FLOWCYTOMETRE Kỹ thuật phân tích tế bào dòng chảy (FC)

MỤC LỤC

THUẬT NGỮ SỬ DỤNG
Thuật ngữ chuyên ngành
Compensation : Chạy chuẩn máy, thiết lập bù trừ quang phổ tự động.
CS&T (Cytometer Setup and Tracking) : Thiết lập điều kiện chuẩn máy.
Blast cell: Tế bào non
Erythroblast: Các nguyên hồng cầu nói chung là những hồng cầu non có
nhân chỉ ở trong tủy xương tạo máu, bình thường không ở máu ngoại vi.
Megacaryoblast: Nguyên mẫu tiểu cầu.
Monoblast: Nguyên bạch cầu mono đơn nhân.
Lymphoblast: Nguyên bạch cầu lympho
CD (Cluster of differentiation: nhóm biệt hóa): kháng thể đặc hiệu.
AL (Acute Leukemia): Bệnh bạch cầu cấp.
AML (Acute Myeloid Leukemia): Bệnh bạch cầu cấp dòng tủy.
ALL (Acute lymphoblastic Leukemia): Bệnh bạch cầu cấp dòng lympho
Các chữ viết tắt
RPM: Tốc độ ly tâm (vòng/phút).
FC: Flow Cytometry ( Phân tích tế bào dòng chảy)
BCC: Bạch cầu cấp.
DAMDTB: Dấu ấn miễn dịch tế bào.
FC: Máy đếm tế bào theo dòng chảy (flow cytometry)
FITC: Fluorescein Isothiocyanante.
PE: Phycoerythrin.
PerCP: Peridin chlorophyll.
PE-Cy7: Phycoerythrin-cyanine 7.
APC: Allophycocyanin.

1

CHƯƠNG I: TỔNG QUAN VỀ ĐƠN VỊ THỰC TẬP
BỆNH VIỆN UNG BƯỚU ĐÀ NẴNG
1. Bệnh viện ung bướu Đà Nẵng – bệnh viện ung bướu lớn nhất nước mang
dấu ấn ông Nguyễn Bá Thanh.

1.1. Giới thiệu chung

Bệnh viện ung bướu Đà Nẵng được đánh giá lớn nhất cả nước không chỉ quy mô
giường bệnh, công tác khám và điều trị mà còn bởi quang cảnh sạch đẹp, hiện đại.

Ngày 28/3/2009, Bệnh viện ung thư Đà Nẵng khởi công xây dựng trên diện

2


tích 15 ha tại phường Hoà Minh, quận Liên Chiểu (Đà Nẵng). Gần 4 năm sau,
bệnh viện này chính thức tiếp nhận khám chữa cho bệnh nhân ung thư tại khu
vực miền Trung. Chính thức từ ngày 1/9/2015 bệnh viện ung thư Đà Nẵng đổi
tên thành bệnh viện ung bướu Đà Nẵng và trực thuộc sở y tế thành phố Đà Nẵng .
Với tổng kinh phí 1.500 tỷ đồng từ các tổ chức, cá nhân có tấm lòng hảo tâm,
cùng với nguồn từ xổ số kiến thiết của thành phố và hỗ trợ của Chính phủ, dự án
được cho là có công lớn của Nguyên Bí thư Nguyễn Bá Thanh với lời kêu gọi ủng
hộ đầy tâm huyết của ông.
Chức năng chính của bệnh viện là tiếp nhận khám và phát hiện sớm bệnh
nhân ung thư, chẩn đoán chính xác điều trị có hiệu quả mọi bệnh lý ung thư, dự
phòng bệnh ung thư cho nhân dân thành phố Đà Nẵng và khu vực miền Trung, triển
khai các chương trình nghiên cứu khoa học công nghệ và tham gia đào tạo nhân lực
chuyên ngành.
Bệnh viện được đánh giá là lớn nhất cả nước không chỉ quy mô giường bệnh,
công tác khám và điều trị mà bởi quang cảnh sạch đẹp, hiện đại.

Tổng diện tích sàn bệnh viện là 60.000 m2, đạt 120 m2 mỗi giường bệnh, thiết kế
theo mô hình bệnh viện khách sạn với cảnh quan hài hòa, tiện nghi và thân thiện,
không gian xanh bao phủ khắp nơi. Quy mô 500 giường bệnh điều trị và nội trú.

Cụ Lê Thị Bốn 83 tuổi (ngụ tại huyện Đại Lộc, tỉnh Quảng Nam) điều trị ung
thư gan tại Khoa chăm sóc điều trị và giảm nhẹ của bệnh viện hơn 3 tháng nay.

3


Nguyễn Thị Á, cho biết tình trạng bệnh của mẹ chồng chị đã thuyên giảm, sức khoẻ
cũng đã tốt lên nhiều. Bệnh nhân có bảo hiểm y tế và bệnh nhân khám chữa bệnh
theo yêu cầu đều được đón nhận khám chữa và điều trị như nhau.

Với các thiết bị chẩn đoán hình ảnh hiện đại nhất hiện nay tại Việt Nam như
máy MRI 3,0 Tesla (cả nước chỉ có 3 chiếc), CT-scan 128 lát..., người bệnh đã
không còn phải cất công chuyển ra Hà Nội hoặc TP HCM để kiểm tra như trước đó.
Với 76 bác sĩ chuyên khoa, trong đó 82% bác sĩ có trình độ từ thạc sĩ y
học/BS chuyên khoa 1 trở lên, trong đó có 2 giáo sư và phó giáo sư y học, 8 tiến sĩ
y học và BS chuyên khoa II, 9 BS nội trú, 43 thạc sĩ y học và BS chuyên khoa I,
mọi bệnh nhân đều được đảm bảo điều trị và chăm sóc tốt nhất có thể.

1.2. Các bộ phận hoạt động
1.2.1. Các phòng chức năng: 08 phòng
1. Phòng Hành chính quản trị;
2. Phòng Tổ chức cán bộ;

4

3. Phòng Kế hoạch tổng hợp;
4. Phòng Tài chính kế toán;
5. Phòng Công nghệ thông tin;
6. Phòng Điều dưỡng;
7. Phòng Chỉ đạo tuyến và quản lý chất lượng bệnh viện;
8. Phòng Vật tư, trang thiết bị y tế.
1.2.2. Các khoa: 18 khoa
Các khoa lâm sàng:
1. Khoa Khám bệnh và cấp cứu;
2. Khoa Chăm sóc giảm nhẹ;
3. Khoa Hóa trị 1;
4. Khoa Hóa trị 2;
5. Khoa Huyết học;
6. Khoa Gây mê hồi sức;
7. Khoa Ngoại 1 (Tiêu hóa, tiết niệu, sinh dục nam, mô mềm);
8. Khoa Ngoại 2 (Thần kinh, đầu cổ, lồng ngực);
9. Khoa Ngoại 3 (Vú và phụ khoa);
10. Khoa Xạ trị;
11. Khoa Dược;
12. Khoa Y học hạt nhân;
Các khoa cận lâm sàng:
13. Khoa Chẩn đoán hình ảnh;
14. Khoa Nội soi và thăm dò chức năng;
15. Khoa Kiểm soát nhiễm khuẩn;
16. Khoa Xét nghiệm - Truyền máu;
17. Khoa Giải phẫu bệnh;
18. Khoa Kỹ thuật phóng xạ.

Vì em được phân công thực tập tại khoa Xét nghiệm – Truyền máu nên sẽ

giới thiệu rõ hơn về khoa này.

2. Giới thiệu về khoa Xét nghiệm – Truyền máu
5


2.1. Tên đơn vị, địa chỉ, điện thoại liên hệ:
Khoa Xét nghiệm - Truyền máu được thành lập từ ngày 28/08/2015 theo quyết
định thành lập bệnh viện Ung bướu Đà Nẵng của UBND TP.Đà Nẵng. Trên cơ sở
sáp nhập nguyên trạng giữa Khoa xét nghiệm, Khu truyền máu và Trung tâm nghiên
cứu ung thư thuộc Bệnh viện Ung thư Đà Nẵng.
- Địa chỉ: Tầng 2 – Khu nhà D – Bệnh Viện Ung bướu Đà Nẵng – Tổ 14 Phường
Hòa Minh, Quận Liên Chiểu,TP Đà Nẵng.
- Điện thoại: 05113.717361 (Hành chính)
05113.717 362 (BS Lê Văn Hùng – Trưởng khoa)
05113.717 364 (Labo Hóa sinh – Huyết học)
05113.717 366 (Labo Vi sinh)

2.2. Chức năng nhiệm vụ
a. Các xét nghiệm về Huyết học, Đông máu và Tế bào:
- Đánh giá các chức năng đông máu Nội sinh và Ngoại sinh.
- Tổng phân tích tế bào máu bằng máy đếm Laser.
- Các xét nghiệm chuyên sâu về Huyết đồ, Tủy đồ, D-Dimer, Tế bào dịch
b. Các xét nghiệm về Hóa sinh- Miễn dịch:
- Các xét nghiệm hóa sinh cơ bản đánh giá chức năng gan, thận, chuyển hóa,
biland lipid, calci, phospho, HbA1c, A.Uric, LDH…
- Các xét nghiệm hóa sinh cao cấp như định lượng các kháng thể IgG, IgM,
IgA, IgE, β2- Microglobulin, Pre-albumin, CK-MB…
- Các xét nghiệm Hormon T3, FT3, T4, FT4, TSH, Estrogen, Testosteron,
Cortisol, ADH…

- Đặc biệt là các xét nghiệm dấu hiệu sinh học bướu nhằm giúp tầm soát và
chẩn đoán sớm các bệnh ung thư gan, phổi, đường tiêu hóa, thận,vú, buồng
trứng, cổ tử cung, tụy như: CEA, CA125, CA15-3, CA19-9, Cyfra 21-1, AFP,
Pepsinogen I & II, Pro-GRP, PSA, SCC, HE 4, NSE …
c. Các xét nghiệm nuôi cấy, định danh vi khuẩn, nấm và thực hiện kháng sinh đồ,
xác định nồng độ ức chế tối thiểu … được thực hiện thường quy.

2.3. Cơ cấu tổ chức:
Cơ cấu tổ chức của khoa như sau:
TRƯỞNG KHOA

KTV TRƯỞNG

6


TỔ
CTM –
ĐÔNG MÁU

TỔ TẾ BÀO
(HUYẾTTUỶ ĐỒ-TB
DỊCH)

TỔ HÓA
SINH –
MIỄN DỊCH

TỔ VI SINH
– SINH HỌC

PHÂN TỬ

TỔ LẤY
MẪU-NHẬN
VÀ XỬ LÝ
MẪU

2.4. Cơ sở vật chất, trang thiết bị:
Khoa XNTH được trang bị một hệ thống phân tích mẫu hoàn toàn tự động của
các hãng lừng danh trên thế giới như Abbott, Roche, Siemens, Becton, Dickinson.
- Đối với các xét nghiệm Hóa sinh – Miễn dịch khoa được trang bị hệ thống
kết nối hiện đại của hãng Abbott, Hoa Kỳ (Module Ci16200) và máy xét nghiệm
miễn dịch i1000 cũng của hãng Abbott sử dụng kỹ thuật miễn dịch hóa phát quang
(CMIA) tiên tiến nhất hiện nay với độ nhạy và độ đặc hiệu rất cao.
Hệ thống phân tích khí máu động mạch và ion đồ hiện đại gồm 2 máy: máy
cobas b121 của hãng Roche và máy Rapid point 400 của hãng Siemens (Germany).
Hệ thống phân tích nước tiểu hoàn toàn tự động 18 thông số Combi scan 500 của
hãng Siemens (Germany).
- Đối với các xét nghiệm Huyết học khoa được trang bị hệ thống hiện đại,
hoàn toàn tự động bao gồm máy xét nghiệm tổng phân tích tế bào máu 33 thông số
bằng máy đếm laser Cell Dyn Ruby của hãng Abbott (Hoa Kỳ) và máy XS 800 của
hãng Sysmex (Nhật Bản).
Các xét nghiệm đông máu được thực hiện hoàn toàn tự động trên máy CA
1500 của hãng Sysmex (Nhật Bản) và máy STA Compact CT của hãng Stago
(Pháp).
Xét nghiệm máu lắng tự động hoàn toàn được thực hiện bằng máy Human Sed
25 mix của hãng Human (Germany).
- Đối với các xét nghiệm vi sinh, bao gồm các xét nghiệm định danh vi khuẩn,
nấm và thực hiện kháng sinh đồ, xác định nồng độ tối thiểu ức chế vi khuẩn gây
bệnh được thực hiện hoàn toàn tự động trên máy BD Phoenix của hãng Becton

Dickinson lừng danh (Hoa Kỳ).

7


Hệ thống nuôi cấy vi khuẩn hiếu khí và kỵ khí hiện đại cũng đã được trang
bị, xét nghiệm cấy máu được thực hiện bằng máy Bactec 9250 cũng của hãng
Becton Dickinson lừng danh (Hoa Kỳ).
Hệ thống kính hiển vi – xét nghiệm tế bào:
- Kính hiển vi đối pha Nikon Eclipse Ci H550s – Nhật Bản.
- Hệ thống kính hiển vi quang học Nikon Eclipse E100 – Nhật Bản.
3. Đơn vị Di truyền và sinh học phân tử thuộc khoa Xét nghiệm-Truyền máu
3.1. Nhiệm vụ đơn vị:
Đơn vị Di truyền và sinh học phân tử chuyên xét nghiệm về các mảng miễn
dịch ung thư, di truyền và SHPT ung thư.
STT

KỸ THUẬT XÉT NGHIỆM
MIỄN DỊCH UNG THƯ

KỸ THUẬT XÉT NGHIỆM DI
TRUYỀN, SHPT UNG THƯ

1

Xét nghiệm dấu ấn tế bào Bạch cầu
cấp (20CD)

Xét nghiệm phát hiện gen

2

Đếm tế bào gốc CD34+ bằng
Flowcytometry

Xét nghiệm gen bệnh máu ác tính

3

Đếm số lượng tế bào Lympho T
CD4/CD8-CD3

Xét nghiệm công thức NST
(Karyotype)

4

Phân tích CD

5

Xét nghiệm sắc thể: kỹ thuật
DNA với Protein

Đánh giá tồn lưu tế bào ác tính
(MRD) sau điều trị (24CD)

Phát hiện gen JAK2 V617F bằng
kỹ thuật Allen-specific PCR
Định lượng vvirus viêm gan B

(HBV)

6

Phân loại Lymphoma

7

Xét nghiệm định type HLA (bằng
kỹ thuật sinh học phân tử)

HCV (RT-PCR)

8

Kháng thể kháng nhân

HIV (PCR)

9

Xét nghiệm đọ chéo ( bằng
Flowcytometry)

HIV (RT-PCR)

10

Xét nghiệm Đường – Ham

Xác định DNA trong viêm gan B

11

Chuẩn đoán bệnh tiểu huyết sắc tố
về đêm (PNH)(5CD)

Định lượng virus viêm gan B
(HBV) cho các bệnh viêm gan C
mãn tính

12

Xét nghiệm CD64, CD11b trong

Định lượng virus viêm gan C

8


SEPSIS

(HCV) cho các bệnh viêm gan C
mãn tính

13

PCR chuẩn đoán CMV

14

Đo tải lượng CMV

15

PCR chuẩn đoán lao bằng hệ thống
Cobas TaqMan48
Bảng 1: Các kỹ thuật xét nghiệm

3.2. Trang thiết bị tại đơn vị Di truyền và sinh học phân tử.

H1: Máy Flowcytometry

H4: Máy ly tâm ống nghiệm

H2: Tủ ấm có trao đổi khí

H5: Máy ly tâm Eppemdorf

H3: Tủ ATSH cấp 2

H6: Máy Realtime PCR

Hình 9: Tủ lạnh -200C

Hình 7: Tủ hút khí độc

Hình 8: Tủ lạnh 40C

Hình 10: Máy Vortex

Hình 11: Máy Spindown

9

Hình 12: Máy PCR


Hình 13: Máy đo nồng độ Acid nucleid

Hình 14: Máy đọc gel

Hình 15: Máy điện di
Hình 16: Ủ nhiệt có lắc

H18: Kính hiển vi huỳnh
Hình 17: Tủ lạnh -800C
quang camera

10


CHƯƠNG II: ỨNG DỤNG KỸ THUẬT PHÂN TÍCH TẾ BÀO DÒNG
CHẢY TRONG XÉT NGHIỆM BỆNH BẠCH CẦU CẤP
( FLOW CYTERMETRY – FC )

I.

Giới thiệu kỹ thuật tế bào dòng chảy

I.1.

Lịch sử

Năm 1969, Lou Herzenberg phát minh ra kỹ thuật phân loại tế bào dựa vào
việc sử dụng ảnh sáng huỳnh quang (đèn argon) và phát triển thiết bị phân loại tế
bào dựa trên kích hoạt huỳnh quang (FACS – Flourescent Activated Cell Sorter).
Đến năm 1990, Becton Dickinson (BD) tung ra thị trường máy FACSCount
chuyên dụng cho máy đếm T-CD4, tại thời điểm đó máy chưa được cấp giấy
chứng nhận bởi FDA nhưng hiện nay đã được công nhận.
Năm 1996, BD tiếp tục đưa ra hệ thống FACSCalibur và sau đó là các dòng
máy FACS Canto, FACS Aria hiện đại và đa nhiệm.Về sau các máy FACS ngày
càng được nâng cấp và tính đa nhiệm ngày càng cao.

I.2.

Sự kết hợp kháng nguyên – kháng thể - chất phát huỳnh
quang

Hình 1: Sơ đồ hóa
mối liên kết kháng
nguyên – kháng thể
- chất huỳnh quang.
(Nguồn: tác giả Nguyễn Phương Liên)

Kỹ thuật tế bào dòng chảy nhận diện DAMDTB, là các kháng nguyên của
tế bào, gián tiếp thông qua mật độ các chất huỳnh quang gắn với các kháng thể đặc
trưng tương ứng với từng loại kháng nguyên. kháng nguyên cần khảo sát có thể là
một Protein, immunoglobulin, cytokine…nằm trên màng tế bào, trong bào tương
hoặc thậm chí trong nhân tế bào.

11


Từ năm 1992, các chuyên gia Việt Nam đã biết đến kỹ thuật tế bào dòng
chảy, nhưng chỉ được tiếp cận thông qua kỹ thuật miễn dịch huỳnh quang bằng
kính hiển vi để phân biệt BCC dòng lympho B và T, kế đến là xác định dòng tủy
tại Viện Truyền máu Huyết học Trung ương, bệnh viện nhi Trung Ương…Năm
1995, bệnh viện truyền máu huyết học là bệnh viện đầu tiên được trang bị máy
FASC Calibur (3 màu) để phân biệt các dòng tế bào tạo máu khác nhau trong bệnh
lý BCC và thực hiện đếm tế bào CD4 cho bệnh nhân HIV. Trong những năm sau
đó, nhiều trung tâm nghiên cứu trong cả nước đã quan tâm đầu tư máy móc thiết bị
mở rộng các lĩnh vực nghiên cứu. Các bệnh viện truyền nhiễm trung ương và viện
pasteur TP.HCM (2000) là những đơn vị kế tiếp sử dụng máy tế bào dòng chảy 34 màu trong lĩnh vực nghiên cứu về CD3/CD4/CD8 ở bệnh HIV. Nhu cầu đếm
CD4 lan rộng trên cả nước và thế giới nên có những dòng máy đơn giản rẻ tiền
hơn thay thế. Những năm 2005 trở lại đây, kỹ thuật tế bào dòng chảy đã đóng một
vai trò quan trọng trong các nghiên cứu về tế bào gốc máu cuống rốn, đặc biệt là tế
bào trung mô. Cùng với sự phát triển của kỹ thuật, công nghệ này càng được đổi
mới tiến bộ hơn với những dòng máy từ 4,6 hoặc 8 màu đã ra đời và được các đơn
vị nghiên cứu quan tâm đầu tư để tăng thêm độ chính xác, giúp nghiên cứu những
quần thể tế bào rất nhỏ ( bệnh viện TMHH TP.HCM năm 2009 đã có thêm máy 6
màu, Viện Hải dương học Nha Trang..)
Ứng dụng kỹ thuật tế bào dòng chảy xác định DAMDTB trong chẩn đoán,
phân loại bệnh BCC, từ đó chọn lựa các phương pháp và kiểu hình DAMDTB phù
hợp để đánh giá TLTBAT bằng dàn kháng thể đơn dòng hiện có.

I.3.

Nguyên lý hoạt động của máy tế bào dòng chảy [5]

Nguyên lý cơ bản của máy đếm tế bào theo dòng chảy (flow cytometry FC) là nguyên lý biến đổi điện trở của dòng hạt đi qua cửa sổ có tế bào quang điện
và một điện trường. Nguyên lý này giúp phân tích sự khác biệt về kích thước các
loại tế bào khác nhau, nhưng không nhận diện chính xác từng loại tế bào.
Các máy đếm tế bào hiện đang được sử dụng có thể chia làm hai loại:

- Máy đếm tế bào nguyên lý tổng trở: phân biệt từng loại tế bào dựa vào
kích thước tế bào.

- Các máy thế hệ sau: ứng dụng laser và xung điện đa chiều nên có tốc độ
cao và phân loại tế bào chính xác hơn. Với những máy sản xuất trước

12


1996 khả năng phân loại chính xác các thành phần bạch cầu nói chung
không quá 90%. Các máy model gần đây, với việc áp dụng tổng hợp các
cơ chế tổng trở, xung điện đa chiều, laser và scatter nên khả năng nhận
diện tế bào được nâng đến 95%. Một số serie máy có thể phân biệt được
các loại bạch cầu ưa a xít, ưa baso, hồng cầu lưới bằng việc kết hợp với
các phương pháp nhuộm men peroxydase, nhuộm RNA/DNA, nhuộm
huỳnh quang, phân tích huyết sắc tố (CellDyn 4000 của hãng ABBOTT,
SE-Advance của hãng Sysmex…).

I.4.

Các bộ phận chính và nguyên lý cơ bản của máy flow
cytometry [4]

Hình 2: Hệ thống Flow Cytormetry

I.4.1. Hệ thống tạo dòng chất lỏng (fluidics system)
Hệ thống tạo dòng chất lỏng là bộ phận căn bản nhất của một máy đếm tế
bào dòng chảy.
Hệ thống tạo dòng chất lỏng gồm có 2 vùng chất lỏng có áp lực khác nhau.
Dòng dịch lỏng bên ngoài (sheath fluid) còn được gọi là dung dịch tạo dòng bao: có
tác dụng “nắn chỉnh” dòng dịch lỏng chứa mẫu bên trong (core fluid) còn gọi là

13


dòng lõi thành một dòng hẹp tới mức các tế bào/hạt vật chất trong mẫu chỉ có thể đi
qua khe hẹp đó từng cái một từ đó giúp tập trung tế bào/vật thể nhỏ có trong mẫu
thành dòng tế bào đơn và vận chuyển dòng tế bào đơn này đi qua hệ thống quang
học với tốc độ rất cao, khoảng 1000 tế bào/giây. Điều chỉnh mức độ chênh lệnh áp
lực giữa dòng bao và dòng lõi có thể mở rộng hoặc thu hẹp tiết diện dòng lõi, phù
hợp với yêu cầu phân tích (ví dụ phân tích tế bào máu thì cần dòng lõi lớn, phân
tích ADN thì cần dòng lõi hẹp). Nhờ cơ chế này hệ thống mới có thể phân tích đồng
thời nhiều đặc tính trên từng tế bào một cách chính xác, giảm được yếu tố nhiễu.
Dịch dùng tạo dòng sheath thường phải đáp ứng 2 yêu cầu:
(1) không gây ảnh hưởng tới tế bào (không làm tan tế bào).
(2) không làm ảnh hưởng đến độ chiết quang và độ huỳnh quang của hệ
thống. Ở một số dòng máy người ta sử dụng ống vi mao thay thế cho dòng bao.

Hình 3: Hệ thống dòng chất lỏng trong buồng mẫu (flow cell)

I.4.2. Hệ thống quang học

14

Bản thân một tế bào không được nhuộm với kháng thể có gắn huỳnh quang
cũng có thể phát ra những tia phản xạ, được các bộ phận nhận sóng ghi nhận, từ đó
phản ánh hai thông số : FSC và SSC, còn được gọi là hai yếu tố nội tại của tế bào
FSC (Forward Scatter Chanel): nguồn sáng laser
sẽ đón nhận những tia sáng thẳng tới từ tế bào
gốc, phản ánh kích thước tế bào.
SSC (Side Scatter Chanel): những tia sáng
được các gương phản xạ ở những vị trí khác
đón nhận, phản ánh tính chất phức tạp của tế
bào như: sự nhấp nhô của màng tế bào, bản
chất không hạt, ít hạt hay nhiều hạt của bào
tương…
Hình 4: Yếu tố nội tại của tế bào
Hệ thống quang học bao gồm nguồn phát tia sáng (thường là các đèn laser
hoặc đèn hồ quang), hệ thống kính lọc và các kênh thu tín hiệu quang học và tính
hiệu huỳnh quang (FSC dùng thu nhận tín hiệu ánh sáng tán xạ góc thẳng; SSC
dùng thu nhận tín hiệu ánh sáng tán xạ góc bên, các FL (Fluoressen Light), dùng thu
nhận tín hiệu ánh sáng huỳnh quang từ kênh màu huỳnh quang và số kênh màu
huỳnh quang có thể dao động từ 2 đến 18 FL tùy dòng máy; PMT – Photo
Multiplier Tube, các ống nhân quang tương ứng với các kênh màu huỳnh quang có
vai trò khuếch đại tín hiệu ánh sáng huỳnh quang).

Ánh sáng từ nguồn
laser tương tác với tế bào
nhuộm kháng thể gắn huỳnh
quang sẽ sinh ra các ánh
sáng sau: FSC liên quan tới
kích cỡ tế bào, SSC liên
quan đến độ phức tạp nhân
và bào tương tế bào, các

ánh sáng huỳnh quang như
FITC, PE, PC5 đặc trưng
cho các kháng nguyên tương
ứng có trên bề mặt tế bào.
Hình 5: Hệ thống quang học

15


Khi một tế bào hay một vật thể đi qua nguồn sáng, ánh sáng của nguồn sáng
sẽ tương tác với vật thể sẽ tạo ra các ánh sáng tán xạ (tán xạ góc thẳng và tán xạ góc
bên) và nếu tế bào/vật thể đó được nhuộm màu huỳnh quang, dưới kích thích của
nguồn sáng, chất màu huỳnh quang đó sẽ phát ra ánh sáng huỳnh quang. Sau đó các
tia sáng này sẽ đi qua hệ thống kính lọc (đó là các thấu kính chỉ cho phép các tia
sáng có bước sóng nhất định đi xuyên qua). Với hệ thống kính lọc này các tia sáng
tán xạ và ánh sáng huỳnh quang sẽ được phân chia và đi đến hệ thống thu nhận tín
hiệu một cách chính xác.
Nếu tế bào có kích thước càng lớn, chỉ số FSC thu được càng lớn. Tế bào
càng nhiều hạt hoặc khoang trong bào tương, nhân càng quận, chia múi thì chỉ số
SSC càng cao. Như vậy, trong các thành phần bạch cầu có thể thấy chỉ số SSC của
quần thể tế bào lympho là thấp nhất, của quần thể mono cao hơn quần thể lympho,
và SSC của quần thể bạch cầu hạt đa nhân sẽ lớn nhất.
Các tín hiệu màu huỳnh quang (FL-Fluoressent Light) từ phức hợp kháng thể
kháng nguyên trên bề mặt tế bào đích cũng được thu nhận theo các kênh màu huỳnh
quang và được khuếch đại trong các ống nhân quang PMTs (photomultipliers tube).
Khi tia laser chiếu vào các chất phát huỳnh quang này sẽ tạo ra các ánh sáng
huỳnh quang và sau đó các tín hiệu sáng này sẽ được thu nhận, chuyển đổi thành tín
hiệu điện tử và biểu thị dưới dạng biểu đồ gồm các quần thể dương tính và âm tính
với các huỳnh quang tương ứng với các kháng nguyên cần khảo sát.
Hình 6: Đồ thị 2 chiều SSC và FSC của mẫu máu toàn phần đã ly giải hồng

cầu cho thấy các quần thế tế bào bạch cầu được phân tách thành 3 quần thể
rõ rệt theo kích thước và mức độ phức tạp của cấu trúc bên trong tế bào.

Hình 7: Hiển thị tín hiệu huỳnh quang trên máy tính phân tích

16


Trong một số trường hợp, tín hiệu huỳnh quang có thể được thu nhận một
cách không đặc hiệu do các kháng thể gắn huỳnh quang có thể gắn không đặc hiệu
với màng tế bào đích, hoặc các tế bào đích có khả năng tự phát huỳnh quang.
Thông thường các hãng khác nhau có đôi chút khác biệt trong việc bố trí đèn
huỳnh quang và các hệ thống kính lọc, do vậy các kênh màu huỳnh quang cũng có
đôi chút khác biệt. Điều này cần chú ý vì sẽ liên quan đến việc lựa chọn phối hợp
màu huỳnh quang trong các phân tích đa màu.
Tổng hợp các tín hiệu về ánh sáng tán xạ góc bên và các tín hiệu về ánh sáng
huỳnh quang tương ứng của một tế bào sẽ giúp chúng ta phân biệt tế bào này với
các nhóm tế bào khác trong quần thể. Ngoài ra, việc khoanh vùng (gating) quần thể
mong muốn còn giúp thực hiện thống kê hoặc tiếp tục phân tích sâu hơn.

I.4.3. Hệ thống điện tử (electronics system)
Hệ thống điện tử về bản chất là một hệ thống có trong máy, các tín hiệu của
ánh sáng tán xạ và tín hiệu huỳnh quang sau khi được khuếch đại ở PMT sẽ được hệ
thống điện tử chuyển thành tín hiệu số đo đếm được và được biểu hiện dưới dạng
biểu đồ cột, biểu đồ mật độ hay biểu đồ điểm trên máy tính thông qua các phần
mềm chuyển đổi chuyên dụng theo máy.
Chuyển tín hiệu ánh sáng huỳnh quang thành
tín hiệu điện tử và biểu diễn dưới dạng đồ thị (Ví
dụ trong hình vẽ, tín hiệu huỳnh quang được
chuyển thành tín hiệu điện từ và được thể hiện trên

màn hình máy tính dưới dạng các điểm đồ thị Dot
Plot
Hình 8: Hiển thị tín hiệu huỳnh quang
I.5.
Ứng dụng
bằng đồ thị điểm trên máy tính
Sử dụng kháng thể đơn dòng gắn chất
huỳnh quang kháng dấu ấn bề mặt để phân biệt các giai đoạn phát triển của tế bào.
Sự thay đổi về số lượng tương đối, số lượng tuyệt đối hay tỉ lệ các loại tế
bào có thể cung cấp các thông tin giá trị về trạng thái miễn dịch của người hay loài
vật.
Cho phép quan sát các tiểu quần thể tế bào và phụ nhóm của 1 mẫu máu.
Kỹ thuật tán huyết không rửa (lyse-no-wash methodology) cho số đếm
tuyệt đối các nhóm tế bào limpho nhanh và chính xác.
Đếm hồng cầu lưới

17


Định lượng DNA ở tế bào bướu.
Với FACSCalibur, phân loại tế bào trở nên thông thường. Chỉ cần đặt giới
hạn (gate) của quần thể tế bào cần quan tâm và ấn ACOUIRE. FACSCalibur làm
tiếp chu trình phân loại tế bào. Chu trình này khép kín, không tạo khí dung, tạo an
toàn khi xử lý các mẫu phẩm. Chu trình này thanh lọc các tiểu quần thể, loại bỏ
các chất có thể gây nhiễm cho các xét nghiệm nhạy, tăng số lượng tế bào cần quan
tâm trong mẫu phẩm hay khẳng định các phát hiện của flow cytometry.
Phân loại tế bào rất lý tưởng cho việc kiểm tra hình thể tế bào và thực hiện
các kỹ thuật phân tử như FISII hay PCR hay xét nghiệm chức năng. Sự liên hệ
chéo giữa thông tin từ flow cytometry và kết quả các xét nghiệm hậu phân loại tạo
thuận lợi cho phân tích tế bào.

Ngoài ra còn những ứng dụng thành công trong các lĩnh vực nghiên cứu
sinh học và y học như phân tích tiểu cầu, nghiên cứu tế bào gốc, phân tích DNA ,
xét nghiệm động học...[7]
Immunophenotyping (HIV) cho thấy sự hiện diện của các quần thể bất
thường hoặc chưa trưởng thành của bạch cầu .
Đếm tuyệt đối kháng nguyên CD4 để đánh gía mức độ suy giảm miễn dịch
(suy giảm miễn dịch nặng khi CD4<200/mm3, hoặc số lượng tế bào lymphô ở
máu ngoại biên < 1.200/mm3)
Thực hiện thủ tục immunophenotyping sau đó dùng kỹ thuật FC để xét
nghiệm chẩn đoán bệnh bạch cầu và ung thư hạch bạch huyết.
Phân tích chu kỳ tế bào và mức bội thể của khối u.
Phản ứng chéo tương hợp mô (ghép tạng) [6]
- Biểu hiện của các thụ thể trên bề mặt tế bào: đếm số lượng tế bào lympho
T-CD4, xác định các dòng tế bào gây ung thư, đếm tế bào gốc, đếm tế bào hồng cầu
lưới, định danh vi khuẩn, nghiên cứu sự biệt hóa tế bào động, thực vật...
- Phân tách tế bào: thu nhận các quần thể tế bào lai cho việc sản xuất kháng
thể đơn dòng, các quần thể tế bào miễn dịch cho nuôi cấy tương tác invitro, thu
nhận tế bào gốc, thu nhận tinh trùng X hoặc Y.....
- ADN/ tế bào: xác định các giai đoạn của chu trình phân bào, khảo sát sự bất
thường trong bộ nhiễm sắc thể, xác định tổn thương ADN, nghiên cứu tác dụng của
thuốc kháng ung thư lên trên tế bào đích...

18


- Phát hiện cytokine: định lượng nồng độ cytokine trong dung dịch bằng kỹ
thuật dùng hạt bi có gắn kháng thể đơn dòng đặc hiệu với phổ cytokines. Xác định
tế bào đích sản xuất các cytokine và bán định lượng thông qua kỹ thuật đo cytokine
nội bào...
- Ngoài ra, kỹ thuật đếm tế bào dòng chảy còn được ứng dụng trong nghiên

cứu biến dưỡng tế bào, hoạt động cá kênh ion, các cơ quan nội bào, pH nội bào, ảnh
hưởng của thuốc lên trên sinh lý tế bào...
2. Ứng dụng kỹ thuật FC để chẩn đoán BCC.

2.1.

Giới thiệu về bệnh bạch cầu cấp (BCC)

2.1.1. Khái niệm:
Bệnh bạch cầu (Leukemia) là bệnh xảy ra khi cơ thể bắt đầu tích tụ bạch
cầu bất bình thường. Vì vậy, số lượng và khả năng của tế bào máu trưởng thành bị
giảm bớt. Tế bào trở thành ‘bất bình thường’ vì chúng không thể trưởng thành trọn
vẹn. Tình trạng không thể trưởng thành trọn vẹn này là yếu tố chính gây ra bệnh
bạch cầu. Những tế bào ‘em bé’, hay còn non, tích tụ trong cơ thể vì chúng không
chết và không bị tiêu hao dần. Khi phát bệnh bạch cầu, các tế bào bệnh bạch cầu
tích tụ trong tủy xương. Cuối cùng tất cả bạch cầu, hồng cầu và tiểu cầu bình
thường hết chỗ trú ngụ hay không đổi mới nữa. Tủy xương khỏe mạnh bị thay thế
bằng những tế bào còn non, rồi cuối cùng những tế bào này nhập vào dòng máu và
đi khắp nơi trong cơ thể. Do đó, khi số lượng tế bào còn non gia tăng, thì số lượng
hồng cầu, bạch cầu và tiểu cầu giảm bớt.
Bốn dạng bệnh bạch cầu thông thường là:
• Bệnh Bạch Cầu Nguyên Bào Cấp Tính
(Acute Lymphoblastic Leukaemia - ALL)
• Bệnh Bạch Cầu Bạch Huyết Bào Mạn tính
(Chronic Lymphocytic Leukaemia - CLL)
• Bệnh Bạch Cầu Tủy Bào Cấp Tính
(Acute Myeloid Leukaemia - AML)
• Bệnh Bạch Cầu Tủy Bào Mạn tính
(Chronic Myeloid Leukaemia- CML) [8]
Bệnh Bạch cầu cấp (Acute Leukaemia) là bệnh tăng sinh ác tính các tế bào

máu chưa biệt hóa hay đã biệt hóa một phần thành các tế bào đầu dòng của tế bào

19


bạch cầu xảy ra khi các tế bào trong thời kỳ phát triển ban đầu bị ảnh hưởng. Do
đó, các tế bào này còn không trưởng thành được và hoàn toàn vô dụng. Do vậy
bệnh nhân bị bệnh bạch cầu dạng cấp tính dễ bị viêm nhiễm, chảy máu, và thiếu
máu, và hầu như phải được trị liệu ngay. Bạch cầu cấp, còn gọi là bệnh lơ xê mi
cấp, là bệnh ung thư phổ biến nhất ở trẻ em trên thế giới, bệnh chiếm khoảng một
phần tư các bệnh ung thư ở trẻ em dưới 15 tuổi. Bạch cầu cấp thể lympho chiếm
75% các bệnh bạch cầu cấp [3].

2.1.2. Nguyên nhân [1]
Cho đến nay, y học đang tìm kiếm nguyên nhân cụ thể gây nên bệnh bạch
cầu cấp. Tuy nhiên, các nhà nghiên cứu ghi nhận các yếu tố liên quan đến bệnh lý
này như sau:

- Hóa chất : các chất nhóm Alkyl, nhóm benzen (những hóa chất có cấu trúc
-

hóa học nhân vòng).
Tia xạ hay tia ion hóa: tỷ lệ bệnh bạch cầu cấp gặp nhiều ở những người

-

tiếp xúc với tia xạ lâu ngày hay ở trong vùng nhiễm xạ nặng.
Virus: nhiều nghiên cứu ghi nhận một số virus gây bệnh trên người một thời
gian dài cũng gây ung thư. Ví dụ: EBV gây ung thư vòm, HTLV1,2 gây bệnh

-

bạch cầu cấp dòng lympho T….
Bất thường nhiễm sắc thể: đây là nguyên nhân thường gặp trên bệnh nhân

-

bạch cầu cấp.
Yếu tố di truyền: có một số bệnh bẩm sinh di truyền như Hội chứng Down,
hội chứng thiếu hụt miễn dịch bẩm sinh, hội chứng Poland… gây người bệnh

-

dễ mắc thêm bệnh bạch cầu cấp.
Yếu tố môi trường: môi trường bị nhiễm độc do hóa chất, thuốc trừ sâu, tia
xạ…gây nên tình trạng nhiễm độc nguồn nước, thức ăn…và các chất độc này
gây đột biến nhiễm sắc thể, gây ung thư máu.

2.1.3. Tiêu chuẩn chẩn đoán bệnh bạch cầu cấp [2]
a/ Triệu chứng lâm sàng:
- Cấp tính và sốt thường gặp nhất (50-60%)
- Thiếu máu: da xanh, niêm mạc nhợt nhạt, trẻ mệt mỏi tim đập nhanh, khó thở
đôi khi có biểu hiện suy tim.
- Giảm bạch cầu trung tính: sốt, viêm loét niêm mạc miệng, nhiễm khuẩn.

20


- Giảm tiểu cầu: xuất huyết dưới da, chấm, nốt xuất huyết, bầm máu, chảy máu
niêm mạc, đôi khi chảy máu nội tạng (tiêu hóa, nội sọ, phổi)

- Gan, lách, hạch to.
- Các triệu chứng khác có thể gặp do tế bào ác tính xâm lấn các cơ quan phì đại
lợi răng, lồi mắt, tăng áp lực sọ não, sưng tinh hoàn, buồng trứng, có u trung thất,
đau xương khớp…
b/ Huyết đồ:
- Hồng cầu giảm vừa đến nặng; hồng cầu đẳng sắc, đẳng bào.
- Số lượng bạch cầu có thể thấp, bình thường hay tăng cao.
- Tiểu cầu giảm khá rõ rệt ngay từ đầu.
- Đa phần các tế bào blast ở máu ngoại vi trên phết lam máu, một số trường
hợp ít hoặc không có.
c/ Tủy đồ:
- Số lượng tế bào tủy tăng, song có thể bình thường hoặc giảm.
-Tăng sinh rất nhiều lymphoblast, thường có thể tới 60-90% tế bào tủy.
- Có hiện tượng lấn át các tế bào tủy bình thường.
- Hình thái học tế bào dựa vào phân loại FAB.
- Nhuộm hóa mô tế bào.

2.2.

Chẩn đoán và phân loại dưới nhóm bệnh BCC bằng DAMDTB
[2]

2.2.1. DAMDTB đặc trưng cho các loại tế bào non
Điều quan trọng trong chẩn đoán bệnh bạch cầu cấp là xác định quần thể tế
bào non (còn gọi là tế bào blast). Đa số các tế bào non có nguồn gốc từ dòng tủy
(như myeloblast, monoblast,erythroblast, megakaryoblast) đều có chung 1 số đặc
điểm về DAMDTB như CD34, HLA.DR và CD38, CD117 rất cao. Đối với dòng
lympho, các dấu ấn non bao gồm: CD34, CD38, CD10, TdT. Ngoài các dấu ấn kể
trên còn có thể thấy sự hiện diện của HLA.DR và CD1a trên tế bào non dòng
lympho T.

Hình 9: Vị trí các quần thể tế bào non ác tính trên biểu đồ SSC-CD45
(quần thể tế bào non màu đỏ - P1, bên trái là 1 ca bệnh BCC dòng
lympho, ở giữa và bên phải là 2 ca bệnh BCC dòng tủy) ( Nguồn: Bộ phận
DAMDTB, bệnh viện TMHH)

21


Quan sát trên biểu đồ SSC-CD45 có thể thấy lymphoblast có nồng độ CD45
thay đổi từ âm tính đến trung bình, trong khi SSC luôn giữ ở mức thấp, myeloblast
có đặc tính SSC thay đổi từ thấp đến cao và CD45 thường mạnh hơn lymphoblast.
Việc chẩn đoán bệnh dựa vào việc so sánh với đồ thị điểm của người bình
thường.
Bất thường

Bình thường

2.2.2. Đặc điểm DAMDTB của bệnh BCC dòng lympho B
DAMDTB trên tế bào lympho B thay đổi qua năm giai đoạn khác nhau.
Trong đó DAMDTB xuất hiện sớm và nồng độ ổn định từ đầu dòng đến cuối dòng
là cyCD19, cyCD22, smCD22, HLA.DR. Các dấu ấn trưởng thành hơn là CD20,

22


cyIgM, smIgM, Igk hoặc Ig..Tương bào là một giai đoạn đặc biệt của dòng B
không có CD22 và CD20. CD19 và CD45 rất yếu, thường đặc trưng bởi CD38 và
CD138 với nồng độ cao.
Tế bào non của bệnh BCC của dòng lympho B có những đặc điểm sau: có
một hoặc nhiều dấu ấn non như TdT, CD34, CD10, CD38, không có chuỗi nhẹ κ

hoặc λ trên bề mặt, không có CyIgµ ở giai đoạn sớm. Không có dấu ấn CD79b
trên bề mặt, mà chỉ có dấu ấn CD79a trên bào tương, nồng độ CD45 có thể thay
đổi từ âm tính đến trung bình.
Từ năm 1976, người ta đã đưa ra tiêu chẩn đoán và phân loại dưới nhóm
của bệnh BCC dòng lympho B dựa vào DAMDTB phải có sự hiện diện của các
kháng nguyên liên quan đến dòng B bên cạnh các dấu ấn non, đồng thời không
xuất hiện các dấu ấn đặc trưng của các dòng khác.
DAMD

ProB-All

TdT
Cd34
CD10
Cd19
CD20
CD22
CyIgµ
smIg-CD79
HLA-DR

++
+
++
_
++
++

Commo
n

++
+
++
++
+
++
++

Pre-B-All

transilition

Mature

++
+
++
++
+
++
++
++

++
+
++
+
++
++
++

++
++

++
++
++
++
+
++

Bảng 1: Bảng phân loại dưới nhóm BCC dòng lympho B dựa vào DAMD
-: <10%
± : 10-25%
+ : 25-75%++ : >75% quần thể tế bào non ác tín

23


Hình 10: Sơ đồ phát triển DAMDTB bình thường
của tế bào dòng lympho B

2.2.3. Đặc điểm DAMDTB của bệnh BCC dòng lympho T
Các tế bào non dòng lympho T trước hết phải mang dấu ấn đặc hiệu của
dòng lympho T là cyCD3, kế đến phải có một hoặc nhiều các dấu ấn dòng T khác
(CD2, CD3, CD4, CD5, CD7, CD8) và một hoặc nhiều các dấu ấn non (CD34.
TdT, HLA.DR, CD1a, CD10).
Tế bào lympho T có 3 giai đoạn phát triển chính:
- Giai đoạn sớm (hay trước tuyến ức): xảy ra ở tủy xương, tế bào được gọi là
tiền tế bào T (Pro-T), hiện diện chủ yếu cyCD3 và CD7. Các dấu ấn khác như
CD3, CD4, CD8...chưa thấy xuất hiện.

- Giai đoạn giữa: xảy ra ở vỏ tuyến ức, tế bào T được gọi là tế bào tuyến ức
(T-thymocyte). Đặc trưng là sự xuất hiện của CD1a+, khi tế bào rời khỏi tuyến ức
sẽ không còn CD1a. Các dấu ấn khác lần lượt xuất hiện như: CD3 yếu, CD4+,
CD8+, CD2+, CD5+,...Ở giai đoạn này, sự phối hợp giữa CD4 và CD8 tạo ra
nhiều kiểu hình khác nhau: CD4-CD8, CD4+CD8+, CD4+CD8-.
-Giai đoạn trễ: bắt đầu xảy ra ở tủy ức, tế bào xuất hiện tương đối đầy đủ các
DAMDTB của dòng lympho T. Đồng thời dựa trên CD4 và CD8, có sự tách biêt

24


thành 2 nhóm kiểu hình: CD4+CD8- và CD8+CD4-, các tế bào này rời khỏi tuyến
ức đi vào tủy xương, biệt hóa thành hai loại tế bào: T giúp đỡ (CD3+CD4+CD8-)
và T gây độc (CD3+CD4-CD8+).

Hình 11:Sơ đồ phát triển DAMDTB bình thường
của tế bào dòng lympho T

2.2.4. Đặc điểm DAMDTB của bệnh BCC dòng tủy

25