PHƯƠNG PHÁP THỬ NGHIỆM IN VIVO và IN VITRO và HOẠT TÍNH SINH học của các hợp CHẤT tự NHIÊN từ THỰC vật

Ketnooi.com diễn đàn công nghê, giáo dục

MỞ ĐẦU
Ngày nay, cùng với công cuộc phát triển kinh tế thì việc chăm sóc sức khỏe ban
đầu và bảo vệ sức khỏe cộng đồng trở nên cấp thiết đối với mọi quốc gia trên thế giới.
Do vậy nhu cầu về sử dụng thuốc để phòng ngừa và chữa trị bệnh tật ngày càng tăng
cao. Việt Nam là quốc gia nằm ở vùng nhiệt đới nóng ẩm, có thảm thực vật phong phú
đa dạng với gần 14.600 loài thực vật trong đó có 12.000 thực vật bậc cao chưa kể rêu,
tảo, các loại nấm. Nhiều loài trong số đó đã được sử dụng trong y học cổ truyền và các
mục đích khác phục vụ chữa bệnh cho nhân dân việt nam trong suốt quá trình lịch sử và
phát triển của đất nước.
Hiện nay một trong những hướng chính để phòng ngừa và chữa trị bệnh tật là
nghiên cứu tìm kiếm các hợp chất có nguồn gốc từ thiên nhiên. Theo đánh giá của tổ
chức y tế thế giới (WHO), 80% dân số trên toàn thế giới vẫn tin dùng các loài thảo dược
cho việc chăm sóc sức khỏe ban đầu và khoảng hơn 60% các tác nhân hóa trị liệu có
nguồn gốc từ các hợp chất thiên nhiên.
Việc nghiên cứu thành phần hóa học và khảo sát hoạt tính sinh học không những
giúp sử dụng các cây thuốc một cách hiệu quả mà trên cơ sở đó còn có thể phân lập được
các hợp chất để tiến hành tổng hợp hay bán tổng hợp ra các hoạt chất mới có hoạt tính
cao hơn và ít tác dụng phụ hơn trong điều trị.
Việc nghiên cứu kế thừa và phát huy vốn quí của dân tộc đặt ra lúc này vừa là vận
hội và cũng là thử thách đối với những nhà khoa học nói chung và cho những nhà nghiên
cứu trong lĩnh vực công nghiệp dược nói riêng. Bằng nhiều phương pháp thử nghiệm
khác nhau, đã có nhiều nghiên cứu chứng minh được ứng dụng của các hợp chất tự nhiên
như: ankaloid, flavonoid, saponin, glycozid, steroid, tinh dầu... trong các lĩnh vực y học,
dược học và thực phẩm chức năng. Bởi vậy chúng tôi đã tiến hành: Khảo sát hoạt tính
sinh học của các hợp chất tự nhiên từ thực vật và các phương pháp thử nghiệm
invitro và invivo.

1

Ketnooi.com diễn đàn công nghê, giáo dục

Phần 1. Hoạt tính sinh học của các hợp chất tự nhiên từ thực vật
1. Khái niệm và phân loại các hợp chất tự nhiên
Hợp chất thiên nhiên là các sản phẩm hữu cơ của các quá trình trao đổi chất trong
cơ thể sống. Ngành hóa học nghiên cứu tính chất và cấu trúc của các hợp chất thiên
nhiên được gọi là hóa học các hợp chất thiên nhiên
Dựa vào chức năng sinh học người ta chia các hợp chất chứa trong cây thành hai
nhóm lớn:
Chất trao đổi bậc một : Là các chất tham gia vào quá trình sinh trưởng của cây như
các hydrat cacbon, lipit và các axit amin, chúng là thành phần không thể thiếu trong cây
cỏ.
Chất trao đổi bậc hai: Là những chất mà vai trò chủ yếu của chúng không phải là
để nuôi sống và phát triển cây. Chúng có thể có ở cây này nhưng vắng mặt ở cây kia. Các
chất trao đổi bậc hai thường là đối tượng nghiên cứu quan trọng do các tác dụng sinh lí và
dược lí của chúng, như tác dụng kháng sinh, tác dụng diệt nấm, tác dụng ức chế hoặc
kích thích sinh trưởng và tác dụng dược lí, sinh lí khác. Ngoài ra còn một số thành phần
vô cơ.
Trong hợp chất thiên nhiên thường có các nhóm chức cơ bản:








Hợp chất hidrocacbon chưa no
Ancol - phenol - ete

Andehit- xeton
Axit hữu cơ và dẫn xuất
Amin
Dị vòng
Hợp chất tạp chức …

Dựa vào bộ khung cacbon, các nhóm chức và theo tính phổ biến của hợp chất, các
hợp chất thiên nhiên thường được phân loại thành:








Chất béo - lipit
Hidratcacbon- Gluxit
Tecpenoit
Steroit
Coumarin
Flavonoit
Ankaloit
2


Ketnooi.com diễn đàn công nghê, giáo dục
 Tanin
 Chất kháng sinh
 Vitamin…

Hoạt chất sinh học là một hợp chất hóa học - giống như vitamin và khoáng chất –
cung cấp năng lượng cho các hoạt động sống của cơ thể.
2. Hoạt tính sinh học của các hợp chất chính
2.1. PHENOL - AXÍT PHENOL VÀ DẪN XUẤT
* Đặc điểm và phân bô:
Phenol là nhóm các hợp chất hữu cơ trong phân tử có nhóm OH liên kết trực tiếp
với nhân thơm.
Các hợp chất phenol nói chung dễ tan trong nước vì trong thiên nhiên chúng
thường tồn tại ở dạng glycozit.
Trong hàng ngàn hợp chất phenol trong thiên nhiên đã biết rõ cấu tạo thì hợp chất
flavonoit là nhóm hợp chất quan trọng nhất. Ngoài hợp chất phenol đơn chức một vòng,
các phenylpropanoit và quinon cũng chiếm một tỉ lệ đáng kể.
Về các poliphenol trong cây có lignin, melanin, tanin.
Các phenol và axit phenol thường được nghiên cứu chung vì chúng thường song
song tồn tại với nhau ở trong cây.
Một số phenol có trong cây là: hydroquinon (1,4-dihidroxibenzen), rezocxinol
(1,3-dihidroxibenzen), ocxinol (1,3-dihidroxi-5-metylbenzen), phlorogluxinol (1,3,5trihidroxibenzen),catechol (1,2-dihidroxibenzen),pyrogalol (1,2,3-trihidroxibenzen),..
Các axit phenol thường gặp là: axit p-hydroxibenzoic,axit protocatechic (axit 3,4dihidroxibenzoic), axit vanilic (axit 4-hidroxi-3-metoxi benzoic), axit syringic (axit 4hidroxi-2,3-dimetoxi benzoic),…
Các axit phenol tồn tại ở dạng kết hợp với lignin tạo thành este hoặc với các oza
dưới dạng glycozit. Các axit phenol thường gặp là: axit p-hydroxibenzoic, axit
pyrocatechic, axit vanilic, axit syringic, các axit ít gặp là

axit salixylic, axit o-

protocatechic (axit 2,3-dihydroxibenzoic),.

3


Ketnooi.com diễn đàn công nghê, giáo dục

Ngược với axit phenolic, các phenol tự do rất hiếm thấy trong cây. Hydroquinon là
chất thường gặp hơn cả, tiếp đến là catechol, ocxinol, phlorogluxinol, pyrogalol
Hợp chất phổ biến nhất là các axit hydroxyxinamic
H3C-O

R
HO

R= H:
R= OH:

CH=CH-COOH

HO

CH=CH-COOH
R

axit p-cumaric
axit cafeic

R= H :axit ferulic
R= OCH3: axit sinapic

Các axit hidroxixynamic tồn tại trong cây chủ yếu ở dạng este, dễ bị thủy phân
bằng kiềm cho axit tự do.
Axit cafeic thường tồn tại ở dạng este với axit quinic, gọi là axit clorogenic
Coumarin là nhóm hợp chất thiên nhiên được xem là dẫn xuất lacton của axit ortohydroxixynamic (I). Hầu hết các coumarin đã biết hiện nay (khoảng 600 chất) tồn tại chủ
yếu dưới dạng tự do, một số ít tồn tại ở dạng glycozit như các glycozit của psonolen (II).
Coumarin phổ biến nhất trong cây là chất umbeliferin (III)

o

(I)

o

o

o

o

o

HO

(II)

o

(III)

Về phân bố: Coumarin có trong nhiều họ thực vật: Leguminosen, Umbeliferae,
Ochidaceae, Rutaceae. Chúng có mặt trong hầu hết các bộ phận của cây: rễ, lá, hoa, quả.
Đặc tính vật lý: Coumarin là chất phát quang mạnh và rất nhạy với ánh sáng.
Người ta lợi dụng tính chất này để tách các hợp chất coumarin
* Về tác dụng dược lý
Coumarin và dicoumarin dùng làm thuốc chống đông máu. Tính chất này có liên
quan đến nhóm OH ở vị trí C4 trong cấu trúc. Tính chất chống đông máu biến mất hoặc
giảm khi nhóm OH ở vị trí này bị biến mất hoặc bị thay thế bởi nhóm khác.

Ngoài ra một số coumarin có tác dụng làm giản động mạch vành và mạch ngoại
vi, có tác dụng chống co thắt.
Một số coumarin có tác dụng làm tăng cholesterol trong máu.
4


Ketnooi.com diễn đàn công nghê, giáo dục
Một số chất có tác dụng ức chế sinh trưởng thực vật, tác dụng kháng khuẩn, diệt
nấm và chống viêm.
Coumarin được dùng để làm thuốc chống đông máu. Ngoài ra một số coumarin có
tác dụng làm giãn động mạch vành và mạch ngoại vi. Đồng thời có tác dụng chống co
thắt. Một số chất có tác dụng ức chế sinh trưởng thực vật, tác dụng kháng khuẩn, diệt
nấm, chống viêm...
Đã có thông báo về kết quả thử nghiệm hoạt tính gây độc tố tế bào (in vitro) với
hai dòng ung thư gan người (Hep-2) và phổi (LU). với xeton đi từ 3-axetyl-4-hiđroxi-Nphenylquinolin-2-on với p-nitrobenzanđehit. Kết quả cho thấy hợp chất này cho kết quả
dương tính với cả hai dòng ung thư. Nghiên cứu hoạt tính kháng u của hợp chất này trên
chuột nhắt trắng Swiss mang u báng Sarcomal 80 cho thấy với liều lượng 4mg/kg và
8mg/kg đều đạt hiệu lượng kháng u (++) theo thang đánh giá tiêu chuẩn hoạt tính của
H.Itokawa (1989). Xeton này với liều lượng 4mg/kg có tỉ số ức chế u (IR%) lên tới
68.85%.
2.2. FLAVONOIT
* Đặc điểm và phân bô
Flavonoit là những chất màu thực vật có cấu trúc cơ bản như sau:
8
7

2'
1

O

4'
3

6

3'

2

4

6'

5'

Tại các vòng có liên 5kết với một hay một vài nhóm hydroxyl tự do hay đã thay thế
O

một phần. Vì vậy về bản chất chúng là những poliphenol có tính axit.
Dựa vào sự oxy hóa của vòng pyran trung tâm, người ta phân flavonoit thành các
loại khác nhau.
Phân bố: Nó là loại hợp chất phân bố rộng nhất ở trong thiên nhiên ( lớn hơn 2000
chất). Nói chung nó không có mặt trong tảo và nấm. Các loại thực vật bậc cao đều có mặt
flavonoit, và nó có mặt liên kết các bộ phận của cây : thân, lá, rễ, gỗ… và khu trú ở thành
tế bào. Flavonoit tham gia vào sự tạo thành màu sắc của cây (đặc biệt là hoa) đó là một
trong những chức năng cơ bản của flavonoit đối với cây.
5

Ketnooi.com diễn đàn công nghê, giáo dục
* Hoạt tính sinh học của flavonoit
-Tác dụng chống oxi hóa
Các hợp chất phenol cũng như các flavonoid trong những điều kiện nhất định dễ
tạo ra các gốc tự do ArO (aryl bền vững) có khả năng thay thế các gốc tự do kém bền
trong phản ứng peroxy hóa lipit màng tế bào và dây chuyền sẽ bị cắt đứt. Vì thế có thể
gọi các gốc ArO là các tác nhân thu dọn và hủy diệt các gốc tự do có hại.
Mặt khác, các flavonoid có thể ngăn chặn sự hình thành các gốc tự do bằng cách
kết hợp với các ion kim loại nặng (Fe, Mn) vốn là các tác nhân xúc tác nhiều quá trình
sinh hóa làm xuất hiện các gốc tự do.
- Tác dụng của flavonoid đối với các enzym sinh học
Hạn chế biến chứng của bênh tiểu đường: trong cơ thể người bình thường,
aldoreductaza khử glucoza thành dulcitol (D – galactitol). Flavonoid có thể kìm hãm hoạt
tính của enzym này.
Các bệnh dị ứng, hen phế quản: flavonoid có khả năng kìm hãm hoạt tính của
enzym proton ATP.aza trong màng tế bào mastocyl làm cho các tác nhân histamin và
serotonin chứa trong tế bào không bị thoát ra ngoài.
Các siêu vi trùng (virus) chỉ có thể gây bệnh khi lớp vỏ protein bị tiêu hủy bởi các
lysoxom với sự tham gia của enzym proton ATP.aza và có thể của cả phospholipaza A2.
Các enzym này đều bị flavonoid kìm hãm.
Flavonoid vô hoạt các enzym kinaza do vậy các tế bào ác tính gây ra bởi virus có
thể trở lại thành các tế bào bình thường (nghiên cứu in vitro).
Đã có nhiều thử nghiệm dùng flavonoid trong lâm sàng có kết quả tốt trong điều
trị ung thư vòm họng do thuốc lá,
- Tác dụng chống viêm
Hiện tượng viêm tấy, sưng, đau có liên quan đến sự giải phóng các prostaglandin,
thu hút các bạch cầu đến nơi tổn thương, gây cảm giác đau và sau khi di chuyển từ máu
đến não làm mất sự cân bằng của trung tâm điều tiết thân nhiệt và gây sốt. Do các
flavonoid có khả năng kìm hãm hoạt tính của các enzym protaglandin (cyclooxygenaza

6


Ketnooi.com diễn đàn công nghê, giáo dục
và lipoxyzenaza). Cơ chế này cũng giải thích tác dụng chống co thắt cơ trơn, hiện tượng
cứng cơ bắp, đau đầu.
Điều trị bệnh thấp khớp: sử dụng flavonoid trong điều trị thấp khớp thì các tổ chức
liên kết không bị phá hủy mà còn được củng cố thêm. Cơ chế có thể là do sự kết hợp giữa
việc ngăn chặn sinh tổng hợp prostaglandin với việc kích thích phản ứng hydroxyl hóa
polin nghĩa là tạo ra những liên kết chéo trong collagen.
Tác dụng gây tê tại chỗ của flavonoid đã được sử dụng trong các trường hợp bị
côn trùng đốt hoặc cắn, và đôi khi còn có hiệu lực hơn cả cocain. Có nhiều loại nọc độc
có chứa phospholipaza A2 có khả năng giải phóng axit arachidonic, chất này lại chuyển
tiếp thành prostaglandin.
Đối với các màng tế bào, flavonoid tự nhiên có khả năng làm thay đổi tính thẩm
thấu. Tác dụng này có thể chính là cơ sở làm cho nhiều loại flavonoid có tính sát khuẩn
và diệt nấm.
- Khả năng peroxy hóa lipit màng tế bào của flavonoid
Sự peroxy hóa các lipit sinh vật đều thông qua cơ chế của quá trình gốc tự do.
Những gốc tự do sinh ra từ các quá trình chuyển hóa trong cơ thể không bền và rất dễ
phản ứng. Trong khi đó, những gốc tự do tạo ra từ những chất flavonoid tự nhiên ArO lại
rất bền vững, khó phản ứng. Trong quá trình peroxy hóa lipit màng, những gốc này sẽ
loại bỏ và thay thế các gốc kém bền dẫn đến sự cắt đứt quá trình. Đó chính là cơ chế giải
thích sự chống peroxy hóa lipit của flavonoid dẫn tới làm chậm lại quá trình lão hóa của
con người.
2.3 TINH DẦU
* Đặc điểm và phân bô
 Tinh dầu (còn có tên khác là chất thơm, hương thơm, tinh du…) là hỗn hợp
của nhiều chất bay hơi, có mùi đặc biệt có nguồn gốc chủ yếu từ thực vật,
thu được bằng cách chưng cất hoặc chiết bằng dung môi hữu cơ.

 Nó ít tan trong nước, dễ tan trong ete, dầu béo, dễ bay hơi,
 Về phân bố: Cây chứa tinh dầu phân bố khá rộng trong nhiều họ thực vật.
Trong cây, tinh dầu có thể khu trú tại lá, hoa, quả, rễ,vỏ, thân gỗ…
7


Ketnooi.com diễn đàn công nghê, giáo dục
 Thành phần tinh dầu của mỗi bộ phận của cây có thể giống hoặc khác
nhau:
• Nó là hỗn hợp của nhiều hợp chất khác nhau: các hydrocacbon béo hoặc
thơm, các dẫn xuất của chúng như ancol, andehit, xeton, este , ete…
• Nhưng chung qui lại chúng có hai nhóm chính là tecpenoit và các dẫn xuất
của phenol. Nhóm tecpenoit chủ yếu là monotecpen và sesquitecpen
OH
OH

• Loại một vòng
Geraniol

linalol

myrxen

O
OH

• Loại 2 vòng

α
-tecpineol

tecpinolen

limonen

O

O

1,8- xineol

O

• Sesquitecpen luôn có mặt cùng với monotecpen trong tinh dầu.
• Sesquitepen
trong tinh
dầu có nhiệt độ sôi
trên 200 oC, fenchon
do đó khi chưng cất
pinen
camphor
α
−
thujon
thì chúng có hàm lượng không cao.
• Một số sesquitecpen thường gặp

* Hoạt tính sinh học
Cadinen
α

−

Humulen

β
−
Selinen

Caryophyllen

• Một số tinh dầu được dùng làm thuốc do tinh dầu có tác dụng trên đường
tiêu hóa: kích thích tiêu hóa, lợi mật, thông mật.
• Tác dụng kháng khuẩn và diệt khuẩn: Tác dụng trên đường hô hấp như tinh
dầu bạc hà, bạch đàn, tác dụng trên đường tiết niệu như tinh dầu hoa Barosma
betulina.
• Một số có tác dụng kích thích thần kinh trung ương: Dược liệu chứa tinh
dầu giàu anethol: đại hồi...
8


Ketnooi.com diễn đàn công nghê, giáo dục
• Một số có tác dụng diệt ký sinh trùng: trị giun như: tinh dầu giun, santonin,
trị sán như: thymol., diệt ký sinh trùng sốt rét như: artemisinin.
• Rất nhiều tinh dầu có tác dụng chống viêm, làm lành vết thương, sinh cơ, ...
khi sử dụng ngoài da.
• Một số dược liệu vừa sử dụng dạng tinh dầu vừa sử dụng dạng dược liệu
như: quế, hồi, đinh hương, tiếu hồi, bạc hà, hạt mùi, bạch đàn để dùng làm thuốc,
nhưng cũng có những dược liệu chỉ sử dụng tinh dầu: long não, tinh dầu giun. Nhưng
cũng có nhiều dược liệu chứa tinh dầu chỉ sử dụng làm thuốc mà ko sử dụng tinh dầu
như: đương qui, bạch truật, thương truật, phòng phong...

• Một số tinh dầu được dùng làm thơm bánh kẹo, các loại mứt, đồ đóng hộp:
vanilin, menthol...
• Một số dùng để pha chế rượu mùi: tinh dầu hồi, tinh dầu đinh hương.
• Một số được dùng trong pha chế đồ uống, sản xuất chè, thuốc lá: tinh dầu
vỏ cam, chanh, nhài, bạc hà...
• Tinh dầu được ứng dụng lớn trong ngành kỹ nghệ pha chế nước hoa, xà
phòng, mỹ phẩm.
2.4. STEROIT
* Đặc điểm và phân bô
Steroit là những hợp chất dẫn xuất của xiclopentenophenantren.Chúng gồm nhiều
hợp chất thiên nhiên trong đó có sterol, axit mật, hocmon giới tính, vitamin D
Nhiều steroit có nhiều tính chất quan trọng được dùng trong điều trị bệnh (điều
hòa hệ thống nội tiết, chữa viêm khớp…). Hiện nay steroit còn dùng điều chế thuốc tránh
thai. Nhiều ứng dụng của steroit trong chăn nuôi và nông nghiệp
R
R'

R''

A

C

D

B
xiclopentenophenantren

KHUNG STEROIT

9


Ketnooi.com diễn đàn công nghê, giáo dục
Sterol phân bố rộng, nó thường có mặt cùng với ankaloit hoặc saponin steroit.
Chúng có mặt trong tất cả các bộ phận của cây, nhưng chủ yếu là các hạt có dầu ở dạng
tự do hoặc este, một số ở dạng glycozit.
* Hoạt tính sinh học
Ergosterol được tìm ra năm 1889 trong cựu lõa mạch, lại được tìm thấy ở men bia
và nhiều mốc – chất này có công thức thô C 28H46O có 2 dãy nối đôi trong vòng B. Bằng
cách chiếu tia tử ngoại, nó biến thành canxiferol hoặc vitamin D 2 có tác dụng trị còi
xương.
Stigmasterol là nguồn nguyên liệu để tổng hợp hoocmon và chúng ta đã nói đến
việc sử dụng với khối lượng lớn. Vài genin của saponozit có nhân sterol (hecogenin,
diosgenin) được dùng để bán tổng hợp các hoocmon sinh dục và vỏ thượng thận.
Ngày nay, người ta dùng sitosterol của ngũ cốc là chất phòng xơ cứng động mạch,
làm chất mềm thành mạch, một mặt nó phòng sự hấp thụ cholesterol ở ruột bằng cách tạo
ra một phức chất không tan, mặt khác nó có tác dụng trị xơ mỡ động mạch.
2.5. SAPONIN
* Đặc điểm và phân bô
Saponin là thuật ngữ để chỉ một nhóm glucozit có đặc điểm chung là khi hoà tan
trong nước sẽ có tác dụng giảm sức căng bề mặt của dung dịch và tạo nhiều bọt.
Dưới tác dụng của enzym thực vật hay vi khuẩn, axit loãng saponin bị thuỷ phân
tạo thành genin (gọi là sapogenin) và phần đường.
Phần đường có thể gồm một hay một số phân tử monosaccarit:phổ biến nhất là DGlucoza, D-Galactoza, L-Arabioza, L-Rammoza
Dựa vào cấu trúc của sapogenin người ta chia thành 2 nhóm lớn
 Sapogenin tritecpen
 Sapogenin steroid
Về phân bố: Saponin phân bố rất rộng, đà tìm thấy ở trên 80 họ thực vật. Saponin
steroid tập trung chủ yếu ở cây một lá mầm trong khi saponin tritecpen có nhiều ở cây hai

lá mầm.
* Hoạt tính sinh học
10


Ketnooi.com diễn đàn công nghê, giáo dục
•
•
•
•
•

Tác dụng bồi bổ, tăng cường sinh lực (nhân sâm)
Tác dụng long đờm, dịu ho (cam thảo, cam thảo đất…)
Giảm đau khớp xương (ngưu tất, cỏ xước)
Hạ cholesterol trong máu (ngưu tất, cỏ xước)
Riêng nhóm saponin steroit là nguồn nguyên liệu quan trọng bán tổng hợp

các thuốc cocticoit và thuốc hạn chế sinh đẻ
• Saponin có tác dụng long đờm, chữa ho. Saponin là hoạt chất chính trong
các dược liệu chữa ho như viễn chí, cát cánh, cam thảo, thiên môn, mạch môn...
Một số dược liệu chứa saponin có tác dụng thông tiểu như rau má, tỳ giải, thiên
môn, mạch môn,...
• Một số có tác dụng chống ung thư trên thực nghiệm
• Nhiều saponin có tác dụng diệt các loài thân mềm (nhuyễn thể).
Sapogenin steroid dùng làm nguyên liệu để bán tổng hợp các thuốc steroid.
Digitonin dùng để định lượng cholesterol.
• Saponin trong đậu nành giống như phytate, hành xử như chất anti-oxidants
để bảo vệ tế bào cơ thể chúng ta khỏi bị hư hại do tác dụng các gốc tự do. Nó cũng
còn có khả năng trực tiếp ngăn cản sự phát triển ung thư kết tràng và đồng thời làm

giảm lượng cholesterol trong máu.
• Saponin trong nhân sâm làm tăng chuyển hóa lipid, Theo các thí nghiệm,
nhân sâm có thể ngăn ngừa sự phát sinh cholesterol cao ở thỏ, vì vậy mà ngăn ngừa
được sự hình thành xơ vữa động mạch.
2.6. GLYCOZIT TIM VÀ GLYCOZIT XIANOGEN
* Đặc điểm và phân bô
• Glycozit tim là nhóm glycozit có cấu trúc steroit, có tác dụng đặc hiệu đối
với tim. Nhưng ở liều cao chúng trở nên gây độc, dẫn đến chết người.
• Trong cây glycozit tim tồn tại ở dạng glycozit hòa tan trong dung dịch tế
bào. Dưới tác dụng của men hoặc axit loãng, các glycozit bị thủy phân tạo thành
genin và các đường. Là glycozit nên chúng dễ tan trong nước và cồn loãng, rất ít tan
trong các dung môi không phân cực hoặc phân cực yếu như ete, ete dầu hỏa,
benzen...Trong dung dịch nước các glycozit tim làm giảm sức căng bề mặt của dung
dịch và tạo bọt khi lắc mạnh.
11


Ketnooi.com diễn đàn công nghê, giáo dục
• Glycozit tim tồn tại trong khoảng 10 họ thực vật, đặc biệt là họ
Apocynaceae và họ Asclepiadaceae

* Tác dụng dược lý
Tác dụng của glycosid tim làm tăng sức co bóp của cơ tim cả ở người lành lẫn
người bệnh; làm tăng trương lực cơ tim: làm ngắn chiều dài của các sợi cơ tim đã bị căng,
giãn do vậy làm tăng trương lực cơ tim, giảm thể tích và kích thước tim; làm chậm nhịp
tim: do vừa có tác dụng trên dây thần kinh phế vị, vừa làm giảm tính tự động của nút
xoang; làm giảm dẫn truyền trong nhĩ, đặc biệt nút nhĩ thất; làm giảm tính kích thích của
cơ tâm nhĩ, nhưng trái lại, làm tăng tính kích thích của cơ tâm thất; gây lợi tiểu nhẹ do
giảm tái hấp thu natri ở ống lượn gần.
2.7. ALCALOIT

* Đặc điểm và phân bô
• Ankaloit là những hợp chất có chứa dị vòng nitơ,có tính bazơ, thường gặp
trong nhiều loại thực vật, đôi khi còn tìm thấy trong một vài động vật. Ngoài hợp
chất dị vòng, người ta còn thấy một số ít ankaloit có nguyên tử nitơ nằm ở ngoài
vòng (như colchixin, hordenin…)
• Ankaloit có tính chất hoạt động sinh lý cao đối với cơ thể người và động
vật, nhất là đối với hệ thần kinh.Với một lượng nhỏ có thể là loại thuốc đặc hiệu,
nhưng lượng tương đối lớn nó là chất độc gây chết người.
N

N

H

H

pirol

N

H

piperidin

N

pirolidin

N

H

indol

piridin

N

quinolin

12


Ketnooi.com diễn đàn công nghê, giáo dục
• Có rất nhiều họ, loài thực vật chứa ankaloit trong đó đại đa số là cây 2 lá
mầm. Để giới hạn với ý nghĩa thực tiễn, một cây được coi là có ankaloit phải chứa ít
nhất 0,05 % ankaloit so với nguyên liệu khô.
• Điều đáng lưu ý: Cây có chứa ankaloit đều vắng mặt tinh dầu và ngược lại.
Có ý kiến cho rằng chức năng của 2 nhóm này đối với cỏ cây là như nhau.
* Hoạt tính sinh học
• Tác dụng lên hệ thần kinh mạnh, có thể dùng lượng nhỏ chữa bệnh, nhưng
dùng nhiều gây chết, gây nghiện…
• Các alcaloid như cocain, morphin là những chất ma túy nguy hiểm.
• Ephedrin và các dẫn xuất của chúng là các chất thuộc nhóm doping.
• Các alcaloid chủ yếu được dùng làm thuốc như:
- Các thuốc ức chế thần kinh trung ương như: morphin, scopolamin, Itetrahydropalmatin.
- Các thuốc kích thích thần kinh trung ương như: strychnin, caphein.
- Các thuốc điều trị bệnh tim như: quinidin, ajmalin.
- Các thuốc chống co thắt như: papaverin.
- Các thuốc hạ huyết áp như: reserpin, vincamin.

- Các thuốc trị hen suyễn như: atropin, theophylin, ephedrin.
- Các thuốc chống sốt rét như: quinin.
- Chống lỵ amip như: emetin.
- Các thuốc chống ung thư như: vinblastin, vincristin, colchamin, elliptixin.
- Các thuốc có tác dụng kháng sinh, chống viêm như: berberin.
- Các thuốc bổ dương như: yohimbin.
- Các thuốc trị ho như: codein trong cây thuôc phiện.
Các alcaloid của thuốc lá, thuốc lào, của củ bách bộ và của lá na, hạt na còn
được sử dụng làm thuốc trừ sâu, bảo vệ mùa màng.
Các alcaloid khác nhau có các hoạt tính sinh học khác nhau. Cho đến nay, có
khoảng vài chục alcaloid được sử dụng rộng rãi trong y học và trong nông nghiệp.
2.8. CAROTENOIT
* Đặc điểm và phân bô
• Carotenoit là những chất màu vàng,da cam, đỏ...có nhiều trong nhiều loại
động thực vật.
• Người ta còn gọi nó là chất màu lipocromic ( màu trong chất lipit) vì chúng
tan trong dầu béo

13


Ketnooi.com diễn đàn công nghê, giáo dục
• Trong cơ thể động vật, carotenoit được hòa tan trong mỡ hoặc hóa hợp với
protein ở pha nước
• Chúng là những chất màu chính trong một số hoa màu vàng, da cam, đỏ
của nhiều loại vi sinh vật.
• Phổ biến là caroten có nhiều trong cà rốt

α
-caroten

-caroten
β

* Hoạt tính sinh học

-caroten
γ

Lutein có khả năng phản ứng với các gốc tự do, bảo vệ tế bào khỏi bị ôxi hoá,
chống ung thư da, lão hoá da, lão hoá thuỷ tinh thể, làm giảm hiện tượng xơ vữa động
mạch.
Lycopen có khả năng bảo vệ tế bào khỏi sự ôxi hoá, lycopen còn góp phần vào
quá trình hấp thụ ánh sáng khi quang hợp. Một số nghiên cứu gần đây được xác định rằng
lycopen có khả năng làm chậm quá trình phát triển của ung thư tuyến tiền liệt, ruột kết và
thực quản. Lycopen phân bố khá rộng rãi trong tự nhiên, thường gặp trong cà chua, ổi,
dưa đỏ, đu đủ, nho…
Theo một nghiên cứu của Đại học Havard, Mỹ, những loại rau quả giàu chất
carotenoit giúp giảm hiệu quả nguy cơ ung thư phổi. Loại carotenoit quen thuộc nhất
chính là bêta caroten, chất này khi vào cơ thể sẽ chuyển hóa thành vitamin A.
Ngoài bêta caroten, còn có rất nhiều loại khác (khoảng 600) như anpha
caroten, lutein, hay licopen, tất cả những chất này có vai trò quan trọng trong phòng
bệnh ung thư.

14


Ketnooi.com diễn đàn công nghê, giáo dục
Các chất dạng carotenoit có ảnh hưởng lớn tới các chứng bệnh như ung thư,
bệnh tim mạch hay tiểu đường. Các chất này chống lại quá trình ôxi hóa của các tế

bào tự do, đây chính là các tế bào có vị trí quyết định đối với quá trình suy yếu hay
phát triển các bệnh.
Carotenoid là chất chống oxy hóa tự nhiên có khả năng bắt giữ oxy đơn phân
tử 1O2 và các gốc tự do.
Carotenoid có khả năng bảo vệ quang hóa do có khả năng bắt giữ các chất
nhạy quang ở trạng thái triplet hoặc các oxy đơn phân tử.
Carotenoid có khả năng ngăn chặn sự tạo thành LDL oxy hóa và các peroxyde
của chất béo.
Carotenoid có khả năng ngăn chặn sự khởi phát sự tăng sinh của tế bào ung
thư cũng như sự phát triển của căn bệnh này.
β-carotene có khả năng tiêu diệt chất bạch sản (leukoplakia), là chất gây tổn
thương tiền ác tính của ung thư vòm họng, đồng thời việc bổ sung β-carotene có thể
làm tăng lượng nhân tố tiêu diệt khối u TNF-α trong huyết tương.
Lycopene cũng là một carotenoid có tác dụng phòng chống nhiều căn bệnh
ung thư, đặc biệt đối với ung thư tuyến tiền liệt, ung thư phổi, ung thư dạ dày.
Lycopene có khả năng ngăn chặn sự phát triển u ngực, có tác dụng ức chế sự
tăng sinh tế bào ung thư màng trong dạ con.
Ngoài ra, lycopene do tính chất bảo vệ quang hóa , nên có tác dụng bảo vệ,
phòng chống ung thư da.
β-carotene là tiền chất của vitamin A nên có tác dụng tăng cường thị lực,
chống bệnh quáng gà, khô mắt. Bảo vệ các protein của mắt khỏi sự oxy hóa.
Carotenoid giảm nguy cơ mắc bệnh thoái hóa điểm đen do tuổi già, giảm nguy
cơ mắc bệnh đục thủy tinh thể.
Carotenoid có tác dụng kích thích sự hình thành sắc tố melanin và chống lại
các gốc tự do, chúng kích thích miễn dịch và góp phần vào sự đổi mới tế bào.
Carotenoid giúp tạo lập tế bào lympho làm tăng khả năng đề kháng của cơ thể,
do đó hạn chế các bệnh nhiễm trùng, trong đó có nhiễm trùng da.
15

Ketnooi.com diễn đàn công nghê, giáo dục
Nhiều nghiên cứu đã khẳng định khả năng giảm viêm sưng của nhóm chất
carotenoid. Chủ yếu là hoạt tính của zeaxanthin và β-cryptoxanthin.

Phần 2. Các phương pháp thử hoạt tính sinh học tại Việt Nam
và trên thế giới
A. Phương pháp nghiên cứu tác dụng kháng khuẩn in vitro
Mục đích của việc thử nghiệm tác dụng kháng khuẩn in vitro là xác định thuốc
nghiên cứu có tác dụng trên vi khuẩn nào và mức độ tác dụng in vitro như thế nào. Có
16


Ketnooi.com diễn đàn công nghê, giáo dục
nhiều phương pháp nghiên cứu tác dụng kháng khuẩn in vitro, cũng như có nhiều yếu tố
ảnh hưởng góp phần vào sự nhạy cảm của vi khuẩn với thuốc nghiên cứu. Nếu các yếu tố
này thay đổi sẽ ảnh hưởng rất nhiều đến kết quả nghiên cứu. Những yếu tố ảnh hưởng
quan trọng nhất có thể kể đến là điều kiện vô trùng, tính tan của chất thử, môi trường
nuôi cấy, pH của môi trường, nhiệt độ, thời gian nghiên cứu, cách cấy chúng và kĩ thuật
nghiên cứu.
1. Những yếu tố ảnh hưởng
1.1. Điều kiện vô trùng
Nghiên cứu tác dụng kháng khuẩn phải tiến hành trong điều kiện vô trùng, tránh
đưa vi khuẩn khác vào làm nhiễu kết quả nghiên cứu. Tất cả các dụng cụ dùng trong
phòng thí nghiệm, môi trường nuôi cấy, không khí làm việc đều phải tiệt trùng. Mặt khác,
trong các môi trường làm việc không được có chất kháng khuẩn nào có thể gây ra dương
tính giả, ngộ nhận là do thuốc nghiên cứu, mà thực ra do chất kháng sinh lẫn vào.
1.2. Tính tan của chất thử
Chất thử phải tan thì kết quả mới chính xác. Khi thí nghiệm, hòa chất thử vào
trong nước. Nếu chất thử tan hoàn toàn trong nước là tốt nhất. Nếu chất thử không tan
trong nước thì phải hòa tan trong một dụng môi đặc biệt như dimethylformamid (DMF),

dimethylsulfoxid (DMSO) hoặc polyethylenglycol (PEG). Sau đó, dùng nước pha loãng
ra. Lúc này, nồng độ chất thử thấp nên có thể tan được. Nếu chất thử không tan, kết quả
nghiên cứu sẽ sai.
1.3. Chuẩn bị mẫu thử
Mẫu thử có thể là dược liệu khô, cao đã chiết từ dược liệu, hợp chất tinh khiết do
tổng hợp, hoặc chiết từ dược liệu và kháng sinh chuẩn để tham chiếu.
* Mẫu là dược liệu
Có thể chiết bằng cách sắc với nước, chiết bằng cồn hoặc một dung môi nào khác
nhưng sau đó phải chuyển sang dạng cao lỏng trong nước theo tỉ lệ 1:1 (1 g dược liệu
được 1 ml cao lỏng).
* Mẫu là cao thô chiết từ dược liệu

17


Ketnooi.com diễn đàn công nghê, giáo dục
Cân chính xác 200 mg cao hòa tan vào 2 ml nước. Nếu dung dịch tan hoàn toàn,
dung dịch này làm gốc (100 mg/ml). Nếu dung dịch có lẫn tạp chất thì ly tâm lấy dịch
trong làm dung dịch gốc (100 mg/ml). Nếu cao không tan trong nước thì thay nước bằng
các dung môi khác như DMSO, DMF hoặc PEG theo đúng cách làm như với nước, ta
được dịch thử 100 mg/ml.
Khi thử, tùy theo hoạt tính mạnh hay yếu, ta hòa loãng với nước để được dịch thử
có nồng độ thấp hơn: 50; 25; 12,5; 6,25; 3,125 mg/ml. Kết quả về nồng độ ở đây nên tính
theo mg cao trong 1 ml dung dịch.
* Mẫu là hợp chất tinh khiết
(Chất tổng hợp hoặc chiết từ dược liệu. Nếu là chất chiết từ dược liệu, cần biết
hàm lượng hợp chất trong dược liệu là bao nhiêu %).
Cân chính xác 20 mg, hòa vào 2 ml nước cất. Nếu hợp chất tan hoàn toàn dùng
dung dịch này làm gốc (10 mg/ ml). Nếu hợp chất không tan hoặc khó tan trong nước,
thay nước cất bằng DMSO, DMF hoặc PEG để hòa tan ta cũng được dung dịch gốc 10

mg/ml.
Khi thử, từ dung dịch gốc 10 mg/ml, pha thành dung dịch thử loãng gấp 10 lần,
tức là 1 mg/ml. Nếu hoạt tính mạnh quá, ta có thể pha loãng 2 lần liên tiếp với nước để
được dịch thử có nồng độ thấp hơn như 500; 250; 125; 62,5…µg/ml.
* Mẫu là thuốc kháng sinh để tham chiếu
Cân chính xác 100 mg thuốc kháng sinh cần thử, hòa tan vào 10 ml nước cất, hoặc
nếu thuốc không tan trong nước thì hòa với DMSO, DMF hoặc PEG, ta sẽ được nồng độ
dung dịch mẹ 10 mg/ml. Dung dịch mẹ này nếu để trong tủ lạnh thì hoạt tính kháng
khuẩn vẫn không giảm sau khi bảo quản được nhiều tuần.
1.4. Môi trường
Có nhiều loại môi trường nuôi cấy vi khuẩn. Việc lựa chọn môi trường phụ thuộc
vào loại vi khuẩn và bản chất của chất thử. Có những trường hợp đòi hỏi những môi
trường rất phức tạp. Dưới đây là một số môi trường thường dùng cho đa số các vi khuẩn
thử.
* Môi trường thạch nền
18


Ketnooi.com diễn đàn công nghê, giáo dục
Khi nghiên cứu dùng môi trường đặc (môi trường thạch) để tiết kiệm môi trường
chứa vi khuẩn, người ta trải trên tấm kính một lớp thạch nền sau đó mới trải một lớp
thạch có vi khuẩn thử.
Thành phần của lớp thạch nền này gồm:


Pepton:

10 g



NaCl:

4g



Thạch:

15 – 20 g



Nước cất vừa đủ:

1000 ml



pH sau khi tiệt khuẩn: 7,4 ± 0,2

* Môi trường lỏng dinh dưỡng cho vi khuẩn
Khi nuôi cấy trên môi trường lỏng, đa số các vi khuẩn thích hợp với môi trường
sau đây:


Cao thịt bò:

10 g



Pepton:

10 g



NaCl:

5g



Nước cất vừa đủ: 1000 ml

Hòa tan bằng nhiệt. Điều chỉnh pH 8,0 – 8,4 bằng NaOH 5M hoặc NaOH 1N và
đun sôi trong 10 phút. Lọc. Điều chỉnh đến pH 7,2 – 7,4 bằng NaOH 5M hoặc HCl 5M
(hoặc HCl 1N). Tiệt trùng ở 115 °C trong 30 phút.
Nếu không có cao thịt bò, dùng thịt bò 500 g, ninh lên, lấy nước cốt, được khoảng
gần 1000 ml. Thêm pepton 10 g, NaCl 5 g. Khuấy cho tan đều, thêm nước cất vừa đủ
1000 ml, rồi tiến hành như trường hợp cao thịt bò.
* Môi trường thạch dinh dưỡng cho vi khuẩn
Dùng môi trường lỏng dinh dưỡng, thêm thạch 1,2 – 2 %. Đun đến tan đều.
Trường hợp dùng thịt bò thì thạch phải dùng nhiều hơn, thường 1,5 – 2,5 %. Có những vi
khuẩn không phát triển trên môi trường thạch dinh dưỡng như một số loại
Pneumonococcus, Streptococcus,…phải dùng môi trường thạch dinh dưỡng thạch đặc
biệt như thạch máu, huyết thanh, thạch canh thang glucose,…
1.5. Chuẩn bị chủng vi khuẩn
19

Ketnooi.com diễn đàn công nghê, giáo dục
Từ chủng gốc, cấy trên mặt thạch dinh dưỡng. Sau 24 giờ, tách các khuẩn lạc phát
triển trên mặt thạch, nghiền trong nước muối sinh lý cho đồng nhất rồi cho vào một ống
nghiệm để đo độ đục. Thêm nước muối sinh lý để được hỗn dịch vi khuẩn có tỉ lệ số tế
bào thích hợp, còn gọi là CFU (Colony Forming Unit: đơn vị tạo khuẩn lạc) trong 1 ml.
Xác định số lượng tế bào vi khuẩn trong 1 ml bằng cách đo độ đục do với một ống mẫu.
Hỗn dịch vi khuẩn đã được chuẩn hóa số lượng vi khuẩn trong 1 ml (số cfu/ml) gọi là
canh khuẩn gốc.
Các vi khuẩn thử tùy theo yêu cầu của chất thử và điều kiện thử. Nếu có điều kiện
nên thử 10 loại vi khuẩn, trong đó có 5 loại vi khuẩn Gram dương và 5 loại vi khuẩn
Gram âm.
1.6. Nhiệt độ ủ và thời gian ủ
Đảm bảo nhiệt độ ủ đúng theo yêu cầu của từng vi khuẩn. Trong đa số các trường
hợp đối với vi khuẩn, thường ủ ở nhiệt độ 37 ± 1°C. Thời gian ủ cũng tùy loại vi khuẩn
nhưng thông thường là 24 giờ.
1.7. Các phương pháp thử in vitro
Có rất nhiều phương pháp thử kháng khuẩn in vitro, sau đây là một số phương
pháp chính:


Kĩ thuật định tính để thăm dò tác dụng trên vi khuẩn



Kĩ thuật dùng môi trường đặc



Kĩ thuật dùng môi trường lỏng



Kĩ thuật sinh tự kí

2. Kĩ thuật định tính để thăm dò tác dụng trên vi khuẩn
Giả thiết ta phải thử tác dụng kháng khuẩn của dược liệu A trên 10 loại vi khuẩn
mà ta có là :
5 vi khuẩn Gram dương:






Staphylococcus aureus
Streptococcus faecalis
Bacillus subtilis
Entercoccus faecium
Clostridium perfringens

5 vi khuẩn Gram âm:






Pseudomonas aeruginosa

Klebsiella pneumoniae
Escherichia coli
Proteus mirabilis
Salmonella typhimurium
20


Ketnooi.com diễn đàn công nghê, giáo dục

Nếu tiến hành thử định lượng tác dụng của A trên tất cả 10 vi khuẩn trên sẽ mất
nhiều thời gian mà có khi cũng không thu được kết quả mong muốn. Để giảm thiểu khối
lượng công việc mà vẫn thu được kết quả, trước hết thử định tính tác dụng của A trên tất
cả 10 loại vi khuẩn.


Nếu thử định tính mà thấy A không có tác dụng trên một loại vi

khuẩn nào thì có thể kết luận ngay mà không phải thử định lượng.


Nếu thử định tính mà thấy A có tác dụng trên loại vi khuẩn nào thì

khi thử định lượng chỉ cần thử trên loại vi khuẩn đó.


Nếu thử định tính mà thấy A có tác dụng trên nhiều trong số 10 loại

vi khuẩn thử thì có thể phân tích, đánh giá xem A có chiều hướng tác dụng
trên vi khuẩn Gram dương hay vi khuẩn Gram âm nhiều hơn, cũng như
chiều hướng sử dụng A để làm thuốc tác dụng trên loại vi khuẩn gây bệnh

gì để đi sâu vào nghiên cứu có tính chất định lượng một số loại vi khuẩn
nhất định.
2.1. Dụng cụ
- Các hộp Petri
- Que cấy bạch kim
- Tủ ấm 37 °C
- Tủ sấy để tiệt trùng
- Cốc đựng môi trường
- Ống hút, ống đong, ống nghiệm
- Đèn cồn để khử trùng que cấy
- Bút viết trên kính
2.2. Chuẩn bị
- Chuẩn bị mẫu thử đến khi được cao lỏng 1:1
- Chuẩn bị các ống canh khuẩn gốc của 10 loại vi khuẩn định thử
- Chuẩn bị môi trường thạch nền
- Chuẩn bị môi trường thạch dinh dưỡng
21


Ketnooi.com diễn đàn công nghê, giáo dục
- Chuẩn bị môi trường thạch dinh dưỡng có thuốc: Lấy 100 ml môi trường thạch
dinh dưỡng, thêm 1 ml dịch cao lỏng thuốc 1:1. Đun nóng chảy, khuấy cho thật đều, dùng
ống hút, hút môi trường đã có thuốc, láng đều trên mặt thạch nền của các đĩa petri, tạo
thành một lớp thạch có thuốc, dàn đều trên lớp thạch nệ dày 1 – 1,5 mm. Nếu không có
thạch nền có thể dùng toàn bộ thạch có thuốc cho vào đĩa petri để có độ dày khoàn 2,5
mm.
2.3. Tiến hành
Dùng các hộp petri có đường kính 90 mm hoặc 100 mm, 160 mm (cũng có thể
thay bằng khay kính). Phía dưới là một lớp môi trường thạch nền dày khoảng 1,5 mm.
Với loại hộp petri đường kính 90 mm, thể tích thạch nền cần 8 – 10 ml. Đun chảy thạch

nền. Dùng ống hút, hút thạch nền, rồi lắng đều trên đĩa petri đã được đặt trên một mặt
phẳng ngang. Để ở nhiệt độ phòng 15 – 20 phút cho thạch nền trong đĩa petri đặc lại.
Dùng ống hút, hút môi trường thạch dinh dưỡng có thuốc đang nóng chảy láng đều lên
trên mặt lớp thạch nền, tạo thành một lớp dày 1 – 1,5 mm. Với hộp petri đường kính 90
mm, thể tích thạch có thuốc cần khoảng 6 – 9 ml. Nếu không có lớp thạch nền thì phải
dùng cho mỗi hộp petri khoảng 15 ml thạch có thuốc. Để ở nhiệt độ phòng cho lớp thạch
có thuốc trong đĩa petri đặc lại. Dùng que cấy bạch kim cấy vi khuẩn trên mặt thạch của
hộp petri. Mỗi đĩa petri có thể cấy 3 – 5 loại vi khuẩn. Do đó, với mỗi nồng độ của thuốc
trong môi trường thạch dinh dưỡng cần 2 – 3 đĩa petri. Đánh dấu rõ vị trí của mỗi loại vi
khuẩn ở mặt ngoài của đáy đĩa petri.
Đậy nắp các hộp petri lại, cho các hộp petri vào tủ ấm và ủ ở 37 °C. Sau 24 giờ,
lấy các hộp petri ra để đọc kết quả. Nếu vi khuẩn mọc chưa rõ, thì cho các hộp petri vào
tủ ấm và tiếp tục ủ ở 37 °C trong 24 giờ nữa. Lấy các hộp petri ra và đọc kết quả.
2.4. Đọc kết quả
- Vi khuẩn nào không mọc được thì thuốc có tác dụng trên vi khuẩn đó.
- Vi khuẩn nào mọc được thì thuốc không có tác dụng trên vi khuẩn đó. Nếu vi
khuẩn mọc càng mạnh thì thuốc càng không có tác dụng.

22


Ketnooi.com diễn đàn công nghê, giáo dục
Đến đây, ta có thể kết luận về mặt định tính là thuốc A không có tác dụng trên vi
khuẩn nào và có tác dụng trên vi khuẩn nào. Chọn các vi khuẩn mà thuốc có tác dụng để
nghiên cứu tiếp.
2.5. Chọn kháng sinh làm thuôc tham chiếu
Sau bước thăm dò, ta đã xác định được thuốc A có tác dụng ức chế sự phát triển
của vi khuẩn nào thì khi chọn kháng sinh làm thuốc tham chiếu trong thí nghiệm tiếp theo
phải phù hợp.
Mỗi loại vi khuẩn thường nhạy cảm, chịu tác dụng của một hoặc một số thuốc

kháng sinh nhất định. Vì thế không nên dùng một kháng sinh bất kì để tham chiếu cho
một vi khuẩn, mà đối với một vi khuẩn nhất định nên chọn kháng sinh nào có tác dụng ức
chế mạnh vi khuẩn đó để tham chiếu . Ví dụ:
- Nếu thử trên S. aureus có thể dùng kháng sinh tham chiếu là một trong các
cephlosporin, các cyclin hoặc ampicilin, oxacilin, penicilin.
- Nếu thử trên B. cereus có thể dùng kháng sinh tham chiếu là một trong các
cyclin.
- Nếu thử trên B. subtilis có thể dùng kháng sinh tham chiếu là ampicilin, oxacilin,
tetracyclin.
- Nếu thử trên K. pneumoniae có thể dùng kháng sinh tham chiếu là neomycin,
streptomycin.
3. Phương pháp nghiên cứu tác dụng kháng khuẩn bằng kĩ thuật dùng
khoanh giấy trên môi trường đặc
Nguyên tắc của phương pháp: xác định khả năng của thuốc được tẩm vào khoanh
giấy, khuếch tán vào lớp thạch gây ức chế sự phát triển của vi khuẩn ở xung quanh
khoanh giấy tẩm thuốc. Vùng ức chế càng lớn thì tác dụng của thuốc càng mạnh.
Ví dụ nghiên cứu tác dụng kháng khuẩn của cao thuốc B chiết từ một dược liệu
mà hàm lượng cao là 10 % (100 g dược liệu được 10 g cao). Sau khi thử định tính trên 10
loại vi khuẩn, thấy thuốc không có tác dụng trên 7 loại và có tác dụng trên 3 loại là
Staphylococcus aureus, Bacillus subtilis và Klebsiella pneumoniae. Như vậy, ta chọn
kháng sinh để tham chiếu khi nghiên cứu tác dụng trên Staphylococcus aureus hoặc
23


Ketnooi.com diễn đàn công nghê, giáo dục
Bacillus subtilis là ampicilin, còn khi nghiên cứu tác dụng trên Klebsiella pneumoniae
thì phải dùng kháng sinh tham chiếu là streptomycin.
Bước tiếp theo là phải xác định mức độ tác dụng (nghiên cứu có tính chất định
lượng) của cao B trên 3 loại vi khuẩn này. Có nhiều cách đánh giá:
Đánh giá định lượng sơ bộ: ở Việt Nam vẫn dùng cách này. Pha cao B thành dung

dịch có nồng độ nhất định, tẩm khoanh giấy lọc vào dung dịch thuốc rồi đặt nhanh lên
mặt thạch. Ủ ở nhiệt độ thích hợp, ví dụ 37 °C trong 24 giờ. Sau đó lấy ra và đọc kết quả.
Nếu vòng vô khuẩn càng lớn thì thuốc có tác dụng càng mạnh.
Đánh giá định lượng sơ bộ có so sánh với kháng sinh chuẩn để tham chiếu. Cách
tiến hành cũng như trên, nhưng ngoài thử với dung dịch thuốc B, lại thử với một dung
dịch kháng sinh để tham chiếu. Kết quả, ta có thể so sánh tác dụng của thuốc nghiên cứu
với kháng sinh dùng để tham chiếu.
Đánh giá định lượng.
4. Phương pháp nghiên cứu tác dụng kháng khuẩn bằng kĩ thuật dùng ống
trụ trên môi trường đặc
Cũng như kĩ thuật dùng khoanh giấy, nguyên tắc của phương pháp là xác định khả
năng của thuốc, cho vào trong ống trụ, khuếch tán vào lớp thạch, gây ức chế sự phát triển
của vi khuẩn ở xung quanh ống trụ đựng thuốc. Vùng ức chế càng lớn thì tác dụng thuốc
càng mạnh.
Có nhiều phương pháp nghiên cứu:





Phương pháp đánh giá định lượng về tác dụng kháng khuẩn
Phương pháp đánh giá định lượng sơ bộ có so sánh
Phương pháp đánh giá định lượng sơ bộ không có so sánh
Phương pháp đánh giá tác dụng kháng khuẩn của các chất chiết khác nhau từ một
dược liệu
5. Phương pháp nghiên cứu tác dụng kháng khuẩn dùng kĩ thuật hệ nồng độ

trong môi trường lỏng
Nguyên tắc: dùng hàng loạt ống nghiệm chứa môi trường lỏng có chất dinh dưỡng
thích hợp cho sự phát triển của vi khuẩn định nghiên cứu. Thêm những nồng độ khác

nhau của thuốc nghiên cứu tác dụng kháng khuẩn vào các ống. Xác định nồng độ thấp
24


Ketnooi.com diễn đàn công nghê, giáo dục
nhất của thuốc ức chế sự phát triển của vi khuẩn. Nồng độ này được gọi là nồng độ ức
chế tối thiểu (MIC: Minimal Inhibitory Concentration). Phương pháp này còn được gọi là
kĩ thuật hòa loãng 2 lần liên tiếp (Two – fold serial dilution) hoặc phương pháp hệ nồng
độ.
Ví dụ xác định nồng độ tối thiểu ức chế vi khuẩn (MIC) của hợp chất tinh khiết H
chiết được từ dược liệu A với hàm lượng 0,2 % trên 10 loại vi khuẩn gồm:
5 vi khuẩn Gram dương:

5 vi khuẩn Gram âm:



Staphylococcus aureus



Pseudomonas aeruginosa



Streptococcus faecalis



Klebsiella pneumoniae



Bacillus subtilis



Escherichia coli



Entercoccus faecium



Proteus mirabilis



Clostridium perfringens



Salmonella typhimurium

Trước hết, định tính thăm dò xem H có tác dụng trên vi khuẩn nào trong số 10 loại
vi khuẩn trên. Sau khi xác định được, ví dụ H không có tác dụng trên 7 loại vi khuẩn mà
chỉ có tác dụng trên 3 loại vi khuẩn: S. aureus, B. subtilis, K. pneumoniae. Như thế, ta chỉ
còn cần nghiên cứu tác dụng của H trên 3 loại vi khuẩn, dùng kĩ thuật hệ nồng độ môi
trường lỏng.

Dưới đây xin giới thiệu phương pháp xác định MIC của H trên S. aureus, còn cách
xác định MIC của H trên B. subtilis và trên K. pneumoniae cũng được tiến hành tương tự.
5.1. Dụng cụ
- Ống nghiệm có đường kính 10 mm và dài 100 mm.
- Ống hút chia độ, ống đong chia độ.
- Bình đựng các môi trường lỏng.
- Tủ ấm 37 °C để cho vi khuẩn phát triển.
- Tủ sấy để tiệt trùng.
- Dung dịch NaCl 0,9 %.
- Dung dịch NaOH 1N.
- Dung dịch HCl 1N.
25