Khảo sát sự ức chế acetylcholinesterase trên sắc kí lớp mỏng

Mục lục


Bản các từ viết tắt
ACh

acetylcholine

AChE

acetylcholinesterase

AChI

chất ức chế acetylcholinesterase

ATC

acetylthiocholine

ATCI

acetylthiocholine iodide

BSA

bovine serum albumin

DTNB

5,5’- dithiobis-(2-nitrobenzoic acid)

HPTLC

sắc kí lớp mỏng hiệu năng cao

TLC

sắc kí lớp mỏng

DTNB

5-thio-2-nitrobenzoate

2
2


KHẢO SÁT SỰ ỨC CHẾ ACETYLCHOLINESTERASE TRÊN
SẮC KÍ LỚP MỎNG
1.

TỔNG QUAN

1.1

BỆNH ALZHEIMER
Bệnh Alzheimer là bệnh thoái hóa thần

kinh phổ biến được đặc chưng bởi sự giảm
nồng

độ

chất

dẫn

truyền

thần

kinh

acetylcholine (ACh) trong não bộ. Một số điều
trị lâm sàn của bệnh Alzheimer là kích thích
thụ thể tiết ra ACh hoặc kéo dài sự tồn tại của
ACh trong các khe thần kinh sinap bằng cách
sử dụng các chất có khả năng tích trữ và làm
tăng nồng độ ACh. Ước tính có khoảng 50-60
thuốc được đưa vào thử nghiệm lâm sàn trong
việc điều trị bệnh Alzheimer và việc sử dụng
chất ức chế enzyme acetylcholinesterase (có
vai trò thủy phân ACh) hứa hẹn đầy tiềm năng
trong việc điều trị bệnh Alzheimer [1].

Hình 1. Bệnh Alzheimer

SƠ LƯỢC VỀ ACETYLCHOLINESTERASE VÀ CHẤT ỨC CHẾ

1.2

ACETYLCHOLINESTERASE
1.2.1

Acetylcholinesterase

Enzyme acetylcholinesterase (AChE) là một enzyme rất quan trong đối với động
vật kể cả loài người. AChE có nhiệm vụ chuyển hóa chất dẫn truyền thần kinh (ACh)
sau khi ACh đã truyền thông tin. Nếu chất dẫn truyền thần kinh không được chuyển
hóa sau khi nó hoàn thành nhiệm vụ thì các cơ có liên quan sẽ không thể nghỉ và điều
đó có thể gây ra các cơn co thắt , tê liệt và một số vấn đề khác.
AChE được tìm thấy trong khe synap, ở giữa các tế bào thần kinh thông qua các
luồng thông tin. Khi ACh đi qua, AChE sẽ chuyển hóa ACh thành choline và acid
acetic.
3
3


AChE chuyển hóa ACh chỉ trongs, rất nhanh để giữ cho khe synap luôn rõ ràng để
thông tin hỗn hợp không xảy ra [2].
1.2.2

Chất ức chế acetylcholinesterase

Chất ức chế acetylcholinesterase (AChI) là những hợp chất có khả năng ức chế
phản ứng thủy phân acetylcholine, được chia làm hai nhóm là chất ức chế thuận
nghịch và chất ức chế không thuận nghịch (chất ức chế thuận nghịch là chất ức chế tạo
liên kết với các enzyme bằng liên kết không nối như liên kết hydrogen, liên kết Van
der waals, nối liên kết ion; chất ức chế bất thuận nghịch là chất ức chế tạo liên kết với
enzyme bằng liên kết cộng hóa trị [1].

Hầu như các chất ức chế được tìm được đều chứa nitrogen, có 3 mức độ ức chế [3]:
Ức chế mạnh : phần trăm ức chế enzyme lớn hơn 60 %.
Ức chế trung bình: phần trăm ức chế enzyme từ 15 - 50 %.
Ức chế yếu: phần trăm ức chế enzyme nhỏ hơn 15 %.
Một số hợp chất ức chế enzyme đã được sử dụng trong việc điều trị bệnh
Alzheimer:

4
4


Hình
2. Công thức của một số hợp chất ức chế

[1]

Tacrine (1) là thuốc đầu tiên được cục quản lí dược và thực phẩm cho phép áp
dụng vào việc điều trị bệnh Alzheimer (1993), là một chất ức chế không cạnh
tranh thuận nghịch.
Donepezil (2) là thuốc thứ hai được cục quản lí dược vả thực phẩm cho phép áp
dụng cho việc điều trị bệnh Alzheimer (1996), là chất ức chế thuận nghịch.
Rivastigmine (3) là chất ức chế không cạnh tranh thuộc nhóm carbamates, liên
kết với bề mặt mang nhóm ester của enzyme, là thuốc được cục quản lí dược và
thực phẩm cho phép sử dụng vào năm 2000.
Galathamine (4) là một phenanthrene alkaloid, một chất ức chế cạnh tranh
thuận nghịch, được cục quản lí dược và thực phẩm cho phép sử dụng vào năm
2001.
Huperzine A (5) và huperzine B (6) là hai alkaloid được cô lập từ loài thảo
mộc Huperzia serrate. Cả hai hợp chất này đều là chất ức chế thuận nghịch đầy
tiềm năng và có tính chọn lọc cao, được cho phép sử dụng ở Trung Quốc.

5
5


Physostigmine (7) (eserine) là chất ức chế thuận nghịch có cơ cấu là một amine
bậc 3.
Eptastigmine (8) là một dẫn xuất của physostigmine, trong đó nhóm
carbamoylheptyl được thay bằng nhóm carbamoylmethyl tại vị trí thứ 5 của
vòng indole [1].
Dae Keun Kim và cộng sự năm 2004 cô lập được 4 hợp chất isoquinoline
alkaloid từ Corydails speciosa có hoạt tính ức chế AChE thu được giá trị IC 50 (ức chế
enzyme 50%): corynoxidine (89 µM) (9), protopine (16.1 µM) (10), palmatine (5.8
µM) (11), berberine (3.3 µM) (12)[4].
Ngoài các alkaloid là galanthamine, huperzine A và huperzine B còn có 3
alkaloid khác: sanguinine (0.1 0.01 µM) (13), 11-hydroxygalanthamine (1.61 0.21
µM) (14), epinorgalanthamine (9.60 0.65 µM) (15); 3 lycorine: oxoassoanine (47.21
1.13 µM) (16), assoanine (3.87 0.24 µM) (17), pseudolycorine (152.32 32.06 µM)
(18) cũng có khả năng ức chế AChE[5].

6
6


M. Iqbal Choudhary và cộng sự năm 2006 đã nghiên cứu một số hợp chất
triterpennoid alkaloid cô lập từ cây Buxus hyrcana có hoạt tính ức chế AChE:
hyrcanone (145.0 11.5) (19), buxabenzacinine (468.0 5.0 µM) (20), Nbdimethylcycloxobuxoviricine (310.0 22.1 µM) (21), hyrcamine (83.0 1.3 µM) (22),
buxidine (210.6 8.3 µM) (23), buxandrine (175.4 11.0 µM) (24), buxippine-K (25)[6].

7

7


1.3

GIỚI THIỆU SẮC KÍ LỚP MỎNG[7]
Sắc kí lớp mỏng (TLC) dựa chủ yếu vào hiện tượng hấp thu trong đó pha động là

một dung môi hay hỗn hợp các dung môi, di chuyển ngang qua pha tĩnh là một chất
hấp thu trơ, thí dụ như: silica gel hoặc nhôm oxid. Pha tĩnh này được tráng thành một
lớp mỏng, đều, phủ lên một nền phẳng như tấm kiếng, tấm nhôm hoặc tâm plastic. Do
chất hấp thu được tráng thành một lớp mỏng nên phương pháp này được gọi là sắc kí
lớp mỏng.
Ưu và nhược điểm của sắc kí lớp mỏng:
Ưu điểm: chỉ cần một lượng rất ít mẫu để phân tích; có thể phân tích đồng
thời mẫu và chất chuẩn đối chứng trong cùng điều kiện phân tích, tất cả các hợp
chất trong mẫu phân tích có thể được định vị trí trên sắc kí lớp mỏng, dụng cụ lớn,
kích thước mẫu lớn có thể kiểm soát được.
Nhược điểm: chất đem đi phân tích phải có tính kém bay hơi, hiệu quả tách
chất định lượng và khả năng tách lượng lớn không cao.
2.

KHẢO SÁT SỰ ỨC CHẾ ENZYME ACETYLCHOLINESTERASE
TRÊN TLC
Để khảo sát sự ức chế AChE bằng phương pháp sắc kí lớp mỏng (TLC), có rất

nhiều cách để thực hiện trong đó hai cách tiêu biểu nhất là sử dụng thuốc thử muối fast
blue B và thuốc thử Ellman (phương pháp Ellman, ngoài TLC có thể dùng phương
pháp 96 giếng với thuốc thử Ellman).
2.1

THỬ NGHIỆM TRÊN TLC VỚI THUỐC THỬ MUỐI FAST BLUE
B[8]
8
8


2.1.1

Cơ sở lý thuyết

Hình 3. Phản ứng của acetylcholinesterase với 1-naphthyl acetate và nhuộm màu tím trên thử nghiệm
sắc kí lớp mỏng.

α-naphthyl acetate bị thủy phân với xúc tác enzyme AChE thành sản phẩm là α-naphthol. Sau đó,
sản phẩm này tiếp tục phản ứng với thuốc thử muối fast blue B cho hợp chất azo có màu tím.
Tại những vị trí enzyme bị ức chế thì trên bản mỏng sẽ quan sát thấy xuất hiện các điểm màu
trắng trên nền tím do không xảy ra phản ứng giữa α-naphthol và thuốc thử muối fast blue B sau khi
bản mỏng được chấm mẫu, giải ly, phun enzyme và phun thuốc thử.

2.1.2

Nguyên liệu

Củ của họ Amaryllidaceae: Galanthus nivalis (Champagne, Switzerland),
Leucojum vernum (Vuillens, Switzerland), Narcissus pseudonarcissus (Oron-la-Ville,
Switzerland), củ của Ismene festalis, Nerine bowdenii, Crinum powellii và Sprekelia
formosissima (Charmois Garden Centre, Savigny, Switzerland) và phần ngọn của
Chelidonium majus (Papaveraceae, Dixa AG (St. Gallen, Switzerland)).
10 g nguyên liệu khô và nhuyễn được trích bằng phương pháp ngâm dầm với 250

ml EtOH 80% trong 12 giờ. Dịch chiết được cô quay ở áp suất thấp để thu được cao
9
9


EtOH. Cao thô EtOH được pha thành dung dịch có nồng độ 1 mg/ml để thực hiện sắc
kí lớp mỏng.
2.1.3

Dụng cụ, hóa chất và cách pha hóa chất

2.2.3.1

Dụng cụ và hóa chất

Bản mỏng silica gel 60 F254 (Merck) và bản Al2O3 60 F254 trung tính loại E
(Merck).
Enzyme AChE (Sigma), galanthamine (Sigma), tris-HCl, bovine serum albumin
(BSA) và α-naphthyl acetate (Merck), muối fast blue B, physostigmine (eserine),
chlorogenic acid, quinine, caffeine (Fluka), và một số dung môi thông dung như
ethanol, acetone, isopropanol.
2.2.3.2

Cách pha các dung dịch

Dung dịch enzyme AChE: hòa tan dung dịch AChE 1000 U vào 150 ml dung
dịch đệm tris-HCl 0.05 M (pH 7.8). Sau đó thêm 150 mg BSA vào dung dịch trên để
ổn định enzyme AChE cho đến khi tiến hành thí nghiệm (được giữ ở 4 ).
Dung dịch α-naphthyl acetate: hòa tan 250 mg α-naphthyl acetate trong 100 ml
ethanol.

Dung dịch muối fast blue B: hòa tan 400 mg muối fast blue B trong 160 ml nước
cất.
Dung dich thuốc thử: trộn 10 ml α-naphthyl acetate vào 40 ml muối fast blue B.
Không pha trước hai dung dịch muối fast blue B và α-naphthyl acetate khi chưa sử
dụng để tránh hiện tương thủy phân.
2.1.4

Quy trình thực hiện

10
10


Rửa sạch bản mỏng với acetone và sấy
Mẫu
Mẫu với
với nồng
nồng độ
độ
1
1 mg/ml
mg/ml

- Sắc kí bản mỏng, giải ly trong
hệ CHCl3-MeOH-H2O (65:35:5)

Mẫu
Mẫu đã
đã giải
giải ly

ly trên
trên bản
bản mỏng
mỏng

- Phun enzyme AChE

0
0
Ủ
Ủ bản
bản mỏng
mỏng trong
trong 20
20 phút
phút ở
ở 37
37 C
C

- Phun dung dich thuốc thử muối fast blue B

Quan
Quan sát
sát các
các vết
vết trên
trên bản
bản mỏng
mỏng

khô bản mỏng.
Chấm 15 µl chất chứng dương galanthamine và mẫu cần khảo sát lên bản mỏng sau đó
giải ly bản mỏng trong hệ dung môi CHCl3-MeOH-H2O (65:35:5)
Phun dung dịch enzyme AChE lên bản mỏng chứa mẫu đã giải ly và sấy khô lại. Sau
đó, tiến hành ủ bản mỏng ở 37 trong 20 phút.
Phun dung dịch thuốc thử lên bản mỏng sau khi đã tiến hành ủ enzyme và đợi trong 12 phút để phản mỏng enzyme rồi quan sát bản mỏng.
Hình 4. Sơ đồ quy trình thực hiện thử nghiệm ức chế
2.1.5

Kết quả

A. Marson và cộng sự (2001) dùng TLC

AChE với thuốc thử muối fast blue B bằng sắc kí lớp
mỏng

khảo sát sự ức chế AChE với 2 chất đối chứng dương và thu được kết quả sau.
Đối với physostigmine, nồng độ tối thiểu để có thể quan sát được sự ức chế AChE
(giới hạn phát hiện) là 0.001 µg, còn galanthamine thì ở mức 0.01 µg. (hình 4).
11
11


Một số alkaloid khác như boldine, caffeine và quinine ức chế AChE ở nồng độ tối
thiểu lần lượt là 0.1 µg, 1 µg và 10 µg. Một flavonoid là kaempferol cũng cho hoạt ức
chế ở 10 µg. Tất cả các hợp chất này đều cho hoạt tính kém.
Tất cả các dịch chiết từ cao EtOH của các cây khảo sát đều thể hiện hoạt tính ức
chế AChE ngoại trừ cao của Sprekelia formosissima.

Hình 6. Bản mỏng sau khi ủ với enzyme và phun hỗn hợp dung dịch thuốc thử được thực hiện trên: 1
galathamine , và một số cao EtOH 80% (15 μg) như 2 Galanthus nivalis, 3 Leucojum vernum, 4
Narcissus pseudonarcissus, 5 Chelidonium majus, 6 Ismene festalis, 7 Nerine bowdenii, 8 Crinum
powellii, 9 Sprekelia formosissima.

12
12


Hình 5. Bản mỏng sau khi ủ với enzym và phun hỗn hợp dung dịch thuốc thử được thực
hiện trên hai chất đối chứng: (a) galanthamine (0.0001-1 μg) và (b) physostigmine
(0.00001-0.1 μg).
Dung môi giải ly: CHCl3-MeOH-H2O (65:35:5).

2.2

THỬ NGHIỆM TLC VỚI THUỐC THỬ ELLMAN

2.2.1

Khảo sát sự ức chế cho kết quả dương tính thật[9]

2.2.3.3

Cơ sở lý thuyết

13
13

Hình 7. Sơ đồ xác định hoạt tính của enzyme bằng phương pháp Ellman

Acetylthiocholine (ATC) bị thủy phân với xúc tác enzyme AChE thành sản phẩm là
thiocholine. Sau đó, sản phẩm này tiếp tục phản ứng với thuốc thử 5,5’-dithiobis-(2nitrobenzoic acid) (DTNB) cho sản phẩm 5-thio-2-nitrobenzoate có màu vàng.
Tại những vị trí enzyme bị ức chế thì trên bản mỏng sẽ quan sát thấy xuất hiện các
điểm màu trắng trên nền vàng do không xảy ra phản ứng giữa thiocholine và thuốc thử
Ellman sau khi bản mỏng được chấm mẫu, giải ly, phun enzyme và phun thuốc thử.
2.2.3.4

Nguyên liệu

1, Hymanocallis × festails ‘Zwanenburg’; 2, Chlidanthus fragrans Herb; 3,
Narcissus ‘Avalanche’ (Tazetta); 4, Nerine bowdenii; 5, Narcissus ‘Grand Soleil
d’Or’(Tazetta); 6, Zephyranthes candida (Lindl) Herb; 7, Crinum × powellii Baker; 8,
Polianthes tuberosaL; 9, Amaryllis belladonna L; 10, Eucharis amazonica Linden
exPlanch; 11, × Hippeastrelia; 12, Habranthus robustus Herb. Ex Sweet; 13,
Rhodophiala bifida (Herb) Traub; 14, Hymencallis ‘Sulphur’ Queen’; 15, Sprekelia
formosissima (L.) Herb.
2.2.3.5

Hóa chất, dụng cụ và cách pha hóa chất

2.2.3.5.1 Hóa chất và dụng cụ

Bản silica gel 60 F254 (Merck).
14
14


Enzyme AChE, tris-HCl, DTNB (Sigma), ATCI (Sigma), BSA, galanthamine

hydrobromide, physostigmine (eserine), carbachol (Sigma); pancracine, lycorine,
tazettine (Dr. Serap Whitmer).
2.2.3.5.2 Cách pha các dung dịch

Dung dịch đệm A: tris-HCl 50 mM pH 8.
Dung dịch đệm B: đệm A chứa 0.1 % BSA.
Dung dịch enzyme: từ mẫu enzyme AChE đã được đông cô chân không, pha
loãng với đệm A để thu được dung dịch enzyme gốc có nồng độ 1000 U/ml. Tiếp tục
pha loãng dung dịch enzyme với đệm B để thu được dung dịch enzyme AChE có nồng
độ 3 U/ml dùng cho sắc kí lớp mỏng.
Dung dịch chất nền: đệm A chứa 1 mM acetylthiocholine iodide (ATCI).
Thuốc thử Ellman: đệm A chứa 1 mM DTNB và 1 mM ATCI.
2.2.3.6

Phương pháp

2.2.3.6.1 Mẫu chiết

Phơi khô và nghiền nhuyễn nguyên liệu của 15 loại cây Amaryllidaceae thành
dạng bột.
Bột cây của từng loại (1 g) được trích bằng phương pháp ngâm dầm với 10 ml
methanol và toluene riêng biệt ở nhiệt độ phòng trong 24 giờ cho mỗi lần trích và quá
trình được lặp lại trong một tuần. Các dịch chiết được cô quay dưới áp suất thấp thu
được cao methanol và cao toluene.

15
15


Quy trình thực hiện

2.2.3.6.2
Mẫu
Mẫu với
với nồng
nồng độ
độ
10
10 mg/ml
mg/ml

- Sắc kí bản mỏng, giải ly trong
hệ CHCl3-MeOH (8:2)

Mẫu
Mẫu đã
đã giải
giải ly
ly trên
trên bản
bản mỏng
mỏng

- Phun thuốc thử Ellman

Sấy
Sấy khô
khô bản
bản mỏng
mỏng 3-5

3-5 phút
phút

- Phun dung dịch enzyme AChE

Quan
Quan sát
sát các
các vết
vết trên
trên bản
bản mỏng
mỏng

Pha mẫu cao methanol và toluene trong methanol để được mẫu có nồng độ 10
mg/ml.
2.5 μl của từng loại dung dịch mẫu nói trên và dung dịch đối chứng galanthalmine
được dùng để chấm lên bản mỏng rồi giải ly bản mỏng trong hệ dung môi CHCl 3MeOH (8:2).
Phun dung dịch thuốc thử Ellman lên bản mỏng đã sấy khô cho đến khi bản mỏng
bão hòa dung dich thuốc thử.
Sấy khô bản mỏng trong 3-5 phút
rồi phun dung dịch enzyme AChE 3

Hình 5. Sơ đồ quy trình thực hiện thử nghiệm ức chế

U/ml lên bản mỏng.

AChE với thuốc thử Ellman bằng sắc kí lớp mỏng

Sau khoảng 5 phút thì bản mỏng

sẽ chuyển sang màu vàng và có
những điểm trắng thể hiện khả năng ức chế enzyme AChE. Ghi nhận kết quả trong 15
phút từ khi bản mỏng chuyển màu vì sau 20-30 phút thì kết quả sẽ biến mất.
Tương tự như các bước trên, chấm 1.5 μl galanthamine, physostigmine,
pancracine, lycorine, tazettine, carbachol với các nồng độ khác nhau (5 mM – 5 µM)
16
16


lên bản mỏng để xác định nồng độ tối thiểu để có thể quan sát được sự ức chế enzyme
AChE là những điểm trắng trên nền màu vàng.

Kết quả

2.2.3.7

Sử dụng lượng dung dịch phun phải phù hợp. Nếu phun quá nhiều thì các điểm
trắng trên nền vàng sẽ bị lan rộng và kéo dài ra khi đó ta sẽ khó quan sát được kết quả.
Và bản mỏng sẽ được làm khô sau khi phun chất nền rồi mới phun dung dịch enzyme
AChE.
In Kyung Rhee và cộng sự (2001) thử nghiệm trên cao methanol và toluene của 15
loại cây thuộc họ Amaryllidaceae và một số chất đối chứng dương thu được các kết
quả sau:

Hình 7. Kết quả ức chế AChE trên TLC của 15 cao methanol nguyên liệu thuộc họ
Amaryllidaceae (1, Hymanocallis × festails ‘Zwanenburg’; 2, Chlidanthus fragrans Herb; 3,
Narcissus ‘Avalanche’ (Tazetta); 4, Nerine bowdenii; 5, Narcissus ‘Grand Soleil
d’Or’(Tazetta); 6, Zephyranthes candida (Lindl) Herb; 7, Crinum × powellii Baker; 8,
Polianthes tuberosaL; 9, Amaryllis belladonna L; 10, Eucharis amazonica Linden exPlanch;
11, × Hippeastrelia; 12, Habranthus robustus Herb. Ex Sweet; 13, Rhodophiala bifida

(Herb) Traub; 14, Hymencallis ‘Sulphur’ Queen’; 15, Sprekelia formosissima (L.) Herb) và
chất đối chứng galanthamine.

17
17


Hình 8 : Kết quả ức chế AChE trên TLC của 15 cao toluene nguyên liệu thuộc họ Amaryllidaceae (1,
Hymanocallis × festails ‘Zwanenburg’; 2, Chlidanthus fragrans Herb; 3, Narcissus ‘Avalanche’ (Tazetta);
4, Nerine bowdenii; 5, Narcissus ‘Grand Soleil d’Or’(Tazetta); 6, Zephyranthes candida (Lindl) Herb; 7,
Crinum × powellii Baker; 8, Polianthes tuberosaL; 9, Amaryllis belladonna L; 10, Eucharis amazonica
Linden exPlanch; 11, × Hippeastrelia; 12, Habranthus robustus Herb. Ex Sweet; 13, Rhodophiala bifida
(Herb) Traub; 14, Hymencallis ‘Sulphur’ Queen’; 15, Sprekelia formosissima (L.) Herb) và chất đối chứng
galanthamine.

Bảng 1. Nồng độ tối thiểu có thể quan sát được khả năng ức chế enzyme của một số chất
đối chứng trong phương pháp Ellman
Akaloid

Giới hạn phát hiện (μg)

Galanthamine

0.01

Physostigmine

0.01

Pancracine

0.1

Carbachol

0.1

Lycorine

0.2

Tazettine

>0.5

Khi sử dụng nhiều loại bản mỏng khác nhau: bản silica gel, bản nhôm oxid, bản
pha đảo, bản tinh bột, bản polyamide rút ra được các kết quả[8]:
i.

Bản mỏng nhôm oxid cho nền vàng rõ hơn nhưng điểm trắng lại kéo dài hơn so
với bản silica gel.
18
18


ii.

Bản silica gel cần lượng enzyme nhiều hơn để có thể quan sát được sự ức chế.

iii.

Sau khi giải ly với hệ dung môi phù hợp thì trên bản nhôm oxid sẽ quan sát thấy
hiện tượng kéo dài đuôi. Bề dày của bản silica gel cũng ảnh hưởng đến kết quả.
Thí dụ như với bề dày 1 mm thì nhận được nền vàng rõ hơn nhưng lại cần một
lượng enzyme và mẫu lớn.
Khảo sát sự ức chế cho kết quả dương tính giả[10]

2.2.2

Ngoài những chất cho khả năng ức chế thực sự thì bên cạnh đó có những chất tuy
cho kết quả dương tính nhưng thực tế không có hoạt tính ức chế AChE. Dựa vào
phương pháp Ellman có thể phát hiện những chất cho kết quả dương tính giả bằng thử
nghiệm

với

một

số

aldehyde

(heptanal,

decanal,

cinnamaldehyde,

4-

dimethylaminobenzaldehyde, 3-metoxy-4-hyroxybenzaldehyde) và một số amine
(diethylamine, triethylamine, ethanolamine, triethanolamine, hexylamine, trypamine
hydrochloride và tyramine hydrocloride). Thực hiện song song hai quy trình:
Quy trình 1
Mẫu với nồng độ
10 mg/ml
- Sắc kí bản mỏng, giải ly trong
hệ CHCl3-MeOH (8:2)
Mẫu đã giải ly trên
bản mỏng
- Phun thuốc thử Ellman
Sấy khô bản mỏng
3-5 phút
- Phun dung dịch enzyme AChE

Quy trình 2
Mẫu với nồng độ
10 mg/ml
- Sắc kí bản mỏng, giải ly trong
hệ CHCl3-MeOH (8:2)
Mẫu đã giải ly trên
bản mỏng
- Phun dd thiocholine
• Enzyme gốc 3 U/ml
ATCI 1 mM
Sấy khô bản •mỏng
3-5 phút
- Phun dung dịch DTNB 1 mM
- Sấy khô bản mỏng

•

Quan sát các vết

Quan sát các vết

trên bản mỏng

trên bản mỏng

Quy trình 1: giống như quy trình khi khảo sát chất ức chế dương tính thật. Chấm
các mẫu aldehyde và amine đã được pha trong methanol với các nồng độ khác nhau
19
19


trên trên hai loại bản mỏng silica gel và nhôm oxid. Sau đó phun hỗn hợp thuốc thử
DTNB-ATCI (1mM DTNB và 1mM ATCI pha trong đệm 50 mM tris-HCl (pH =
8 )) cho đến khi bản mỏng bão hòa, để khô bản khoảng 3-5 phút rồi phun dung dịch
enzyme AChE 3 U/ml. Sau 5 phút, bản mỏng sẽ xuất hiện vệt màu trắng trên nền
•

màu vàng.
Quy trình 2: giống như quy trình 1 nhưng thứ tự phun thuốc thử khác nhau. Sau khi
bản mỏng chứa mẫu đã giải, phun dung dịch đã được trộn dung dịch enzyme AChE
3 U/mL và ATCI 1 mM ( dung dịch thiocholine) rồi ủ bản mỏng trong 15 phút cuối
cùng là phun dung dịch DTNB 1 mM lên bản mỏng sẽ thu được các diểm trắng trên
nền vàng của bàn mỏng
Nếu là chất ức chế thật (như galanthamine và physostigmine) thì khi phun thuốc

thử DTNB lên bảng mỏng theo quy trình 2 sẽ không quan sát thấy điểm trắng trên nền
vàng còn chất ức chế giả sẽ cho thấy điểm trắng trên nền vàng.
Kết quả TLC theo quy trình 1 cho thấy có sự ức chế AChE và ức chế phản ứng
giữa ATC với DTNB. Kết quả TLC theo quy trình 2 chỉ cho thấy có sự ức chế phản
ứng giữa ATC với DTNB. So sánh kết quả TLC theo hai quy trình có thể phân biệt
nhóm hợp chất nào có hoạt tính ức chế enzyme AChE hay ức chế phản ứng giữa ATC
với DTNB.
In K. Rhee và cộng sự (2001) đánh giá sự ức chế dương tính giả bằng TLC với
một số aldehyde, amine, các dịch chiết từ cao ethanol cua cây Nerrine bowdenii

Dịch

Cao toluene của N.
hexane :
bowdenii
nước

methanol
hexane
50 %
Dịch
Dịch
hexane

methanol 50
%

Dịch

nước

chlorofo
Dịch
Dịch
rm
chlorofor
nước
m

Hình 9. Các phân đoạn chiết cao toluene của N. bowdenii

20
20


Bảng 2. Kết quả xác định dương tính giả trong thừ nghiệm ức chế enzyme AChE
Bản silica gel
Nồng độ

Bản nhôm oxid

[mM (%)]

Ức chế do
phản ứng
hóa học

Ức chế do
enzyme

Ức chế do

phản ứng
hóa học

Ức chế do
enzyme

Heptanal

720 (10%)

+

+

+

+

Decanal

530 (10%)

+

+

+

+

Cinanamaldehyde

790 (10%)

+

+

+

+

Anisaldehyde

820 (10%)

+

+

+

+

Benzaldehyde

100

+

+

-

-

4-dimethylaminobenzaldehyde

100

-

+

-

+

3-etoxy-4-hydroxybenzaldehyde

100

-

+

-

+

Diethylamine

960 (10%)

-

+

-

+

Triethylamine

717 (10%)

-

+

-

+

Ethanolamine

1670 (10%)

-

-

-

-

Triethanolamine

750 (10%)

-

+

-

+

Hexylamine

756 (10%)

+

+

+

+

Tryptamine

50

+

+

+

+

Tyramine

50

-

+

-

+

Galanthamine

1

-

+

-

+

Physostigmine

1

-

+

-

+

Hợp chất

Áp dụng phương pháp này có thể xác định được các hợp chất hoặc cao thô nào
mới thực sự có hoạt tính ức chế AChE.
Một thí dụ là trích lỏng-lỏng cao toluene của Nerine bowdenii với các dung môi
hexane, chloroform, methanol 50% (methanol pha trong nước) thu được các dịch
tương ứng (hình 9).
Các dịch chiết hexane, chloroform, methanol 50% được tiến hành theo hai quy
trình để đánh giá hoạt tính ức chế AChE.

21
21

A

B

C

Hình 10. Thử nghiệm xác định khả năng ức chế AChE và hiện tượng dương tính giả của các dịch chiết từ
Nerine bowdenii. Bản mỏng được chấm các mẫu dịch chiết toluene (1), hexane (2), chloroform (3), methanol
50% và được giải ly trong hệ dung môi CHCl3 - methanol (10:1).

•

Hình A: vệt màu trắng trên nền vàng thể hiện sự ức chế khi phun DTNB 1 mM/ ATCI 1 mM trong tris-

•

hydrochloride 50 mM rồi phun 3 units/mL AChE.
Hình B: vệt màu trắng trên nền vàng thể hiện sự ức chế giả khi phun 3 units/mL AChE/ ATCI 1 mM

•

(thiocholine) rồi phun DTNB 1 mM.
Hình C : hiện hình với thuốc thử anisaldehyde

Từ kết quả thu được (hình 10) cho thấy mặc dù các dịch chiết có chứa nhiều hợp
chất ức chế, tuy nhiên chỉ có một số hợp chất có hoạt tính ức chế. Trong 4 dịch chiết
chỉ có dịch chiết chloroform có chứa nhiều hợp chất ức chế nhất. Từ đó có thể sử dung
cao chiết chloroform để cô lập các hợp chất ức chế có trong Nerine bowdenii.

2.2.3

Khảo sát sự ức chế enzyme bằng sắc kí bản mỏng hiệu năng cao[11,12,13]

Ngoài kỹ thuật TLC, kỹ thuật sắc kí lớp mỏng hiệu năng cao (HPTLC) cũng có thể
áp dụng để khảo sát sự ức chế AChE. Kỹ thuật HPTLC được dùng để định tính, thử
tinh khiết , có thể bán định lượng và định lượng.
Về nguyên tắc cơ bản HPTLC không khác nhiều so với TLC. Điểm khác chủ yếu
là quá trình chấm sắc ký được điều khiển và thực hiện bằng máy, chất hấp thu pha tĩnh
có kích thước nhỏ hơn, số vết, lượng dịch chiết sẽ chấm trên bản mỏng được xác lập
trên máy vi tính. Quá trình chấm dịch chiết thực hiện với sự hỗ trợ của máy nén khí
hoặc bình khí nén. Sau khi triển khai, sắc ký đồ được chụp ảnh qua buồng chụp
(reprostar 3) và kết quả được đánh giá bằng phần mềm Videoscan.
22
22


HPTLC cho phép chấm nhanh nhiều lần những dung dịch pha loãng chất cần phân
tích. Bản mỏng được tráng sẵn chất hấp thu có chất phát quang thích hợp.
Khi làm sắc ký lớp mỏng bán định lượng, độ chính xác của kết quả phân tích phụ
thuộc rất nhiều vào độ chính xác của lượng chất thử đưa lên bản mỏng, tức là thể tích
dung dịch chấm lên bản mỏng. Do đó, với những trường hợp phân tích bán định lượng
phải dùng các mao quản định mức chính xác. Khi không cần định lượng dùng
micropipet hoặc ống mảo quản thường.
Theo nghiên cứu của Christel Weins và cộng sự năm 1996 đã sử dụng kỹ thuật
HPTLC đánh giá sự ức chế AChE thu được kết quả ở bảng 3.

Bảng 3. Giới hạn xác định của các hợp chất ức chế cholinesterase trong HPTLC
Cơ chất

Parathion-ethyl sau khi đã oxi hóa
Paraoxon-ethyl
Paraoxon-methyl
Mevinphos
Dichlorvos
Carbaryl
Aldicarb
Butoxycarboxim
Butocarboxim
Oxamyl

Giới hạn xác định (ng)
0.045
0.013
0.400
0.200
0.200
0.200
0.400
0.100
0.800
0.800
23
23


Pentachlorophenol

20.000

Mẩu và chất chuẩn

Sắc kí lớp mỏng chọn lọc

Rửa bản mỏng
Linomat 5

Chuẩn bị bản mỏng

applicator

Áp dụng mẫu và chất chuẩn
Buồng
giải li
Phát triển bản mỏng

Xác định vết, quét, phổ đồ

Máy quét

Xuất dữ liệu hình ảnh
kỹ thuật số

Hình 10. Sơ đồ kỹ thuật HPTLC
24
24


3.

TỔNG KẾT
Các hợp chất cho hoạt tính ức chế enzyme AChE thường có chứa nitrogen.
Mặc dù TLC là phương pháp định tính với độ nhạy không cao nhưng phương pháp

cũng có thể giúp nhận biết được các hoạt tính ức chế enzyme vào giai đoạn đầu nghiên
cứu. Từ đó có thể chọn cao thô nào có chứa nhiều hợp chất cho hoạt tính ức chế dể cô
lập.
Bên cạnh phát hiện các hợp chất cho hoạt tính ức chế thật thì có thể phát hiện ra
các hợp chất có hoạt tính ức chế giả bằng phương pháp Ellman.
Với thuốc thử muối fast blue B thì có thể xác định hợp chất cho hoạt tính ức chế
AChE nhưng cũng không thể kết luận được các hợp chất đó không cho kết quả dương
tính giả vì chưa tìm thấy được tài liệu nào vấn đề đó. Đây có thể là hướng nghiên cứu
mới trong việc khảo sát sự ức chế AChE.
Kĩ thuật HPTLC cũng có thể đánh giá sự ức chế của enzym AChE, nhanh hơn kĩ
thuật TLC thông thường tiết kiệm thời gian hơn, có thể dùng để bán định lượng và
định lượng.

25
25