Phân lập và tuyển chọn vi khuẩn cố định đạm, hòa tan lân trong đất vùng rễ cây ngô (Zea mays L.) trồng trên đất xám tỉnh Tây Ninh

1

MỞ ĐẦU
1. Tính cấp thiết của đề tài
Ở Việt Nam, ngô là cây lương thực quan trọng đứng thứ hai sau lúa. Hiện nay,
được xác định là cây an ninh lương thực trọng yếu, cây ngô đã góp phần cứu đói
hộ nghèo và dần trở thành một định hướng phát triển kinh tế khá ổn định đối với
nông dân nhiều địa phương trong cả nước (Nguyễn Đức Cường, 2010). Vùng ngô
Đông Nam Bộ là một vùng ngô hàng hoá giàu tiềm năng. Trong đó, tỉnh Tây Ninh
là một địa phương chuyên trồng và cung cấp ngô giống cho vùng và cho cả nước.
Tuy diện tích gieo trồng ngô của tỉnh chỉ xếp thứ ba trong cả vùng nhưng năng
suất đạt 50,7 tạ/ ha, chỉ xếp sau Đồng Nai. Xét về mặt thổ nhưỡng, đất trồng ngô ở
Đồng Nai chủ yếu là đất đen và đất đỏ basalt, vốn giàu dinh dưỡng hơn. Trong khi
đó, đất trồng ngô tại Tây Ninh chủ yếu là đất xám bạc màu (Trung tâm Viễn thám–
Tin học, Viện Quy hoạch và thiết kế Nông nghiệp). Khuyến nghị về phân bón cho
ngô (năng suất 6 – 8 tấn ngô hạt/ ha) trồng trên đất xám và đất bạc màu về N: P: K
là 2: 2: 2,5 tương đương 333 – 400 kg urea, 935 – 1125 kg super phosphate, 375 –
450 kg KCl, kèm theo 10 tấn phân chuồng, cao hơn so với lượng dùng cho ngô
trồng trên các loại đất khác (Nguyễn Đức Cường, 2010). Như vậy muốn duy trì
năng suất cao như hiện nay, người trồng ngô tại Tây Ninh phải mất nhiều chi phí
cho phân bón và thuốc bảo vệ thực vật.
Thế nhưng, trong tự nhiên có nhiều loài vi khuẩn phát triển mạnh ở vùng rễ
của cây; ngoài ra chúng có thể phát triển bên trong, trên bề mặt, hoặc xung quanh
các mô thực vật, kích thích sự phát triển của thực vật bằng một loạt cơ chế, những
vi khuẩn này được gọi chung là PGPR (Plant Growth Promoting Rhizobacteria: Vi
khuẩn rễ thúc đẩy sự tăng trưởng của thực vật). Hiện nay, việc phát triển các
phương pháp phân lập cũng như các phương pháp khảo sát tính năng của các
PGPR nhằm tìm ra hướng ứng dụng chúng vào thực tiễn đời sống và sản xuất đang
gia tăng nhanh chóng. Một số nghiên cứu trước đó đã cho thấy tiềm năng phân lập
và tuyển chọn được các dòng vi khuẩn có khả năng cố định đạm, hòa tan lân và
thậm chí là phân giải kali từ đất vùng rễ cây ngô trồng ở Đông Nam Bộ (Đặng Thị

2

Ngọc Thanh, Cao Ngọc Điệp, 2012). Trong sản xuất phân bón vi sinh, thông
thường nhà nghiên cứu trộn phối hợp dòng có khả năng cố định đạm với dòng có
khả năng hòa tan lân, hay bổ sung thêm các dòng có các đặc tính khác như hòa tan
kali, tổng hợp IAA… Vì vậy, nếu phát hiện được một dòng cùng lúc có hai hoặc
ba khả năng vừa nêu thì đó sẽ là nguồn giống vô cùng quý giá.
Với những lý do vừa nêu, hướng nghiên cứu “Phân lập và tuyển chọn vi
khuẩn cố định đạm, hòa tan lân trong đất vùng rễ cây ngô (Zea mays L.) trồng
trên đất xám tỉnh Tây Ninh” là có tiềm năng thực hiện. Vi sinh vật được phân
lập từ cây trồng và vùng đất bản địa sẽ đạt được trạng thái sinh trưởng tốt nhất,
thân thiện với môi trường và có hiệu quả cao nhất khi được chủng trở lại loại cây
trồng và vùng đất đó. Đất xám vốn là loại đất có hàm lượng dinh dưỡng thấp nên
lượng phân hóa học dùng trong canh tác thường nhiều hơn. Thế nhưng trong một
môi trường ít màu mỡ như vậy, để thích nghi, có thể thực vật ở đây có được mối
quan hệ gắn bó với các vi sinh vật có khả năng chuyển hóa một cách hiệu quả các
chất dinh dưỡng. Chính vì vậy, trong nghiên cứu này, đất xám được chọn làm môi
trường để dò tìm các dòng vi khuẩn đất vùng rễ có các đặc tính quý vừa nêu. Các
dòng vi khuẩn phát hiện được có thể là nguồn giống cho việc nghiên cứu sản xuất
chế phẩm phân bón vi sinh chuyên dụng cho cây ngô và đạt hiệu quả trên các loại
đất nghèo dinh dưỡng như đất xám. Điều này sẽ mang lại lợi ích kinh tế cho nhà
nông và người tiêu dùng, đồng thời cũng góp phần bảo vệ tài nguyên nông nghiệp
được phát triển an toàn và bền vững.
2. Mục tiêu của đề tài
Tuyển chọn được những vi khuẩn có khả năng cố định đạm, hòa tan lân trong đất
vùng rễ cây ngô để có thể sử dụng như là nguồn phân vi sinh nhằm thay thế hay
tiết kiệm một lượng phân khoáng NPK trong nhu cầu dinh dưỡng của cây ngô.
3. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu

- Đối tượng nghiên cứu bao gồm các vi khuẩn trong đất vùng rễ cây ngô thuộc các
giống ngô lai được trồng phổ biến trên đất xám tỉnh Tây Ninh.


3

- Thu mẫu ngô tại các vùng chuyên canh ngô trên đất xám của tỉnh Tây Ninh, gồm
các huyện Trảng Bàng, Gò Dầu, Dương Minh Châu, Thị xã Tây Ninh, Tân Biên,
Châu Thành, Tân Châu.
- Khả năng cố định đạm được đánh giá thông qua môi trường chọn lọc là môi
trường Burk vô đạm. Khả năng hòa tan lân được đánh giá thông qua môi trường
chọn lọc là môi trường NBRIP chứa calcium orthophosphate.
- Định danh vi khuẩn thông qua kết quả giải trình tự đoạn 16S rDNA và so sánh
tương đồng trình tự với cơ sở dữ liệu có trong GenBank, NCBI.
4. Thời gian nghiên cứu
- Tháng 7/2013 đến tháng 3/2014: Thu mẫu, thực nghiệm thí nghiệm.
- Từ tháng 3/2014 đến tháng 10/2014: Phân tích dữ liệu, viết báo cáo.
- Từ tháng 10/2014 đến tháng 12/2014: Hoàn tất báo cáo và nghiệm thu đề tài.
5. Nội dung nghiên cứu
- Phân lập và xác định đặc tính của các dòng vi khuẩn vùng rễ cây ngô có khả năng
cố định đạm và hòa tan lân.
- Tuyển chọn và nhận diện các dòng vi khuẩn có khả năng cố định đạm và hòa tan
lân tốt nhất.


4

Chương I

TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1. Cây ngô và tình hình sản xuất ngô ở tỉnh Tây Ninh
1.1.1. Cây ngô
Cây ngô (còn gọi là bắp) có tên khoa học là Zea mays L., do Linnaeus đặt vào
năm 1737. Ngô là loài duy nhất của chi Zea. Các giống ngô trồng hiện nay là các
phân loài của Zea mays và các giống ngô lai giữa các phân loài này.
Ngô là loại lương thực có hàm lượng protein và lipid cao hơn hạt gạo. Ngô
được dùng làm lương thực, thực phẩm nuôi sống khoảng 1/3 dân số thế giới. Tất
cả các bộ phận của cây ngô từ hạt, thân, lá đều có công dụng. Theo Nguyễn Đức
Cường (2010), từ cây ngô có thể chế biến tạo thành trên 670 sản phẩm chính và
các sản phẩm phụ. Có đến 70% tổng sản lượng ngô trên thế giới được dùng làm
thức ăn cho gia súc dưới dạng thức ăn tươi hoặc ủ chua. Khoảng 20% tổng sản
lượng ngô trên thế giới được dùng trong sản xuất công nghiệp (Dương Minh,
1999).
1.1.2. Tình hình sản xuất ngô ở tỉnh Tây Ninh
Tây Ninh là một trong sáu tỉnh của miền Đông Nam Bộ, có tọa độ từ
10o57’08’’ đến 11o46’36’’ vĩ độ Bắc và từ 105o48’43” đến 106o22’48’’ kinh độ
Đông. Phía Tây và Tây Bắc giáp vương quốc Cambodia; phía Đông giáp tỉnh Bình
Dương, Bình Phước; phía Nam giáp Tp. Hồ Chí Minh và tỉnh Long An (Hình 1.1).
Khí hậu trong vùng nóng ẩm, ôn hòa quanh năm. Nhiệt độ trung bình năm là
27,4oC. Lượng mưa trong năm đạt 1.578,7 mm. Một năm có hai mùa rõ rệt: mùa
khô kéo dài từ tháng 12 đến tháng 4, và mùa mưa từ bắt đầu từ tháng 5 đến tháng
11 năm sau ( />1/7/2014).
Đất xám (Acrisols) là loại đất có diện tích lớn đứng hàng thứ hai, chiếm gần
32% tổng diện tích tự nhiên của vùng Đông Nam Bộ. Đất xám phân bố rải rác
khắp sáu tỉnh thành của vùng, trong đó có sự tập trung nhiều ở tỉnh Tây Ninh (tiểu


5

vùng đất xám bạc màu Tây Ninh). Đất xám có tính chua, thành phần cơ giới nhẹ,

khả năng giữ nước kém, độ bền đoàn lạp thấp, hàm lượng mùn thấp, khả năng trao
đổi cation (CEC) rất thấp, nghèo dinh dưỡng (Lê Huy Bá, 2009). Đất xám cũng
được khuyến nghị cho canh tác nông, lâm nghiệp nhưng cần chú ý đầu tư phân bón
để đạt năng suất cao.

Hình 1.1: Bản đồ hành chính tỉnh Tây Ninh
(Nguồn: />

6

Tây Ninh là tỉnh có sản lượng ngô xếp thứ ba trong vùng và là nguồn cung
cấp ngô giống cho khu vực. Hai huyện trồng ngô lớn của tỉnh là Gò Dầu và Trảng
Bàng. Huyện Gò Dầu có 8 xã và một thị trấn, tất cả đều canh tác ngô. Trong đó,
Phước Đông và Hiệp Thạnh là hai xã có diện tích ngô lớn nhất: 450 ha (25,2 %
diên tích cây thường niên) và 267 ha (12,4 % diên tích cây thường niên); năng suất
và sản lượng lần lượt là: 51 tạ/ha, 2.316 tấn và 65 tạ/ha, 1.737 tấn. Huyện Trảng
Bàng là huyện sản xuất ngô trọng điểm, với diện tích 2.813 ha, năng suất 68 tạ/ha,
sản lượng 19.128 tấn. Huyện có 10/11 xã trồng ngô, trong đó có Lộc Hưng là xã có
diện tích trồng ngô lớn nhất (935 ha). Đất ở hai huyện nói trên chủ yếu là đất xám
(83,7 %), nghèo dinh dưỡng và thiếu nước vào mùa khô (Phòng thống kê tỉnh Tây
Ninh, 2006).
Bảng 1.1: Diện tích gieo trồng, năng suất và sản lượng ngô ở các tỉnh thành vùng
Đông Nam Bộ, năm 2010
(Nguồn: Tổng cục thống kê Việt Nam, 2010)
Địa phương

Diện tích

Năng suất

Sản lượng

(nghìn ha)

(tạ/ ha)

(nghìn tấn)

Bình Phước

6,7

31,9

21,4

Tây Ninh

5,8

50,7

29,4

Bình Dương

0,6

20,0

1,2

Đồng Nai

47,7

59,2

282,4

Bà Rịa – Vũng tàu

19,6

43,5

85,2

TP. Hồ Chí Minh

0,9

34,4

3,1

Đông Nam Bộ

81,3

52,0

422,7


7

1.2. Vi khuẩn vùng rễ và vai trò đối với sự tăng trưởng của thực vật
1.2.1. Vùng rễ và vi khuẩn vùng rễ
Vùng rễ hay hệ rễ (rhizosphere) được biết đến như là một lớp đất mỏng bao
quanh rễ cây. Đó là một khu vực cực kỳ quan trọng và tích cực cho hoạt động của
rễ và sự trao đổi chất. Khái niệm vùng rễ lần đầu tiên được giới thiệu bởi Hiltner
(1904) để mô tả một vùng hẹp của đất xung quanh rễ nơi mà các quần thể vi sinh
vật được kích thích bởi hoạt động của rễ (Hartmann et al., 2008). Khái niệm ban
đầu này đã được mở rộng, bao gồm vùng đất xung quanh rễ nơi mà các đặc tính
vật lý, hóa học và sinh học đã được thay đổi bởi sự phát triển và hoạt động của rễ
(McCully, 2005 trích dẫn của Saharan and Nehra, 2011). Tùy thuộc vào hoạt động
đang xét như là sự tiết các hợp chất cảm ứng, hoạt động hô hấp hay sự hấp thụ
nước và các dưỡng chất di động mà phạm vi của vùng rễ có thể dao động từ dưới
đơn vị µm cho đến trên cm (Hinsinger et al., 2005). Lớp đất bao quanh rễ thường
được kết dính bởi mạng sợi của nấm rễ, hệ thống lông hút, các chất nhày do rễ và
các vi sinh vật vùng rễ tiết ra tạo nên một cấu trúc gọi là vỏ rễ (rhizosheath) (Hình
1.2) (Watt et al., 1993; Hinsinger et al., 2009).

Hình 1.2: Vỏ rễ hình thành quanh rễ cây Lyginia barbata
(Nguồn: Hinsinger et al., 2009)


8

Trong các vi sinh vật hiện diện ở vùng rễ, vi khuẩn là nhóm phong phú nhất.
Do đó chúng có ảnh hưởng lớn đến sinh lý học thực vật và có khả năng cạnh tranh
cao trong tiến trình dòng hóa rễ (Saharan and Nehra, 2011). Sau khi tập trung ở
vùng rễ (rhizophere), chúng di chuyển đến bề mặt rễ (rhizoplane) và tại đó thể hiện
các lợi ích đối với cây chủ. Một số chủng, loài còn có khả năng xâm nhập vào rễ
(endorhizophere), thậm chí là vào các bộ phận khác của cây (Compant et al.,
2010).
1.2.2. Vai trò của vi khuẩn vùng rễ đối với sự tăng trưởng của thực vật
Vi khuẩn vùng rễ kích thích sự tăng trưởng của thực vật PGPR (Plant Growth
Promoting Rhizobacteria) có lịch sử nghiên cứu hàng thế kỷ. Kinh nghiệm thực tế
của nông dân trong việc luân canh với cây họ Đậu giúp tăng năng suất cây trồng.
Cuối thế kỷ XIX, việc trộn hạt giống với vi khuẩn có ích đã được khuyến cáo rộng
rãi ở Hoa Kỳ. Sau đó, chế phẩm Nitragin ra đời, là sự ứng dụng khả năng cố định
đạm của Rhizobium sp. (Bashan, 1998). Vào những năm 1950, ở Liên xô cũ, hơn
10 triệu ha đất nông nghiệp được xử lý với hỗn hợp vi khuẩn cố định đạm và hòa
tan lân, chủ yếu là Azotobacter chroococcum và Bacillus megaterium. Trong
những thí nghiệm này, khoảng 60% số lần thí nghiệm cho thấy năng suất của các
loại cây trồng khác nhau đã tăng khoảng 10 – 20%. Những năm 1970,
Azospirillum được phát hiện có khả năng tác động tích cực đến sự sinh trưởng của
các cây không thuộc họ Đậu thông qua quá trình hô hấp của thực vật (Bashan and
Holguin, 1997). Hai loài Pseudomonas là P. fluorescens và P. putida, ngoài chức
năng cung cấp dinh dưỡng cho cây trồng, còn được ứng dụng như là các tác nhân
phòng trừ sinh học (Glick, 1995). Nhiều loài vi khuẩn vùng rễ khác nhau đã được
nghiên cứu và đánh giá như Bacillus, Flavobacterium, Acetobacter, Azospirillum,
v.v... (Tang and Yang, 1997).
PGPR được Kloepper và Schroth (1978) định nghĩa như là những vi khuẩn có
khả năng sống quanh vùng rễ và bám vào hạt giống, sau đó giúp cho sự tăng
trưởng của thực vật. Tiến trình phát triển của chúng qua các giai đoạn: phát tán từ
hạt giống và nhân nhanh mật số trong vùng rễ, bám vào bề mặt rễ và phát triển
trong hệ thống rễ cây (Kloepper, 1993). Sự giảm tác dụng của PGPR trong các thử

9

nghiệm ngoài đồng thường là do thiếu khả năng bám trụ của vi khuẩn vào rễ cây
(Bloemberg et al., 2000; Benizri et al., 2001). Có một số gene chuyên trách cho
quá trình này; tuy nhiên, chỉ có một số ít gene được xác định (Benizri et al., 2001;
Lugtenberg et al., 2001). Chúng bao gồm gene chi phối các khả năng di động, sản
phẩm của tiêm mao hay roi, khả năng sản sinh những chất đặc biệt trên bề mặt rễ
cây, khả năng sản sinh các chất cảm ứng (Lutenberg et al., 2001). Sự nghèo nàn về
mật số của PGPR trong đất vùng rễ xảy ra khi mà trong quá trình phát triển của
thực vật gặp phải các điều kiện bất lợi như pH thấp, nhiệt độ cao, lượng mưa thấp
(Frommel et al., 1993). Đối với cây trồng, những điều kiện canh tác không mong
muốn cũng là nguyên nhân làm giảm mật số vi sinh vật trong đất (Dobbelaere et
al., 2001). Sự khác biệt về nhiệt độ cũng là yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến sự
phát triển của PGPR (Okon and Labandera-Gonzalez, 1994).

ISR: Induction of Systemic Resistance of host plant by PGPR
Hình 1.3: Các cơ chế kích thích sự tăng trưởng thực vật bởi PGPR
(Nguồn: Kumar et al., 2011)


10

Vi khuẩn vùng rễ làm tăng sự phát triển của cây trồng thông qua các cơ chế
gián tiếp và trực tiếp nhưng cơ chế chuyên biệt vẫn chưa được hiểu rõ (Glick,
1995; Kloepper, 1993). PGPR kích thích trực tiếp sự phát triển của thực vật thông
qua sự cố định đạm, hòa tan lân khó tan, phân giải kali, sản sinh chất điều hòa sinh
trưởng, v.v… (Glick, 1995; Qi-mei et al., 2002; Zhao et al., 2008). Cơ chế tăng
trưởng của thực vật trực tiếp thông qua việc hấp thụ kim loại và các ion trên bề

mặt rễ cây cũng đã được báo cáo (Bashan and Levanony., 1991; Bertrand et al.,
2000). PGPR tác động tốt đến cây trồng một cách gián tiếp, thông qua sự khống
chế các vi sinh vật gây bệnh. Các cơ chế có thể kể đến là cạnh tranh dinh dưỡng,
cạnh tranh các nguyên tố kẽm, sắt với vi sinh vật gây bệnh; tổng hợp các chất
kháng khuẩn; tiết enzyme phân hủy màng tế bào nấm; sản sinh hydrogen cyanide
khống chế nấm gây hại; v.v... (Hình 1.3) (Glick, 1993; Persello-Cartieaux et al.,
2003; Kumar et al., 2011).
1.2.3. Các cơ chế thúc đẩy tăng trưởng thực vật của vi khuẩn vùng rễ
1.2.3.1. Cố định đạm
Sự cố định đạm sinh học đóng góp 180.106 tấn N/năm trên toàn cầu, trong đó
có các hiệp hội cộng sinh giữa vi sinh vật và thực vật chịu trách nhiệm sản xuất
khoảng 80% và phần còn lại đến từ các hệ thống vi sinh vật sống tự do hoặc kết
hợp (Graham, 1988 trích dẫn của Saharan and Nehra, 2011). Có thể chia vi khuẩn
cố định đạm thành 2 nhóm chính: các vi khuẩn cộng sinh bắt buộc ở cây họ Đậu
(như các rhizobium) và cây không thuộc họ Đậu (như Frankia); các vi khuẩn
không cộng sinh (sống tự do, liên hiệp với cây hoặc nội sinh), gồm có Vi khuẩn
lam, Azospirillum, Azotobacter, Acetobacter diazotrophicus, Azoarcus, v.v… Cố
định đạm được tăng cường thông qua gia tăng cả về số lượng và trọng lượng khô
của nốt rễ, tăng hoạt động của nitrogenase đối với các quan hệ cộng sinh ở cây họ
Đậu hoặc thông qua sự tăng hàm lượng các chất dinh dưỡng khác trong đất hoặc
sự mở rộng hệ thống rễ khi chủng phối hợp các diaztrophe với các vi khuẩn có khả
năng hòa tan các khoáng dinh dưỡng hay các vi khuẩn tổng hợp được các chất điều
hòa sinh trưởng thực vật (Saharan and Nehra, 2011). Việc chủng Rhizobium sp.
giúp gia tăng đáng kể số lượng nốt rễ cũng như năng suất so với đối chứng trong


11

điều kiện ngoài đồng. Thử nghiệm được tiến hành ở Ấn Độ cho thấy tùy thuộc vào
cây họ Đậu, điều kiện đất đai và khí hậu, thông qua việc chủng các rhizobium, có

thể bổ sung khoảng 50% nhu cầu về đạm, dẫn đến sự gia tăng năng suất đáng kể
(Saharan and Nehra, 2011). Ngoài hoạt động cố định N2, các rhizobium có thể cải
thiện tình trạng dinh dưỡng lân của cây trồng bằng cách huy động lân vô cơ và hữu
cơ. Alikhani và ctv. (2006) đã phân lập được từ đất trồng ở Iran các chủng
Rhizobium có khả năng hòa tan Ca3(PO4)2 và inositol hexaphosphate.
Tuy nhiên, sự cố định đạm không cộng sinh còn có ý nghĩa nông học tuyệt
vời hơn vì giúp mở rộng khả năng huy động nguồn đạm vô tận từ không khí (N2)
cho nhiều loại cây trồng khác nhau. Hạn chế chính mà các vi khuẩn không cộng
sinh phải đối mặt là nhu cầu cao về nguồn carbon và nguồn năng lượng sẵn có cho
một quá trình tốn kém năng lượng như cố định đạm. Hạn chế này có thể được khắc
phục bằng cách di chuyển đến gần thực vật, chẳng hạn như các vi khuẩn
diazotrophe trong vùng rễ hoặc trên bề mặt rễ và các vi khuẩn nội sinh.
Azotobacter và Azomonas là hai chi thuộc họ Azotobacteriaceae. Việc chủng
Azotobacter có thể ảnh hưởng đến sự nảy mầm và phát triển của cây con
Helianthus annus (Shaukat et al., 2006). Các cây trồng khác nhau ở Ấn Độ đã
được chủng với Azotobacter và Azospirillum và cho thấy tác dụng cải thiện năng
suất trên cả cây cỏ hàng năm và lâu năm (Saharan and Nehra, 2011).
Kể từ năm 1970, các dòng Azospirillum đã được phân lập và sử dụng. Mặc dù
Azospirillum lần đầu tiên được phân lập là từ ngũ cốc và hầu hết sự chủng trở lại
được thực hiện trên các loại cây trồng ngũ cốc, tuy vậy có nhiều loài khác ngũ cốc
được chủng thành công với Azospirillum. Các loài Azospirillum cố định đạm trong
điều kiện vi hiếu khí. Sau khi dòng hóa trong vùng rễ, Azospirillum thường thúc
đẩy sự phát triển của thực vật. Mặc dù sở hữu khả năng cố định N2 (khoảng 1 10kg N/ha) nhưng sự gia tăng sản lượng bởi Azospirillum chủ yếu là do sự sản
xuất các chất thúc đẩy tăng trưởng thực vật, từ đó cải thiện phát triển hệ rễ làm
tăng tỉ lệ hấp thu nước và khoáng (Saharan and Nehra, 2011). Acetobacter đã đạt
được tầm quan trọng như là một chế phẩm cho cây mía. Vi khuẩn này dòng hóa
thành công vào các giống mía ở Ấn Độ, nơi thay thế phân đạm hoá học hoàn toàn


12

bằng phân hữu cơ ít nhất là trong hai năm liên tiếp (Gillis et al., 1989;
Muthukumarasamy et al., 2000; Ashbolt and Inkerman, 1990 trích dẫn của Saharan
and Nehra, 2011). Azoarcus là một vi khuẩn nội sinh, vi hiếu khí và có khả năng
cố định đạm cực kỳ hiệu quả. Vi khuẩn này được phân lập từ cỏ Kallar
(Leptochloa fusca L. Kunth) và có thể gây nhiễm vào rễ lúa. Ở Pakistan- nơi mà
hàm lượng dinh dưỡng thấp do ảnh hưởng của muối, cỏ Kallar được ứng dụng cho
nhiễm Azoarcus như là một thực vật tiên phong vì nó là một loại cỏ chịu mặn và
đạt được những hiệu quả nhất định (Reinhold et al., 1986).
Ngoài các vi khuẩn kể trên, một số loài thuộc các chi Herbaspirillum,
Burkholderia, Enterobacter, Klebsiella, Bacillus và Pseudomonas được tìm thấy
trong đất vùng rễ hoặc nội sinh thực vật cũng có khả năng cố định đạm, hòa tan lân
tốt.
1.2.3.2. Hòa tan lân và các khoáng dinh dưỡng
Bên cạnh sự cố định đạm sinh học, hòa tan phosphate cũng không kém phần
quan trọng trong việc cải thiện độ phì của đất. Các phosphate trong đá là một
nguồn lân dồi dào nhưng lại là một yếu tố giới hạn sự phát triển của cây vì tính
chất khó hấp thu của nó. Các vi sinh vật hòa tan lân (Phosphate Solubilising
Microorganisms - PSM) hiệu quả nhất gồm các vi khuẩn thuộc về rhizobium,
Bacillus và Pseudomonas; và các nấm thuộc chi Aspergillus và Penicillium
(Richardson et al., 2009). Cơ chế hòa tan lân là thông qua các hoạt động trao đổi

chất có tiết các acid hữu cơ hòa tan phosphate trong đá hoặc tiết các ion calcium
chelate giúp giải phóng lân hòa tan (Saharan and Nehra, 2011). Ngoài ra, các hợp
chất mùn với thành phần chứa acid humic và acid fulvic, các enzyme loại esterase,
các siderophore, H2S, CO2, và cơ chế tiết proton đều có liên quan đến sự hòa tan
phosphate của các PSM (Kumar and Pathak, 2000).
Trong các rhizobium, hai loài tạo nốt rễ ở đậu xanh là Mesorhizobium ciceri
và Mesorhizobium mediterraneum được coi là tác nhân hòa tan phosphate tốt
(Rivas et al., 2006). Vi khuẩn Pseudomonas là các γ-Proteobacteria phổ biến trong

đất nông nghiệp và có nhiều đặc điểm thích hợp với một chế phẩm thúc đẩy đặc


13

điểm tăng trưởng và năng suất của cây trồng. Nhiều nghiên cứu được tiến hành
trên quy mô toàn cầu để khai thác tiềm năng của nhóm Pseudomonad huỳnh quang
(Fluorescent Pseudomonads - FLPs). FLPs giúp đỡ trong việc duy trì sức khỏe đất,
là nhóm đa dạng nhất về mặt trao đổi chất và chức năng. Các Pseudomonad nhanh
chóng xâm chiếm rễ của khoai tây, củ cải đường và củ cải, và làm gia tăng sản
lượng đáng kể về mặt thống kê lên đến 144% trong các thử nghiệm thực địa
(Saharan and Nehra, 2011). Các dòng vi khuẩn Pseudomonas sp. và Azospirillum
sp. phân lập được từ đất vùng rễ và rễ của Piper nigrum L. thể hiện khả năng hòa
tan phosphate in vitro cao (Ramachandran et al., 2007).
Khoảng 95% trực khuẩn đất Gram dương thuộc chi về chi Bacillus. Các
thành viên của các loài vi khuẩn Bacillus có thể tạo nội bào tử do đó có thể tồn tại
trong điều kiện bất lợi của môi trường. Bacillus megaterium cũng giúp cải thiện
các hiệu suất rễ, chiều dài và hàm lượng chất khô của rễ bạc hà (Kaymak et al.,
2008). Natarajan và Subramainan (1995) cho rằng chủng kết hợp Rhizobium
(chủng Tt 9) với B. megaterium var. phosphaticum có thể đáp ứng với khoảng 50%
nhu cầu phân bón có chứa phosphate của đậu phộng; làm gia tăng nốt rễ, tăng
chiều dài rễ và chồi cũng như tăng năng suất quả (trích dẫn của Kumar et al.,
2011). Nghiên cứu in vitro cho thấy chủng phối hợp Azotobacter vinelandii và
Bacillus cereus làm gia tăng khả năng hòa tan phosphate (Husen, 2003 trích dẫn
của Saharan and Nehra, 2011). Một nghiên cứu của Algawadi và Gaur (1988)
trong điều kiện nhà kính nhằm tìm hiểu hiệu quả của việc chủng phối hợp
Rhizobium và vi khuẩn hòa tan phosphate bao gồm Pseudomonas striata hoặc
Bacillus polymyxa lên sản lượng và hàm lượng dinh dưỡng của đậu xanh với sự bổ
sung hoặc không bổ sung phân bón (Kumar et al., 2011).
Với các nguyên tố đa lượng khác, các vi khuẩn vùng rễ cũng góp phần quan

trọng trong việc chuyển hóa các dạng khó hấp thu trong đất thành dạng sẵn có cho
cây trồng. Việc chủng các vi khuẩn oxy hóa lưu huỳnh (Thiobacillus) vào hạt
giống của những cây trồng có nhu cầu về S cao đã được chứng minh là khá thành
công trong việc tạo ra dạng lưu huỳnh hữu dụng hơn cho cây (Saharan and Nehra,
2011). Ngoài ra, nhiều loài vi khuẩn đất vùng rễ và vi khuẩn nội sinh có khả năng


14

phân giải các hợp chất chứa kali như kaolinite, illite, montmorilonite, v.v... (Qimei et al., 2002; Zhao et al., 2008). Vi khuẩn hòa tan lân Bacillus megaterium var.
phosphaticum kết hợp với vi khuẩn hòa tan kali Bacillus mucilaginosus khi chủng
vào đất có dinh dưỡng hạn chế (do chứa P và K không tan) cho thấy chúng có khả
năng làm tăng tính hữu dụng của các khoáng; từ đó làm tăng sự hấp thu dinh
dưỡng và sự tăng trưởng của tiêu và dưa chuột (Han et al., 2006). Các siderophore
có thể thúc đẩy sự hòa tan các khoáng chất chứa kim loại như Ca và Fe. Các phản
ứng oxi hóa khử hình thành mảng bám Fe quanh rễ; các mảng bám này còn có thể
cô lập các chất dinh dưỡng khác như phosphate và kẽm (Hinsinger et al., 2009).
1.2.3.3. Các cơ chế thúc đẩy tăng trưởng thực vật khác
Ngoài việc tăng cường nguồn dinh dưỡng cho cây thông qua sự cố định đạm
và tạo ra nguồn khoáng hữu dụng cho cây từ dạng khó tan, khó hấp thụ, các PGPR
còn có khả năng thúc đẩy sự tăng trưởng của thực vật thông qua việc sản xuất các
phytohormone như auxin, cytokinin và gibberellin. Ngoài ra, các hợp chất hữu cơ
dễ bay hơi (volatile organic compounds - VOCs) như acetoin và 2,3-butanediol có
tác dụng điều hòa nội cân bằng (homeostasis) auxin trong cây cũng được Bacillus
subtilis, B. amyloliqufaciens và Enterobacter cloacae tạo ra như là các chất thúc
đẩy tăng trưởng thực vật (Jha et al., 2013; Zhang et al., 2008). Cofactor PQQ
(pyrroquinoline quinine) cũng là tác nhân kích thích tăng trưởng thực vật được tìm
thấy ở Pseudomonas fluorescens (Saharan and Nehra, 2011; Jha et al., 2013).
Bên cạnh đó, các PGPR còn đóng vai trò quan trọng trong việc kiểm soát sinh
học thông qua tính kháng có hệ thống gây tạo (ISR) và tính kháng thu được có hệ

thống (SAR), từ đó làm giảm tác động xấu của mầm bệnh lên sự tăng trưởng của
cây chủ. Nhiều PGPR có thể phục vụ như tác nhân cô lập kim loại hiệu quả để
chủng cho cây trồng tại những vùng bị stress kim loại nặng (Saharan and Nehra,
2011; Bhattacharyya and Jha, 2012). Các vi khuẩn này giúp giảm thiểu tác dụng
độc hại của kim loại nặng thông qua bài tiết acid, protein, phytoantibiotic, v.v…
(Alizadeh, 2011), hoặc giúp tập trung kim loại nặng trong sinh khối thân lá hay rễ
của cây chủ từ đó làm giảm hoạt tính sinh khả dụng của kim loại nặng trong đất
(Saharan and Nehra, 2011). Vì đặc tính này, các PGPR chịu/kháng kim loại nặng


15

có thể được sử dụng như tác nhân chữa trị sinh học (bioremediation) tiềm năng cho
đất bị ô nhiễm (Chacko et al., 2009).
1.3. Định danh vi khuẩn thông qua các phương pháp Sinh học phân tử
Các phương pháp phân loại và định danh truyền thống được thực hiện dựa
trên các đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hóa, dinh dưỡng và phát triển của sinh
vật. Các tài liệu tham khảo chuẩn hỗ trợ cho các phương pháp này có thể kể đến
như Vi khuẩn học hệ thống của Bergey (Bergey's Manual of Systematic
Bacteriology) hay Vi khuẩn học lâm sàng (Manual of Clinical Microbiology). Tuy
nhiên các phương pháp truyền thống này không thể áp dụng cho các sinh vật
không thể nuôi cấy, chẳng hạn như Tropheryma whippelii. Hoặc trong một vài
trường hợp, đặc tính sinh hóa của một số sinh vật không phù hợp với mô hình với
bất kỳ chi, loài nào đã biết (Woo et al., 2000). Với sự phát hiện phản ứng chuỗi
trùng hợp (PCR) và phương pháp giải trình tự DNA, sự xác định các đơn vị phân
loại (taxon) nào có liên quan chặt chẽ với nhau đã được thực hiện thành công hơn
so với phương pháp thông thường khác. PCR (Polymerase Chain Reation) là kỹ
thuật Sinh học phân tử cho phép nhân bản in vitro một đoạn DNA mong muốn từ
DNA bộ gen của một cơ thể sinh vật với sự có mặt của cặp mồi đặc hiệu. Kỹ thuật
này được Kary Mullis và cộng sự đề xuất năm 1985; mặc dù nguyên tắc đã được

mô tả trước đó một thập niên bởi Khorana và cộng sự. Phương pháp PCR cho phép
khuếch đại rất nhanh một trình tự chuyên biệt. Đây là phương pháp hiện đại và
thuận tiện cho sự xác định sự hiện diện của một trình tự nào đó trong mẫu với độ
chính xác cao và được ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực (Trần Nhân Dũng và
ctv., 2012).
Công dụng và sự thuận tiện của các phương pháp khuếch đại trên nền tảng
PCR và việc giải trình tự tự động các sản phẩm PCR đã mở rộng cơ sở dữ liệu về
rRNA trong vài năm qua. Thông tin trình tự từ các vùng bảo tồn của 16S rRNA
(rrs) là hữu ích cho việc nghiên cứu các mối quan hệ phát sinh chủng loại cũng
như cho việc thiết kế các mẫu dò oligonucleotide chung hoặc chuyên biệt cho
phương pháp lai phân tử và việc thiết kế mồi dùng cho phương pháp PCR. Phân


16

tích trình tự rRNA đã được sử dụng rộng rãi để nghiên cứu mối quan hệ phát sinh
chủng loại giữa các sinh vật cũng như để xác định hệ thống phân loại (Mehnaz et
al., 2001). Trong khi đó, vùng biến đổi của 16S rRNA cung cấp dữ liệu để phát
triển các mẫu dò hoặc mồi chuyên biệt nhằm phát hiện vi khuẩn (Mehnaz et al.,
2001). Weisburg et al. (1991) cũng đã đề xuất một số mồi công hiệu cho việc
khuếch đại gen 16S rRNA của các vi khuẩn thật (eubacteria); trong đó có chứa vị
trí nhận biết của một số enzyme cắt giới hạn.
Chính sự dồi dào của thông tin trình tự trong các cơ sở dữ liệu công cộng,
chẳng hạn như NCBI, đã tạo điều kiện tốt hơn bao giờ cho việc xác định các chủng
vi khuẩn bằng cách so sánh trình tự chuỗi. Bằng cách khuếch đại gene 16S rRNA
và giải trình tự, kết hợp các test sinh hóa và hình thái, Mehnaz et al., (2001) đã xác
định được các chủng PGPR cố định đạm, sinh tổng hợp IAA phân lập được từ đất
vùng rễ lúa trồng tại Pakistan thuộc các chi Enterobacter, Aeromonas và
Azospirillum. Tương tự, khi khuếch đại gene 16S rRNA của vi khuẩn nội sinh rễ và
hạt ngô trồng tại Melle (Bỉ) bằng PCR với mồi tổng P338f và P518r, sau đó giải

trình tự sản phẩm PCR (khoảng 180bp) với cơ sở dữ liệu của NCBI bằng chương
trình BLAST, Seghers et al. (2004) nhận thấy các dòng thu được có sự tương đồng
trình tự với Rahnella aquatilis, Enterobacter sp., Pseudomonas sp. từ 96 - 99%.


17

Chương II

PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Các nghiên cứu của đề tài được tiến hành tại Phòng thí nghiệm Vi sinh vật và
Sinh hóa, trường Đại học Sài Gòn và Phòng thí nghiệm Vi sinh vật và Sinh học
Phân tử, Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học, trường Đại học Cần
Thơ.
2.1. Phương tiện nghiên cứu
2.1.1. Vật liệu
- Mười mẫu đất vùng rễ cây ngô lai F1 trong giai đoạn trổ cờ được thu tại 7 huyện
của Tây Ninh vào tháng 7/2013.
2.1.2. Thiết bị, dụng cụ
- pH kế Mettle MP220
- Máy lắc Red Roter
- Cân phân tích Sartorius BP210S
- Tủ cấy Esco
- Tủ sấy Binder ED115
- Tủ Hotte
- Bếp vô cơ hóa Foss
- Máy phân tích đạm tự động Kjeltec 2300
- Tủ mát Akira
- Tủ lạnh âm sâu Akira URF 180
- Nồi hấp tiệt trùng nhiệt ướt Tomy ES-315

- Quang phổ kế Labomed
- Máy ly tâm Eppendorf Centrifuge 5417C
- Máy hút chân không Eppendorf Concentrator 5301


18

- Bồn ủ Grant
- Máy PCR Bio-Rad Thermoal Cycler C1000
- Bộ điện di một chiều Embi-Tec
- Các dụng cụ thủy tinh thông dụng
- Hệ thống chụp hình gel Bio-Rad UV 2000
- Micropipette Eppendorf
- Máy vortex Labnet VX100
2.2. Phương pháp nghiên cứu
2.2.1. Thu thập và xử lý mẫu đất vùng rễ cây ngô
2.2.1.1. Thu thập mẫu
Việc thu mẫu được tiến hành tại các ruộng ngô thuộc các huyện Trảng Bàng,
Gò Dầu, Dương Minh Châu, Thị xã Tây Ninh, Tân Biên, Châu Thành, Tân Châu.
Quy trình thu mẫu thực hiện theo Viện Thổ nhưỡng Nông Hóa (1998) (Hình 2.1).
Mỗi ruộng thu ngẫu nhiên ít nhất 5 cây ngô để lấy đất vùng rễ.
Chọn cây ngô đang ở giai đoạn tăng trưởng mạnh (vừa trổ cờ). Hớt bỏ lớp đất
bề mặt (1 - 3 cm) quanh gốc. Thu toàn bộ đất vùng rễ và gốc cây ngô (cắt bỏ thân
và lá) cho vào túi nylon, ghi và dán nhãn. Mẫu sau khi thu được đem ngay tới
phòng thí nghiệm để xử lý (trong vòng 24 giờ).

Hình 2.1: Cách thu mẫu ngẫu nhiên
(Nguồn: Viện Thổ nhưỡng Nông Hóa, 1998)

19

2.2.1.2. Xử lý mẫu
- Giũ mạnh bộ rễ ngô để thu đất xa rễ (cách rễ > 1 cm). Nhặt sạch rễ khô, sỏi, sạn.
Dùng tay đeo găng cao su bóp vụn đất, trải đều ra khay, để khô trong không khí.
Đất này được dùng để phân tích lý - hóa đất.
- Dùng dụng cụ vô trùng gạt lấy đất vùng cạnh rễ và vùng xung quanh rễ (cách rễ 0
đến 1 cm) cho vào lọ chứa đã tiệt trùng, bảo quản lạnh (4-5oC). (Viện Thổ nhưỡng
Nông Hóa, 1998)
2.2.2. Phân tích một số chỉ tiêu dinh dưỡng của đất vùng rễ cây ngô
(Theo Viện Thổ nhưỡng Nông Hóa, 1998)
2.2.2.1. Xác định pHH2O
- pH = -lg aH+, là đại lượng biểu thị hoạt độ H+ trong môi trường đất. Ðó là chỉ
tiêu đơn giản đầu tiên về độ chua thường được xác định nhất, nó có ý nghĩa rất lớn
trong việc đánh giá tính chất đất. pHH2O là pH được đo khi tác động đất với nước.
Phép đo thông dụng và tiêu chuẩn hiện nay là phép đo điện thế bằng pH kế điện
cực thủy tinh.
-

Cân 20 g đất mịn khô trong không khí cho vào bình có dung tích 100 ml miệng

rộng.
-

Thêm 50 ml nước cất.

-

Loắc xoáy bằng tay cho phân tán đất và tiếp tục lắc trên máy 30 phút. Để yên

khoảng 2 giờ trở lên (không được quá 3 giờ).
- Loắc xoáy lại 2 - 3 lần bằng tay cho phân tán huyền phù.
- Sau đó đo ngay bằng pH kế. Vị trí bầu điện cực ở vị trí trung tâm và trung điểm
độ sâu của dung dịch trong huyền phù.
- Ðọc số đo sau khi kim chỉ ổn định 30 giây.


20

2.2.2.2. Xác định N tổng số theo phương pháp Kjendahl
Nguyên lý
Nguyên lý là máy vô cơ hóa mẫu sẽ chuyển toàn bộ N có trong hợp chất hữu
cơ thành muối ammon bằng cách công phá với H2SO4 đậm đặc (với K2SO4 tăng
nhiệt độ sôi và CuSO4 và Se xúc tác). Chuyển mẫu sang hệ thống chưng cất đạm,
NH3 được sản sinh ra khi cho muối ammon tác dụng với NaOH. Thu NH3 bằng
dung dịch acid boric và chuẩn độ borate ammon bằng dung dịch acid mạnh (ví dụ
như H2SO4 chuẩn hay HCl chuẩn).
Acid boric là một acid rất yếu, dung dịch 0,65M có pH = 4,7. Khi trung hòa
hết 20% H+ ở nấc điện ly thứ nhất thì đã tăng lên pH = 8,6 (25 ml dung dịch có thể
tương đương 48 mg N). Khi chuẩn độ bằng một acid mạnh, loãng, tại điểm đổi
màu pH = 4,5 cho phép kết thúc định phân.
Hỗn hợp chỉ thị màu methyl đỏ (khoảng đổi màu pH = 4,4 - 6,2 chuyển từ đỏ
sang vàng) và với bromocresol xanh (khoảng đổi màu pH = 3,8 - 5,4 chuyển từ
vàng sang xanh dương) là để mở rộng khoảng đổi màu và phối màu để nhận biết
sự đổi màu rõ rệt hơn.
Hóa chất cần chuẩn bị
+ Hỗn hợp chất xúc tác
100g K2SO4, 10g CuSO4.5H2O và 1g Se. Nghiền rời từng thứ sau đó trộn đều.
Nghiền lại một lần nữa toàn bộ hỗn hợp.
+ Dung dịch NaOH 10M

Hòa tan 420g NaOH (tiêu chuẩn kỹ thuật) thành 1l dung dịch. Để yên vài ngày cho
lắng hẳn carbonate. Bảo quản trong bình chống CO2 xâm nhập.
+ Dung dịch acid boric 2% và chỉ thị màu
Hòa tan 20g acid boric vào 900ml nước cất nóng. Để nguội và thêm 20ml hỗn hợp
chỉ thị màu (chuẩn bị trước bằng cách hòa tan 0,1g bromocresol xanh lục và 0,07g
methyl đỏ trong 100ml ethanol). Cho thêm từng giọt dung dịch NaOH 0,1M cho


21

đến khi toàn bộ dung dịch có màu đỏ tía nhạt. Thêm nước cất không N đến 1l.
+ Dung dịch H2SO4
Pha từ ống tiêu chuẩn bằng nước cất không N.
Thao tác
+ Vô cơ hóa mẫu (Công phá mẫu) bằng máy tự động
- Cân 0,5 – 1 g đất (hoặc mẫu vật rắn khác) khô kiệt cho vào bình công phá thể
tích 50 – 100 ml.
- Thêm 1g chất xúc tác (K2SO4:CuSO4:Se theo tỉ lệ 100:10:1) và 5 - 10 ml H2SO4
đậm đặc.
- Đưa bình vào máy nung đặt trong tủ Hotte, tiến hành vô cơ hóa mẫu trong 1 giờ
ở 420oC.
- Để nguội và bay hết hơi acid. Lấy bình ra, đưa vào máy chưng cất và chuẩn đạm
tự động.
- Chuẩn bị tương tự với mẫu trắng.
+ Chưng cất đạm và định lượng N tổng số bằng máy tự động
- Chuẩn bị: nạp đủ lượng dung dịch NaOH 10 M, dung dịch acid boric 2% và chất
chỉ thị màu, dung dịch H2SO4 chuẩn.
- Máy sẽ tự động nạp các hóa chất theo đúng trình tự và tính toán lượng đạm tổng
số, hiển thị kết quả trên màn hình.
+ Công thức tính N tổng số (trên 1g mẫu khô)

Với a: Thể tích dung dịch acid tiêu chuẩn tiêu tốn khi chuẩn độ mẫu (ml).
b: Thể tích dung dịch acid tiêu chuẩn tiêu tốn khi chuẩn độ mẫu trắng (ml).
V: Thể tích toàn bộ dung dịch đã vô cơ hóa (ml).


22

v: Thể tích dung dịch trích chuẩn độ (ml).
N: Nồng độ đương lượng dung dịch chuẩn acid.
m: Khối lượng mẫu phân tích (g).
2.2.2.3. Xác định P dễ tiêu theo phương pháp Oniani
Nguyên lý
Hòa tan các dạng hợp chất chứa P trong đất bằng dung dịch H2SO4 0,1N với tỉ
lệ đất: dung môi bằng 1: 25, lắc trong 3 phút. Hàm lượng P trong dung dịch được
xác định bằng phương pháp trắc quan với màu xanh molybden.
Phương pháp này phù hợp với các loại đất chua không carbonate và thành
phần lân khoáng chủ yếu là nhôm, sắt phosphate.
Hóa chất
+ Dung dịch H2SO4 0,1N
Pha 2,8 ml H2SO4 đặc với nước thành 1000 ml trong bình định mức. Chuẩn độ
bằng dung dịch tiêu chuẩn 0,1N, chỉ thị màu phenolphtalein. Yêu cầu nồng độ đạt
0,09 - 0,11N.
+ Hỗn hợp tạo màu (sử dụng potassium antimonyl tartrate)
+Dung dịch 1 (dung dịch ammonium molybdate 1,25% trong dung dịch H2SO4
5N):
- Cân 12,5 g ammonium molybdate (NH4)6Mo7O24.4H2O hòa tan trong 200ml
nước cất đã đun nóng đến 60oC. Để nguội và lọc nếu đục (dung dịch A).
- Hòa tan từ từ 140 ml H2SO4 đặc vào 500 ml nước cất, để nguội (dung dịch B).
- Rót từ từ dung dịch B vào dung dịch A rồi thêm nước cho đủ 1l. Lắc đều, được

dung dịch 1, đựng trong lọ màu nâu.
+ Dung dịch 2 (dung dịch potassium antimonyl tartrate 0,06% w/v trong nước).
+ Dung dịch 3 (dung dịch acid ascorbic 2%w/v trong nước), pha dùng trong ngày.
Trộn hỗn hợp 3 dung dịch 1:2:3 theo tỉ lệ 2:1:1 v/v.


23

+ Dung dịch tiêu chuẩn 50 ppm P
Cân chính xác 0,2195g KH2PO4 đã được sấy khô ở 40oC, hòa tan vào 500 ml nước,
sau đó cho 25ml dung dịch H2SO4 4N và thêm nước đến vạch định mức 1000 ml.
Trộn đều thu được dung dịch tiêu chuẩn P có nồng độ 50 ppm.
Thao tác
+ Chuẩn bị mẫu
- Cân 0,4 g đất khô kiệt cho vào ống 25 ml, thêm 10 ml H2SO4 0,1N, lắc 3 phút.
Lọc, thu lấy dịch.
- Chuẩn bị tương tự với mẫu trắng.
+ Xây dựng đường chuẩn
Sử dụng 7 bình định mức 25 ml. Lần lượt cho vào các bình định mức số ml dung
dịch tiêu chuẩn 50 ppm P theo thứ tự ở bảng sau và thêm dung dịch H2SO4 0,1N
vào cho đến vạch (25 ml).
STT

0

1

2

3

4

5

6

Số ml P tiêu chuẩn

0

0,5

1,0

2,0

3,0

4,0

5,0

Số mg P/ 25ml

0

0,025

0,050

0,100

0,150

0,200

0,250

Nồng độ P (ppm)

0

1

2

4

6

8

10

+ Tạo màu và so màu
- Lấy 2,5 ml các dung dịch tiêu chuẩn, các mẫu và mẫu trắng đã qua chuẩn bị cho
vào bình định mức. (Xem lưu ý)
- Cho thêm 7,5 ml dung dịch H2SO4 0,1N và nước cất đến khoảng 15 – 20 ml.
- Thêm từ burette 4 ml hỗn hợp tạo màu (dung dịch B).

- Thêm nước cất cho đến vạch định mức. Lắc và trộn đều. Để ổn định 10 - 20 phút.
- Đo màu trên quang phổ kế tại bước sóng 880 nm.


24

+ Tính kết quả
- Lập đồ thị tương quan số đo trên máy với nồng độ P (ppm) trong các dung dịch
tiêu chuẩn.
- Dựa vào đồ thị tiêu chuẩn và số đo trên máy của dung dịch mẫu suy ra nồng độ P
hoặc P2O5 (ppm) trong dung dịch mẫu.
- Căn cứ tỉ lệ (đất : dung dịch = 1: 25), suy ra ppm P trong đất:
ppm P (đất) = ppm P (dung dịch đất) . 25
ppm P2O5 = ppm P . 2,31
- Từ ppm có thể tính nồng độ mg/100 g đất bằng cách nhân với 10-1.
+ Lưu ý: Cách lấy dung dịch mẫu thay đổi theo hàm lượng P dễ tiêu trong đất:
+ P dễ tiêu < 20 ppm, lấy 10 ml dung dịch mẫu.
+ P dễ tiêu từ 20 – 35 ppm, lấy 5 ml dung dịch mẫu và thêm 5 ml dung dịch H2SO4
0,1 N.
+ P dễ tiêu từ 35 – 80 ppm, lấy 2,5 ml dung dịch mẫu và thêm 7,5 ml dung dịch
H2SO4 0,1 N.
+ P dễ tiêu từ >80 ppm, cần pha loãng dung dịch mẫu 2 - 3 lần bằng dung dịch
H2SO4 0,1 N; rồi lấy 2,5 ml dung dịch mẫu và thêm 7,5 ml dung dịch H2SO4 0,1 N.
2.2.2.4. Xác định hàm lượng chất hữu cơ tổng theo phương pháp WalkleyBlack
Nguyên lý
Thuật ngữ “chất hữu cơ” để chỉ toàn bộ phần không phải khoáng của đất. Đó
là nguồn cung cấp nhiều chất dinh dưỡng cho cây, tăng lượng và chất của CEC, cải
thiện tính chất vật lý và khả năng giữ ẩm của đất.
Nguyên lý: Oxide hóa chất hữu cơ bằng K2Cr2O7 N/3 trong H2SO4 25N tại
nhiệt độ hòa tan H2SO4 đậm đặc vào dung dịch K2Cr2O7 1N. Chuẩn độ lượng dư

K2Cr2O7 bằng dung dịch muối Fe II.


25

Hóa chất
+ Dung dịch kali dicromate chuẩn 1N (M/6)
Cân chính xác 49,04 g kali dicromate đã sấy khô ở 105oC, hòa tan vào nước thành
1l.
+ Sắt II ammonia sulfate (muối mhor) khoảng 0,5M
Cân 196g muối mhor FeSO4.(NH4)2SO4.6H2O hòa tan vào 50ml H2SO4 đậm đặc và
thêm nước đến 1l. Bảo quản tránh xâm nhập của O2 không khí.
+ Chỉ thị màu ferroin
Pha 0,695g sắt II sulfate FeSO4.7H2O (hoặc lượng muối mhor có Fe2+ tương
đương) và 1,485g o.phenaltrolinamonohydrate C12H8N2.H2O trong 100ml nước.
Thao tác
- Cân 0,5 g đất khô kiệt đã qua rây 0,2 mm (lượng chứa không quá 25 mg carbon)
cho vào bình tam giác 250 – 300 ml.
- Thêm chính xác 10 ml K2Cr2O7 1N, lắc trộn đều.
- Rót nhanh 20 ml H2SO4 đậm đặc (thực hiện trong tủ Hotte), lắc đều rồi để yên 30
phút.
- Thêm 100 ml nước và 10 ml H3PO4, để thật nguội.
- Thêm 0,5 ml chất chỉ thị màu (ferroin) và chuẩn độ dicromate dư bằng muối Fe II
ammonium sulfate (muối mhor).
- Tới gần điểm kết thúc, màu trở nên tím đậm. Cần thiết nhỏ từ từ từng giọt muối
mhor và cẩn thận lắc đều cho đến khi màu đột ngột chuyển sang xanh lá cây là kết
thúc.
Lưu ý: Nếu chuẩn quá dư Fe II, cho thêm 0,5ml K2Cr2O7 1N và tiếp tục nhỏ cẩn
thận muối mhor, tính thêm K2Cr2O7 1N vào số đã dùng (10ml).
Tính kết quả:

Vì phương pháp này chỉ oxide hóa 75% chất hữu cơ và mili đương lượng carbon