Đề tài: Kỹ thuật nuôi cấy tế bào động vật và ứng dụng pot

Phạm văn thương –k20 .động vật học
PHẦN I: MỞ ĐẦU
I. Đặt vấn đề:
Thế kỷ 21 là thế kỷ của CNSH, nó sẽ xâm nhập vào mọi lĩnh vực của đời
sống. Với sự tiến bộ vượt bật của khoa học ngày nay, ngày càng có nhiều sản
phẩm cải tiến phục vụ cho cuộc sống được ứng dụng từ công nghệ sinh học.
Điều này có thể thấy qua những kết quả nghiên cứu đã được công bố của các
nước trên thề giới.
Trong vòng 30 năm qua, chúng ta chứng kiến những thành tựu đáng kinh
ngạc của sinh học và công nghệ sinh học cả trong nghiên cứu cơ bản lẫn nghiên
cứu ứng dụng. Nó không chỉ thành công trong việc khám phá những bí ẩn của
sự sống giúp con người nhìn nhận bản chất thế giới quan sinh học rõ ràng minh
bạch, mà sự thành công của sinh học và công nghệ sinh học còn nằm ở chỗ nó
tạo ra những sản phẩm chuyên về sinh – y – nông nghiệp – công nghệ sinh học
với đủ mọi cấp độ quy mô. Từ sự phát triển này, con người đã thừa hưởng nhiều
thành quả không thể chối cãi: những công cụ chẩn đoán bệnh tật hiệu quả, các
khuynh hướng giải quyết các vấn đề môi trường, nông nghiệp. Đi sâu hơn vào
bản chất của sự thành công này, chúng ta không thể “quên ơn” những nghiên
cứu từ trong phòng thí nghiệm. [2]
Và nếu đặt câu hỏi “Công cụ nào trong phòng thí nghiệm đóng vai trò quan
trọng trong các nghiên cứu ?” Có thể dễ dàng tìm thấy câu trả lời từ những nhà
nghiên cứu sinh y công nghệ sinh học: tế bào và nuôi cấy tế bào là công cụ quan
trọng hầu như không thể thiếu trong các nghiên cứu. Quả thật không thể nói hết
công lao của tế bào và kỹ thuật nuôi cấy tế bào trong nghiên cứu y sinh công
nghệ sinh học ngày nay. Chỉ dám nói rằng: Không có chúng, sẽ không có ngành
sinh học hiện đại và công nghệ sinh học.
Tế bào động vật tách từ mô có thể được nuôi cấy trên các loại môi trường
dinh dưỡng tổng hợp bên ngoài cơ thể, chúng sinh trưởng bằng cách tăng số
lượng và kích thước tế bào. Kỹ thuật nuôi cấy tế bào động vật đã tạo cơ hội để
nghiên cứu các tế bào ung thư, phân loại các khối u ác tính, mô hình thực
nghiệm để khảo sát tác động của hóa chất, xác định sự tương hợp của mô

trong cấy ghép và nghiên cứ u các tế bào đặc biệt cùng sự tương tác của chúng.
Vấn đề nuôi cấy tế bào nói chung và nuôi cấy tế bào động vật nói riêng
đang ngày càng được dư luận thế giới quan tâm hết mức trên nhiều phương diện
Học viên: Bùi Thanh Long – ĐVH - KXVII 1
Phạm văn thương –k20 .động vật học
khác nhau, cả về lợi ích lẫn những tác hại có thể vô cùng to lớn mà hiện nay
người ta chưa lường hết được.
Nhằm bổ sung cho mình những kiến thức mới về kỹ thuật nuôi cấy tế bào
cũng như xem xét những thành tựu mà kỹ thuật này đã đem lại, được sự hướng
dẫn và cho phép của thầy giáo Ngô Đắc Chứng, tôi đã quyết định tìm hiểu về đề
tài: “Kỹ thuật nuôi cấy tế bào động vật và ứng dụng”. Do thời gian hạn chế,
chắc chắn đề tài không thể tránh khỏi những thiếu sót, mong quý thầy cô và bạn
đọc thông cảm và góp ý để đề tài này được hoàn thiện hơn.
II. Phương pháp tiếp cận và phạm vi của đề tài
- Mặc dù hiện nay kỹ thuật nuôi cấy tế bào đã được thực hiện trên rất nhiều
đối tượng khác nhau như vi sinh vật, thực vật, động vật thậm chí cả con người.
Mỗi đối tượng khác nhau thì kỹ thuật nuôi cấy tế bào có sự khác biệt lẫn nhau.
Nhưng trong phạm vi của đề tài này chúng tôi chỉ xin trình bày về kỹ thuật nuôi
cấy tế bào trên đối tượng động vật (bao gồm cả trên con người) và những ứng
dụng của nó.
- Để thực hiện đề tài này tôi đã sưu tầm thông tin, hình ảnh từ các nguồn
khác nhau như giáo trình, bài giảng, tạp chí, các phương tiện thông tin đại
chúng, internet,… các tài liệu và hình ảnh sưu tầm được qua việc phân tích so
sánh từ nhiều nguồn để đảm bảo tính chính xác và tổng hợp thành bài viết này.
Học viên: Bùi Thanh Long – ĐVH - KXVII 2
Phạm văn thương –k20 .động vật học
PHẦN II: NỘI DUNG
I. Kỹ thuật nuôi cấy tế bào động vật
Kỹ thuật nuôi cấy tế bào là tổ hợp các thao tác kỹ thuật nhằm tạo ra những cơ
quan, bộ phận hoặc cơ thể hoàn chỉnh từ một hay một số tế bào ban đầu. Kỹ

thuật này có sự khác nhau đối với các đối tượng khác nhau: Vi sinh vật, thực vật
và động vật do đặc điểm riêng biệt của từng loại tế bào.
1. Tế bào động vật và cơ sở của việc nuôi cấy tế bào động vật
Tế bào động vật trong cơ thể trưởng thành hầu như ít biểu hiện tính toàn
năng, có quá trình chết theo chu trình, rất nhạy cảm với môi trường, tốc độ sinh
sản chậm,… vì thế rất khó để nuôi cấy một cơ thể hoàn chỉnh từ một tế bào của
cơ thể trưởng thành. Các tế bào động vật là tế bào eukaryote, chúng được liên
kết với nhau bởi các nguyên liệu gian bào để tạo thành mô. Mô động vật thường
được phân chia theo 4 nhóm: biểu mô (epithelium), mô liên kết (connective
tissue), mô cơ (muscle) và mô thần kinh (nerve). Biểu mô tạo thành lớp phủ và
lớp lót trên các bề mặt tự do của cơ thể, cả bên trong và bên ngoài. Ở mô liên
kết, các tế bào thường được bao bọc trong thể gian bào rộng (kéo dài), đó có thể
là chất lỏng, hơi rắn hoặc rắn. Các tế bào mô cơ thường thon dài và được gắn
với nhau thành một phiến hoặc một bó bởi mô liên kết. Mô cơ chịu trách
nhiệm cho hầu hết chuyển động ở động vật bậc cao. Các tế bào mô thần kinh
gồm có thân tế bào chứa nhân và một hoặc nhiều phần mở rộng dài và mảnh
được gọi là sợi. Các tế bào thần kinh được kích thích dễ dàng và truyền xung
động rất nhanh.[3]
1.1 .

C

ác

t ế bà o

dị c

h

hu y

ề n

ph ù
Tế bào hồng cầu và bạch huyết là các mô liên kết không điển hình dạng
thể lỏng. Các tế bào máu hoặc dịch bạch huyết là các tế bào dịch huyền phù
(suspension cells), hoặc không dính bám khi chúng sinh trưởng trong nuôi cấy in
vitro. Các tế bào không dính bám không đòi hỏi bề mặt để sinh trưởng.
Chẳng hạn, các tế bào bạch huyết (lymphocytes) (Hình 1a) bắt nguồn từ mô
bạch huyết là các tế bào không dính bám và có hình cầu đường kính từ 10-20 µm.
Chúng có thể được nuôi cấy trong môi trường dịch lỏng theo phương thức tương tự
vi khuẩn.
1.2. Các tế bào dính bám

Hầu hết các tế bào động vật bình thường là các tế bào dính bám, vì thế chúng
cần có bề mặt để gắn vào và sinh trưởng. Trong các ứng dụng, người ta sử dụng
Học viên: Bùi Thanh Long – ĐVH - KXVII 3
Phạm văn thương –k20 .động vật học
rộng rãi các loại tế bào dính bám là tế bào biểu mô và nguyên bào sợi (fibroblast)
(Hình 1b và c). Các tế bào dính bám cần có một bề mặt ẩm để sinh trưởng như là
thủy tinh hoặc plastic. Đĩa petri hoặc các chai trục lăn là các loại được sử dụng
rộng rãi nhất. Các chai được đặt nằm trên một trục lăn quay tròn chậm trong tủ ấm.
Chai có dung tích 1 l chứa khoảng 100 ml môi trường là thích hợp cho các tế bào
vừa sinh trưởng trên thành chai vừa tiếp xúc với môi trường và không khí. Tuy
nhiên, chai trục lăn chỉ dùng cho quy mô phòng thí nghiệm vì diện tích bề mặt trên
một đơn vị thể tích của chai nuôi cấy khá nhỏ (500 cm
2
/l).
Hình 1: Các tế bào động vật thường được sử dụng trong nuôi

cấy.
(a) tế bào bạch huyết, (b) tế bào biểu mô, (c) nguyên bào sợi
Tỷ lệ diện tích/thể tích có thể được tăng lên khi các tế bào sinh trưởng trên
các giá thể là polymer bọt biển (spongy), thể gốm (ceramic), các sợi rỗng, bao vi
thể (microcapsule), hoặc trên các hạt nhỏ có kích thước hiển vi gọi là microcarrier.
[3]
2. Kỹ thuật nuôi cấy tế bào động vật
Năm 1907, Harrison là người đầu tiên đã nuôi cấy thành công một mảnh
mô phôi ếch trong dịch bạch huyết với kỹ thuật “giọt treo” (Hanging drop).
Năm 1923, Carel đã hoàn thiện kỹ thuật nuôi cấy tế bào trong các bình thủy tinh
(in vitro), dễ tiệt trùng và tạo điều kiện cho tế bào phát triển tốt. Nhưng phải chờ
đến những năm 1960, khi hoàn thiện được môi trường nuôi cấy nhân tạo thì kỹ
thuật nuôi cấy tế bào động vật mới được phát triển mạnh và được ứng dụng vào
nhiều ngành công nghệ sinh học.[5]
2.1. Môi trường nuôi cấy
Vấn đề quan trọng bậc nhất trong nuôi cấy tế bào động vật là môi trường
nuôi cấy phải đủ chất dinh dưỡng, nhân tố sinh trưởng, độ pH và nồng độ muối
ổn định, đồng thời phải có hệ thống thải bỏ các sản phẩm trao đổi độc hại để tế
bào có thể sống và phát triển được. Nhu cầu dinh dưỡng của các tế bào động vật
lớn hơn vi sinh vật do, không giống các vi sinh vật, động vật không trao đổi chất
nitrogen vô cơ. Vì thế, nhiều amino acid và vitamin cần phải được bổ sung vào
Học viên: Bùi Thanh Long – ĐVH - KXVII 4
Phạm văn thương –k20 .động vật học
môi trường. Môi trường đặc trưng dùng trong nuôi cấy tế bào động vật bao gồm
các amino acid, các vitamin, các hormone, các nhân tố sinh trưởng, muối
khoáng và glucose. Ngoài ra, môi trường cần được cung cấp từ 2-20% (theo thể
tích) huyết tương của động vật có vú. Mặc dù huyết thanh có thành phần chưa
được xác định đầy đủ, nhưng nhiều nghiên cứu đã cho thấy nó rất cần thiết cho
sự phát triển và tồn tại của tế bào trong nuôi cấy.
2.1.1. Môi trường hóa chất

Huyết thanh dùng trong môi trường nuôi cấy không chỉ đắt tiền mà còn là
nguồn nhiễm bẩn virus và mycoplasma. Do bản chất hóa học của huyết thanh
chưa được xác định đầy đủ nên trong một số trường hợp có thể ảnh hưởng xấu
đến kết quả nuôi cấy. Sự hiện diện của nhiều protein khác nhau trong huyết
thanh cũng có thể làm phức tạp các quá trình phân tách và tinh sạch đầu ra. Vì lý
do đó, nhiều nghiên cứu đã được thực hiện để xây dựng công thức môi trường
không có huyết thanh. Những công thức này chứa các hormone và các nhân tố
sinh trưởng được tinh sạch để thay thế cho huyết thanh.
Môi trường hóa chất được sáng chế từ những năm 1950 đã thay thế hoàn
toàn cho các dịch sinh học như dịch chiết từ phôi gà, huyết tương,… Môi trường
hóa chất được điều chế hàng loạt, cất giữ được lâu, dễ thay thế, thêm, bớt các
chất cần thiết, ít bị lây nhiễm… Môi trường nuôi cấy có chứa đủ các chất dinh
dưỡng (Cacbonhydrat, acid amin, vitamin, nguyên tố vi lượng, hormon, nhân tố
sinh trưởng). Hiện nay, người ta dùng một số môi trường nuôi cấy như môi
trường Eagle, môi trường Dulbecco,…
Môi trường nuôi cấy phải đẳng trương để duy trì cân bằng áp suất thẩm
thấu. Người ta thường dùng bicacbonat để tạo hệ đệm kết hợp với hệ làm giàu
CO
2
môi trường (5-10% CO
2
/95% không khí) trong đó tế bào được nuôi. Độ pH
thích hợp là 7,4. Người ta thường sử dụng đỏ phenol để kiểm tra độ pH của môi
trường, nếu môi trường chuyển dần từ đỏ sang vàng cam thì tế bào phát triển tốt,
nếu chuyển sang vàng nhạt là môi trường bị nhiễm khuẩn.
2.1.2. Nhân tố sinh trưởng
Nếu không có nhân tố sinh trưởng thì tế bào động vật sẽ không phát triển.
Người ta thường phải bổ sung huyết thanh bê vào môi trường nuôi cấy (10-15%)
vì trong huyết thanh có chứa nhân tố sinh trưởng. Nhưng dùng huyết thanh vừa
đắt tiền lại vừa dễ bị nhiễm khuẩn cho nên ngày nay người ta thường dùng các

Học viên: Bùi Thanh Long – ĐVH - KXVII 5
Phạm văn thương –k20 .động vật học
chất bổ trợ để thay thế cho huyết thanh như: insulin, transferin, ethanolamin,…
hoặc sử dụng lớp tế bào nuôi.
2.1.3. Các chất kháng sinh
Các chất kháng sinh như penecillin, streptomicin hoặc amphotericin B
thường được dùng để chống nhiễm khuẩn cho mẻ cấy. Tuy nhiên, các chất
kháng sinh thường độc vì vậy phải dùng với liều lượng thích hợp và phải kết
hợp với quy trình tiệt trùng chu đáo.[2]
Bảng 1. Thành phần môi trường Eagle (1959).[3]
Học viên: Bùi Thanh Long – ĐVH - KXVII 6
Phạm văn thương –k20 .động vật học
Hình 1: Môi trường nuôi cấy
(*Nguồn: Website của ĐH Nông nghiệp 1 Hà Nội)
2.2. K ỹ thuật nuôi cấy tế bào động vật
Phương pháp chính trong nuôi cấy tế bào động vật có vú để sản xuất các
sản phẩm sinh - dược là dựa trên cơ sở nuôi cấy dịch huyền phù trong hệ lên
men. Từ lâu, hệ lên men đã được sử dụng trong nuôi cấy vi khuẩn và nấm men.
Đầu tiên, sự lên men là thuật ngữ dùng cho sản xuất cồn. Sau đó, các nhà vi sinh
vật học ứng dụng các nguyên tắc trên để tách chiết các vitamin, các acid hữu cơ
và các kháng sinh… Kết quả dẫn đến sự phát triển nhanh chóng các phương
pháp và các hệ thống lên men khác nhau.
Các nguyên lý tương tự sau đó được ứng dụng cho nuôi cấy sinh khối tế
bào động vật và thực vật. Tuy nhiên, nuôi cấy các tế bào động vật và thực vật
khó khăn hơn nhiều so với vi sinh vật, cái chính là do quá trình trao đổi chất
trong các loại tế bào này diễn ra chậm, điều này cũng phản ánh tốc độ sinh
trưởng chậm của tế bào. Các tế bào động vật có nhu cầu dinh dưỡng phức tạp
hơn so với vi khuẩn và nấm men, chúng không có thành tế bào như vi khuẩn vì
thế rất dễ biến dạng và vỡ. Do đó, các hệ thống khuấy và sục khí được thiết kế
khác với nuôi cấy vi khuẩn. Mặc dù có một số điểm không thuận lợi, nhưng hệ

thống lên men đã được sử dụng để nuôi cấy tế bào động vật ít nhất cũng vài
chục năm trước đây. Các dòng tế bào khác nhau như BHK-21, LS, các tế bào
Học viên: Bùi Thanh Long – ĐVH - KXVII 7
Phạm văn thương –k20 .động vật học
Namalwa… đã được sinh trưởng trong hệ lên men theo phương thức nuôi cấy
chìm ngập trong môi trường để sản xuất các viral vaccine và các sản phẩm khác.
Đặc điểm dễ biến dạng và dễ vỡ của tế bào động vật đã được khắc phục
bằng cách đưa vào các cánh khuấy có dạng hình mái chèo. Việc cung cấp khí
trực tiếp có thể tạo ra bọt khí dễ làm vỡ tế bào, vì thế cần cung cấp khí bằng
cách khuếch tán thông qua ống silicone. Môi trường chứa nhiều protein huyết
thanh có khả năng gây ra hiện tượng tạo bọt nên cần khuấy chậm và nhẹ. Đối
với nuôi cấy mật độ cao, cần cung cấp thêm oxygen. Phương pháp dùng ống
silicone để sục khí có nhiều ưu điểm do không tạo ra bọt khí và tốc độ truyền
oxygen là thỏa đáng.
Như vậy, các hệ lên men vi sinh vật được cải tiến thích hợp có thể dùng để
nuôi cấy sinh khối các tế bào động vật sinh trưởng trong dịch huyền phù. Nếu
muốn nuôi cấy một dòng tế bào dính bám thì nên dùng một hệ thống chất mang
như là microcarrier.
Các dòng tế bào động vật có vú thường được sử dụng trong nuôi cấy là
CHO4, NS05, BHK6, HEK-2937 và tế bào võng mạc của người.
Người ta có thể sử dụng tế bào tự do (bạch cầu, limpho,…) hoặc tế bào của
mô để nuôi cấy. Mô được phẩu thuật trong môi trường vô trùng, cắt thành mảnh
nhỏ và được xử lý bằng enzyme kết hợp với kỹ thuật nghiền mô để tách thành tế
bào riêng biệt ở dạng huyền phù. Trong môi trường nuôi cấy, các tế bào tự do
thường ở dạng huyền phù, còn tế bào mô thường bám vào đáy bình thành lớp.
Người ta sử dụng buồng đếm hoặc máy đếm tự động để tính toán số lượng tế
bào theo từng giai đoạn phát triển.
Người ta có thể thực hiện các mẻ cấy liên tục bằng cách trích một phần mẻ
cấy trước để cấy chuyền vào môi trường mới, nếu là mẻ bám thì phải sử dụng
enzyme để tách riêng tế bào và phải làm rất nhanh trong vòng 15 phút vì enzyme

có thể gây hại cho tế bào.[2]
2.2.1. Nuôi cấy sơ cấp
Nuôi cấy sơ cấp là quá trình nuôi cấy tế bào trực tiếp từ mô trước lần cấy
chuyền đầu tiên (subculture).
Trong nuôi cấy sơ cấp, các tế bào ban đầu thường là một hỗn hợp các dòng
tế bào khác nhau, hoặc chứa một kiểu tế bào trội nhất, trong đó có những tế bào
quan tâm và những tế bào khác (được gọi là tế bào nhiễm). Có thể loại bỏ các tế
bào nhiễm bằng cơ học hay enzyme khi tách mô hay bằng cách duy trì các điều
Học viên: Bùi Thanh Long – ĐVH - KXVII 8
Phạm văn thương –k20 .động vật học
kiện chọn lọc dương tính cho sự sống sót của một kiểu tế bào quan tâm cần thu
nhận.
Học viên: Bùi Thanh Long – ĐVH - KXVII 9
Hình 2: Sơ đồ nuôi cấy sơ cấp (*Nguồn:CNSH trên người và động vật )
Thu nhận mẫu mô
Cắt nhỏ
(Chọn lọc mẫu mô quan tâm, cắt bỏ phần mô chết)
Cắt nhỏ
(Mảnh nhỏ để nuôi)
Tách TB bằng cơ học
(nghiền, ép)
Tách TB bằng enzyme
(ủ,…)
Nuôi mẫu mô sơ cấp
Thu nhận tế bào
mới
Nuôi mảnh mô
thứ cấp
Trypsin lạnh Trypsin ấm Collagenase
Li tâm

Nuôi sơ cấp
Cấy chuyền
Dòng tế bào
Tái huyền phù
Phạm văn thương –k20 .động vật học
Qui trình nuôi cấy sơ cấp gồm:
- Bước 1: Thu nhận mô (tươi hoặc đông lạnh) có chứa tế bào sống.
- Bước 2: Phẫu tích và (hoặc) tách rời tế bào, xác định nồng độ.
- Bước 3: Nuôi cấy tế bào.
2.2.1.1. Thu nhận mẫu và xử lý sơ bộ
Các mẫu thu nhận có thể bao gồm bất kỳ mô nào của cơ thể, trước khi lấy
phải làm sạch mô tại vị trí lấy, đưa mô vào bảo quan trong dung dịch DPBS,
nhanh chóng chuyển về phòng thí nghiệm.
Xử lí mẫu sơ bộ bao gồm rửa nhiều lần bằng dung dịch PBS có bổ sung
kháng sinh, kháng nấm, sau đó cắt bỏ các phần mô chết, phần thừa,… mẫu mô
cần được cắt nhỏ thành từng mảnh 2-3 mm
2
2.2.1.2. Tách rời các tế bào
Có thể sử dụng nhiều phương pháp khác nhau như:
- Tách tế bào bằng cơ học: nghiền, ép
- Tách tế bào bằng cách ủ với enzyme trypsin hay collagenase
- Tách tế bào bằng phương pháp li tâm theo gradient tỷ trọng
- Tách tế bào bằng phương pháp dựa vào marker bề mặt.
Kết quả của giai đoạn này thu được dịch tách tế bào.
2.2.1.3. Nuôi cấy
- Dùng pipetman hút vào bốn eppendorf, mỗi cái 1 ml dịch tách tế bào.
- Li tâm 1000 vòng/ph trong 10 phút, loại bỏ dịch nổi.
- Cho vào mỗi eppendorf 1 ml môi trường nuôi, huyền phù tế bào bằng
vortex.
- Hút dịch huyền phù tế bào ở bốn eppendorf cho vào một bình nuôi cấy

(bình Roux) và bỏ sung 1ml môi trường.
- Ủ ở 37,5
0
C trong tủ nuôi, sau 24h thay môi trường mới và tiếp tục ủ.
Sau lần nuôi cấy sơ cấp sẽ thu được các tế bào sơ cấp. Đối với trường hợp
lượng mẫu mô quá ít, người ta nuôi cấy nguyên mảnh mô để thu nhận tế bào sơ
cấp.[4]
2.2.2. Đời sống tế bào động vật trong nuôi cấy
Tế bào mô động vật, đặc biệt là động vật có vú có đặc điểm là khi nuôi cấy,
dù là cấy chuyền chỉ qua được 50 thế hệ, sau đó chúng thoái hóa và chết. Số thế
hệ tế bào tùy thuộc vào độ biệt hóa của mô mà ta lấy tế bào. Đối với tế bào gốc
Học viên: Bùi Thanh Long – ĐVH - KXVII 10
Phạm văn thương –k20 .động vật học
thì khả năng sinh trưởng sẽ dài hơn so với tế bào biệt hóa, tế bào gốc phôi có
khả năng sinh trưởng dài hơn tế bào gốc cơ thể trưởng thành. Tuy vậy, người ta
đã tạo ra được các dòng tế bào “bất tử” tức là tế bào có khả năng sinh trưởng
liên tục trong môi trường cấy chuyền. Đó chính là các tế bào ung thư của cơ thể
hoặc là dạng tế bào được làm chuyển dạng “ung thư hóa” với những biến đổi di
truyền. Sự chuyển dạng thường được thực hiện nhờ tác nhân gây đột biến, nhờ
virut, nhờ gen ung thư,… Ngày nay, người ta đã nuôi cấy và cất giữ nhiều dòng
tế bào “bất tử” nhân tạo như các dòng tế bào chuột, chuột Hamster TQ, khỉ,…
hoặc lấy từ cơ thể từ các mô ung thư tế bào Hela (tế bào ung thư cổ tử cung) hay
tế bào Namalwa (tế bào ung thư limphoma của một phụ nữ có tên là Namalwa).
2.2.3. Sự sinh trưởng của tế bào động vật trong nuôi cấy.
Sự sinh trưởng của tế bào động vật in vitro thường trải qua 3 pha:
- Pha chậm (Lag phase) là giai đoạn khi tế bào được đưa vào môi trường
nuôi cấy cho đến khi tế bào bắt đầu phát triển. Thời gian này dài hay ngắn tùy
thuộc vào trạng thái biệt hóa của mô được trích tế bào.
- Pha tiến triển (exponential phase) là giai đoạn tế bào phân chia liên tục,
tăng nhanh số lượng tế bào trong khoảng thời gian từ 15 – 25 giờ với số lượng tế

bào đạt 1-2 x 10
6
/cm
3
, là nồng độ chuẩn cho nuôi cấy theo mẻ.
- Pha dừng (Stationary phase) là giai đoạn sau pha tiến triển, trong đó số
lượng tế bào không thay đổi, tức là khi môi trường dinh dưỡng nghèo dần và bắt
đầu tích lũy các sản phẩm trao đổi chất độc hại. Bắt đầu xuất hiện tự hoại tế bào
thể hiện ở chổ nhân bị đứt chẻ và trên bề mặt tế bào tạo thành các mảnh khối có
thể quan sát được dưới kính hiển vi. Muốn cho tế bào tiếp tục sinh trưởng cần
thực hiện các mẻ cấy chuyền với môi trường mới.
2.2.4. Các phương thức nuôi cấy
Phương thức nuôi cấy đơn giản nhất là nuôi cấy theo mẻ (batch culture),
trong đó tế bào được nuôi vài ngày cho tới khi sinh trưởng dừng lại. Đây là hệ
thống nuôi cấy kín vì không cho thêm gì vào và cũng không lấy từ môi trường ra
một chất gì. Điều kiện chuẩn: mật độ tế bào trong môi trường là 10
5
/cm
3
và nuôi
trong 3 ngày cho tới khi mật độ tế bào đạt 10
6
/cm
3
. Trong khi nuôi cấy phải
khuấy lắc để huyền phù tế bào và chất dinh dưỡng phân bố đều trong môi
trường. Tuy nhiên, môi trường sẽ nghèo dần chất dinh dưỡng và tích lũy nhiều
chất độc (sản phẩm chuyển hóa của tế bào) do đó tế bào sẽ đi vào thoái hóa.
Học viên: Bùi Thanh Long – ĐVH - KXVII 11
Phạm văn thương –k20 .động vật học

Người ta có thể kéo dài thời gian nuôi cấy bằng cách bổ sung thêm chất dinh
dưỡng vào môi trường nuôi cấy theo thời gian để tế bào tiếp tục tăng sinh,
nhưng đến một thời gian nhất định, sinh trưởng sẽ dừng lại vì môi trường đã tích
lũy quá nhiều chất độc như amoniac hay lactat,…
Để giải quyết vấn đề trên người ta tiến hành phương thức nuôi cấy liên tục
(continuous culture), trong đó môi trường luôn được đổi mới và các chất độc
luôn được loại bỏ tương tự như trong cơ thể. Có hai cách nuôi cấy liên tục: Cách
thứ nhất là dùng hệ thống tiếp liệu chất dinh dưỡng nhưng vẫn duy trì tế bào
trong mẻ cấy cho đến khi số lượng tế bào đạt 10
7
/cm
3
. Cách thứ hai là đồng thời
có thêm hệ thống rút bớt môi trường cùng với tế bào ra khỏi mẻ cấy, như vậy hệ
số tăng trưởng tế bào sẽ tỷ lệ với hệ số đổi mới dòng chảy vào và ra. Một hệ cân
bằng như vậy được gọi là hệ ổn hóa (chemostat), là một dạng nồi lên men dùng
để nuôi cấy liên tục.[2,5]
II. Ứng dụng kỹ thuật nuôi cấy tế bào động vật
1. Nuôi cấy và tạo tế bào lai soma động vật
1.1. Tế bào lai soma
Như đã biết in vivo, sự tạo thành tế bào lai soma là vô cùng hiếm. Tuy
nhiên in vitro người ta có thể nuôi cấy các loại tế bào của cùng một mô, của các
mô khác nhau trong cùng một cơ thể, của các cơ thể khác nhau trong cùng một
loài, thậm chí người ta có thể nuôi cấy các tế bào giữa các loài khác xa nhau để
tạo nên tế bào lai soma (hybridoma)
Năm 1960, lần đầu tiên, các tác giả Barski, Sorieul, Cornefert thông báo là
đã tạo được tế bào lai soma in vitro khi nuôi cấy trộn lẫn các tế bào sarcoma của
chuột thuộc hai dòng khác nhau. Các dòng tế bào nuôi cấy khác biệt nhau ở
nhiều đặc điểm: Khả năng tạo thành u khi tiêm chúng vào chuột mang tính
tương hợp mô và số lượng, hình thái nhiễm sắc thể của chúng cũng khác nhau.

Khi tế bào lai được hình thành từ các tế bào cùng một khởi nguồn, thì tế
bào lai được gọi là tế bào đồng nhân (Homocaryon – lai giả), còn khi các tế bào
lai được nuôi cấy thuộc các cơ thể khác nhau về bậc phân loại khác nhau ta thu
được tế bào lai dị nhân (Heterocaryon – lai thật). Như vậy, theo nghĩa đúng đắn
thì heterocaryon mới thực sự là tế bào lai (hybridoma). Khi nuôi cấy trộn lẫn các
tế bào thuộc hai loài khác nhau người ta vẫn có thể thu được tế bào lai một cách
ngẫu nhiên nhưng xảy ra với tần số rất thấp. Vì vậy, để thu được tế bào lai dễ
Học viên: Bùi Thanh Long – ĐVH - KXVII 12
Phạm văn thương –k20 .động vật học
dàng với tần số cao hơn người ta thường phải sử dụng các nhân tố kích thích,
thông thường người ta dùng hóa chất hoặc virut làm nhân tố kích thích. Một số
virut được sử dụng làm nhân tố kích thích đã trở nên phổ biến là các virut chứa
ADN (nhóm virut Herpes, virut đậu mùa,…), các virut chứa ARN (virut lợn,
virut Niucatson, virut Sendai,…) hoặc các virut gây ung thư (virut Sarcoma
Rous),…
1.2. Đặc tính của tế bào lai soma
- Sự hoạt hóa của nhân:
+ Khi lai các tế bào mang nhân hoạt hóa như limpho bào của chuột, tế bào
ung thư Hela của người với tế bào mang nhân bất hoạt ví dụ tế bào hồng cầu của
gà, người ta thu được tế bào lai có chứa nhân lai ở trạng thái hoạt hóa, trong đó
các gen của hồng cầu gà trước đây bất hoạt nay đã trở nên hoạt hóa, tổng hợp
ARN và protein đặc trưng cho gà.
+ Khi sử dụng tế bào nhân bất hoạt nhưng ở mức độ vừa phải so với nhân
hồng cầu gà, ví dụ đại thực bào chẳng hạn (bình thường các đại thực bào không
tổng hợp ADN và tế bào ở giai đoạn biệt hóa G1, chúng chứa hạch nhân nhỏ và
tổng hợp ít ARN). Khi nuôi cấy các đại thực bào (của chuột hoặc thỏ) với các tế
bào hoạt hóa như tế bào Hela hoặc tế bào melanom của người, sẽ tạo nên các tế
bào lai heterocaryon, trong đó nhân đại thực bào tăng cao thể tích và chúng tổng
hợp ARN tăng 4-10 lần so với bình thường chỉ 1 giờ sau dung hợp và 3 giờ sau
xảy ra tổng hợp ADN. Điều này chứng tỏ so với nhân hồng cầu gà, nhân đại

thực bào bất hoạt ở mức thấp hơn.
+ Khi nghiên cứu tiến trình tổng hợp các ARN và ADN trong tế bào lai
giữa đại thực bào và tế bào melanom, người ta đã chứng minh sự tổng hợp ADN
trong nhân đại thực bào không phụ thuộc vào sự tổng hợp ARN và protein trong
nhân đại thực bào mà phụ thuộc vào các nhân tố đến từ tế bào chất của tế bào
melanom.
+ Khi lai tế bào soma với tinh trùng thì nhân của tinh trùng tồn tại trong tế
bào lai rất lâu (vài tháng) và vẫn ở trạng thái bất hoạt, nhưng khi đem lai tinh tử
với tế bào soma (ví dụ đem tinh tử của chuột cống lai với tế bào soma của chuột
nhắt) thì tạo nên các tế bào lai có khả năng phân chia.
Học viên: Bùi Thanh Long – ĐVH - KXVII 13
Phạm văn thương –k20 .động vật học
+ Khi đem trứng chưa thụ tinh của chuột nhắt lai với các tế bào soma khác
nhau như tế bào chuột cống, khỉ hoặc người thì sẽ tạo nên tế bào lai và tế bào
này có thể phát triển tới giai đoạn phôi dâu.
- Sự thụ tinh là sự dung hợp giữa tinh trùng và trứng để tạo nên hợp tử chứa
cả hai nhân – có thể được xem như một tế bào lai giữa hai tế bào đơn bội cùng
nguồn hoặc đôi khi khác loài xảy ra in vivo, trong ống dẫn rứng của con cái
hoặc ở phần nào đó trong xoang bụng ngoài ống dẫn trứng là đã được chương
trình hóa trong bộ gen của sinh vật. Trong nuôi cấy in vitro, để thực hiện được
sự thụ tinh giữa tinh trùng và trứng thì tinh trùng phải được xử lý để làm thay
đổi tính chất sinh lý, được gọi là khả năng hóa (capacitation), nhưng khi sử dụng
virut Sendai để kích thích thì không cần khả năng hóa vẫn thực hiện được sự thụ
tinh.
- Sự điều hòa tổng hợp ADN và ARN trong tế bào lai: Khi sử dụng các
dạng tế bào soma có đặc tính hoạt hóa hay bất hoạt khác nhau về tổng hợp ADN
và ARN trong nhân để tạo tế bào lai, thấy rằng:
+ Tế bào có hoạt tính càng cao tham gia vào tế bào lai sẽ kích thích nhân tế
bào không có hoạt tính, hoặc có hoạt tính thấp tổng hợp ADN và ARN càng tích
cực hơn (trừ trường hợp tế bào ít hoạt tính có kích thước lớn hơn nhiều so với tế

bào hoạt tính cao, hoặc khi tế bào heterocaryon được tạo thành từ các tế bào quá
già).
+ Nhân không có hoạt tính hoặc hoạt tính thấp sẽ đạt mức tổng hợp ADN
và ARN như ở nhân có hoạt tính.
Tín hiệu phát động sự tổng hợp ADN và ARN đến từ tế bào chất của tế bào
có hoạt tính cao và không mang tính đặc trưng mô hoặc loài.
+ Cơ chế và nguyên tắc điều hòa sự tổng hợp ADN và ARN diễn ra trong
tế bào lai tương tự như ở tế bào bình thường. Nhiều gen là bất hoạt trong các tế
bào không có hoạt tính vẫn giữ trạng thái bất hoạt trong tế bào lai chứng tỏ
chúng không mang tính ngược chiều, nhưng nhiều gen bất hoạt đã trở lại hoạt
động trong tế bào lai chứng tỏ chúng có tính ngược chiều. Những công trình cấy
ghép nhân hoặc nhân bản vô tính từ tế bào soma chứng tỏ tùy loại tế bào, tùy
mức độ và giai đoạn biệt hóa mà tính ngược chiều của hoạt động gen thể hiện
khác nhau từ các gen riêng lẻ, các họ gen hay toàn bộ genom.
Học viên: Bùi Thanh Long – ĐVH - KXVII 14
Phạm văn thương –k20 .động vật học
- Biến đổi của bộ nhiễm sắc thể trong tế bào lai: Phân tích bộ nhiễm sắc thể
của tế bào lai có tầm quan trọng trong việc xác định các tế bào dung hợp có thực
sự là tế bào lai hay không và cho phép ta nghiên cứu nhiều vấn đề về cấu trúc,
tập tính của nhiễm sắc thể như là cấu trúc hiển vi chứa thông tin di truyền của tế
bào. Bằng phương pháp đánh dấu nhiễm sắc thể và phương pháp tế bào học
khác như xây dựng kiểu nhân, nhuộm cắt băng cũng như phương pháp lai
ADN… người ta đã làm sáng tỏ nhiều vấn đề di truyền và biến dị của tế bào lai
soma.
+ Trong tế bào lai khác loài, khi 2 bộ nhiễm sắc thể của 2 tế bào bố mẹ kết
hợp lại với nhau sẽ xảy ra sự biến mất một số nhiễm sắc thể của một trong hai
bộ hoặc của cả hai bộ nhiễm sắc thể. Ví dụ: Khi lai giữa tế bào người và chuột
nhắt thì bộ nhiễm sắc thể của người sẽ bị mất, lai giữa chuột nhắt và chuột cống
thì cả hai bộ nhiễm sắc thể cùng đều bị mất một số nhiễm sắc thể. Sự giữ lại
hoặc loại thải nhiễm sắc thể nào trong bộ nhiễm sắc thể bố mẹ trong tế bào lai

xảy ra không phải ngẫu nhiên mà chắc chắn tuân theo các cơ chế tương tác giữa
hai bộ gen trong trạng thái tế bào chất chung của tế bào lai và với môi trường
nuôi cấy in vitro.
+ Trong tế bào lai xảy ra sự biến đổi cấu trúc nhiễm sắc thể. Các tế bào bố
mẹ được sử dụng để tạo tế bào lai có thể ở các giai đoạn khác nhau của chu kỳ tế
bào, khi các tế bào bố mẹ dung hợp tạo thành tế bào lai chứa một nhân dung hợp
thống nhất với hai hoặc vài bộ nhiễm sắc thể, thường quan sát thấy sự biến đổi
cấu trúc trong các nhiễm sắc thể như sự đông đặc hóa, đứt đoạn,… Các nhiễm
sắc thể bị đông đặc hoặc đứt mảnh sẽ bị loại thải qua các kỳ phân bào của tế bào
lai.
- Sự biểu hiện của gen thành các tính trạng kiểu hình ở tế bào lai:
+ Khi ta cho lai hai loại tế bào soma khác loài in vitro ta thu được tế bào lai
heterocaryon chứa hai nhân hoặc vài nhân riêng biệt, về sau các nhân trong
heterocaryon dung hợp tạo nên một nhân độc nhất chứa tổ hợp các bộ nhiễm sắc
thể trong một tế bào lai được gọi là syncaryon. Các heterocaryon có thể tồn tại
rất lâu hoặc chết đi hoặc biến thành syncaryon. Người ta theo dõi số phận và đời
sống của các tế bào lai qua các đặc tính như biểu hiện của hệ gen thành các tính
trạng kiểu hình để đánh dấu, chủ yếu là tổng hợp protein, các enzyme, sự tạo
thành các siêu cấu trúc, sự biệt hóa tế bào về hình thái và một số đặc tính sinh lý,
Học viên: Bùi Thanh Long – ĐVH - KXVII 15
Phạm văn thương –k20 .động vật học
sinh hóa khác như phản ứng với các tác nhân kích thích, sự sinh sản và phát
triển,…
+ Sử dụng các kiểu đánh dấu ta có thể theo dõi sự biểu hiện của các gen
trong nhiễm sắc thể thường, hoặc các gen trên nhiễm sắc thể giới tính, đặc biệt
là nhiễm sắc thể X.
+ Để nghiên cứu quá trình biệt hóa tế bào lai, người ta thường sử dụng tế
bào bố mẹ, đặc biệt là các tế bào ung thư hoặc các tế bà của các chủng quần biệt
hóa cao, ổn định như limpho, tế bào sợi, tế bào gốc hồng cầu,…
Kỹ thuật nuôi cấy tế bào động vật không chỉ được phục vụ cho nghiên cứu

về di truyền học, tế bào học, sinh lý học, phân loại học,… mà còn phục vụ cho
công nghệ tế bào.[2]
2. Công nghệ nhân bản vô tính động vật
Nhân bản vô tính là thuật ngữ được dùng để chỉ quá trình hình thành cơ thể
đa bào không bằng con đường sinh sản hữu tính tự nhiên mà thông qua sự phát
triển của tế bào soma bằng cách phân bào nguyên nhiễm và biệt hóa tế bào thành
cơ thể trong điều kiện nuôi cấy in vitro. Đối với đa số động vật sinh sản hữu tính
thì kỹ thuạt nhân bản có nhiều thủ thuật đặc biệt.
2.1. Kỹ thuật chuyển nhân:
Trong nhân của tế bào soma có chứa 2n NST, chứa hệ gen quy định nên tất
cả các tính trạng của cơ thể giống như bộ NST của hợp tử. Qua quá trình phát
triển, từ hợp tử sẽ phân bào và biệt hóa để cho ra các tế bào và mô khác nhau.
Quá trình biệt hóa là thể hiện sự hoạt động biệt hóa trong hệ gen theo thời gian
và không gian của phôi đang phát triển dưới sự kiểm soát của các yếu tố nội bào
và ngoại bào. Nhân còn ít biệt hóa thì càng có nhiều tiềm năng biệt hóa, vì vậy
sử dụng tế bào gốc để nhân bản vô tính là dễ thực hiện hơn so với tế bào đã biệt
hóa. Bình thường người ta tách nhân từ tế bào cho (tế bào soma) và đem cấy
chuyển vào tế bào trứng chưa thụ tinh đã bị lấy hoặc hủy nhân để tạo nên một tế
bào 2n giống như hợp tử chứa nhân của tế bào soma và tế bào chất của tế bào
trứng. Vì nhân 2n của tế bào cho đã biệt hóa đến một mức độ nhất định nào đó
do tế bào chất của nó quy định phù hợp với thời gian và không gian phát triển
của phôi. Khi nhân này được cấy chuyển vào tế bào chất của trứng là môi trường
giống với hợp tử thì nhân sẽ tái biệt hóa trở lại trạng thái như nhân của hợp tử và
Học viên: Bùi Thanh Long – ĐVH - KXVII 16
Phạm văn thương –k20 .động vật học
hệ gen của nó sẽ hoạt hóa theo đúng chương trình phát triển do các nhân tố của
trứng điều khiển.
Những thành công của nhân bản vô tính bằng cấy nhân được thực hiện ở
ếch, bằng cách sử dụng nhân của các tế bào soma lấy ở giai đoạn phôi. Năm
1952, lần đầu tiên, hai nhà khoa học tai Philadelphia là R. Briggs và T. King đã

nhân bản vô tính con nòng nọc bằng kỹ thuạt chuyển cấy nhân từ tế bào phôi
nang ếch. Từ những năm 1960, J. Gordon đã nhân bản vô tính thành công con
ếch trưởng thành từ nhân tế bào ruột nòng nọc và về sau là từ nhân của tế bào
ruột ếch. Đến nay người ta đã thành công trong việc nhân bản vô tính nhiều
động vật như cá và cả động vật có vú.[2]
2.2. Nhân bản vô tính động vật có vú
Đối với động vật có vú là động vật thụ tinh trong và phôi phát triển trong
dạ con của mẹ dưới sự nuôi dưỡng qua nhau thai. Vì vậy, kỹ thuật nhân bản vô
tính khó khăn và phức tạp hơn các loài động vật khác rất nhiều. Từ những năm
1960-1980, các nhà khoa học đã thành công trong kỹ thuật thụ tinh trong ống
nghiệm để tạo nên phôi người và cấy chuyển phôi vào dạ con người mẹ và sinh
ra em bé được gọi là em bé sinh ra từ ống nghiệm (Em bé đầu tiên là Brown,
1978, tại Anh).[2]
Kết hợp kỹ thuật chuyển nhân với kỹ thuật thụ tinh trong ống nghiệm từ
1983, người ta đã nhân bản thành công đối với chuột từ nhân lấy ở giai đoạn
phôi nang, và từ 1984 – 1986 đã thực hiện thành công ở bò, cừu,… từ nhân lấy ở
giai đoạn phôi. Trước năm 1992, các nhà khoa học cho rằng, đối với động vật có
vú chỉ có thể nhân bản vô tính thành công với nhân lấy từ giai đoạn phôi, còn
đối với nhân của tế bào soma trưởng thành thì không thể thực hiện được vì tính
biệt hóa của chúng là không thể đảo ngược. Tuy nhiên, sự kiện tháng 2/1997,
khi báo chí công bố con cừu Dolly ra đời (ngày 5 tháng 7 năm 1996) bằng kỹ
thuật nhân bản vô tính với nhân lấy từ tế bào tuyến vú của cừu mẹ trưởng thành
6 năm tuổi do I. Wilmut, Campbel và cộng sự ở Viện Roselin (Scottland) thực
hiện. Tế bào được thu nhận từ sinh thiết tuyến vú của một cừu cái giống Finn
Dorset ở giai đoạn 3 tháng cuối của thai kỳ, lúc tế bào đang tăng sinh và biệt
hóa. Các tế bào này được nuôi cấy, sau đó được đưa vào môi trường rất nghèo
huyết thanh nhằm làm ngừng hoàn toàn chu kỳ tế bào. Đồng thời, một trứng của
cừu cái giống Scottish Blackface (Đầu đen) có chu kỳ tế bào ngừng ở kỳ giữa
Học viên: Bùi Thanh Long – ĐVH - KXVII 17
Phạm văn thương –k20 .động vật học

giảm phân II, bị hút bỏ bộ nhiễm sắc thể đơn bội cùng với thể cực và một ít tế
bào chất, phần còn lại của trứng được chuyển vào môi trường nuôi cấy ở 37
0
C,
hoạt hóa bằng một xung điện rồi cho kết hợp với tế bào tuyến vú của Finn
Dorset bằng một loạt xung điện khác. Kết quả tạo thành một phôi.
Phôi này được đưa vào nuôi cấy tự nhiên trong ống dẫn trứng đã thắt của
một cừu cái khác. Khi phôi phát triển đến giai đoạn phôi dâu hay phôi nang,
chúng được cấy vào tử cung của cừu cái mang, từ phôi này phát triển thành cừu
Dolly. Điều đáng chú ý là trong số 277 phôi được tạo ra ban đầu, đến giai đoạn
phôi nang chỉ còn 29 và chỉ có 1 trong số đó phát triển được thành cừu con. Cừu
Dolly đã sống được 6 năm tuổi nhưng những phân tích trên tế bào chứng minh
rằng nó đã 12 năm tuổi.[1,2]
3. Ứng dụng trong lĩnh vực y tế.
3.1. Cấy ghép mô, cơ quan
Với công nghệ nuôi cấy tế bào, người ta đã nuôi cấy thành công gần như tất
cả mọi bộ phận trên cơ thể con người như mũi, tai, xương, gân, thậm chí cả tim,
phổi, não trong phòng thí nghiệm theo đơn đặt hàng từ các bệnh viện. Giống
như việc sản xuất các phụ tùng thay thế của xe hơi hay máy vi tính, giới khoa
học gọi đây là "thuật giả kim phân tử của thế kỷ 21".
Một vòng dạo quanh các "xưởng chế tạo linh kiện thay thế"
Tại một phòng thí nghiệm ở Aberdeen (Anh). Các bác sĩ sau gần nửa tháng
làm việc và chờ đợi đã vừa "chế tác" thành công một chiếc mũi dành cho cô gái
xinh đẹp người Nigeria 20 tuổi. Cô bị mất chiếc mũi dọc dừa của mình trong ca
phẫu thuật ung thư vòm miệng. Cách làm của các bác sĩ ở đây như sau: thoạt
đầu, họ nuôi cấy miếng sụn mũi mới dưới da cánh tay cô gái. Khi nó phát triển
đến kích thước thích hợp, họ tách nó ra và sau đó sẽ ghép nó vào vị trí mũi cũ
trong ca phẫu thuật chỉnh hình mặt cho cô gái sắp được tiến hành. Tương tự,
trong phòng thí nghiệm này, người ta cũng đang thử nghiệm tái tạo "hai trái đào
tiên" cho nạn nhân của ung thư vú.

Còn tại thành phố Worcester, các bác sĩ thuộc Đại học Massachusetts vừa
tiến hành xong một cuộc làm mới một mẩu khuỷu tay cho một người đàn ông 37
tuổi sau khi ông bị mất nó vì tai nạn giao thông. Người ta đã lấy vài ba tế bào
xương đơn chiếc của nạn nhân cấy vào hỗn hợp polimer rồi ghép nó vào vị trí bị
khuyết nơi khuỷu tay nạn nhân. Sau thời gian 3 tháng, tế bào sinh sôi nảy nở và
Học viên: Bùi Thanh Long – ĐVH - KXVII 18
Phạm văn thương –k20 .động vật học
hình thành nên mẩu khuỷu tay y như đã mất, nó hoàn thiện tới mức, bệnh nhân -
một họa sĩ chuyên nghiệp - lại có thể vẽ tranh như bình thường.
Các nhà công nghệ sinh học thuộc hãng Bio Tissue của Đức từ lâu đã nổi
tiếng với kỹ thuật sản xuất những khớp nối của ngón tay. Tại đây, những khớp
nối này được nuôi cấy hàng loạt trong các ống nghiệm. Người ta đã sử dụng
mẫu sụn và xương lấy từ xương sườn và khớp háng. Sau thời gian 3 tuần, trên
khuôn mẫu đã hình thành khớp nối mới, sau đó các bác sĩ phẫu thuật thuộc đại
học ở Freiburg ghép thành công cho bệnh nhân bị tai nạn hay bị bệnh phong.
Các phòng thí nghiệm và trung tâm công nghệ sinh học tương tự như vậy
xuất hiện như nấm sau mưa trên toàn thế giới. "Ngoài mô, sụn, xương, tại những
cơ sở đó, người ta còn tạo ra không ít cơ quan nội tạng như: gan, mật, thận, tim,
phổi " - TS. Stanislaw Wronky - nhà thần kinh học Ba Lan, người đầu tiên trên
thế giới nuôi cấy thành công đường tiết niệu nhân tạo tiết lộ. Cách đây 3 năm,
các bác sĩ địa phương đã ghép sản phẩm đầu tiên cho cậu bé 15 tuổi. Sản phẩm
thứ 2 được ghép cho một người đàn ông 24 tuổi - "cả hai đến nay đều hoạt động
không có gì phải chê trách" - TS. Wronky khẳng định. Chính ông cũng đã tiến
hành các công trình nghiên cứu nuôi cấy da cho các bệnh nhân bị bỏng. Ngay
trong năm nay, ông đang triển khai chương trình nuôi cấy thành mạch và các
động mạch nhân tạo.
Rõ ràng, với những gì vừa được chứng kiến, người ta có thể thấy rằng khoa
học và y học đã bắt đầu một kỷ nguyên mới với một gương mặt mới trong đó
nhân tố có thể làm thay đổi toàn bộ gương mặt ấy chính là những nhà sinh học tế
bào. Chỉ với vài ba tế bào gốc và những ống nghiệm, họ có thể tạo ra những

"phiên bản" của sự sống giống y như nguyên bản.
"Chúng tôi sẽ có đủ khả năng tái tạo dường như tất cả các mô và bộ phận
cơ thể bị thương tổn, thậm chí cả toàn bộ cánh tay" - Jay Vacanti ở Boston tuyên
bố. Hiện tại trong khuôn khổ dự án quốc tế mang tên LIFE (Living Implants
From Engineering), những thử nghiệm nuôi cấy cơ tim đầu tiên đã được tiến
hành với cả hai tâm thất và van tim. Các chuyên gia khẳng định rằng, muộn nhất
trong 10 năm tới, công trình sẽ hoàn thành. Những thí nghiệm gây choáng váng
cho nhiều người của GS. Makoto Asashima ở Đại học tổng hợp Tokyo là chứng
cứ thuyết phục về điều đó: trong phòng làm việc của ông, không ít cơ quan nội
tạng đang từng ngày lớn lên trong ống nghiệm không khác gì hạt ngô hạt đỗ. Để
Học viên: Bùi Thanh Long – ĐVH - KXVII 19
Phạm văn thương –k20 .động vật học
nuôi cấy chúng, GS. Makoto sử dụng tế bào gốc có khả năng phát triển thành
hầu hết các mô của cơ thể: da, xương, não, gan, hoặc tim. Nhà bác học người
Nhật Bản này đổ vào ống nghiệm những chất dinh dưỡng thích hợp như protein
và các hormon tăng trưởng (thành phần của chúng được giữ bí mật tuyệt đối),
tiếp theo ông đưa vào đó vài ba tế bào gốc. Những tế bào phôi gốc này sẽ tự
hình thành ra mô bất kỳ, tùy thuộc vào "khuôn mẫu" mà chúng được nuôi cấy.
Khi tế bào bắt đầu hình thành những dạng mô cụ thể, chúng sẽ được đặt vào
giữa hai lớp phôi dinh dưỡng khác nhau. Sau một thời gian nhất định, từ những
ống nghiệm sẽ xuất hiện các bộ phận thay thế mà ông cần. Trước đó không ai
nghĩ rằng lại có thể dễ dàng nuôi cấy những cơ quan phức tạp đến như thế ngay
trong điều kiện phòng thí nghiệm. Điều ngạc nhiên lớn hơn là những cơ quan đó
lại có thể hoạt động bình thường, thậm chí còn rất "trơn tru" khi được thay thế
vào cơ thể sống. Sắp tới đây, các bệnh viện lớn có thể sẽ không còn phải đau
đầu đi tìm kiếm những nguồn hiến, tặng mô và nội tạng cơ thể nữa. Thay vì cấy
ghép các mô nội tạng lấy từ thi thể người chết, các bác sĩ có thể đặt hàng với các
phòng thí nghiệm và trung tâm sinh học, nơi sản xuất hàng loạt những gì họ cần!
"Thuật giả kim" này cũng hứa hẹn sẽ tạo nên một cuộc cách mạng trong
việc điều trị các bệnh thuộc hệ thần kinh trung ương. Dẫu thực tế vẫn chưa có ai

thử nuôi cấy não người trong ống nghiệm nhưng khoa học đã thành công trong
nỗ lực ghép tế bào não nhân tạo. TS. Michele Levesque - nhà phẫu thuật thần
kinh học ở Los Angeles đã tiến hành ca cấy ghép đầu tiên như thế cho người đàn
ông 50 tuổi mắc bệnh liệt rung. Ông đã khoan xương hộp sọ bệnh nhân và lấy ra
vài ba chục tế bào gốc. Chúng được nhân lên (tới khoảng 6 triệu) và được tiêm
thêm một chất hóa học đặc biệt để biến chúng thành tế bào có khả năng sản xuất
ra dopamin. Sau khi cấy lô tế bào đã được "tân trang" này vào não, nồng độ
hormon dopamin trong não bệnh nhân tăng lên gần 60%. 6 tháng sau ca cấy
ghép, sức khỏe bệnh nhân đã được cải thiện rõ rệt và 3 năm sau, bệnh nhân
không còn bất cứ dấu hiệu nào của căn bệnh. Thật là một điều kỳ diệu![6]
Ghép thành công tế bào sừng tự thân nuôi cấy
Nuôi cấy tế bào sừng trong môi trường không huyết thanh là một phương
pháp hiệu quả, ít tốn kém so với nhiều phương pháp trong điều trị bỏng. Lần đầu
tiên, Viện bỏng Quốc gia đã điều trị thành công cho một bệnh nhân nhờ ghép tế
bào sừng tự thân nuôi cấy.
Học viên: Bùi Thanh Long – ĐVH - KXVII 20
Phạm văn thương –k20 .động vật học
Thông tin này được BS Đinh Văn Hân, Viện Bỏng quốc gia báo cáo tại Hội
nghị Bỏng và Phẫu thuật tạo hình toàn quốc lần thứ IX, diễn ra trong hai ngày 3
- 4/3/2009 tại Hà Nội.
Theo BS Hân, trong bỏng và mất da diện rộng, nguồn da ghép tự thân hạn
chế thì trị liệu tế bào là một giải pháp lý tưởng. Tuy nhiên, trước đây, các tế bào
biểu mô được nuôi cấy trong môi trường có huyết thanh, cần có chi phí rất cao,
quy trình nuối cấy phức tạp. Vì thế, các bác sĩ Viện bỏng Quốc gia đã thử
nghiệm phương pháp phân lập và nuôi cấy tế bào sừng trong môi trường không
huyết thanh với mục tiêu tạo tấm tế bào sừng tự thân nuôi cấy để điều trị bỏng
và vết thương lâu liền. Đây là biện pháp đơn giản, rẻ tiền hơn rất nhiều so với
phương pháp nói trên.
Để có được thành công này, các bác sĩ đã tiến hành nuôi cấy trên 17 mẫu
da lấy từ người tình nguyện và 7 mẫu da lấy từ bệnh nhân bỏng. BS Hân cho

biết, sau khi vệ sinh vùng cho da, lấy 3 - 4cm
2
da toàn lớp, da này đã được bảo
quản trong môi trường huyết thanh, sau đó tiến hành tách tế bào sừng và tiến
hành nuôi cấy. Kết quả cho thấy, các mẫu da tự nguyện có tỷ lệ mọc tế bào sừng
ở tuần thứ 1, thứ 2 đều cao hơn bệnh nhân bỏng, với tỷ lệ lần lượt là 70,5%,
57,2%. Còn tỷ lệ cấy chuyển tế bào sừng thành công ở người tình nguyện và
bệnh nhân bỏng lần lượt là 91,25%, 100%.
Trên những kết quả bước đầu, các bác sĩ đã quyết định tiến hành ghép tế
bào sừng tự thân trên bệnh nhân bỏng.
Bệnh nhân được chọn là Đỗ Khương V, 22 tuổi, bị bỏng lửa xăng 56% độ
3, 4 thân chi. Sau khi được hồi sức ổn định, bệnh nhân được ghép da khoảng
50cm
2
. Kết quả ghép da đạt khoảng 76%, phần còn lại bệnh nhân được ghép tế
bào sừng.
Ngày thứ 3 sau ghép, các tấm tế bào có độ bám rất tốt trên vết thương. Đến
ngày thứ 12 sau ghép, tỷ lệ thành công khoảng 80%. Như vậy, sau 12 ngày điều
trị bằng cấy ghép tế bào sừng tự thân, vết thương cơ bản đã khỏi.
TS Nguyễn Viết Lượng, Trưởng phòng Kế hoạch tổng hợp Viện Bỏng
quốc gia cho rằng, dù chỉ mới là ca đầu tiên, nhưng thành công trên này cho
thấy, phương pháp tác lọc, nuôi cấy tế bào sừng trong môi trường không huyết
thanh cho kết quả tốt để tách lớp tế bào sừng. Đây là phương pháp đơn giản, ít
tốn kém hơn phương pháp nuôi cấy trong môi trường có huyết thanh. Hơn nữa,
Học viên: Bùi Thanh Long – ĐVH - KXVII 21
Phạm văn thương –k20 .động vật học
phương pháp này phù hợp với các labo nghiên cứu tế bào hiện có tại Việt Nam.
Vì vậy, Viện bỏng sẽ tiếp tục hoàn thiện quy trình nuôi cấy, mở rộng trong
nghiên cứu lâm sàng để ứng dụng trong điều trị bỏng và vết thương lâu liền,
đem lại hiệu quả điều trị tốt nhất cho bệnh nhân bỏng.

TS Lượng cho biết thêm, tại Viện bỏng Quốc gia mỗi năm khám, điều trị
cho khoảng gần 7.000 bệnh nhân. Ngoài sử dụng các phương pháp điều trị
truyền thống, y học cổ truyền dân tộc, trong những năm qua, Viện Bỏng đã ứng
dụng hơn 30 kỹ thuật tiên tiến vào điều trị bỏng như: cắt bỏ hoại tử, ghép da
sớm, ghép da đồng loại, ghép da mảnh siêu nhỏ, điều trị nhiễm độc, kỹ thuật
nuôi dưỡng sớm đem lại hiệu quả điều trị tốt nhất cho bệnh nhân bỏng. [7]
Hình 3: Bệnh nhân bỏng sẽ có thêm cơ hội điều trị khi kỹ thuật mới này tiếp tục được
nghiên cứu, ứng dụng rộng vào thực tế (Ảnh:Hồng Hải)
3.2. Nuôi cấy tế bào trong mô hình thực nghiệm để khảo sát tác động của hóa
chất:
Một hóa chất trị bệnh, trước khi được phép lưu hành, phải trải qua nhiều
thử nghiệm, trong đó có giai đoạn thử nghiệm trên động vật như chuột, thỏ, khỉ,
… Các thử nghiệm này đã gặp phải sử phản đối kịch liệt của các phong trào bảo
vệ động vật hoang dã, đồng thời những thử nghiệm này nhiều khi không thể mở
rộng trên người, thí nghiệm lâu dài và tốn kém,… Vì vậy, người ta nghĩ ra
hướng sử dụng tế bào nuôi cấy làm mô hình thử nghiệm, khi có thể nuôi cấy bất
kỳ loại tế bào nào.
Học viên: Bùi Thanh Long – ĐVH - KXVII 22
Phạm văn thương –k20 .động vật học
3.3. Nuôi cấy tế bào trong độc chất học:
Người ta có thể chủ động tạo ra các hư hại đặc trưng trên tế bào bằng các
chất độc, từ đó phát hiện ra các bào quan bị ảnh hưởng và xác định các cơ chế
sinh hóa và phân tử của quá trình chuyển hóa chất độc.
3.4. Nuôi cấy tế bào để sản xuất chế phẩm sinh học:
Tế bào động vật nuôi cấy cũng đã được ứng dụng trong việc sản xuất các
chế phẩm sinh học. Các vaccine virus sản xuất từ tế bào động vật nuôi cấy đã có
những đóng góp cho lĩnh vực y tế cộng đồng trên thế giới mà điển hình nhất là
hiệu quả ngừa bệnh đậu mùa và chứng bại liệt ở trẻ em, trong ngành thú y là
vaccine ngừa bệnh lở mồm long móng ở gia súc. Để sản xuất vaccine, người ta
cho nhiễm và nhân virus trong tế bào nuôi cấy để đạt đến mật độ tối đa. Sau đó,

virus được ly trích và xử lý bằng các tác nhân gây bất hoạt trước khi sử dụng
làm vaccine.[1]
Học viên: Bùi Thanh Long – ĐVH - KXVII 23
Phạm văn thương –k20 .động vật học
PHẦN III: KẾT LUẬN
1. Kết luận:
Kỹ thuật nuôi cấy tế bào động vật được ra đời và hoàn thiện muộn
hơn những lĩnh vực khác của công nghệ sinh học nói chung và công
nghệ tế bào nói riêng. Điều này bắt nguồn từ lý do cơ bản là tính toàn
năng của tế bào động vật khó biểu hiện ở tế bào trưởng thành, chỉ biểu
hiện rõ ở tế bào gốc phôi.
Mặc dù ra đời muộn nhưng kỹ thuật nuôi cấy tế bào động vật đã
mở ra nhiều hướng ứng dụng quan trọng trong đời sống của con
người: Nhân bản các nguồn gen quý hiếm, tạo động vật chuyển gen
phục vụ chăn nuôi, thử nghiệm các loại hóa chất trị bệnh trước khi đưa
vào sử dụng, sản xuất các loại vaccine và đặc biệt, nó đã giúp con
người rất nhiều trong vấn đề điều trị các bệnh nan y, thay thế các cơ
quan, bộ phận của cơ thể bị tổn thương hoặc thậm chí đã có thể tạo
được con người hoàn chỉnh bằng phương pháp nhân bản vô tính. Tuy
nhiên, vấn đề này đang gặp phải rất nhiều trở ngại đặc biệt là về đạo
đức sinh học.
2. Kiến nghị:
Mặc dù đã cố gắng dành thời gian tìm hiểu vấn đề này nhưng tôi
thấy kiến thức và hiểu biết của mình trong lĩnh vực này còn quá mới
và quá ít. Vì vậy, mong muốn của bản thân tôi là được tiếp tục tìm
hiểu vấn đề này trong tương lai ở một cấp độ cao hơn, quy mô rộng
hơn.
Học viên: Bùi Thanh Long – ĐVH - KXVII 24
Phạm văn thương –k20 .động vật học
TÀI LIỆU THAM KHẢO

1. Ngô Đắc Chứng – Sinh sản và phát triển cá thể động vật –
NXB ĐH Huế, 2007.
2. PGS. TS. Nguyễn Như Hiền – Công nghệ sinh học, tập 1:
Sinh học phân tử và tế bào, Cơ sở khoa học của công nghệ
sinh học – NXB Giáo dục, 2007.
3. Nguyễn Hoàng Lộc - Công nghệ tế bào – NXB ĐH Huế, 2006
4. Phan Kim Ngọc, Phạm Văn Phúc - Công nghệ sinh học trên
người và động vật – NXB Giáo dục, 2007.
5. GS. TS. Vũ Văn Vụ, PGS. TS. Nguyễn Mộng Hùng - Công
nghệ sinh học, tập 2: CNSH tế bào – NXB Giáo dục, 2006.
6. Minh Giang - Chế tạo “linh kiện người” - Cuộc cách mạng
trong y học – (
/Thong-tin-can-biet/Y-hoc-the-gioi/Che-tao-linh-kien-nguoi-
Cuoc -cach-mang-trong-y-hoc.html)
7. Hồng Hải – Ghép thành công tế bào tự thân nuôi cấy –
( />sung-tu-than-nuoi-cay.htm)
Học viên: Bùi Thanh Long – ĐVH - KXVII 25