PHƯƠNG PHÁP xác ĐỊNH VIBRIO và hàm LƯỢNG AMONI TRONG mẫu nước

TRƯỜNG ĐẠI HỌC HẢI PHÒNG
VIỆN SINH NÔNG


BÁO CÁO RÈN NGHỀ
PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH VIBRIO VÀ HÀM LƯỢNG AMONI
TRONG MẪU NƯỚC
Giảng viên hướng dẫn : TS. Đỗ Mạnh Hào
Sinh viên thực hiện:

: Hoàng Thị Thanh Nga

Lớp

: Công nghệ Sinh học K13

Địa điểm thực tập

: Trạm nghiên cứu biển Đồ Sơn,
Viện Tài nguyên và Môi trường Biển.

Hải Phòng, tháng 9 năm 2015
Năm học 2013 - 2014


Phương pháp xác định Vibrio và Amoni trong mẫu nước

PHẦN 1: GIỚI THIỆU
Vi khuẩn Vibrio là một trong những tác nhân gây ngộ độc cho thủy sản
đáng lo ngại nhất hiện nay. Thủy sản như cá bị nhiễm bệnh thường bỏ ăn, chết
rải rác, bụng trương to, thức ăn không tiêu. Cá hoạt động kém, bơi chậm chạp,

màu sắc cá chuyển từ màu nâu sang xám đen. Bệnh xuất hiện nhiều ở cá giống
và giai đoạn nuôi cá thương phẩm mật độ cao, khi nước bị nhiễm bẩn. Vì vậy
khi nuôi cá ở giai đoạn làm giống, cần phân tích mẫu nước để xác định ra vi
khuẩn gây bệnh Vibrio anguillarum.
Amoni không gây độc trực tiếp cho con người, động thực vật nhưng sản phẩm
chuyển hoá từ amoni là nitrit và nitrat là yếu tố gây độc. Các hợp chất nitrit
hình thành do quá trình oxi hoá của vi sinh vật trong quá trình xử
lý, tàng trử và chuyển tải nước đến con người và nhiều loài động thực vật nói
chung và làm giảm năng suất nuoi trồng thủy sản nói riêng. Vì vậy việc xử lý
amoni trong nước là đối tượng rất đáng quan tâm.

2


Phương pháp xác định Vibrio và Amoni trong mẫu nước

PHẦN 2: TỔNG QUAN
2.1 Tổng quan về Vibrio
2.1.1. Đặc điểm của vi khuẩn Vibrio
Một số đặc điểm của nhóm vi khuẩn Vibrio spp và khả năng gây bệnh trên
động vật thủy sản:
- Giống : Vibrio
- Họ : Vbrionales
- Lớp: Gammaproteobacteria
- Ngành : Proteobacteria
Đặc điểm chung của các loài vi khuẩn thuộc giống Vibrio là Gram âm,
hình que thẳng và hơi uốn cong, kích thước 0,3-0,5×1,4-2,6µm, chúng không
hình thành bào tử hoặc chuyển động nhờ một tiên mao hoặc nhiều tiên mao
mảnh.
Tất cả chúng đều yếm khí không bắt buộc ( tùy nghi) và hầu hết là oxy hóa

và lên men trong môi trường O/F Glucose. TCBS agar là môi trường chọn lọc
của Vibrio. Hầu hết các loài đều phát triển trong môi trường nước biển cơ bản,
Na+ kích thích cho sự phát triển của tất cả các loài Vibrio và nhiều loài là nhu
cầu tuyệt đối, chúng không phát triển trong môi trường không muối NaCl, không
sinh H2S. Cơ bản chúng đều sống trong môi trường nước, đặc biệt là nước biển
và cửa sông, liên quan đến động vật biển và một số loài là tác nhân gây bệnh cho
người và động vật biển.
Ngoài ra nhóm Vibrio còn có đặc điểm là di động, cho phản ứng dương
tính với catalase và oxydase, là vi khuẩn gram âm, hình que, có khả năng lên men
trong cả hai trường hợp hiếu khí và kỵ khí, tạo nitrit từ nitrat, là nhất là nhạy nhất
với hợp chất 2,4-diamino-6,7-diisopropyl pteridine(O/129,150µm) là hợp chất
giúp phân biệt vi khuẩn Vibrio và Aeromonas . Các vi khuẩn phát sáng đều phát
3


Phương pháp xác định Vibrio và Amoni trong mẫu nước
triển tốt trên môi trường có 3%NaCl, sinh indol và tạo axit từ mannitol và
trehalose.
2.2.2. Một số loài vi khuẩn Vibrio gây bệnh cho động vật thủy sản và người
Có 4 loài vi khuẩn Vibrio gây bệnh cho người: V.cholerae, V.vulnificus,
V.parahaemolyticusvà V.alginolyticus được phân lập dựa trên các đặc điểm sau:
- V.cholerae có phản ứng oxidase (+), tăng trưởng được trong môi trường
canh Trypton ở 42oC, arginine dehydrolase(-), lysine dehydrolase(+), lên men
được sucrose, khử nitrat thành nitrite, có thể tăng trưởng được trong môi trường
chứa 6,8,10%.
- V.parahaemolyticus có phản ứng oxidase(+), phát triển được trong trypton ở
24oC, phản ứng ADH(-), LDC(+), có khả năng phản ứng nitrate thành nitrite
nhưng không lên men sucrose, sử dụng được một số nguồn carbohydrate khác để
lên men nhưng không sinh hơi, không tăng trưởng được trong môi trường không
có muối, tăng trưởng tốt trong môi trường có đến 8% muối nhưng bị ức chế trong

môi trường chứa 10% muối.
- V.vulnificus khác với hai loài trên là không lên men sucrose, không tăng
trưởng được trong môi trường không có muối, bị ức chế trong môi trường có 810% muối.
- V.alginolyticus có khả năng lên men đường sucrose, không tăng trưởng được
khi trong môi trường không có muối nhưng có thể phát triển trong môi trường
chứa đến 10% muối.
Vibrio gây bệnh cho động vật thủy sản gồm:
- Vibrio spp thường gây bệnh ở động vật thuỷ sản nước mặn và nước ngọt:
cá, giáp xác, nhuyễn thể... Những vi khuẩn này thường là tác nhân cơ hội, khi
động vật thuỷ sản sốc do môi trường biến đổi xấu hoặc bị nhiễm các bệnh khác

4


Phương pháp xác định Vibrio và Amoni trong mẫu nước
như virus, nấm, ký sinh trùng. Động vật thuỷ sản yếu không có sức đề kháng, các
loài vi khuẩn Vibrio spp cơ hội gây bệnh nặng làm động
vật thuỷ sản chết rải rác tới hàng loạt
- Vibrio alginolyticus: Bệnh đỏ dọc thân ở ấu trùng tôm, bệnh đỏ thân và ăn
mòn vỏ ki tin ở tôm, bệnh xuất huyết ở cá biển.
- Vibrio anguillarum: bệnh đỏ thân và ăn mòn vỏ ki tin ở tôm, bệnh xuất
huyết ở cá.
-

Vibrio harveyi: Bệnh phát sáng, đỏ thân và ăn mòn vỏ kitin ở giáp xác.
Vibrio parahaemolyticus: Bệnh phát sáng, đỏ thân và ăn mòn vỏ kitin ở

-

giáp xác.

Vibrio vulnificus: Bệnh đỏ thân và ăn mòn vỏ kitin ở giáp xác, bệnh xuất

-

huyết ở cá biển.
Vibrio ordalii: Bệnh đỏ thân và ăn mòn vỏ kitin ở giáp xác, bệnh xuất

huyết ở cá biển.
Vibrio salmonicida: Bệnh Hitra ở cá.
2.2 Tổng quan về amoniac
Amoniac tồn tại trong nước ở 2 dạng: NH 3 và NH4+ hay còn gọi là tổng
amoniac (TAN). Trong đó, amoni ở dạng khí (NH3) có mức gây độc cao hơn so
với dạng ion (NH4+) do xâm nhập trực tiếp vào cơ thể qua đường mang và tấn
công thẳng vào tế bào của động vật thủy sản. Không giống như người và động
vật, cá và giáp xác không có khả năng bài tiết cũng như chuyển hóa ammonia
thành dạng ít độc. Do đó , các động vật thủy sản thường bị ngộ độc amoniac khi
ở nồng độ cao

5


Phương pháp xác định Vibrio và Amoni trong mẫu nước
PHẦN 3: PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH VIBRIO VÀ HÀM
LƯỢNG AMONI TRONG MẪU NƯỚC

a.

3.1 Phương pháp xác định vi khuẩn Vibrio trong nước
Xác định Vibrio bằng phương pháp sinh hóa truyền thống
Tăng sinh chọn lọc

- Chuẩn bị mẫu nước sau đó cấy mẫu nước vào môi trường tăng sinh là môi
trường canh thang tăng sinh chọn lọc( dùng nước pepton kiềm chứa 1% muối
NaCl cho trường hợp V.cholerae, V.vulnificus, V.alginolyticus, canh Colistine
cho trường hợp V.parahaemolyticus).

b.

Sau đó ủ ở 37oC trong 6-8 giờ.
Phân lập
- Dùng que cấy vòng ria váng trên bề mặt môi trường tăng sinh chọn lọc lên
bề mặt đĩa thạch TCBS để phân lập khuẩn lạc đơn, ủ 37oC trong 18-22 giờ.
- Hình dạng khuẩn lạc đặc trưng của các loài Vibrio trên môi trường này là
như sau:
Khuẩn lạc V.cholerae và V.alginolyticus lớn đường kính khoảng 2-3mm, láng,
có màu vàng, hơi phẳng, tâm đục và chung quanh khuẩn lạc có quầng trắng đục.
Khuẩn lạc V.parahaemolyticus và V.vulnificus lớn, đường kính khoảng 34mm, có màu từ xanh đến xanh dương.

1.
a.
-

3.2 Cách tiến hànhxác định vi khuẩn Vibrio trong nước
Chuẩn bị mẫu phân tích
Lấy mẫu
Địa điểm lấy mẫu: Đồ Sơn
- Dụng cụ mang lấy mẫu gồm có lọ đựng mẫu nước đã qua khử trùng.
- Trước khi lấy mẫu ta chọn bể cá nào có hoạt động cung cấp nước từ ngoài
vào, bể nuôi cá có tỉ lệ những con cá phát triển không đông đều về kích thước và
số lượng.

b.

Chuẩn bị mẫu nước
6


Phương pháp xác định Vibrio và Amoni trong mẫu nước
-

Lắc đều chai mẫu nước ta được hệ số pha loãng 100.
Dùng pipet chuyển 1ml mẫu nước vào ống nghiệm thứ nhất, dùng máy trộn lắc

-

đều ta được hệ số pha loãng 10-1.
Tiếp tục chuyển 1ml mẫu từ ống nghiệm có hệ số pha loãng 10 -1, dùng máy trộn

-

lắc đều ta được hệ số pha loãng 10-2.
Tiếp tục chuyển 1ml mẫu từ ống nghiệm có hệ số pha loãng 10 -2, dùng máy trộn

2.
a.
-

lắc đều ta được hệ số pha loãng 10-3, rồi pha 10-4.
Mẫu nước còn lại đem bảo quản trong tủ lạnh để giữ mẫu.
Nuôi cấy vi khuẩn
Cấy mẫu

Dùng pipet hút 0,1ml ở từng nồng độ nhỏ vào giữa đĩa petri sau đó dùng que cấy
đã khử trùng rồi, trang đều mẫu lên mặt thạch. Trong quá trình trang lưu ý phải
để cho mặt thạch khô, tránh tình trạng mặt thạch ướt vi khuẩn phát triển tập trung
về một chỗ sẽ không đếm được số lượng khuẩn lạc. Sau khi cấy xong ta úp ngược
đĩa xuống và ghi trên mặt đĩa ngày tháng cấy, nồng độ, tên mẫu, lượng thể tích

b.

lấy để cấy.
Nuôi vi khuẩn
o
- Vi khuẩn được nuôi trong tủ nuôi với điều kiện nhiệt độ 37 C trong khoảng
thời gian 24h. Nếu thấy hiện tượng khuẩn lạc mọc không đồng đều, ta có
thể nuôi tiếp vi khuẩn trong thời gian 48h.

7


Phương pháp xác định Vibrio và Amoni trong mẫu nước

c.
-

Các đĩa petri được nuôi trong tủ nuôi ở nhiệt độ 37oC
Giữ mẫu Vibrio
Nếu trong thời gian ngắn không tiến hành các phản ứng sinh lý,sinh hóa
hay nghiên cứu tiếp theo ta tiến hành giữ mẫu vi khuẩn vừa phân lập

-

-

được trên môi trường trong môi trường Canh thang.
Môi trường Canh thang:
Peptone 5g
Lactose 5g
K2HPO4 2,75g
KH2PO4 2,75g
Sodium laurly sulfase 0,1g
DW: 1l
Khi chuẩn bị xong môi trường này ta tiến hành tạo ống thạch nghiêng
bằng cách cho 5ml môi trường vào ống nghiệm đã khử trùng sau đó để
một thanh gỗ cao khoảng 5cm đặt các ống nghiệm lên rồi để tạo bề mặt

-

nghiêng.
Sau khi được ống thạch nghiêng môi trường cứng lại tiến hành dùng
que cấy vòng cấy một đường ziczac trên bề mặt ống thạch. Sau đó ủ mẫu
trong tủ nuôi 24h. Khi nhìn thấy vi khuẩn phát triển trên môi trường, ta
cho mẫu đó vào tủ lạnh ngăn 4oC để bảo quản mẫu.

3.3 Phương pháp xác định amoniac trong mẫu nước
Dựa trên phản ứng Berthelot, phản ứng tạo màu xanh Indophenol khi
amoniac phản ứng với phenol trong môi trường kiềm với sự có mặt của
hypoclorit. Natri nitroprusit được cho vào nhằm xúc tác cho phản ứng. Phương
pháp có thể phát hiện chính xác đến hàm lượng 0,1 µgN/l.
Sơ đồ phản ứng có thể biểu diễn như sau:
Đầu tiên, p-amino phenol được tạo thành theo phản ứng (1):

8


Phương pháp xác định Vibrio và Amoni trong mẫu nước

Tiếp theo, p- amino phenol phản ứng với natri hypoclorit tạo thành
quinocloro imin:

Cuối cùng, quinocloro imin phản ứng với phenol thứ 2 tạo thành
Indophenol có màu xanh

Đo mật độ quang của hợp chất sinh ra ở 630nm sẽ xác định được hàm
lượng amoni có trong mẫu nước.
Phương pháp đã được tiến hành thành công trực tiếp đối với mẫu nước
có tổng độ cứng nhỏ hơn 400mg/l và nồng độ nitơ nitri nhỏ hơn 5mg/l , có thể
ứng dụng thành công trong phân tích nước biển ven bờ mà không qua chưng cất.
( hệ số tương quan 0,989)
Thuốc thử dùng cho phản ứng thay đổi theo thời gian. Do đó, không
nên xây dựng đường chuẩn sử dụng các dung dịch chuẩn đã biết nồng độ cho
9


Phương pháp xác định Vibrio và Amoni trong mẫu nước
trước đối với phương pháp này. Với mỗi mẫu phân tích, cần song song tiến hành
phân tích một chuẩn có nồng độ biết trước .
Hàm lượng amoni tổng cộng trong mẫu được xác định theo biểu thức:
C1/C2 = D1/D2
Trong đó;

C1,C2 : nồng độ tương ứng của mẫu chuẩn và mẫu phân tích.

D1,D2 : mật độ quang đo được của mẫu chuẩn và mẫu phân

tích.
* Ưu điểm và nhược điểm:
+ Có độ nhạy khá cao, có thể phân tích các đối tượng hàm lượng amoni
thấp
+ Phương pháp có thể tiến hành trực tiêp đối với mẫu nước mà không cần
qua công đoạn chưng cất vẫn đảm bảo độ chính xác cao . Có thể phân tích được
đồng loạt các mẫu với số lượng lớn trong thời gian ngắn.
+ Đây là phương pháp thích hợp nhất và hiện được sử dụng phổ biến nhất
để phân tích amoni trong nước biển
Tuy nhiên, nhược điểm lưu ý nhất là các thuốc thử rất dễ thay đổi theo thời
gian, không thể sử dụng đường chuẩn để xác định theo phương pháp này
3.4 Cách tiên hành xác định amoniac trong mẫu nước
a) Chuẩn bị hóa chất
+ Nước cất khử amoni:
Loại bỏ amoni khỏi nước cát bằng cách cho chúng chạy qua cột nhỏ (30
cm chiều dài và 1-2 cm đường kính trong) có chứa nhựa trao đổi cation dạng H +
trước khi sử dụng và bảo quản trong chai thủy tinh có nút kín.
+ Dung dịch phenol:
Hòa tan 20g phenol dạng tinh thể loại tinh khiết phân tích (PA) trong 200
ml cồn 95% (v/v). Bảo quản trong chai thủy tinh màu nâu có nút tốt.
10


Phương pháp xác định Vibrio và Amoni trong mẫu nước
+ Dung dịch natri nitroprusit:
Hòa tan 1,0 g natri nitroprusit Na₂Fe(CN)₅NO.2H₂O trong 200 ml nước
khử ion. Bảo quản trong chai màu nâu, dung dịch bền ít nhất 1 tháng.
+ Dung dịch đệm kiềm xitrat:

Hòa tan 100 g natri xitrat và 5 g NaOH (loại tinh khiết phân tích) trong 500
ml nước khử ion. Dung dịch bền không giới hạn.
+ Dung dịch natri hypoclorit:
Sử dụng loại hypoclorit thương mại có nồng độ khoảng 1,5N. Dung dịch bị
phân hủy chậm theo thời gian và nồng độ của chúng được kiểm tra tường xuyên
theo định kỳ. Hòa tan 12,5 g natri thiosunphat loại chất lượng tốt trong 500 ml
nước. Thêm vài tinh thể KI vào khoảng 50 ml nước trong bình tam giác 125 ml
và thêm 1 ml dung dịch NaOCl cần kiểm tra. Thêm 5-10 giọt HCl đặc và chuẩn
độ hàm lượng iot giảm phóng ra bằng dung dịch Na 2S2O4 đã chuẩn bị trên. Loại
bỏ dung dịch NaOCl nếu lượng thiosunphat sử dụng nhỏ hơn 12 ml.
+ Dung dịch oxi hóa:
Trộn lẫn các dung dịch đệm xitrat và dung dịch natri hypoclorit đã chuẩn
bị theo tỷ lệ thể tích 4:1 (4 thể tích dung dịch đẹm với 1 thể tích NaOCl). Nút kín
dung dịch khi không sử dụng. Dung dịch bảo quản trong tủ lạnh. Dung dịch sử
dụng trong ngày.
+ Dung dịch chuẩn amoni gốc:
Amoni clorua NH₄Cl được sấy khô ở 100C đến trọng lượn không đổi. Cân
0,3820 g NH₄Cl khô hòa tan vào nước cất trong bình định mức 1 lít và định mức
tới vạch. Bảo quản dung dịch trong tủ lạnh. 1 ml dung dịch này chứa 0.1 µg N.
+ Dung dịch amoni chuẩn (1,0 µg N/l):
Lấy chính xác 10,0 ml dung dịch gốc vào bình đinh mức 1 lít, định mức
đến vạch bằng nước biển nhân tạo. Dung dịch này chuẩn bị trong ngày.
11


Phương pháp xác định Vibrio và Amoni trong mẫu nước
+ Nước biển nhân tạo:
Hòa tan 310 g Natri Clorua, 100 g Magie sunfat và 0,5 g Natri bicacbonat
trong 10 lít nước cất khử ion.
b) Cách làm

Dùng ống đong loại 5ml lấy chính xác 5ml dung dịch mẫu vào một
chiếc lọ penicilin 10ml . Thêm 200 µl dung dịch phenol, lắc kĩ dung dịch rồi tiếp
tục thêm 200µl dung dịch natri nitroprusit và tiếp tục lắc đều. Cuối cùng thêm
500µl dung dịch oxi hóa và lắc đều. Bịt miệng các bình tam giác bằng giấy nhôm
và để trong bóng tối ở nhiệt độ phòng. Sau 1-2 giờ, tiến hành đo mật độ quang
học ở bước sóng 630 nm với mẫu đối chứng là nước biển nhân tạo.
Song song với quá trình phân tích mẫu, tiến hành tương tự với một mẫu
trắng chứa 5ml nước biển nhân tạo và một mẫu dung dịch chuẩn amoni đã biết
trước nồng độ.

12


Phương pháp xác định Vibrio và Amoni trong mẫu nước

13


Phương pháp xác định Vibrio và Amoni trong mẫu nước

PHẦN 4: KẾT QUẢ THỰC HÀNH
4.1 số lượng khuẩn lạc Vibrio
Bảng kết quả số lượng khuẩn lạc: đơn vị cfu/ml
Vi khuẩn
Vibrio
vàng

Vibrio
xanh

màu

Đĩa
Số1
Số2

0.1ml
12
215

1ml
120000
2150000

1
1
81,6×104
4
6

100
106

màu

Số3
Số4
Trung bình
Số 1
Số 2

Số 3
Số 4
Trung bình

13
5
70000

40000
60000
130000
50000

Hình ảnh khuẩn lạc mọc trên môi trường TCBS-agar
4.2 Đối với Amoni
Hàm lượng amoni tổng cộng trong mẫu nước được xác định như sau:

14


Phương pháp xác định Vibrio và Amoni trong mẫu nước

Trong đó:C1, C2 là nồng độ tương ứng của mẫu chuẩn và mẫu phân tích
D1, D2 là mật độ quang đo được của mẫu chuẩn và mẫu phân tích
D0 là mật độ quang đo được tại mẫu trắng
Phấn tích và xác định hàm lượng trong vòng 3 ngày liên tiếp ta thu được bảng
sau :
Falcon 15 ml
Time (h)

Đồ Sơn

Tiên Lãng

Phú Long

0

11.050

11.050

11.050

24

6.193

6.193

5.832

48

3.961

2.801

0.000

72

4.551

0.000

0.000

Biểu đồ minh họa
Phân tích số liệu:
+ Trong 24h đầu, thì hạm lượng amoni ở 2 mẫu thu tại Đồ Sơn và Tiên Lãng
cao như nhau (6,193µgN/l) và thấp nhất là mẫu tại Phù Long (5,832µgN/l)
+ Sau 48h, thì hàm lượng tại amoni ở mẫu tại Đồ Sơn cao nhất
( 3,961µgN/l) , tại Tiên Lãng (2,801µgN/l) , đối với mẫu tại Phù Long thì lượng amoni
đã bị khử hoàn toàn
+ Sau 72h, hàm lượng amoni đối với mẫu tại Đồ Sơn vẫn còn (4,551µgN/l),
mẫu tại Tiên Lãng cũng đã hoàn toàn bị khử hết amoni
Qua số liệu trên ta thấy rằng các nhóm vi khuẩn nitrate bản địa tại khu vực Phú
Long có tốc độ nitrate hóa và khử nitrate hóa nhanh và mạnh hơn so với hai vùng còn
lại. Tiếp đến là các nhóm khuẩn ở khu vực Tiên Lãng và cuối cùng là Đồ Sơn

15


Phương pháp xác định Vibrio và Amoni trong mẫu nước

16


Phương pháp xác định Vibrio và Amoni trong mẫu nước

PHẦN 5: TÀI LIỆU THAM KHẢO
1.

Trần Linh Phước (2009), phương pháp phân tích vi sinh vật trong nước,

2.

thực phẩm và mỹ phẩm, Nxb Giáo Dục, Hà Nội.
Lê Đình Hùng, Nguyễn Đức Hùng, Huỳnh Lê Tâm (2004), Sổ tay kiểm

3.
4.
5.
6.
7.
8.

nghiệm vi sinh thực phẩm thủy sản, Nxb Nông Nghiệp.
Bộ y tế (2008), vi sinh vật y học, Nxb y học, Hà Nội.
Thực hành vi sinh vật – Phạm Thị Minh Đức.
Thực tập vi sinh vật chuyên ngành- Nguyễn Như Thanh.
Tài liệu hướng dẫn học tập (tại Trạm Biển Đồ Sơn) .
Hình ảnh sử dụng trong quá trình thực hành.
/>
9.

khuan-gay-benh.vhtm
/>
n-vibrio-spp-v-kh-n-ng-g-y

10. />11. />%2Fresources
%2F573%2F3182025%2FBENH_CA_4_BENH_DO_VK_va_NAM.ppt&
file=benh+ca+ca+loc&user=7971522

17


Phương pháp xác định Vibrio và Amoni trong mẫu nước
MỤC LỤC
[

18