá mầm không kèm lá mầm
a. Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ BAP
- Công thức 1: MSB + BAP 0.1 mg/l
- Công thức 2: MSB + BAP 0.5 mg/l
- Công thức 3: MSB + BAP 1 mg/l
- Công thức 4: MSB+ BAP 2 mg/l

- Công thức 5: MSB+ BAP 3 mg/l
+ Cách tiến hành:
Nốt lá mầm cắt từ cây con 4 – 5 ngày tuổi sẽ được cấy vào môi trường
tái sinh chồi, môi trường nền có bổ sung nồng độ (0,1; 0.5; 1; 2 và 3 mg/l)
BAP; theo hướng thẳng đứng, thời gian nuôi cấy 2 tuần. Giữ nguyên 2 lá
mầm trên nốt lá mầm, chỉ cắt bỏ trụ dưới lá mầm và trụ trên lá mầm cách 2
mm trên và 3-5 mm dưới vị trí mắt lá mầm. Sau 2 tuần, cắt bỏ 2 chồi nách và


15

cắt bớt callus phát sinh, chuyển mẫu cấy sang môi trường tái sinh chồi mới.
Nuôi cấy thêm 2 tuần.
Sau thời gian tái sinh, chuyển cụm chồi sang môi trường kéo dài chồi
với nền môi trường MS và bổ sung 0,1 mg/l BAP. Thời gian nuôi cấy là 2
tuần. Sau đó cấy chồi tái sinh sang môi trường ra rễ (1/2 MS).
+ Bố trí thí nghiệm:
Thí nghiệm được bố trí theo kiểu ngẫu nhiên hoàn toàn, có 9 công thức,
mỗi công thức nhắc lại 3 lần, mỗi lần nhắc lại cấy 10 mẫu/công thức.
- Chỉ tiêu đánh giá:
Σ số mẫu tái sinh
Tỷ lệ tái sinh(%)=
x 100%
Σ số mẫu cấy
Σ số chồi
Hệ số nhân chồi =
Σ số mẫu cấy
b. Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng Kinetin
- Công thức 1: MSB + Kinetin 0.1 mg/l
- Công thức 2: MSB+ Kinetin 0.5 mg/l

- Công thức 3: MSB+ Kinetin 1 mg/l
- Công thức 4: MSB+ Kinetin 2 mg/l
+ Cách tiến hành
Cách tiến hành tương tự như nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ BAP
nhưng thực hiện với các công thức thí nghiệm có nồng độ Kinetin là: 0,1; 0,5;
1; 2.
3.4.3.2. Nghiên cứu ảnh hưởng của BAP và Kinetin tới khả năng tái sinh in
vitro từ nốt lá mầm kèm 1 lá mầm
Các công thức thí nghiệm và tiến hành tương tự như nghiên cứu khả
năng tái sinh in vitro từ nốt lá mầm không kèm lá mầm. Chỉ khác là thực hiện
trên đối tượng mẫu là nốt lá mầm kèm 1 lá mầm.
3.4.3.3. Nghiên cứu ảnh hưởng của BAP và Kinetin tới khả năng tái sinh in
vitro từ lát cắt nốt lá mầm
Thí nghiệm này được tiến hành như ”đánh giá khả năng tái sinh in vitro
từ nốt lá mầm không kèm lá mầm” nhưng thực hiện trên đối tượng là lát cắt
nốt lá mầm.


16

PHẦN 4
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
4.1. Kết quả thí nghiệm 1 xác định phương pháp khử trùng mẫu
Để đưa mẫu vào môi trường nuôi cấy cần đảm bảo các chỉ tiêu sau: tỷ lệ
nhiễm thấp, tốc độ sinh trưởng tốt. Vì vậy, mô thực vật trước khi đưa vào
nuôi cấy cần phải trải qua giai đoạn khử trùng để đảm bảo yêu cầu vô trùng
trong nuôi cấy mô. Chọn phương pháp khử trùng đóng vai trò quan trọng khi
bắt đầu bất kỳ một hệ thống nuôi cấy mô nào, có ý nghĩa quyết định tới hiệu
quả nuôi cấy mô. Thí nghiệm này thực hiện trên 2 giống đại diện cho kết quả
như sau:

Bảng 4.1. Kết quả so sánh hiệu quả khử trùng bằng các hóa chất khác
nhau với thời gian xử lý khác nhau
Giống

Đậu
đen

IT95M190

CT

Hoá chất

Số mẫu
cấy (chồi)

1
2
3
4

Cồn 70o + 3,5% NaClO trong 5 phút
Cồn 70o + 3,5% NaClO trong 10 phút
Cồn 70o +5% NaClO trong 5 phút
Cồn 70o +5% NaClO trong 10 phút

60
60
60
60

26,00
10,64
0
0

94,00
95,70
92,00
86,00

5

NaClO 5% + HCl trong 16 giờ

60

0

94,00

TLN TLNM
(%)
(%)

CV%

2,10

LSD.05

0,33

1

Cồn 70o + 3,5% NaClO trong 5 phút

60

22,00

96,00

2

Cồn 70o + 3,5% NaClO trong 10 phút

60

14,00

96,00

3

Cồn 70o +5% NaClO trong 5 phút

60

0

93,75

4

Cồn 70o +5% NaClO trong 10 phút

60

0

86,00

5

NaClO 5% + HCl trong 16 giờ

60

0

97,87

CV%

3,60

LSD.05

0,57

Qua bảng 1 ta thấy rằng khử trùng hạt bằng dung dịch NaClO nồng độ
3,5% chưa đủ mạnh để diệt sạch hết mầm bệnh. Ở cả hai giống đậu đen quốc
phòng Cao Bằng và IT95M-190 với hóa chất này thời gian xử lý 5 phút, 10


17

phút đều cho tỷ lệ mẫu cấy bị nhiễm khá cao là 26,00% (CT1), 10,64% (CT2)
và 22,00% (CT1), 14,00% (CT2). Với các công thức khử trùng còn lại thu
được mẫu cấy ở giai đoạn nảy mầm vô trùng 100%. Như vậy kết quả nghiên
cứu cho thấy rằng ở cả hai giống đậu đen quốc phòng Cao Bằng và IT95M190 CT5 (NaClO 5% + HCl trong 16 giờ) cho hiệu quả cao nhất, mẫu sạch
100%, tỷ lệ hạt nảy mầm cao (94,00% và 97,87%). Nhưng giá thành hóa chất
sử dụng trong phương pháp này lại là cao. Phương pháp khử trùng bằng Cồn
70o +5% NaClO trong 5 phút thì cũng cho mẫu sạch 100% và tỉ lệ nảy mầm
cao chỉ sau phương pháp sử dụng NaClO 5% + HCl trong 16 giờ với 92,00%
(giống đậu đen quốc phòng Cao Bằng) và 93,75% (ở giống IT95M-190), giá
thành hóa chất lại thấp hơn. Nên phương pháp khử trùng bằng Cồn 70o +5%
NaClO trong 5 phút là phương pháp phù hợp nhất cho khử trùng một số
giống đậu dải nghiên cứu.
4.2. Kết quả thí nghiệm 2 nghiên cứu ảnh hưởng của mốt số môi trường
cơ bản đến khả năng tái sinh in vitro
Kết quả nghiên cứu cho thấy đối với tất cả các nguồn gen nghiên cứu tỷ lệ
tái sinh trên cả ba nền môi trường đều rất cao (bảng 4.2). Tỷ lệ tái sinh đạt
100% ở cả 3 công thức đối với giống Đậu đen quốc phòng Cao Bằng. Trên
nền môi trường MS và MSB tỷ lệ tái sinh của các giống gần như không có
khác biệt. Nghiên cứu ở giống Đậu thúa đắm Nghệ An kết quả cho thấy khả
năng tái sinh của nốt lá mầm trên môi trường B5 thấp hơn đáng kể so với môi
trường MS và MSB, với tỷ lệ tái sinh tương ứng là 86,67% (CT2). Ở giống
IT95M-190, cả 3 công thức đều cho tỉ lệ tái sinh là 93,33%.

18

Bảng 4. 2. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của một số môi trường cơ bản
tới khả năng tái sinh cây đậu dải
Tổng số

Giống

Công
thức

Tổng số

Số mẫu

chồi hữu

Tỷ lệ tái

mẫu cấy

tái sinh

hiệu tái

sinh

(mẫu)

(mẫu)

sinh

(%)

(chồi)

Đậu đen

Đậu thúa
đắm

IT95M-190

Hệ số
nhân
chồi
(lần)

MS

30

30

85

100

2,83

B5

30

30

102

100

3,40

MSB

30

30

104

100

3,47

CV%

2,30

MS

LSD.05
30

30

114

100

0,15
3,80

B5

30

26

125

86,67

4,81

MSB

30

30

138

100

4,60

CV%

3,5

LSD.05

0,31

MS

30

28

70

93,33

2,50

B5

30

28

34

93,33

1,20

MSB

30

28

78

93,33

2,79

CV%

6

LSD.05

0,26

Từ kết quả trình bày ở bảng 4.2 ta thấy khả năng phát sinh đa chồi ở các
nền môi trường có sự khác biệt.
Với LSD.05 đạt 0,15 ở giống Đậu đen quốc phòng Cao Bằng thì các công
thức có sự sai khác có ý nghĩa ở độ tin cậy 95%. Mẫu cấy trên cả 3 loại môi
trường (cả 3 công thức) đều cho tỉ lệ tái sinh là 100%. Trong 3 môi trường cơ