Khóa luận bước đầu nghiên cứu ảnh hưởng của ba kết hợp với NAA và 2,4 d lên mẫu cây lá kim ngân ( lonicera japonica thunb )

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KỸ THUẬT CÔNG NGHỆ TP. HỒ CHÍ MINH
KHOA MÔI TRƯỜNG VÀ CÔNG NGHỆ SINH HỌC
------------o0o-----------

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP
BƯỚC ĐẦU NGHIÊN CỨU ẢNH HƯỞNG CỦA BA KẾT
HỢP VỚI NAA VÀ 2,4-D LÊN MẪU CẤY LÁ KIM NGÂN
(Lonicera japonica Thunb)
Chuyên ngành: Công Nghệ Sinh Học
Mã ngành

: 111

GVHD: CN. BÙI VĂN THẾ VINH
SVTH : NGUYỄN THÁI QUỲNH QUYÊN
MSSV : 105111053

Tp. Hồ Chí Minh, tháng 07 năm 2009


1. Đầu đề đồ án tốt nghiệp

BƯỚC ĐẦU NGHIÊN CỨU ẢNH HƯỞNG CỦA BA KẾT HỢP VỚI NAA VÀ
2,4-D LÊN MẪU CẤY LÁ KIM NGÂN (Lonicera japonica Thunb)
2. Nhiệm vụ (yêu cầu về nội dung và số liệu ban đầu)
HỌ VÀ TÊN: NGUYỄN THÁI QUỲNH QUYÊN

MSSV:105111053

NGÀNH: CÔNG NGHỆ SINH HỌC

LỚP: 05DSH

 Bước đầu khảo sát phản ứng của mẫu lá Kim Ngân trong điều kiện in vitro.
 Xác định thời gian khử trùng thích hợp đối với mẫu cấy lá để tìm ra thời gian khử trùng
cho tỉ lệ nhiễm thấp nhất và mẫu cấy vẫn còn có khả năng tăng trưởng.
 Khảo sát cách đặt mẫu lá của Kim Ngân Hoa để tìm ra cách đặt mẫu cho khả năng phát
sinh hình thái nhanh và tốt nhất.
 Đánh giá tác động của chất kích thích tăng trưởng (BA, 2,4-D, NAA) ở các nồng độ khác
nhau lên sự phát sinh hình thái của mẫu cấy.
3. Ngày bàn giao Đồ án tốt nghiệp: 1/04/2009
4. Ngày hoàn thành nhiệm vụ: 30/6/2009
5. Họ tên người hướng dẫn

Phần hướng dẫn

CN. Bùi Văn Thế Vinh

Toàn bộ Đồ án

Nội dung và yêu cầu LVTN đã được thông qua Bộ môn.
Ngày …… tháng……..năm 2009
CHỦ NHIỆM BỘ MÔN

NGƯỜI HƯỚNG DẪN CHÍNH

( Ký và ghi rõ họ tên)

PHẦN DÀNH CHO KHOA, BỘ MÔN
Người duyệt (chấm sơ bộ): ......................................................

Đơn vị:.......................................................................................
Ngày bảo vệ: ............................................................................
Điểm tổng kết:...........................................................................
Nơi lưu trữ Đồ án tốt nghiệp: ...................................................

(Ký và ghi rõ họ tên)


Lời cảm ơn
Em xin chân thành cảm ơn:

 Ban Giám hiệu Trường Đại học Kỹ Thuật Công Nghệ Thành phố Hồ Chí Minh,
Ban chủ nhiệm Bộ Môn Công Nghệ Sinh Học, cùng tất cả quý thầy cô đã
truyền đạt kiến thức cho em trong suốt quá trình học tập tại trường.
 Thầy Bùi Văn Thế Vinh đã tận tình hướng dẫn, truyền đạt kinh nghiệm và giúp
đỡ em trong suốt thời gian thực hiện đề tài.
 Thầy Phạm Minh Nhựt và các thầy cô, anh chò nhân viên tại Phòng Thí
Nghiệm khoa Môi Trường và Công Nghệ Sinh Học thuộc Trường Đại học Kỹ
Thuật Công Nghệ Thành phố Hồ Chí Minh đã tận tình hướng dẫn và giúp đỡ
em hoàn thành khoá luận này.
 Cha mẹ đã suốt đời tận tụy để con có được ngày hôm nay.
 Xin gửi lời cảm ơn đến tập thể lớp 05DSH đã gắn bó, giúp đỡ tôi trong suốt 4
năm qua.

Sinh viên thực hiện

Nguyễn Thái Quỳnh Quyên


DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

 2,4-D

: 2,4-dichlorophenolxyacetic acid

 BA

: 6-benzyladenine

 MS

: Môi trường MS (Murashige và Skoog,1962)

 NAA

: α – Naphthalene acetic acid


DANH MỤC BẢNG
Bảng 2.1.

Các cơ quan thực vật được dùng trong nuôi cấy mô

Bảng 3.1.

Môi trường MS bổ sung 2,4-D và BA ảnh hưởng lên sự phát sinh hình
thái của mẫu lá Kim Ngân Hoa

Bảng 3.2.

Môi trường MS bổ sung NAA và BA ảnh hưởng lên sự phát sinh hình

thái của mẫu lá Kim Ngân Hoa

Bảng 4.1.

Kết quả khảo sát thời gian khử trùng mẫu cấy lá Kim Ngân Hoa

Bảng 4.2.

Ảnh hưởng của cách đặt mẫu cấy lên sự phát sinh hình thái sau 1
tháng nuôi cấy

Bảng 4.3.

nh hưởng của chất kích thích tăng trưởng BA kết hợp 2,4-D lên sự
phát sinh hình thái của mẫu lá Kim Ngân Hoa được ghi nhận sau 1
tháng nuôi cấy

Bảng 4.4.

nh hưởng của chất kích thích tăng trưởng BA kết hợp NAA lên sự
phát sinh hình thái của mẫu lá Kim Ngân Hoa được ghi nhận sau 1
tháng nuôi cấy


DANH MỤC HÌNH
Hình 2.1.

Cây Kim Ngân Hoa (Lonicera japonica Thunb)

Hình 2.2.

Một số hình ảnh về Kim Ngân Hoa

Hình 2.2.

Hoa Kim Ngân phơi khô

Hình 4.1.

Cách đặt mẫu lá

Hình 4.2.

Mô sẹo phát sinh từ mẫu lá được đặt theo 2 cách khác nhau

Hình 4.3.

Ảnh hưởng của BA kết hợp với 2,4-D lên sự phát sinh mô sẹo của
mẫu lá Kim Ngân Hoa

Hình 4.4.

Ảnh hưởng của BA kết hợp với NAA lên sự phát sinh mô sẹo của mẫu
lá Kim Ngân Hoa


1.1.

Ñaët vaán ñeà

Kim Ngân hoa (Lonicera japonica Thunb) thuộc Họ Kim Ngân (Caprifolianceae)
là cây dược liệu chứa tanin và một saponin. Hoa chứa một flavonoid là scolymosid
lonicerin và một số carotenoid (ε. caroten, cryptoxanthin, auroxanthin). Quả mọng
giàu carotenoid mà phần lớn là cryptoxanthin. Lá chứa một glucosid gọi là loganin và
khoảng 8% tanin.
Theo Y học cổ truyền: Kim Ngân Hoa có tác dụng thanh nhiệt giải độc.
Theo kết quả nghiên cứu dược lý hiện đại chứng minh cây thuốc Kim Ngân Hoa
có tác dụng: kháng khuẩn, chống viêm, làm giảm chất xuất tiết, giải nhiệt và làm
tăng tác dụng thực bào của bạch cầu, tác dụng hưng phấn trung khu thần kinh cường
độ bằng 1/6 của cà phê, làm hạ cholesterol trong máu, tăng bài tiết dòch vò và mật.
Khi nghiên cứu tác dụng kháng khuẩn in vitro bằng các phương pháp khuyếch tán
và hệ nồng độ, người ta thấy nước sắc cô đặc 100% của hoa Kim Ngân có tác dụng
kháng khuẩn mạnh đối với các trực khuẩn lỵ, dòch hạch, thương hàn, cận thương hàn,
liên cầu khuẩn tan máu, phẩy khuẩn tả. Tác dụng yếu hơn đối với các trực khuẩn
bạch hầu, E.Coli, phế cầu, tụ cầu khuẩn vàng. Nước sắc lá Kim Ngân với nồng độ
201,2% ức chế trực khuẩn Shiga, với nồng độ 2050% ức chế trực khuẩn cận thương
hàn, nồng độ 100% có tác dụng đối với tiêu cầu khuẩn (Tài Nguyên Cây Thuốc Việt
Nam).
Mặc khác, Kim Ngân cũng là dược liệu quý được dùng điều trò ung thư trong Đông
và Tây y như ung thư tuyến vú, gan, vòm họng, cổ tử cung, u bướu giáp trạng, trực
tràng,..
Ngoài tác dụng hoa lá làm thuốc, ứng dụng trong mỹ phẩm, cho cảnh đẹp,
hoa thơm, mành che nắng và mái che nắng, Kim Ngân còn có tác dụng hấp thu nhiệt
của ánh nắng mặt trời (cho cây quang hợp và phát triển) nên mát hơn mành tre, mành
nhựa và mái tôn chống nóng. Ngoài ra, nó còn hút thán khí (CO 2), nhả dưỡng khí (O2)
làm sạch môi trường, tạo bầu không khí trong lành.
Việt Nam được xem là một nước có nguồn dược liệu phong phú và đa dạng với số
lượng trên 3.800 loài cây làm thuốc trên tổng số hơn 10.600 loài thực vật và là thò
trường đầy hứa hẹn khi nhu cầu sử dụng rất lớn không chỉ là thuốc mà xu thế mỹ

phẩm dùng nguyên liệu từ thiên nhiên thay thế nguyên liệu tổng hợp đã chiếm 90%
tổng số mỹ phẩm được sản xuất.


Tuy nhiên, trong vấn đề sản xuất, kinh doanh và lưu thông, phân phối dược liệu,
nguồn dược liệu chưa tương xứng với tiềm năng hiện có và còn rất nhiều bất cập.
Hơn 90% nguyên liệu sản xuất thuốc trong nước vẫn phải nhập khẩu, chủ yếu sản
xuất những loại thuốc thông thường, ngay cả những mặt hàng thuộc về thế mạnh của
Việt Nam là các loại thuốc y học cổ truyền (YHCT), dược liệu lưu hành trên thò
trường cũng chủ yếu nhập từ Đài Loan, Trung Quốc, Singapore.
Tại TP.HCM, nơi chiếm đến 70% tỷ trọng số lượng thành phẩm và nguyên liệu
dược liệu của cả nước, 90% mặt hàng đông dược lưu hành trên thò trường là hàng
nhập lậu.
Một điều đáng lưu tâm nữa là chất lượng dược liệu hiện nay vẫn chưa được kiểm
soát (trên 50% mẫu kiểm tra không đạt tiêu chuẩn chất lượng) và tỷ lệ này với các
loại thuốc từ dược liệu là 10%.
Ngoài ra, việc trồng dược liệu hiện nay vẫn thiếu sự quy hoạch tập trung, thiếu sự
hỗ trợ căn cơ từ nhà nước khiến thò trường dược liệu không ổn đònh, cây dược liệu vì
thế cũng không phát triển.
Vẫn chưa có một cơ quan chuyên môn nào đảm trách khâu kỹ thuật sản xuất dẫn
đến tình trạng các cây dược liệu không đảm bảo được năng suất – chất lượng – giá cả
ổn

đònh

để

cạnh

tranh

được

với

dược

liệu

nhập

khẩu.

Như vậy với giá trò to lớn của cây Kim Ngân, là cây thuốc mọc tự nhiên ở V iệt Nam
trong tình hình dược liệu của nước ta hiện nay nói chung và Kim Ngân nói riêng thì
việc đẩy mạnh nghiên cứu nhân giống bằng nuôi cấy mô theo quy mô công nghiệp để
có thể nâng cao năng suất và số lượng cây trồng trong thời gian ngắn nhất đáp ứng
được nhu cầu tiêu thụ cho thò trường Việt Nam và trên thế giới là điều hết sức cần
thiết.
1.2.

Mục đích và nội dung nghiên cứu

1.2.1.

Mục đích

Bước đầu khảo sát phản ứng của mẫu lá Kim Ngân trong điều kiện in vitro. Đồng
thời tạo tiền đề cho những nghiên cứu tách chiết các hợp chất có giá trò dược lý trong
cây Kim Ngân làm nguyên liệu phục vụ cho ngành công nghiệp dược.

1.2.2.

Nội dung nghiên cứu


Bước đầu khảo sát ảnh hưởng của các chất điều hòa tăng trưởng đến mẫu cấy lá
của cây Kim Ngân.



2.1.

Khái quát về nuôi cấy mô tế bào thực vật

2.1.1.

Khái niệm

Nhân giống in vitro hay nuôi cấy mô đều là thuật ngữ mô tả các phương thức nuôi
cấy các bộ phận thực vật trong ống nghiệm có chứa môi trường xác đònh ở điều kiện
vô trùng. Môi trường có chứa các chất dinh dưỡng thích hợp như muối khoáng,
vitamin, các hormone tăng trưởng và đường (Dương Công Kiên, 2002).
2.1.2.

Tầm quan trọng của phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật

Phương pháp nuôi cấy mô và tế bào thực vật có ý nghóa vô cùng to lớn đối với
nghiên cứu lý luận sinh học cơ bản, đồng thời nó có giá trò đóng góp trực tiếp cho thực
tiễn sản xuất và đời sống.
2.1.2.1. Về mặt lý luận sinh học cơ bản

Nuôi cấy mô đã mở ra khả năng to lớn cho việc tìm hiểu sâu sắc về bản chất của
sự sống.
Thông qua nuôi cấy mô và tế bào, chúng ta có thể tiến hành so sánh đặc tính của
cơ thể với hợp phần của chúng khi tách rời khỏi cơ thể, từ đó rút ra qui luật về mối
tương quan giữa các bộ phận trong cây.
Thực tế đã cho phép chúng ta tách và nuôi cấy trước hết là mô phân sinh rồi từ đó
cho ra nhóm tế bào không chuyên hóa gọi là mô sẹo, và từ mô sẹo có thể kích thích
để tái sinh cây hoàn chỉnh và có thể gây ra những thay đổi đònh hướng ở mức độ tế
bào (trước khi cho ra cây hoàn chỉnh).
Trong một cơ thể, rất khó phân biệt được từng giai đoạn một cách cụ thể và chính
xác theo chu kỳ phát triển của cá thể. Bằng phương pháp nuôi cấy mô, chúng ta có
thể khắc phục được khó khăn trên và dễ dàng tạo ra các bước phát sinh hình thái được
phân biệt một cách rõ rệt. Từ đó có thể tìm ra các mấu chốt thúc đầy sự phát triển của
cây trồng theo chiều hướng mong muốn.
Bằng phương pháp nuôi cấy mô và tế bào, chúng ta có thể tìm hiểu và tiến hành
nghiên cứu mối quan hệ khởi đầu giữa ký sinh và ký chủ. Từ đó, người ta tìm ra được
những cơ chế miễn dòch thực vật. Khi con người hoàn toàn làm chủ được cơ chế này
thì các biện pháp phòng bệnh được hoàn thiện và như vậy việc chống bệnh sẽ trở nên
đỡ tốn kém hơn rất nhiều.
2.1.2.2. Về mặt thực tiễn sản xuất


Ngoài tác dụng nghiên cứu lý luận sinh học cơ bản, phương pháp nuôi cấy mô còn
có những đóng góp hết sức cụ thể đối với sản xuất và đời sống.
Ý nghóa thực tiễn quan trọng nhất của nuôi cấy mô tế bào là áp dụng kỹ thuật sản
xuất đại trà có kiểm soát trong tạo giống và nhân giống cây trồng. Những lợi ích trong
việc áp dụng nuôi cấy mô trong sản xuất nông nghiệp và lâm nghiệp được tóm tắt
như sau:


Kiểm soát được dòch bệnh cây trồng. Bằng phương pháp nuôi cấy mô hay
nuôi cấy tế bào, ta hoàn toàn có thể loại được những cá thể nhiễm bệnh hay
mang mầm bệnh.



Kiểm soát được chất lượng giống thông qua kiểm soát kiểu gen của giống
đem vào sản xuất.



Kiểm soát được toàn bộ kỹ thuật từ khâu nhân giống đến khâu thu hoạch.



Tạo ra sự đồng loạt về giống, từ đó tạo ra sự đồng loạt của sản phẩm cuối.
Sự đồng loạt này sẽ giúp cơ giới hóa được khâu trồng trọt và khâu thu hoạch.
Do đó, năng suất lao động sẽ tăng lên. Chất lượng sản phẩm đồng nhất, tạo
điều kiện cho khâu tiêu thụ và chế biến.

Tóm lại, nuôi cấy mô hay nuôi cấy tế bào thực vật đã đem lại hiệu quả to lớn
trong sản xuất nông nghiệp và lâm nghiệp. Đây thực sự đã và đang là cuộc cách
mạng xanh trong ngành trồng trọt.
2.1.3.

Những thuận lợi và khó khăn của phương pháp nhân giống in vitro

Một số thuận lợi của phương pháp nhân giống in vitro (Pierik, 1975, Anonymous,
1980; van Assche, 1983; Gebhard và cộng sự, 1983; Kunneman-Kooij, 1984):
 Nhân giống vô tính in vitro nhanh hơn nhân giống vô tính in vivo.

 Có thể tái sinh được một số loài thực vật mà không thể tiến hành in vivo và sự
tăng trưởng của những cây nhân giống vô tính in vitro thường mạnh hơn do
nhân giống in vitro có thể cảm ứng được sự trẻ hóa của mô và tạo được cây
sạch bệnh vì có sự chọn lọc các đối tượng sạch bệnh để đưa mẫu vào nuôi cấy,
đồng thời cũng có thể xử lý mẫu cấy của các cây có mang mầm bệnh trước khi
đưa vào môi trường nuôi cấy. Các cây sạch bệnh này có thể được trao đổi dễ
dàng giữa các nơi với nhau do cây có kích thước nhỏ và không trồng trong đất.


 Trong nuôi cấy in vitro chỉ sử dụng những mẫu cấy ban đầu rất nhỏ cho nên có
thể chọn lọc kỹ lưỡng và dễ dàng.
 Do cây in vitro được nuôi cấy trong điều kiện hoàn toàn thích hợp (nguồn dinh
dưỡng và điều kiện môi trường) do đó có thể sản xuất cây con quanh năm.
 Có thể sử dụng cây nhân giống in vitro để làm cây mẹ cho các bước nhân
giống kế tiếp.
 Có thể tạo ra các đột biến điểm trong quá trình nuôi cấy.
 Phương pháp nhân giống in vitro đặc biệt hữu dụng để tạo ra các ngân hàng
gen.
 Các tế bào trần và huyền phù tế bào là đối tượng hữu dụng trong việc lai soma.
 Một số loại cây bò mất khả năng sinh sản hữu tính như các cây đơn bội, cây bất
thụ đực, cây bất thụ do đột biến… có thể được duy trì và nhân giống bằng
phương pháp nhân giống in vitro.
Tuy nhiên bên cạnh những thuận lợi trên, phương pháp nhân giống in vitro có
những bất lợi sau:


Kiểu gen thực vật không được ổn đònh trong một số hệ thống nuôi cấy.



Đặc biệt đối với một số loài cây thân gỗ, việc cảm ứng rễ rất khó thực hiện.



Việc chuyển cây từ trong ống nghiệm ra vườn ươm rất khó đối với một số
cây.



Cây khi được chuyển từ phòng thí nghiệm ra vườn ươm rất dễ bò tấn công
bởi một số loại bệnh hại do nó đã quen sống trong điều kiện vô trùng. Vì vậy,
cần phải xử lý môi trường và giá thể sống của cây thật cẩn thận.



Khả năng tái sinh cây có thể bò mất đi do việc cấy chuyển mô sẹo và huyền
phù tế bào được lặp lại nhiều lần.



Đối với một số mô, việc vô trùng trước khi đưa vào cấy rất khó thực hiện.



Phương pháp nhân giống in vitro tốn nhiều công lao động làm cho giá thành
của cây tăng lên.

2.1.4.

Ứng dụng của kỹ thuật nuôi cấy mô

Phương pháp nuôi cấy mô và tế bào thực vật được ứng dụng trong một số lónh vực
như:


 Lai tạo giữa những loài xa nhau về di truyền bằng phương pháp dung hợp (nuôi
cấy tế bào trần).
 Nuôi cấy tế bào thực vật trong môi trường lỏng (nuôi cầy huyền phù tế bào)
trên quy mô lớn để sản xuất các hợp chất thứ cấp như alkaloid, glycoside, các
steroid (dùng trong y học), chất dính dùng trong công nghiệp thực phẩm, những
chất kìm hãm sự sinh trưởng của vi khuẩn dùng trong nông nghiệp.
 Chọn lọc tế bào có những đặc tính mong muốn, cho phát triển thành cây con
thay vì chọn lọc cây ngoài đồng ruộng (nuôi cấy tế bào đơn).
 Sản xuất dòng cây đồng hợp tử (nuôi cấy bao phấn và túi phấn).
 Vi nhân giống những giống cây có giá trò khoa học và thương mại.
 Bảo quản phôi và cơ quan trong điều kiện nhiệt độ thấp.
 Nuôi cấy phôi sinh dưỡng, phôi hợp tử.
 Nuôi cấy quang tự dưỡng.
2.1.5.

Các cơ quan thực vật được dùng trong nuôi cấy mô
Bảng 2.1. Các cơ quan thực vật được dùng trong nuôi cấy mô
Nguồn gốc mẫu cấy
Đỉnh sinh trưởng
Chồi đỉnh

Kích thước

Mẫu được tách

0,5 – 1 mm

Tế bào đỉnh sinh trưởng

0,5 – 1 cm

Chốp đỉnh có chứa một
phần thân
Chồi bên có chứa một
phần thân, lá và chồi
nách
Mẫu lá được cắt nhỏ,
phân nửa được cấy chìm
vào môi trường
Phiến lá non được đặt
trên môi trường, mặt dưới
đặt trên mặt thạch
Mẫu rễ được đặt trên mặt
thạch
Mẫu được đặt trên mặt
hay được cấy chìm phân
nữa vào môi trường

Chồi bên

0,5 – 1 cm

Mẫu lá

0,2 – 0,3 cm

Phiến lá

0,2 – 1 cm

Rễ

0,5 – 1 cm

Dạng củ hành

1 – 2 cm

Hạt nảy mầm

2 – 3 mm

Hạt phấn

0,1 – 0,5 mm

Chồi non
Hạt phấn trong túi phấn


2.1.6.

Các bước nhân giống in vitro

Quá trình nhân giống in vitro được chia thành các giai đoạn sau:

2.1.6.1. Chọn lựa và khử trùng mẫu cấy
Khi chọn cây mẹ phải chú ý xác đònh đúng cây cần nhân giống. Cây mẹ phải sạch
bệnh và tốt nhất là chọn cây trồng trong nhà kính hoặc trong phòng tăng trưởng.
Kết quả nhân giống tốt nhất có thể đạt được khi mẫu cấy được lấy vào thời điểm
tăng trưởng mạnh nhất của cây mẹ.
Mục tiêu của việc khử trùng mẫu cấy là thu được một lượng lớn các mẫu cấy vô
trùng và vẫn còn khả năng tăng trưởng. Khử trùng bề mặt mẫu cấy bao gồm rửa mẫu
và khử trùng mẫu cấy.
+ Mẫu thu được phải rửa dưới vòi nước chảy từ 30 phút – 2 giờ, sau đó rửa mẫu
bằng xà phòng sẽ làm giảm đáng kể nguồn lây nhiễm trên mẫu cấy.
+ Mẫu sau khi rửa sạch sẽ được ngâm chìm trong dung dòch khử trùng để khử các
nguồn lây nhiễm trên bề mặt mẫu cấy. Dung dòch thường được sử dụng để khử trùng
mẫu là hypochlorite sodium 0,5 – 5,25%, cồn, hypochlorite calcium, oxy già, nitrate
bạc, dung dòch bromine, chlorur thủy ngân. Khi thêm Tween 20 (polyoxyethylene
sorbitan monolaurate) vào dung dòch khử trùng thì sẽ làm tăng hiệu quả khử trùng vì
làm giảm sức căng bề mặt giữa nước và mô thực vật như vậy bề mặt mẫu tiếp xúc với
chất khử trùng tốt hơn.
+ Sau khi khử trùng mẫu cấy phải được rửa lại vài lần bằng nước cất vô trùng
trong tủ cấy để rửa sạch các chất khử trùng còn bám trên bề mặt mẫu, những phần bò
tổn thương phải được cắt bỏ, đồng thời mẫu cấy phải được cắt theo kích thước thích
hợp.
+ Mẫu thực vật thường bò nhiễm bên trong và có thể được khử trùng bằng cách bổ
sung benomyl hoặc benlate 10mg/l trong môi trường nuôi cấy hoặc xử lý mẫu bằng
các chất này trước khi khử trùng.
+ Mẫu cấy của vài loài thực vật có thể hóa nâu hoặc đen sau vài ngày kể từ khi
bắt đầu nuôi cấy. Khi bò hóa nâu thì sự tăng sinh của mẫu sẽ bò ức chế và lâu ngày
mẫu sẽ chết. Hiện tượng hóa nâu này xảy ra khi trong mẫu cấy có chứa một lượng lớn
tannin hoặc các hợp chất hydroxyphenol. Các mô non thường ít bò hóa nâu hơn mô
trưởng thành hay mô già. Hiện tượng hoại tử hoặc hóa nâu là do hoạt động của

enzyme oxidase có nhân Cu (ví dụ như polyphenoloxidase và tryosinase), nó được
tổng hợp và phóng thích tùy thuộc vào vết thương trong suốt quá trình cắt và khử
trùng mẫu.
Phương pháp thường được sử dụng nhiều nhất để ngăn cản hiện tượng hóa nâu là
dùng than hoạt tính để hấp thụ bớt các hợp chất phenol được tiết ra. Lượng thường
dùng 0,5 – 5 g/l. Ngoài ra còn có một số chất khác như: polyvinyl pyrolidone (PVP),
acid ascorbic, acid citric, L–cystein, hydrochlorite, 1,4 – ditheithreitol, glutathione và
mercaptoethanol.
Khi nghiên cứu enzyme phenolase người ta thấy rằng enzyme này hoạt động mạnh
ở pH 6,5 và hoạt động yếu ở pH thấp . Vì vậy, nếu giảm pH thì sẽ giảm được hiện
tượng hóa nâu.
Tóm lại, từ kinh nghiệm thực tiễn người ta rút ra rằng để làm giảm hiện tượng hóa
nâu của mẫu cấy nên:
 Sử dụng mẫu cấy nhỏ ở mô non. Gây vết thương trên mẫu với kích thước
nhỏ nhất.
 Ngâm mẫu vào dung dòch acid ascorbic trong vài giờ trước khi cấy vào môi
trường.
 Nuôi cấy mẫu trong môi trường lỏng có lượng O 2 thấp, không có ánh sáng
trong 1 – 2 tuần đầu.
 Chuyển mẫu từ môi trường có chất kích thích sinh trưởng nồng độ thấp sang
môi trường có chất kích thích sinh trưởng nồng độ cao.
 Chuyển mẫu liên tục trong khoảng thời gian 2 – 4 tuần kể từ khi bắt đầu
nuôi cấy thì một lượng lớn các hợp chất phenol sẽ không tích tụ.
2.1.6.2. Tạo thể nhân giống in vitro
Mẫu nuôi cấy được cấy trên môi trường chọn lọc đặc biệt nhằm mục đích tạo thể
nhân giống in vitro. Có hai thể nhân giống in vitro: thể chồi, thể cắt đốt.
Tạo thể nhân giống in vitro dựa vào đặc điểm nhân giống ngoài tự nhiên của cây
trồng. Tuy nhiên, có những loài cây trồng không có khả năng nhân giống, người ta
thường nhân giống bằng cách tạo cụm chồi từ mô sẹo.

Để nhân giống, trong môi trường nuôi cấy thường bổ sung cytokinin, GA3 và các
chất hữu cơ khác.


2.1.6.3. Nhân giống in vitro
Đây là giai đoạn quan trọng trong việc nhân giống cây trồng bằng phương pháp
nuôi cấy mô tế bào thực vật nhằm mục đích tăng sinh khối thể nhân giống. Vật liệu
nuôi cấy là những thể chồi, môi trường nuôi cấy thông thường giống với môi trường
tạo thể chồi, đôi khi nồng độ chất sinh trưởng giảm thấp cho phù hợp với quá trình
nhân giống kéo dài. Điều kiện nuôi cấy thích hợp giúp cho quá trình tăng sinh được
nhanh. Cây nhân giống in vitro có trạng thái sinh lý trẻ và được duy trì trong thời gian
vô hạn.
2.1.6.4. Tái sinh cây hoàn chỉnh in vitro
Đây là giai đoạn tạo cây con hoàn chỉnh có đầy đủ thân, lá và rễ chuẩn bò chuyển
ra vườn ươm cây. Cây con phải khỏe mạnh nhằm nâng cao sức sống khi ra môi trường
bình thường. Các chất có tác dụng tạo chồi được loại bỏ, thay vào đó là các chất kích
thích quá trình tạo rễ. Điều kiện nuôi cấy tương tự với điều kiện tự nhiên bên ngoài,
một bước thuần hóa trước khi được tách ra khỏi điều kiện in vitro. Sự ra rễ phụ thuộc
vào nhiều yếu tố: hàm lượng auxin nội sinh, tỷ lệ C/N, ánh sáng, sự trẻ hòa của mẫu,
kiểu di truyền. Người ta thường bổ sung auxin để kích thích quá trình ra rễ in vitro.
2.1.6.5. Chuyển cây con in vitro ra vườn ươm
Đây là giai đoạn khó khăn nhất trong quá trình nhân giống vô tính. Cây in vitro
được nuôi cấy trong điều kiện ổn đònh về dinh dưỡng, ánh sáng, nhiệt độ, độ ẩm…
Nên khi chuyển ra đất, với điều kiện tự nhiên hoàn toàn khác hẳn như dinh dưỡng
thấp, ánh sáng có cường độ mạnh, nhiệt độ cao, ẩm độ thấp, cây con dễ dàng bò
stress, dễ mất nước và mau héo.
Để tránh tình trạng này, vườn ươm cây cấy mô phải mát, cường độ chiếu sáng
thấp, nhiệt độ không khí mát, ẩm độ cao,… cây con thường được cấy trong luống ươm
cây có cơ chất dễ thoát nước, tơi xốp, giữ được ẩm, trong những ngày đầu cần phải
được phủ nylon để giảm quá trình thoát nước ở lá (thường 7-10 ngày kể từ ngày cấy).

Rễ được tạo ra trong quá trình cấy mô sẽ dần dần bò lụi đi và rễ mới xuất hiện, cây
con thường được xử lý với chất kích thích ra rễ bằng cách ngâm hay phun lên để rút
ngắn thời gian ra rễ.
2.1.7.

Quá trình tái sinh cơ quan trong nhân giống in vitro


Sự tái sinh cơ quan trong nuôi cấy mô không xảy ra ngay khi vừa cô lập mẫu cấy
mà phải trải qua một quá trình rất phức tạp vì:
Quá trình tái sinh chỉ xảy ra khi mối tương quan cũ được phá vỡ và những mối



tương quan mới được hình thành.
Quá trình này bao gồm nhiều giai đoạn khác nhau:



 Loại bỏ sự phản biệt hóa của các tế bào phản biệt hóa (dẫn đến sự trẻ hóa tế
bào).
 Sự phân chia tế bào (đôi khi dẫn đến sự hình thành mô sẹo): sự hình thành cơ
quan bắt đầu xảy ra khi sự phân chia tế bào diễn ra.
 Sự hình thành cơ quan
 Sự phát triển cơ quan
Sự tái sinh bò giới hạn về số lượng và chất lượng do nhiều nhân tố:




Các yếu tố nội sinh trong mẫu cấy



Điều kiện tăng trưởng của cây mẹ trong nhà kính hoặc ngoài
thiên nhiên



Vò trí của mẫu cấy trên cây



Thời gian thu mẫu trong năm



Hàm lượng chất điều hòa sinh trưởng thực vật nội sinh



Kích thước của mẫu cấy, phương pháp cấy, nuôi, thành phần
dưỡng chất trong môi trường nuôi cấy, các chất điều hòa sinh trưởng, các yếu
tố vật lý trong quá trình nuôi cấy như nhiệt độ, ánh sáng,… sự bổ sung một số cơ
chất khác vào trong môi trường,…

Những nguyên nhân trên cho thấy quá trình tái sinh cơ quan trong nuôi cấy mô rất
phức tạp, chúng ta không thể đề cập hết những khía cạnh liên quan nhưng cần lưu ý
đến một số vấn đề sau:


Quá trình tái sinh phức tạp do chòu sự tương tác của nhiều nhân tố khác nhau
(môi trường dinh dưỡng, ánh sáng, nhiệt độ và các chất điều hòa sinh trưởng,…).



Không thể khái quát chung quá trình tái sinh cho tất cả các loài vì mỗi loài
khác nhau cần điều kiện tái sinh khác nhau.


Khó có thể điều hòa quá trình tái sinh vì khả năng tái sinh của mỗi loài khác



nhau: trong những trường hợp này các nhân tố nội sinh đóng vai trò quyết đònh do
đó các yếu tố ngoại sinh như chất điều hòa ảnh hưởng không nhiều.
Sự hình thành rễ bất đònh thường đối lập với sự hình thành chồi bất đònh. Nếu



cả hai quá trình này được thúc đẩy đồng thời, cây con tạo ra sẽ mang nhiều thiếu
sót. Để thu nhận một cây hoàn chỉnh tốt nhất chúng ta nên tạo chồi bất đònh trước
sau đó cảm ứng tạo rễ.
2.1.7.1. Sự hình thành chồi bất đònh
Người ta sử dụng phương pháp tạo chồi bất đònh như một phương pháp nhân giống
vô tính nhằm làm tăng số lượng cây mong muốn .
Các loại cây thường được áp dụng phương pháp này để nhân giống ví dụ như:
Saintpaulia, Begonia, Achimenes, Streptocarpus, Lily, lan dạ hương, Nerin…
Có nhiều điểm giống nhau giữa tạo chồi bất đònh và tạo rễ bất đònh:


Sự hình thành chồi bất đònh ở cây hạt trần chỉ thành công khi sử dụng các
bộ phận của cây con (Anonymous, 1984).



Đường luôn luôn đóng vai trò quan trọng trong sự tạo cơ quan (chồi và rễ).



Sự hình thành chồi và rễ đều bò ức chế bởi gibberellin và acid abscisic.

• Các yếu tố ảnh hưởng đến sự tạo chồi bất đònh
Ánh sáng



Ánh sáng kích thích sự tạo chồi nhưng cũng có một số trường hợp ngoại lệ là có
một số cây trồng lại có thể tạo chồi dễ dàng hơn khi ở trong tối: chồi hoa của Freesia
(Pierik và Steegmans, 1975), cuống hoa Eucharis grandiflora và Nerine bowdenii
(Pierik, 1985; Pierik và Steegmans, 1986). Economou và Read (1986) cho biết rằng
các mẫu cấy lá của Petunia hyrbida tăng trưởng trên môi trường không có cytokinin
và được xử lý với ánh sáng đỏ thì tạo ra nhiều chồi có trọng lượng tươi lớn hơn là
được nuôi cấy dưới ánh sáng đỏ xa. Tuy nhiên, trên môi trường có BA thì khi xử lý
với ánh sáng đỏ và ánh sáng đỏ xa thì sẽ tạo ra số lượng chồi và trọng lượng tươi của
chúng tương tự nhau và nhiều hơn trên môi trường không có cytokinin.


Nhiệt độ

Nhiệt độ cao cần thiết cho sự tạo chồi nhưng cũng có một số trường hợp ngoại lệ
như Begonia (Heide, 1965) và Streptocarpus (Appelgren và Heide, 1972).




Chất điều hòa sinh trưởng thực vật

Nhu cầu về auxin và cytokinin trong sự tạo chồi bất đònh có phần phức tạp:


Có những loài thực vật về mặt cơ bản không cần cả auxin lẫn cytokinin để
tạo chồi bất đònh như: rau diếp xoăn (Pierik, 1966), Streptocarpus (Appelgren
và Heide, 1972; Rossini và Nitsch, 1966).



Hầu hết các loài thực vật đều cần đến cytokinin để cảm ứng sự tạo chồi,
trong khi auxin lại có vai trò ngược lại (Miller và Skoog, 1953; Paulet, 1965;
Nitsch, 1968).



Có một số thực vật cần đến auxin ngoại sinh để tạo chồi, đó là trường hợp
Lili (van Aartrijk, 1984), lan dạ hương (Pierik và Steegmans, 1975).



Một nồng độ cytokinin cao phối hợp với auxin nồng độ thấp rất quan trọng
trong việc tạo chồi ở nhiều loài thực vật khác nhau như Begonia (Ringe và

Nitsch, 1968; Heide, 1965) và cây bông cải (Margara, 1969).

Chúng ta có thể kết luận rằng ở những loài cần cytokinin và auxin cho sự tái sinh
chồi, nồng độ cytokinin bao giờ cũng cao hơn nồng độ auxin. Tỉ lệ của hai chất điều
hòa sinh trưởng này sẽ quyết đònh sự hình thành cơ quan (Skoog và Tsui, 1948; Miller
và Skoog, 1953). Cytokinin BA rất hiệu quả trong việc thúc đẩy tạo chồi ở nhiều loài
thực vật nhưng nếu sử dụng BA ở nồng độ cao sẽ xuất hiện nhiều biến dò (chồi biến
dạng).
Trong một số trường hợp, sự kết hợp giữa cytokinin và adenine (sulphate) sẽ tăng
hiệu quả tạo chồi (Skoog và Miller, 1957; Nitsh và cộng sự, 1969). Một số trường
hợp, việc sử dụng một mình adenine cũng có thể cảm ứng tạo chồi: Begonia (Ringle
và Nitsch, 1968), cây thuốc lá (Skoog và Tsui, 1948).
Sự gia tăng nồng độ gibberellin ức chế quá trình tạo chồi: ở loài Begonia rex
(Schrandolf và Reinert, 1959), Plumbago indica (Nitsch, 1968)… Acid abscisic ức chế
sự hình thành chồi bất đònh mặc dù vẫn có trường hợp cảm ứng sự hình thành chồi như
ở cây Ipomoea batatas.
2.1.7.2. Sự hình thành rễ bất đònh
Rễ bất đònh được hình thành trên các cơ quan khác nhau của cây, nơi mô của
chúng còn giữ khả năng phân sinh.


Quá trình hình thành rễ rất quan trọng vì nó ảnh hưởng đến khả năng sống sót của
mẫu cấy khi cây in vitro được chuyển ra vườn ươm.
Có nhiều yếu tố ảnh hưởng đến sự hình thành rễ bất đònh: đặc điểm di truyền của
loài, tuổi của mẫu, vò trí của mẫu cấy trên thân, kích thước mẫu cấy, vết thương, số
lần cấy chuyển, nguồn oxy, ánh sáng, nhiệt độ, chất điều hòa sinh trưởng, than hoạt
tính, đường, agar, pH,…
2.1.8.

Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình phát sinh hình thái trong nuôi cấy in

vitro
2.1.8.1. Ảnh hưởng của mẫu cấy
Vật liệu nuôi cấy là một trong những yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến sự sinh
trưởng và phát triển in vitro:


Kiểu di truyền
Khả năng tái sinh của thực vật rất đa dạng. Những cây hai lá mầm thông thường

có khả năng tái sinh mạnh hơn cây một lá mầm và cây hạt trần rất khó tái sinh (trừ
khi chúng còn non). Trong số các cây hai lá mầm, Solanaceae, Begoniaceae,
Crassulaceae, Gesneriaceae, Cruciferae là những họ thực vật dễ tái sinh nhất.
Nếu một loài dễ tái sinh cơ quan trong tự nhiên (các giống lai Saintpaulia
ionantha, Begonia rex, Streptocarpus) thì chúng hầu như dễ tái sinh in vitro. Cũng có
những trường hợp ngoại lệ như những đoạn cắt từ lá của Kalanchoe farinacea hầu như
không có khả năng hình thành chồi bất đònh in vivo nhưng có thể thực hiện trong điều
kiện in vitro, điều này có thể do sự hấp thu các chất điều hòa sinh trưởng có trong môi
trường nuôi cấy.


Tuổi của cây
Các mô phôi thường có khả năng tái sinh cao do đó ở ngũ cốc người ta thường

dùng phôi và hạt làm vật liệu nuôi cấy mô. Khi cây già đi, khả năng tái sinh của
chúng cũng giảm theo và các bộ phận của cây non dễ tái sinh hơn như trong trường
hợp cây bụi.
Khi mô phân sinh và chồi đỉnh được tách khỏi cây mẹ thì chúng vẫn giữ những đặc
tính già hay non trong điều kiện in vitro tùy vào điều kiện ban đầu. Đôi khi qua nhiều
lần cấy chuyển, mô phân sinh già từng bước được trẻ hóa do tăng khả năng tái sinh và

phân chia tế bào. Điều này được chứng minh trên những đối tượng như Pinus vinifera,
Malus sylvestris, Cryptomeria japonica.


Tuổi của mô và cơ quan
Những mô còn non và mềm thường dễ nuôi cấy hơn những mô cứng nhưng cũng

có nhiều trường hợp ngoại lệ. Các mẫu cấy từ cuống lá còn non tái sinh tốt hơn những
mẫu cấy từ cuống lá già do cơ quan của chúng già hơn nên khả năng tái sinh và phân
chia tế bào giảm. Khả năng tái sinh của những loài khác nhau tăng lên trong suốt giai
đoạn ra hoa: các bộ phận của phát hoa còn non đôi khi tái sinh rất mạnh, ví dụ như
Freesia (Bajaj và Pierik, 1974), Lunaria annua (Pierik và cộng sự, 1974), Primula
obconica ( Coumans và cộng sự, 1979).


Tình trạng sinh lý
Tình trạng sinh lý ảnh hưởng mạnh đến khả năng tái sinh và phân chia tế bào in

vitro. Thông thường các bộ phận của cây trong giai đoạn sinh dưỡng dễ tái sinh hơn
trong giai đoạn sinh sản. Các mẫu cấy từ vảy của cây huệ tây ở giai đoạn sinh dưỡng
tái sinh tốt hơn những mẫu cấy ở giai đoạn sinh sản (Robb, 1957). Các chồi của cây
trong giai đoạn ngủ đông (cuối thu đầu đông) khó nuôi cấy in vitro hơn chồi của
những cây đã vượt qua được giai đoạn này (vào mùa xuân trước khi chúng bắt đầu
phát triển).


Vò trí của mẫu cấy trên cây
Ever (1984) đã khảo sát sự ảnh hưởng của vò trí mẫu cấy lên sự sinh trưởng và

phát triền in vitro sau khi tách mẫu ở cây Pseudotsuga menziesii, ông nhận thấy những
chồi ban đầu được tách từ những vò trí thấp trên cây phát triển trong môi trường in
vitro tốt hơn, và chồi gốc tăng trưởng nhanh hơn chồi nách. Sự hình thành các giả
hành bất đònh của mẫu cấy lan dạ hương được tách ra từ phần gốc của vảy hành tốt
hơn từ phần đỉnh. Điều này cũng xảy ra tương tự đối với Lily (Robb, 1957). Điều đáng
lưu ý là những mô sẹo phát sinh từ những mẫu cấy có nguồn gốc từ các phần khác
nhau của cây như rễ, chồi, cuống lá đều có phản ứng in vitro giống nhau.



Kích thước mẫu cấy
Các cấu trúc nhỏ như tế bào, cụm tế bào và mô phân sinh khó cảm ứng để tăng

trưởng hơn những cấu trúc lớn như thân, lá, củ. Các phần được tách rời khỏi cây tự nó


cung cấp chất dinh dưỡng và hormone, do đó mẫu cấy có kích thước càng lớn càng dễ
tái sinh và phát triển. Các bộ phận của cây có chứa nhiều chất dinh dưỡng dự trữ như
củ, thân hành thường dễ tái sinh trên môi trường in vitro hơn những cơ quan ít chất dự
trữ. Đối với những mẫu bò cắt, phần trăm bề mặt bò tổn thương cũng ảnh hưởng đến
khả năng tái sinh. Ảnh hưởng của vết thương lên sự tái sinh của các mẫu cấy từ vảy
hành Lily đã được Aartrijk (1984) chứng minh.


Vết thương
Sự tổn thương trên bề mặt mẫu cấy đóng vai trò quan trọng trong sự tái sinh mẫu

cấy. Bề mặt tổn thương tăng lên làm gia tăng sự hấp thu chất dinh dưỡng và các chất
điều hòa đồng thời ethylene được tạo ra nhiều hơn. Ngoài ra, có thể tăng cường sự

hình thành rễ bất đònh bằng vết thương.


Phương pháp cấy
Các mẫu cấy có thể được đặt trên môi trường theo nhiều cách khác nhau: có cực

(thẳng đứng với phần gốc cắm xuống môi trường) hoặc không cực (cắm phần ngọn
xuống môi trường). Chồi và rễ thường tái sinh dễ và nhanh khi mẫu được cấy không
cực (Pierik và Steegmans, 1975). Mẫu tái sinh tốt khi được cung cấp đầy đủ oxy
nhưng những nhân tố khác cũng đóng vai trò quan trọng. Phần gốc của mẫu cấy
không cực có các chất dự trữ không có khả năng khuếch tán vào trong agar do nó
không tiếp xúc với môi trường. Như ở trường hợp tất cả các cây thuộc họ
Amaryllidaceae (Pierik và cộng sự, 1974), sự tái sinh chỉ xảy ra ở phần gốc của vảy
hành, do đó phương pháp cấy không cực dẫn đến sự hình thành thân hành bất đònh tốt
hơn phương pháp cấy có cực.

2.1.8.2. Ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy
Một trong những yếu tố quan trọng nhất đối với sự tăng trưởng và phát sinh hình
thái của tế bào và mô thực vật trong nuôi cấy là thành phần môi trường. Thành phần
này thay đổi tùy theo loài và bộ phận nuôi cấy.
Đối với cùng một mẫu cấy nhưng tùy theo mục đích thí nghiệm mà thành phần
môi trường cũng thay đổi. Môi trường còn thay đổi tùy theo giai đoạn phân hóa của
mẫu cấy. Tuy nhiên, tất cả các môi trường đều bao gồm năm thành phần: khoáng đa


lượng, khoáng vi lượng, vitamin, đường (nguồn carbon) và các chất điều hòa sinh
trưởng thực vật
•

Khoáng đa lượng: nhu cầu khoáng của mô, tế bào thực vật tách rời không khác

nhiều so với cây trồng trong điều kiện tự nhiên. Các nguyên tố đa lượng cần phải
cung cấp là N, P, K¸Ca, Mg và Fe.

•

Khoáng vi lượng: nhu cầu khoáng vi lượng trong nuôi cấy mô thực vật in vitro
là lónh vực còn ít nghiên cứu. Trước đây, khi kỹ thuật nuôi cấy mô mới ra đời,
người ta không nghó đến việc bổ sung khoáng vi lượng vào môi trường nuôi cấy.
Các thí nghiệm lúc đó thành công là do agar và hóa chất dùng để pha môi trường
không tinh khiết mà có lẫn một số nguyên tố vi lượng cung cấp phần nào cho môi
trường nuôi cấy. Các nguyên tố vi lượng cần cung cấp cho tế bào là: Mn, Zn, Cu,
B, Co, I, Mo...

•

Carbon và nguồn năng lượng: trong nuôi cấy in vitro, nguồn carbon giúp mô và
tế bào thực vật tổng hợp nên các hữu cơ để tế bào phân chia, tăng sinh khối không
phải từ quá trình quang hợp mà chính từ nguồn carbon bổ sung vào môi trường
dưới dạng đường. Hai dạng đường thường gặp nhất là glucose và sucrose. Các
nguồn carbonhydrate khác cũng được tiến hành thử nghiệm như lactose, galactose,
rafinose, maltose và tinh bột nhưng các carbonhydrate này có hiệu quả kém hơn so
với glucose và sucrose. Sucrose là một nguồn carbon quan trọng đối với mô và tế
bào nuôi cấy.

•

Vitamin: thông thường thực vật tổng hợp các vitamin cần thiết cho sự tăng
trưởng và phát triển của chúng. Chúng cần vitamin để xúc tác các quá trình biến
dưỡng khác nhau. Khi tế bào và mô được nuôi cấy in vitro thì một vài vitamin trở
thành yếu tố giới hạn cho sự phát triển của chúng. Các vitamin thường được sử

dụng nhiều nhất trong nuôi cấy mô là: thiamine (B1), acid nicotinic, pyridoxine
(B6) và myo-inositol.

•

Các chất điều hòa sinh trưởng thực vật
Chất điều hòa sinh trưởng hoạt động với liều lượng rất thấp, ở liều lượng cao

chúng trở nên độc, điều này cho phép một vài chất kích thích tố được sử dụng như các
chất diệt cỏ dại.