NGHIÊN cứu điều KIỆN NUÔI, KHẢ NĂNG KHỬ SULFIDEM, QUY TRÌNH ĐÔNG KHÔ VI KHUẨN tía (RHODOBACTER SP NTU) NHẰM sản XUẤT CHẾ hẩm PROBIOTIC

LỜI CẢM ƠN
Trước tiên tôi xin chân thành gửi lòng biết ơn sâu sắc đến thầy Nguyễn Văn
Duy, người đã tận tình hướng dẫn và giúp đỡ tôi hoàn thành đề tài.
Tôi xin gửi lời cảm ơn tới quý thầy, cô trong Viện Công nghệ sinh học &
môi trường, trường Đại học Nha Trang đã truyền đạt cho tôi những kiến thức quý
báu trong suốt quá trình học.
Con xin gửi lòng biết ơn đến bố mẹ cùng gia đình đã tạo mọi điều kiện về
mặt tinh thần cũng như về vật chất trong suốt quá trình của khóa học.
Tôi xin gửi lời cảm ơn đến chị Nguyễn Minh Nhật, cán bộ quản lý phòng thí
nghiệm Công nghệ sinh học, đã tạo mọi điều kiện về thời gian để tôi hoàn thành đề
tài.
Tôi xin gửi lời cảm ơn đến tập thể Lớp 48 CNSH, những bạn đồng hành
cùng tôi trong bốn năm qua, cùng chia sẻ và giúp đỡ tôi trong quá trình thực hiện đề
tài này.
Một lần nữa tôi xin chân thành cảm ơn tất cả!
Nha Trang, tháng 06 năm 2010

Sinh viên thực hiện

Vũ Thị Nhung


Ket-noi.com diễn đàn công nghệ, giáo dục

MỤC LỤC


Ket-noi.com diễn đàn công nghệ, giáo dục

DANH MỤC BẢNG

Ket-noi.com diễn đàn công nghệ, giáo dục

DANH MỤC HÌNH


Ket-noi.com diễn đàn công nghệ, giáo dục

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

Kí hiệu

Chữ viết tắt

OD

Optical Density (Mật độ quang)

CFU

Colony Forming Unit (Đơn vị hình thành khuẩn lạc)

[Na2S]

Nồng độ Na2S


Ket-noi.com diễn đàn công nghệ, giáo dục

LỜI NÓI ĐẦU

Sự phát triển không ngừng của khoa học công nghệ nhằm đáp ứng nhu cầu
ngày càng cao của con nguời. Trên tiến trình vận động này con người ngày càng đòi
hỏi khắt khe hơn về chất lượng của mọi loại sản phẩm tiêu dùng đặc biệt là vấn đề
an toàn sức khoẻ của chính bản thân mình. Chính những nhu cầu này là nhân tố
kích thích trực tiếp thúc đẩy sự phát triển của khoa học công nghệ. “ Probiotic” là
một phần của sự phát triển ấy.
Probiotic là một thành quả khoa học, một thành quả của công nghệ sinh học.
Nó đang được ứng dụng rộng rãi vào đời sống con người bởi vì tính hợp lý và hiệu
quả mà nó thể hiện. Probiotic bao gồm các chủng vi sinh vật hữu hiệu được bổ sung
vào thành phần thức ăn của vật nuôi (gia súc, gia cầm, thủy sản…) nhằm làm tăng
hiệu quả sử dụng thức ăn, tăng và đảm bảo tính an toàn về sức khoẻ. Ngoài ra,
probiotic còn có tác dụng làm sạch đường ruột, cân bằng hệ sinh thái, điều chỉnh
môi trường, ức chế các vi sinh vật gây bệnh, loại bỏ các quá trình lên men bất lợi do
các vi sinh vật có hại này gây nên, làm cho các chức năng của đường ruột được hoạt
động tốt hơn …
Một trong những vi sinh vật hữu hiệu trong chế phẩm probiotic là các vi
khuẩn quang hợp tía. Chúng có tác dụng khử một chất làm hôi môi trường, H2S, và
đóng góp vật chất hữu cơ trong các môi trường thiếu ôxy do năng lực tự dưỡng của
chúng.
Ở nước ta, những nghiên cứu về vi khuẩn tía còn hạn chế, chủ yếu hướng
vào mục đích sản xuất chế phẩm probiotic để xử lý môi trường, một số phục vụ cho
nuôi trồng thủy sản.
Xuất phát từ thực tế trên đây, chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài:
“Nghiên cứu điều kiện nuôi, khả năng khử sulfide và quy trình đông
khô vi khuẩn tía (Rhodobacter sp. NTU) nhằm sản xuất chế hẩm probiotic” với
mục đích như sau:


Ket-noi.com diễn đàn công nghệ, giáo dục

• Nghiên cứu điều kiện nuôi, khả năng sinh trưởng của vi khuẩn
tía (Rhodobacter sp. NTU) nhằm thu hoạch sinh khối tối ưu.
• Xác định khả năng khử sulfide của chủng vi khuẩn trên.
• Xây dựng được quy trình đông khô phù hợp để sản xuất chế
phẩm probiotic.


Ket-noi.com diễn đàn công nghệ, giáo dục

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Chế phẩm probiotic
1.1.1. Khái niệm và thành phần chế phẩm probiotic
Thuật ngữ “probiotic” được Lilly và Stiwell đề xuất năm 1965 để mô tả
những chất sản sinh bởi vi sinh vật làm tăng trưởng một vi sinh vật (hoặc sinh vật)
khác. Năm 1989, Parker lại định nghĩa thêm cho rõ:”Probiotic là những vi sinh vật
(chủ yếu là vi khuẩn) có khả năng cộng sinh (hoặc hợp sinh) trong đường ruột có
tác dụng cân bằng hệ vi sinh vật trong đó có một số tác dụng hữu ích cho vật chủ”
(Parker, 1989). Do vậy, probiotic có nghĩa là phòng ngừa hay dự phòng sinh học
(có lẽ là do ghép 2 chữ tiếng Anh: Prophylxia – phòng bệnh, dự phòng và biotics –
sự sống).
Nghiên cứu ứng dụng probiotic mới được chú ý trong 20 năm trở lại đây,
nhưng tác dụng của nó đã được nhận thấy từ lâu. Elie Metnhicoff là người đầu tiên
đặt nền móng cho việc sử dụng probiotic (Metnhicoff, 1908). Năm 1908, ông đề
nghị sử dụng vi khuẩn lactic (Lactobacterium delbruekii spp bulgaricus) để kéo dài
tuổi thọ con người. Ngày nay chế phẩm probiotic được sử dụng khá hiệu quả trong
chăn nuôi đặc biệt là trong nuôi tôm, trồng trọt, trong bảo vệ sức khỏe con người và
bảo vệ môi trường. Tuy nhiên việc dùng chế phẩm này vào nuôi trồng thủy sản
(tôm, cua, cá, nhuyễn thể…) mới bắt đầu trong hơn thập kỷ gần đây.
Tại Nhật Bản, chế phẩm probiotic có tên gọi là E.M (các vi sinh vật hữu
hiệu) do giáo sư, tiến sỹ Teruo Higa, Trường đại học Ryukyus, Okinawa, Nhật Bản

đề xuất năm 1980 đã được sử dụng nhiều trong chăn nuôi, trồng trọt cũng như bảo
vệ môi trường đều cho kết quả khả quan (Higa, 1980). Đến nay chế phẩm này được
hơn 80 nước và vùng lãnh thổ sử dụng, đặc biệt là khu vực Châu Á và Thái Bình
Dương trong đó có Trung Quốc, Hàn Quốc, Thái Lan và Việt Nam.
Thành phần chế phẩm probiotic thường có những nhóm vi sinh vật sau
(Lương Đức Phẩm, 1998):


Ket-noi.com diễn đàn công nghệ, giáo dục

- Các nhóm vi sinh vật cơ bản:
1. Vi khuẩn lactic,
2. Vi khuẩn Bacillus,
3. Vi khuẩn quang dưỡng khử H2S – vi khuẩn tía lưu huỳnh,
4. Nấm men (men rượu Saccharomyses).
- Các nhóm vi sinh vật phụ:
5. Nhóm vi khuẩn nitrat (Nitrosomonas và Nitrobacter),
6. Nhóm xạ khuẩn,
7. Nhóm nấm mốc.
1.1.2. Tác dụng của probiotic
a. Trong chăn nuôi và nuôi trồng thủy sản
Probiotic có tác dụng đối với tất cả vật nuôi, gồm các loại gia súc, gia cầm,
thủy cầm, thủy sản. Đối với vật nuôi, probiotic giúp phát triển hệ vi sinh vật đường
ruột bình thường, tăng cường khả năng tiêu hóa và hấp thu dinh dưỡng từ các loại
thức ăn. Đối với gia súc dạ cỏ chế phẩm này còn giúp cho hệ vi sinh vật dạ cỏ phát
triển và hoạt động tốt hơn. Hơn nữa, probiotic có tác dụng làm tăng sức khỏe vật
nuôi, tăng sức đề kháng và khả năng chống chịu với các điều kiện bất lợi cho vật
nuôi, phòng chống các dịch bệnh thường gặp, nhất là bệnh ỉa phân trắng (Huang và
cs, 2004). Một số nghiên cứu khác cho thấy, probiotic làm cho gia súc gia cầm cái
mắn đẻ hơn, tăng chất lượng thịt, tăng năng suất chăn nuôi (Fuller, 1998). Cuối

cùng, chế phẩm này làm ức chế và có thể tiêu diệt được các vi sinh vật có hại, làm
giảm hoặc làm mất mùi hôi thối ô nhiễm chuồng trại chăn nuôi (Võ Thị Hạnh và cs,
2005).
Vì vậy, dùng chế phẩm probiotic hòa vào thức ăn hay nước uống cho vật
nuôi đều có tác dụng dương tính. Dùng dạng dịch pha loãng phun trực tiếp lên cơ
thể con vật như chó, lợn… sẽ mất mùi thối, phun trực tiếp vào bầu vú con cái thì
khi cho con bú sẽ tránh bị nhiễm khuẩn có hại (Lương Đức Phẩm, 1998).


Ket-noi.com diễn đàn công nghệ, giáo dục

Ngoài ra, sử dụng probiotic trong nuôi trồng thủy sản giúp phân hủy các chất
hữu cơ trong nước (chất hữu cơ là một trong nhiều nguyên nhân làm môi trường
nước bị ô nhiễm), hấp thu xác tảo chết và làm giảm sự gia tăng của lớp bùn đáy,
giảm các độc tố trong môi trường nước (do các chất khí: NH 3, H2S… phát sinh), do
đó sẽ làm giảm mùi hôi trong nước, giúp tôm cá phát triển tốt, nâng cao khả năng
miễn dịch của tôm cá (do kích thích tôm, cá sản sinh ra kháng thể). Hơn nữa chế
phẩm probiotic sẽ ức chế sự hoạt động và phát triển của vi sinh vật có hại (do các
loài vi sinh vật có lợi sẽ cạnh tranh thức ăn và tranh giành vị trí bám với vi sinh vật
có hại). Trong môi trường nước, nếu vi sinh vật có lợi phát triển nhiều sẽ kìm hãm,
ức chế, lấn át sự phát triển của vi sinh vật có hại, do đó sẽ hạn chế được mầm bệnh
phát triển để gây bệnh cho tôm cá. Đồng thời chế phẩm probiotic giúp ổn định độ
pH của nước, ổn định màu nước do probiotic hấp thu chất dinh dưỡng hòa tan trong
nước nên hạn chế tảo phát triển nhiều, do đó sẽ giảm chi phí thay nước. Cuối cùng,
chế phẩm probiotic còn có tác dụng gián tiếp làm tăng oxy hòa tan trong nước, giúp
tôm cá đủ oxy để thở, do đó tôm cá sẽ khỏe mạnh, ít bệnh, ăn nhiều, mau lớn (Phạm
Văn Ty và cs, 2007).
b. Trong bảo vệ môi trường
Các vi sinh vật của chế phẩm probiotic, đặc biệt là nhóm vi khuẩn lactic và
nhóm vi khuẩn Bacillus có tác dụng ức chế các vi sinh vật gây bệnh đường ruột,

như Samonella, Vibrio, Shigella. Ngoài ra, axit lactic tạo thành có tác dụng làm
sạch ruột, làm cơ chất dinh dưỡng rất tốt cho động vật tiêu hóa. Các hoạt chất kháng
sinh do các vi khuẩn này sinh ra đều có khả năng ức chế sinh trưởng của các vi sinh
vật gây hại.
Nhóm vi khuẩn Bacillus là các vi khuẩn sống hiếu khí tùy tiện và có khả
năng sinh ra các enzyme thủy phân ngoại bào. Vì vậy, khi vào môi trường nuôi thủy
sản chúng có thể sinh sản rất mạnh, ngoài khả năng ngăn chặn các vi sinh vật gây
bệnh phát triển, chúng còn phân hủy các chất hữu cơ do thức ăn thừa và phân của
vật nuôi bài tiết … để làm giảm thiểu ô nhiễm (Lương Đức Phẩm, 1998).


Ket-noi.com diễn đàn công nghệ, giáo dục

Trong quá trình phân giải các hợp chất hữu cơ ta thấy xuất hiện khí H2S và
các khí thối khác là dẫn xuất của khí này. Trong probiotic có vi khuẩn tía có khả
năng sử dụng khí H2S làm thức ăn, mùi hôi thối giảm đi rõ rệt. Đồng thời các nấm
men có trong chế phẩm có khả năng lên men rượu từ đường có trong môi trường,
tạo mùi thơm, cải thiện mùi cho môi trường và nâng cao hệ số tiêu hóa của thức ăn
cho vật nuôi.
Tác dụng của chế phẩm trong bảo vệ môi trường được thể hiện rất đa dạng:
- Khi phun chế phẩm vào những chỗ có mùi hôi thối như cống, rãnh, hố xí,
đống rác thải, chuồng trại chăn nuôi, cũng như vật nuôi đều có tác dụng làm mất
mùi hoặc giảm mùi rõ rệt, giảm số lượng ruồi nhặng và các loại côn trùng so với
trước khi sử dụng chế phẩm.
- Đối với các đống rác ngoài tác dụng làm giảm hoặc mất mùi hôi thối còn có
hiện tượng thể tích giảm nhanh là do các vi sinh vật trong chế phẩm tiết ra hệ
enzyme thủy phân các chất hữu cơ. Đó là các nhóm enzyme amylase, protease,
cellulase và đặc biệt là cellulase, hemicellulase làm tạo mùn nhanh chóng hơn.
- Phun chế phẩm vào kho bảo quản nông sản có tác dụng ngăn chặn được
quá trình thối rữa.

- Cho vật nuôi uống chế phẩm đều tốt, giảm mùi hôi thối của phân.
- Với môi trường nước nuôi tôm, cá khi dùng chế phẩm nước ao đầm có pH
thay đổi từ từ hoặc thay đổi không quá đột ngột. Các chỉ số BOD, COD cũng vậy,
hàm lượng NH3 và H2S thường không quá giới hạn cho phép thì thời gian thay nước
sẽ kéo dài hơn. Điều quan trọng hơn cả là vật nuôi khỏe hơn, tăng trọng nhanh hơn
và chi phí thức ăn cho 1 đơn vị tăng trọng giảm (Lương Đức Phẩm, 1998).
c. Trong trồng trọt
Chế phẩm probiotic có tác dụng với nhiều loại cây trồng (bao gồm cây lương
thực, cây ăn quả, cây hoa màu…) và ở mọi giai đoạn sinh trưởng phát triển khác
nhau (Võ Thị Hạnh và cs, 2004). Những nghiên cứu về tác dụng của probiotic với
cây trồng cho thấy chúng có thể:
i) kích thích sự nảy mầm, ra hoa, kết quả và quá trình chín của quả,


Ket-noi.com diễn đàn công nghệ, giáo dục

ii) cải thiện hệ vi sinh vật đất, ngăn chặn các mầm bệnh,
iii) tăng cường khả năng hấp thụ dinh dưỡng của cây trồng và
iv) kéo dài được thời gian bảo quản, tăng chất lượng các sản phẩm tươi sống,
làm cho hoa trái tươi lâu.
Dùng chế phẩm probiotic trong đất có thể tái lập quần thể hệ vi sinh vật mới
có lợi cho cây trồng, đặc biệt là hệ vi sinh vật vùng rễ. Cây trồng sẽ phát triển tốt ở
đất, nơi mà các vi sinh vật có ích chiếm vai trò chủ yếu, giúp cho cây trồng nâng
cao được hiệu suất quang hợp và sử dụng phân bón, đặc biệt là phân bón hữu cơ
(Võ Thị Hạnh và cs, 2005).
d. Trong y học
Khi probiotic được đưa vào đường ruột, các vi sinh vật hữu ích trong chế
phẩm làm sạch đường ruột, cân bằng hệ sinh thái của các vi sinh vật trong đường
ruột, ức chế các vi sinh vật gây bệnh, loại bỏ các quá trình lên men bất lợi do các vi
sinh vật có hại này gây nên, làm cho các chức năng của đường ruột được hoạt động

tốt hơn. Chế phẩm probiotic còn liên quan đến việc làm sạch đường ruột có tác
dụng thúc đẩy quá trình lọc máu và lọc các chất độc cần bài tiết, tăng cường hệ số
tiêu hóa của thức ăn: tăng hệ số hấp thu và sử dụng các chất dinh dưỡng trong thức
ăn. Ngoài ra, chế phẩm probiotic làm bình thường chức năng miễn dịch của cơ thể,
làm lành mạnh và hoạt hóa khả năng tự nhiên của tế bào.
Tác dụng cuối liên quan đến dịch chiết từ chế phẩm probiotic có hoạt chất
sinh học, như axit amin, các enzyme, các nucleotit, các axit nucleic, các vitamin,
đặc biệt là biotin. Các hoạt chất này có liên quan đến khả năng đổi mới tế bào cơ
thể, làm tăng kháng thể và khả năng miễn dịch… cũng có thể làm chậm quá trình
lão hóa, làm tăng sức đề kháng chống lại sự xâm nhập của vi sinh vật gây bệnh.
1.2.Vi khuẩn tía
1.2.1. Giới thiệu chung về vi khuẩn tía
Vi khuẩn tía là một nhóm chính của vi sinh vật quang dưỡng phân phối rộng
rãi trong tự nhiên. Trong thành phần vi sinh vật của nhiều chế phẩm sinh học


Ket-noi.com diễn đàn công nghệ, giáo dục

probiotic trong nước và nhập ngoại như VEM (Võ Thị Hạnh và cs, 2004), PROBEST (Công ty Cổ phần Thủy sản Bình Minh – thành phố Hồ Chí Minh), CTA –
serri (Công ty Biển Cờ), SUPERKING (Trung Quốc), BACTA (Thailand), EM
(Nhật Bản)…đều có nhóm vi khuẩn quang hợp tía với chức năng đặc trưng là khử
sulfide (H2S).
Nói chung, vi khuẩn tía được coi là nhóm quang dưỡng quan trọng bởi vì
chúng có thể khử một chất làm hôi môi trường, H 2S, và đóng góp vật chất hữu cơ
trong các môi trường thiếu ôxy do năng lực tự dưỡng của chúng. Hơn nữa chúng
còn có khả năng tiêu thụ các hợp chất hữu cơ, trong đó vai trò của chúng là vi sinh
vật quang dị dưỡng. Ngoài ra, chúng còn là vi sinh vật mô hình cho các nhà khoa
học nghiên cứu sự đa dạng phân tử của quá trình quang hợp (Hunter và cs, 2009).
Sinh khối của chúng còn được sử dụng để sản xuất các chất có hoạt tính sinh học có
giá trị như ubiquinine, các chất kháng sinh, enzyme và làm thức ăn trong chăn nuôi

gia cầm và nuôi trồng thủy sản (Sasikala và Ramana, 1995).
Ngoài ra, sinh khối của vi khuẩn tía rất giàu protein và vitamin, đặc biệt là
vitamin B12. Tại Ấn Độ có công nghệ sản xuất sinh khối của vi khuẩn tía ở dịch ly
tâm từ phân gia súc dùng để làm thức ăn (cùng vi tảo) cho tôm hoặc cho ngao đạt
hiệu quả rất khả quan. Có lẽ đây là thức ăn rất thích hợp cho thủy sản thân mềm và
đang được ưa chuộng trên thị trường thế giới (Lương Đức Phẩm, 1998).
Ở Việt Nam, nhóm vi khuẩn này đã và đang được chú trọng phân lập và
tuyển chọn để ứng dụng vào các lĩnh vực khác nhau như xử lý nước thải đậm đặc
hữu cơ (Đỗ Thị Tố Uyên và cs, 2003), phân hủy các hydrocacbon mạch vòng (Đinh
Thị Thu Hằng và cs, 2003), thu nhận các hoạt chất sinh học có giá trị như
ubiquinine (Đỗ Thị Tố Uyên và cs, 2005).
1.2.2. Phân loại vi khuẩn tía
Dựa trên các đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hóa, sinh thái...và căn cứ vào tỷ
lệ G + C trong DNA, người ta phân loại vi khuẩn tía thành 2 nhóm là vi khuẩn lưu
huỳnh màu tía và vi khuẩn không lưu huỳnh màu tía (Nguyễn Lân Dũng, 2005).
a. Vi khuẩn lưu huỳnh màu tía (Purple sulfur bacteria)


Ket-noi.com diễn đàn công nghệ, giáo dục

Vi khuẩn lưu huỳnh màu tía là sinh vật quang tự dưỡng mạnh mẽ nhưng khả
năng quang dị dưỡng cũng như trao đổi chất và tăng trưởng trong bóng tối là hạn
chế. Một số loài có thể sống trong điều kiện khắc nghiệt như nhiệt độ, pH hoặc có
độ mặn cao (Hunter và cs, 2009).
Vi khuẩn tía lưu huỳnh rất đa dạng về hình thái và kiểu di động. Trong quá
trình oxy hóa H2S, lưu huỳnh được tích tụ thành giọt trong tế bào, nhưng cũng có
loài không tích tụ ở trong mà ở ngoài tế bào. Một số loài có khí khổng trong tế bào.
Vi khuẩn lưu huỳnh màu tía bao gồm các vi khuẩn kị khí bắt buộc, có khả năng
quang tự dưỡng vô cơ (photolithoautotroph), tế bào có chứa chlorophyll a hoặc b,
hệ thống quang hợp chứa các màng hình cầu hay hình phiến gắn với màng sinh

chất. Chất nhận điện tử (electron donors) trong quang hợp thường sử dụng là H 2,
H2S hay S. Chúng có khả năng di động với tiên mao mọc ở cực, có loài chu mao, tỷ
lệ G+C là 45-70% (Nguyễn Lân Dũng, 2005).
Hơn 25 chi của vi khuẩn lưu huỳnh màu tía ngày nay được công nhận (bảng
1.1), (Hunter và cs 2009). Vi khuẩn lưu huỳnh màu tía thuộc Lớp
Gammaproteobacteria, có 2 họ: Họ Chromatiaceae: dự trữ S0 bên trong tế bào (hình
1.1a) và họ Ectothiorhodospiraceae: sản xuất S0 ngoại bào (hình 1.1b).
Bảng 1.1: Bảng phân loại vi khuẩn lưu huỳnh màu tía (Hunter và cs, 2009)

Phân loại
Họ Chromatiaceae

Chi
Allochromatium
Amoebobacter
Chromatium
Halochromatium
Isochromatium
Lamprobacter
Lamprocystis
Marichromatium
Rhabdochromatium
Thermochromatium
Thioalkalicoccus
Thiobaca
Thiocapsa

Hình thái
Hình que
Hình khối cầu

Hình que
Hình que
Hình que
Hình que
Hình cầu tạo chùm
Hình que
Hình que
Hình que
Hình cầu
Hình que
Hình cầu


Ket-noi.com diễn đàn công nghệ, giáo dục

Họ

Thiococcus
Thiocystis
Thiodictyon

Hình cầu
Hình cầu, hình que ngắn
Hình que tạo chuỗi tế

Thiofl avicoccus
Thiohalocapsa
Thiolamprovum
Thiopedia
Thiorhodococcus

Thiorhodovibrio

bào
Hình cầu
Hình cầu
Hình cầu
Hình cầu
Hình cầu
Có dạng phẩy khuẩn,

Thiospirillum
Ectothiorhodospira

xoắn khuẩn
xoắn khuẩn
Có dạng phẩy khuẩn,

Halorhodospira

xoắn khuẩn
Có dạng phẩy khuẩn,

Thiorhodospira

xoắn khuẩn
Có dạng phẩy khuẩn,

Ectothiorhodosinus

xoắn khuẩn

Hình que

Ectothiorhodospiraceae

Thermochromatiumtepidum

Rhodobaca bogoriensis


Ket-noi.com diễn đàn công nghệ, giáo dục

Chromatium

Thiocapsa

Thiocystis

Thiospirillum

Hình 1.1: Hình ảnh tế bào của một số vi khuẩn lưu huỳnh màu tía
(a.Vi khuẩn tía chứa S0 bên trong tế bào, b.Vi khuẩn tía sản xuất S0 ngoại bào)
Sinh lý học của vi khuẩn lưu huỳnh màu tía có liên quan mật thiết đến quá
trình trao đổi chất sulfide. Hầu hết chúng được tìm thấy trong môi trường tự nhiên
có ánh sáng và có sulfide. Điều này cho thấy sự tăng trưởng của chúng trong tự
nhiên là quang dưỡng. Nếu tăng trưởng là quang tự dưỡng thì sunfua, H 2,
thiosulfate được sử dụng làm nguồn cho điện tử trong quang hợp (Truper và
Fischer, 1982; Madigan, 1988; Brune, 1995). Một số loài có thể sử dụng ion Fe 2+


Ket-noi.com diễn đàn công nghệ, giáo dục

làm nguồn cho điện tử trong quang hợp, oxi hóa nó thành ion Fe 3+ (Ehrenreich và
Widdel, 1994). Đặc biệt, ít nhất một loài, Thiocapsa. sp, có thể sử dụng nitrit (NO2-)
làm nguồn cho điện tử trong quang hợp, ôxi hóa nó thành nitrat (NO3-).
b. Vi khuẩn không lưu huỳnh màu tía (Nonsulfure purple bacteria)
Vi khuẩn không lưu huỳnh màu tía là nhóm vi khuẩn quang dị dưỡng hữu cơ
(photoorganoheterotrophs) thường kỵ khí bắt buộc, một số loài là quang tự dưỡng
vô

cơ

không

bắt

buộc

(trong

tối

là

hoá

dị

dưỡng

hữu

cơ

- chemoorganoheterotrophs). Tế bào chứa chlorophyl a hoặc b, hệ thống quang hợp
chứa các màng hình cầu hay hình phiến gắn với màng sinh chất. Chất nhận điện tử
trong quang hợp thường sử dụng là chất hữu cơ, đôi khi là hợp chất lưu huỳnh dạng
khử hoặc H2. Vi khuẩn không lưu huỳnh màu tía có khả năng di động với tiên mao
mọc ở cực, hoặc không di động, một số loài có túi khí, tỷ lệ G+C là 61-72%
(Nguyễn Lân Dũng, 2005). Vi khuẩn không lưu huỳnh màu tía thuộc lớp
Grammproteobacteria.
Dưới đây là bảng phân loại vi khuẩn không lưu huỳnh màu tía:
Bảng 1.2: Bảng phân loại vi khuẩn không lưu huỳnh màu tía (Hunter và cs, 2009)

Phân loại
Alphaproteobacteria

Chi
Rhodobacac

Hình thái
Hình cầu,

Rhodobacter
Rhodovulum

hình que ngắn
Hình que
Hình que,

Rhodopseudomonasc

hình cầu
Hình que,

Rhodoblastusc

nảy chối
Hình que,

Blastochloris

nảy chồi
Hình que,


Ket-noi.com diễn đàn công nghệ, giáo dục

Betaproteobacteria

Rhodomicrobium
Rhodobium

nảy chồi
Hình que
Hình que

Rhodoplanes

Xoắn khuẩn

Rhodocistac

Xoắn khuẩn

Rhodospirillum

Xoắn khuẩn

Phaeospirillum

Hình cầu

Rhodopilac

Hình que

Rhodospira

Xoắn khuẩn

Rhodovibrio c

Phẩy khuẩn

Rhodothallasiumc

Xoắn khuẩn

Roseospira

Xoắn khuẩn

Roseospirillum

Xoắn khuẩn

Rhodocyclus

Phẩy khuẩn

Rhodoferaxc

Hình que,

Rubrivivax

phẩy khuẩn
Hình que


Ket-noi.com diễn đàn công nghệ, giáo dục

Rhodobacter

Rhodopila

Rhodocyclus purpureus

Rhomicrobium

Hình 1.2: Hình ảnh tế bào của một số vi khuẩn không lưu huỳnh màu tía
Vi khuẩn không lưu huỳnh màu tía là nhóm vi sinh vật có sinh lý linh hoạt,
có thể phát triển quang dưỡng và trong bóng tối. Chúng có thể sử dụng nguồn
carbon vô cơ hoặc hữu cơ. Nếu tăng trưởng là quang tự dưỡng thì H2, sunfua ở nồng
độ thấp được sử dụng làm nguồn cho điện tử trong quang hợp. Một vài loài có thể


Ket-noi.com diễn đàn công nghệ, giáo dục

sử dụng thiosulfate hoặc Fe2+ là nguồn cho điện tử (Ehrenreich và cs, 1994; Brune,
1995).
Tuy nhiên, hầu hết vi khuẩn không lưu huỳnh màu tía phát triển tốt nhất
trong môi trường dị dưỡng. Đó là môi trường có chứa một số hợp chất hữu cơ dễ sử
dụng, chẳng hạn như malate hoặc pyruvat và ammoniac là nguồn nitơ (Sojka,
1978). Ngoài ra, một số vi khuẩn không lưu huỳnh màu tía có thể phát triển trong
điều kiện thiếu oxy, trong bóng tối bằng cách lên men hoặc hô hấp kị khí (Hunter
và cs, 2009).
1.2.3. Ảnh hưởng của các nhân tố lý hóa đến sinh trưởng của vi khuẩn tía
a. pH
Quang hợp của vi khuẩn tía có thể xảy ra trong môi trường có pH 3 – 11
(Hunter và cs, 2009). Vi khuẩn tía sinh trưởng và phát triển ở pH tối ưu khoảng 6 – 7.
b. Cường độ ánh sáng
Vi khuẩn lưu huỳnh màu tía sử dụng ánh sáng để quang hợp, phát triển mạnh
ở môi trường có ánh sáng đỏ. Vi khuẩn không lưu huỳnh màu tía có thể phát triển
quang dưỡng và trong bóng tối (Hunter và cs, 2009).
c. Nhiệt độ
Quang hợp của vi khuẩn tía có thể xảy ra ở nhiệt độ lên tới 57 0C và xuống tới
00C (Castenholz và Pierson, 1995). Nhiệt độ tối ưu cho sự sinh trưởng và phát triển
của vi khuẩn tía ở 300C.
d. Các yếu tố khác

Nhiều loài vi khuẩn tía có thể sinh trưởng quang dưỡng với sulfide như là
chất cho điện tử với nồng độ nhỏ hơn 2 mM. Nếu trong môi trường sống có nồng độ
sulfide quá cao sẽ ức chế sự sinh trưởng của chúng (Hunter và cs, 2009). Ngoài ra,
nồng độ NaCl trong môi trường cũng ảnh hưởng tới sự sinh trưởng của vi khuẩn tía.
Có loài sống được trong môi trường nước biển có độ mặn từ 8 – 11%NaCl (Mack
và cs, 1993).
1.2.4. Vai trò của vi khuẩn tía trong chế phẩm probiotic


Ket-noi.com diễn đàn công nghệ, giáo dục

Trong môi trường nước, trong các loại phân động vật, trong các đống rác
thường xuất hiện khí hydro sunfua (H2S). Đây là chất khí không màu, có mùi trứng
thối, rất độc. Khí H2S tan trong nước thành axít sunfuhydric (H2SO4). Khí H2S hình
thành từ các con đường: khử sunfat, phân hủy các axit amin có chứa lưu huỳnh trong
quá trình amon hóa. Sự có mặt của khí này làm cho môi trường bị nhiễm độc, thường
có mùi khó chịu và làm chết đối với các động thực vật thủy sinh như tôm, cá…
Chính vì vậy, sử dụng chế phẩm probiotic có chứa vi khuẩn tía có khả năng
sử dụng H2S thay nước trong quá trình quang hợp:
CO2 + H2S => Chất hữu cơ + S
So sánh với phương trình quang hợp của cây xanh ta thấy trong phương trình
này H2S được thay thế cho H 2O và sản phẩm là chất hữu cơ và lưu huỳnh chứ
không sinh ra oxy. Như vậy H2S sẽ được xử lý, làm giảm mùi hôi thối trong môi
trường (Lương Đức Phẩm, 1998).
1.3. Nguyên lý đông khô trong sản xuất chể phẩm probiotic
1.3.1. Khái niệm đông khô
Đông khô (= sự thăng hoa) có nghĩa là làm khô sản phẩm đã bị đông lạnh
(chủ yếu là chất có nước) dưới áp suất chân không mà không qua giai đoạn lỏng của
chất cần đông khô. Ví dụ, CO2 hóa lỏng thăng hoa ngay tại điều kiện áp suất khí
quyển (không qua giai đoạn lỏng). Nhưng nước và các chất khác thì cần phải có

điều kiện áp suất chân không để thăng hoa được như vậy (TELSTAR, 2008).
Các ứng dụng điển hình của đông khô như trong sản xuất dược phẩm,
vaccine kháng sinh, các kít chẩn đoán, kiểm tra, sản phẩm máu hay thu được từ máu
và một số sản phẩm thực phẩm như thảo mộc, hoa quả, nấm, cà phê …Ngoài ra
đông khô còn được ứng dụng trong bảo quản sản phẩm khảo cổ học như các phần
bằng gỗ của con thuyền, gốm sứ, da, quần áo, vải, sách, tài liệu…(TELSTAR, 2008).
1.3.2. Nguyên lý đông khô
Trong quá trình khô thì sản phẩm ở trong môi trường áp suất chân không
(nhỏ hơn 6,11 mbar) và hơi nước bay ra từ sản phẩm sẽ được ngưng tụ tại bề mặt


Ket-noi.com diễn đàn công nghệ, giáo dục

(rất lạnh) của bộ ngưng tụ (ice condenser). Bộ ngưng tụ hoạt động như một máy
bơm hơi nước, máy bơm chân không để giữ áp suất chân không trong khoang.
Nhưng để thăng hoa được thì sản phẩm phải được cung cấp nhiệt (theo
nguyên lý nhiệt học thì bay hơi là thu nhiệt). Khi đông khô ví dụ như các bình to
đáy tròn thì nhiệt độ phòng chính là nguồn nhiệt cung cấp cho sản phẩm. Nếu đông
khô các lọ nhỏ trong khay thì nhiệt độ cấp cho sản phẩm là từ các giá để sản phẩm
(giá sản phẩm điều khiển được nhiệt độ).
Khoảng 90-99% lượng nước được lấy ra từ sản phẩm trong quá trình đông
khô chính (main drying). Lượng nước bám dính còn lại sẽ được lấy ra trong quá
trình đông khô cuối cùng (final drying) dưới áp suất chân không rất thấp
(TELSTAR, 2008).
Nếu áp suất khí quyển lớn hơn 6,11mbar và cố định thì nước sẽ tồn tại ở 3
trạng thái: lỏng, rắn và khí. Tại áp suất chính xác 6,11 mbar và nhiệt độ 0 0C thì
nước sẽ tồn tại cả ở 3 trạng thái rắn, lỏng, khí (điểm cắt của 3 trạng thái). Nếu áp
suất nhỏ hơn 6,11 mbar thì nước sẽ chuyển trực tiếp từ rắn sang khí và ngược lại
bằng việc thay đổi nhiệt độ (quá trình chuyển trực tiếp từ rắn sang khí được gọi là
quá trình thăng hoa).

1.3.3. Các bước của quá trình đông khô
a. Phase 1: Tiền đông
Điểm đông có thể được xác định bằng các giá trị lý thuyết nhiệt động học
của các chất hay sản phẩm hoặc bằng phương pháp DSC (đo quét nhiệt lượng vi sai
(Differential Scanning Calorimetry)) (rất đắt) hoặc bằng phương pháp đo nhiệt độ
và điện trở trong phase làm đông tại điều kiện áp suất khí quyển (rất dễ).
Xác định điểm đông:
Điện trở của sản phẩm thay đổi khi chuyển từ trạng thái lỏng sang trạng
thái rắn và khoảng đông có thể biết được bằng việc ghi cả nhiệt độ và điện trở sản
phẩm. Điểm cắt giữa nhiệt độ và điện trở là điểm đông của sản phẩm.
- Độ dày sản phẩm.


Ket-noi.com diễn đàn công nghệ, giáo dục

- Tiền đông trong các bình cố định (tiền đông tĩnh), độ dày lớp sản phẩm
không vượt quá 10 mm.
- Tiền đông trong các bình quay (tiền đông động), khi lượng sản phẩm nhỏ
so với dung tích bình thì lớp mỏng của sản phẩm có thể đạt được. Chất lỏng được
làm đông trên thành của bình với vận tốc quay cố định.
- Ví dụ, 250 ml huyết thanh máu được đổ vào chai 500 ml, thì lớp sản phẩm
sẽ dày khoảng 70 mm. Nếu quay chai với tốc độ 1000 rpm thì lớp chất lỏng sẽ dâng
lên thành bình nhờ lực ly tâm và độ dày lớp chất lỏng chỉ còn khoảng 9 mm.
b. Phase 2: Chuẩn bị
Nếu sản phẩm đạt nhiệt độ khô và toàn bộ sản phẩm đã bị đông thì phase
chuẩn bị (preparation phase) bắt đầu. Trong phase này bơm chân không chạy khởi
động và nhiệt độ dàn ngưng giảm xuống đến mức thấp nhất (thời gian chuẩn bị từ
20-30 phút).
Giá không được cấp nhiệt và khoang không có áp suất chân không, vì vậy
van giữa bơm chân không và khoang phải được đóng.

c. Phase 3: Khô chính
Tại lúc bắt đầu giai đoạn khô chính, áp suất sẽ giảm xuống tới áp suất chân
không, van điều khiển áp suất giữa khoang và bơm chân không mở ra. Trong quá
trình đông khô chính phải quan sát áp suất chân không và nhiệt độ dàn ngưng. Nhiệt
độ dàn ngưng phải thấp hơn nhiệt độ khô (tại sản phẩm) khoảng 5-15 0C trong toàn
bộ quá trình. Áp suất chân không phải thấp hơn áp suất chân không an toàn. Để
thăng hoa thì cần thiết phải cấp năng lượng nhiệt cho sản phẩm qua giá (điều khiển
được nhiệt độ), nhiệt độ của giá phải được tăng chậm từng bước và lớn nhất tới
nhiệt độ phòng. Nếu dùng các chai đáy tròn thì năng lượng nhiệt được cấp từ môi
trường.
Nhiệt độ đông của sản phẩm là rất quan trọng để xác định độ chân không và
nhiệt độ khô. Trong quá trình khô, nhiệt độ sản phẩm được điều chỉnh chủ yếu bởi
áp suất chân không (mà không bởi nhiệt độ giá) - theo áp suất bay hơi của nước.


Ket-noi.com diễn đàn công nghệ, giáo dục

Nhiệt độ bề mặt sản phẩm gần như độc lập với nhiệt độ giá. Trong quá trình
khô thì phải đảm bảo sản phẩm không bị tan chảy, bởi vậy nhiệt độ khô nên thấp
hơn ít nhất nhiệt độ đông 100C. Căn cứ vào nhiệt độ này ta dễ dàng tra được áp suất
chân không khô theo bảng đường cong áp suất bay hơi. Ví dụ: Nhiệt độ đông t eu =
-100C, nhiệt độ khô tdry = -200C thì áp suất chân không pdry = 1,030 mbar.
Áp suất an toàn: Để sản phẩm có độ an toàn cao nhất thì nhất thiết phải
đặt áp suất an toàn. Nếu áp suất trong buồng khô tăng quá cao (quá giới hạn áp suất
an toàn) thì nhiệt độ của giá cấp cho sản phẩm phải được dừng và quá trình thăng
hoa chậm lại, tránh được sự tan chảy của sản phẩm. Nhiệt độ an toàn nên thấp hơn
50C so với điểm tan chảy (hay điểm đông). Theo đường cong áp suất bay hơi dễ
dàng tìm được psafe. Ví dụ: Nhiệt độ đông teu = -100C, nhiệt độ khô tdry = -200C thì
áp suất chân không pdry = 1,030 mbar, nhiệt độ an toàn t saf = -150C thì áp suất chân
không an toàn psaf = 1,650 mbar.

Áp suất báo động: Các máy lớn có máy điều nhiệt bằng chất lỏng thì có
thể có hệ thống cảnh báo áp suất báo động. Nếu áp suất trong buồng khô tăng tới
giá trị đặt áp suất báo động thì máy sẽ cắt cấp nhiệt cho sản phẩm. Bộ điều khiển sẽ
cho ra âm thanh báo động và nhiệt độ giá được làm lạnh xuống nhiệt độ tiền đông
càng nhanh càng tốt. Nhiệt độ báo động nên thấp hơn nhiệt độ đông từ 3-5 0C. Ví dụ:
Nhiệt độ đông teu = -100C, nhiệt độ khô tdry = -200C thì áp suất chân không p dry =
1,030 mbar, nhiệt độ an toàn tsaf = -150C thì áp suất an toàn psaf = 1,650 mbar, nhiệt
độ báo động talarm = -130C thì áp suất báo động palarm = 1,980 mbar.
d. Phase 4: Đông khô cuối
Nhiệt độ giá sẽ tăng lên và áp suất chân không sẽ giảm xuống thấp nhất có
thể khoảng 0,001 mbar. Thời gian cho đông khô cuối phụ thuộc vào từng loại sản
phẩm (thông thường 2 giờ). Khi kết thúc quá trình khô thì khoang đông khô phải
được thông khí, thông thường thông khí bằng không khí hay một loại khí trơ như
nitơ. Trước khi bắt đầu quá trình đông khô mới thì dàn ngưng phải được xả đá và
khoang đông khô phải được làm sạch và tiệt trùng.


Ket-noi.com diễn đàn công nghệ, giáo dục

1.3.4. Tình hình nghiên cứu quy trình đông khô trong sản xuất chế phẩm
probiotic
Ở nước ta, đông khô chủ yếu được ứng dụng trong sản xuất probiotic cho
người. Ví dụ như Công ty Vacxin và sinh phẩm số 2 sản suất chế phẩm BiosubtylII…Trong sản xuất chế phẩm probiotic ứng dụng trong chăn nuôi và trồng trọt,
người ta thường sản xuất chế phẩm dạng dịch, như chế phẩm BiOI, BiOII, BiOIII,
BiO-F. Trong khi đó, một số chế phẩm dạng bột thường được sản xuất bằng phương
pháp sấy khô như BiO-A, BiO-T (Võ Thị Hạnh và cs, 2004). Phương pháp này đảm
bảo tỷ lệ tế bào sống của tế bào từ 60-70% trở lên, thời gian bảo quản khoảng 1-2
năm. Nếu sử dụng phương pháp đông khô thì cũng đảm bảo tỷ lệ tế bào sống của tế
bào từ 60-70% trở lên, nhưng thời gian bảo quản có thể kéo dài tới 3-4 năm
(TELSTAR, 2008).

Phương pháp đông khô cũng được sử dụng để đông khô tảo Spirulina từ sinh
khối tươi. Sinh khối Spirulina được tách nước bằng công nghệ sấy đông khô tiên
tiến nhất, đảm bảo duy trì tất cả những dưỡng chất quý giá của tảo. Từ 6 kg tảo tươi,
sau quá trình sấy đông khô, thu được 550 g tảo khô (chiếm khoảng 9% sinh khối
tươi nguyên liệu) (Nguyễn Văn Duy, 2010).
Hiện nay, trên thị trường thế giới, có nhiều chế phẩm probiotic đông khô như
EM (Nhật Bản), SUPERKING (Trung Quốc), BACTA (Thailand)…Ở nước ta một
số chế phẩm probiotic như Biosubtyl-II, Superferon (Công ty Vacxin và sinh phẩm
số 2) …cũng được sản xuất bằng phương pháp đông khô.

CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Vật liệu