ĐỊNH LƯỢNG TỔNG VI KHUẨN HIẾU KHÍ VÀ TỔNG NẤM MEN NẤM MỐC

TIỂU LUẬN PHÂN TÍCH VI SINH THỰC PHẨM

LỜI NÓI ĐẦU
Phân tích vi sinh vật học thực phẩm là một môn học quan trọng trong hệ đại học
ngành công nghệ thực phẩm. Môn học này giúp chúng ta có được những kiến thức hữu
ích trong việc phân tích các chỉ tiêu vi sinh trong thực phẩm. Hiên nay, việc phân tích
vi sinh thực phẩm của một số các sản phẩm thiết yếu như thịt-các sản phẩm từ thịt, thủy
sản, sữa,… đều đã được tiêu chuẩn hóa, nên những những vấn đề được đề cập trong
tiểu luận này chỉ là các vấn đề cơ bản nhất. Những ai đang làm, hoặc sẽ làm trong lĩnh
vực này phải thường xuyên cập nhật thông tin, tiêu chuẩn hóa kiến thức của mình, phù
hợp với sự thay đổi của các tiêu chí chất lượng thực phẩm ngày càng cao của xã hội.
Nội dung tiểu luận
•

Tổng số vi sinh vật hiếu khí

• Tổng nấm men, nấm mốc

CHƯƠNG 1 : TỔNG QUAN
GVHD: NGUYỄN THỊ MỸ LỆ

1

NHÓM 1


TIỂU LUẬN PHÂN TÍCH VI SINH THỰC PHẨM

1

Khái quát

1.1 Tổng số vi sinh vật hiếu khí
Vi khuẩn hiếu khí
Vi khuẩn hiếu khí là những vi khuẩn tăng trưởng và hình thành khuẩn lạc trong
điều kiện có oxi phân tử.
Quá trình hiếu khí
* Quátrình oxy hóa (hay dị hóa)
(COHNS) + O2 + VK hiếukhí

→

CO2 + NH3 + sảnphẩmkhác +

nănglượng

(1.1)

Chất hữu cơ
* Quátrìnhtổnghợp (đồnghóa)
(COHNS) + O2 + VK hiếukhí + nănglượng

→

C5H7O2N (tb vi

khuẩnmới)

(1.2)

Quá trình yếm khí

Trong điều kiện yếm khí (khôngcó oxy), vi khuẩn yếm khí sẽ phân hủy chất hữu cơ
như sau:
(COHNS) + VK yếmkhí

→

CO2 + H2S + NH3 + CH4 + các chất khác

+ năng lượng

(COHNS) + VK yếm khí + năng lượng

→

(1.3)

C5H7O2N (tb vi khuẩn mới)

(1.4)

Ghichú: C5H7O2N là công thức hóa học thông dụng để đại diện cho tế bào vi khuẩn.
Trong điều kiện không có chất hữu cơ thì vi khuẩn sẽ trải qua quá trình hô hấp nội bào
hay là tự oxy hóa sử dụng chính bản thân chúng làm nguyên liệu.
C5H7O2N + 5O2 →

5CO2 + NH3 + 2H2O + nănglượng

(1.5)

trong đó CO2 và NH3 là chất dinh dưỡng đối với các loài tảo.

GVHD: NGUYỄN THỊ MỸ LỆ

2

NHÓM 1


TIỂU LUẬN PHÂN TÍCH VI SINH THỰC PHẨM

Trong điều kiện ánh sáng thích hợp, quá trình quang hợp của tảo diễn ra như sau:
NH3 + 7,62CO2 + 2.53H2O

→

C7,62H8,06O2,53N + 7,62O2

(1.6)

Tổng vi khuẩn hiếu khí
Tổng số vi khuẩn hiếu khí hiện diện trong mẫu là chỉ thị mức độ vệ sinh của thực
phẩm. Chỉ số này được xác định bằng phương pháp đếm khuẩn lạc mọc trên môi
trường thạch dinh dưỡng từ một lượng mẫu xác định trên cơ sở xem 1 khuẩn lạc là sinh
khối phát triển từ 1 tế bào hiện diện trong mẫu và được biểu diễn dưới dạng số đơn vị
hình thành khuẩn lạc (colony forming unit, CFU) trong một đơn vị khối lượng thực
phẩm. Chỉ số này có một số tên gọi khác nhau như sau: số vi sinh vật hiếu khí (Aerobic
PlateCount, APC), tổng số đếm trên đĩa (Total Plate Count, TPC), tổng số vi sinh vật
sống ( Total Viable Count, TVC), số đếm đĩa chuẩn (Standard Plate Count, SPC).
Nguyên tắc
Tổng số các nhóm vi khuẩn này trong thực phẩm xác định bằng phương pháp nuôi

cấy trải lên bề mặt thạch hoặc bằng phương pháp tạo hộp đổ. Tổng số vi sinh vật hiếu
khí được đếm bằng cách đổ đĩa và ủ trong điều kiện hiếu khí ở 300C/72 giờ ± 6 giờ
hoặc 370C/48 giờ ± 6 giờ. Thông qua số lượng khuẩn lạc đếm được trên các đĩa peptri
cho phép xác định được lượng vi sinh vật còn có khả năng sinh trưởng trong môi
trường trong mẫu ban đầu.
Để đếm kết quả chính xác thì số vi khuẩn trong đĩa phải trong giới hạn 25-250
khuẩn lạc. Nếu vượt quá giới hạn thì phải tiến hành pha loãng và chọn những độ pha
loãng lớn hơn.
1.2 Tổng nấm men, nấm mốc
Nấm men và nấm mốc là nhóm vi sinh vật rất đa dạng, cho đến nay có hơn
400.000 loài nấm men và nấm mốc đã được mô tả. Đây là nhóm vi sinh vật nhân thật,
có vách tế bào là lớp vở chitin, có nhân và các bào quan khác. Tất cả các loài men và
mốc đều thuộc nhóm vi sinh vật dị dưỡng, chúng cần nguồn carbon hữu cơ để cung cấp

GVHD: NGUYỄN THỊ MỸ LỆ

3

NHÓM 1


TIỂU LUẬN PHÂN TÍCH VI SINH THỰC PHẨM

năng lượng từ môi trường bên ngoài. Vì thế vi sinh vật này thường xuyên được phân
lập từ thực phẩm hay các nguồn giàu dinh dưỡng khác. Có thể phân biệt được nấm men
và nấm mốc theo khái niệm đơn giản như sau: nấm mốc là vi nấm dạng sợi, sinh sản
bằng bào tử hay khuẩn ty; nấm men là những tế bào đơn tính phát triển theo kiểu nảy
chồi, thỉnh thoảng có thể tồn tại ở dạng khuẩn ty giả trong đó các tế bào kết nhau thành
chuổi. Đơn vị hình thành khuẩn lạc của nấm mốc và nấm men là mầm để tạo nên một
khuẩn lạc khi nuôi cấy trong môi trường. Mầm có thể là một bào tử, một tế bào hay một

đoạn của khuẩn ty.
Quá trình tăng trưởng của nấm men và nấm mốc phụ thuộc vào rất nhiều yếu tố từ
môi trường. Hầu hết nấm mốc, nấm men đều thuộc nhóm vi sinh vật ưa mát, nhiệt độ
thích hợp cho sự phát triển của chúng trong khoảng 20 – 28 0C, một ít trong số này ưa
lạnh hay ưa nóng. Nước hoạt tính cũng là nhân tố ảnh hưởng tất quan trọng đến tăng
trưởng. Hầu hết các loại nấm men và nấm mốc phát triển tốt trong cơ chất có nước hoạt
tính khoảng 85% hay lơn hơn, một số ít loài có thể tăng trưởng trong cơ chất có nước
hoạt tính thấp hơn khoảng 60 – 70%. Nấm mốc và nấm men tăng trưởng ở vùng pH từ
2-9, trong pH thích hợp nhất nằm trong khoảng 4 -6,5. Hầu hết nấm mốc, nấm men đều
thuộc nhóm hiếu khí bắt buộc, một số có thể phát triển trong điều kiện vi hiếu khí. Một
số có thể tiếp nhận oxy nguyên tử từ cơ chất của chúng nhưng dù ở dạng nào oxy vẫn là
nguyên tố cần thiết cho quá trình phát triển của nấm men và nấm mốc.
Tất cả các loài nấm men và nấm mốc đều thuộc nhóm vi sinh vật dị dưỡng, chúng
chỉ có khả năng nhận các chất dinh dưỡng ở dạng hòa tan. Trong quá trình trao đổi chất
xảy ra ở tế bào chúng lại có khả năng chuyển hóa các chất hào tan thành các chất không
hòa tan thành lignocellulose... Ngoài ra, chúng còn có thể tạo ra các chất độc, các chất
độc của chúng được gọi chung là độc tố vi nấm ( mycotoxins). Tiêu biểu có Aspegillus
flavus, Aspegillus parasiticus, Aspegillus moninus, Penicillium italicum, Penicillium
roquefortii, Penicillium cammenbertii, Penicillium digitatum. Trong thực phẩm nấm
men và nấm mốc hiện diện có thể tăng trưởng làm thay đổi màu của thực phẩm, làm

GVHD: NGUYỄN THỊ MỸ LỆ

4

NHÓM 1


TIỂU LUẬN PHÂN TÍCH VI SINH THỰC PHẨM

phát sinh mùi hay vị lạ, làm hư hỏng hay thay đổi cơ cấu của thực phẩm, một số có thể
tạo độc tố gây ngộ độc thực phẩm.
Một số loại nấm men như: Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces liquefacien.
Nấm men sinh sản bằng cách nẩy chồi, nguồn chất có đường. Hình dạng của chúng rất
đa dạng như hình cầu, hình trứng, hình oval. (hình 2.4)

Hình 1: Khuẩn lạc và tế bào nấm men [11]
Nấm mốc sinh sản bằng bào tử hay đoạn sợi, có hệ sợi là sợi khí sinh ( sợi sinh
sản), nhiệt độ thích hợp từ 28-320C, ẩm độ cơ chất là 60%, có nguồn chất là bội đường
( hình 2.5)

Hình 2: Khuẩn lạc và hệ sợi nấm mốc [11]
Cách phân biệt nấm men, nấm mốc
• Nấm men là vi nấm dạng sợi, sinh sản bằng bào tử hoặc khuẩn ty

GVHD: NGUYỄN THỊ MỸ LỆ

5

NHÓM 1


TIỂU LUẬN PHÂN TÍCH VI SINH THỰC PHẨM

• Nấm mốc là những tế bào đơn tính phát triển theo kiểu nẩy chồi. Thỉnh thoảng
có thể nhìn thấy các tế bào kết nối thành chuỗi.
Đơn vị hình thành khuẩn lạc của nấm mốc và nấm men là mầm tạo nên một khuẩn
lạc khi nuôi cấy trong môi trường. Mầm có thể là một bào tử, một tế bào hay một đoạn
khuẩn ty. Trong thực phẩm, nấm mốc và nấm men hiện diện có thể tăng trưởng làm
thay đổi màu của thực phẩm, làm phát sinh mùi hay vị lạ, làm hư hỏng hay thay đổi cơ

cấu của thực phẩm.

CHƯƠNG 2 : PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH
2.1.Vật liệu, hóa chất, dụng cụ:
Vật liệu
Mẫu thực phẩm chế biến sẵn.
Hóa chất – môi trường
• Buffer Pepton Water (BPW)
• Plate Count Agar (PCA)
• Tryptone Soya Agar (TSA)
• Violet Red Bile Agar ( VRB)
• Brilliant Green Bile Lactose broth (BGBL)
• Eosine Methylene Blue Agar(EMB)
• Canh trypton
• Canh MR-VP
• Thạch Simmon citrate Agar
• Thuốc khử Kovac’s
• Thuốc khử Methyl Red
• Thuốc khử α- naphtol 5%
• KOH 40%
• Môi trường canh Escherichia coli Broth (EC)

GVHD: NGUYỄN THỊ MỸ LỆ

6

NHÓM 1


TIỂU LUẬN PHÂN TÍCH VI SINH THỰC PHẨM

• Dichloran Rose Bengal Chloramphenicol Agar ( DRBC)
• Môi trường canh LSB
Dụng cụ
• Ống nghiệm không nắp
• Ống nghiệm có nắp
• Đĩa Petri vô trùng
• Cân điện tử
• Bình tam giác
• Bình định mức
• Cốc thủy tinh
• Kéo
• Đũa thủy tinh
• Túi nilon vô khuẩn
• Đèn cồn
• Que cấy thẳng
• Que cấy vòng
• Bình chứa môi trường
• Khăn giấy
• Bông y tế
• Bông không thấm nước
• Pipetman
Thiết bị
• Autoclave
• Tủ lạnh
• Bếp từ
• Tủ ấm 44oC

GVHD: NGUYỄN THỊ MỸ LỆ

7

NHÓM 1


TIỂU LUẬN PHÂN TÍCH VI SINH THỰC PHẨM

• Tủ ấm 30oC
• Tủ ấm 37oC
• Tủ sấy 180oC
• Tủ cấy
• Bếp đun
• Bể ổn nhiệt
2.2 Phương pháp thu, bảo quản và chuẩn bị mẫu thực phẩm
2.2.1 Thu và chứa mẫu
Kết quả thí nghiệm phụ thuộc rất nhiều vào phương pháp lấy mẫu và bảo quản
mẫu. Kế hoạch lấy mẫu được áp dụng cho từng trường hợp cụ thể và được mang về
phòng thí nghiệm phản ánh đúng tình trạng mẫu cần phân tích
Dụng cụ thu mẫu thay đổi tùy loại sản phẩm. Trường hợp thực phẩm đông lạnh,
có thể sử dụng các ống khoan tay vô trùng, dao đã được sát trùng để tách thành lượng
mẫu cần thiết, sau đó dùng thìa, kéo… để cho mẫu vào trong dụng cụ chứa. Lưu ý tránh
thu các mảng băng.
Trường hợp thực phẩm đã đóng gói thành nhiều mức, thực hiện thu mẫu bằng
cách chọn lấy các gói lớn từ đó lấy ra các bao nhỏ hơn.
Khối lượng tổng cần thu của mỗi mẫu thay đổi tùy thuộc số lượng các chỉ tiêu cần
phân tích nhưng ít nhất là khoảng 100 – 250g. Mẫu cần đảm bảo tính đại diện để có
được khối lượng mẫu cần thiết, cần thu gộp mẫu tại nhiều vị trí trên nguyên liệu hay
thành phẩm.
Trường hợp mẫu phân tích là bán thành phẩm đang được chế biến, cần thực hiện
thu mẫu tại nhiều vị trí trong cùng một công đoạn. Đối với các loại mẫu như thịt hay cá,

nơi nhiễm vi sinh vật chủ yếu là bề mặt. Do vậy, có thể sử dụng que bông vô trùng quét
một diện tích bề mặt nhất định hay cắt lát với bề dày 2 - 3mm để thu mẫu.
Dụng cụ chứa mẫu thường là các bình nhựa có nắp bằng nhôm hay bằng chất dẻo,
bao nylon chứa mẫu. Tránh sử dụng các bình bằng thủy tinh để chứa mẫu vì dễ vỡ.
2.2.2 Vận chuyển và bảo quản mẫu
GVHD: NGUYỄN THỊ MỸ LỆ

8

NHÓM 1


TIỂU LUẬN PHÂN TÍCH VI SINH THỰC PHẨM

Mẫu sau khi thu được bảo quản một cách độc lập với nhau trong các thùng bảo
quản mẫu được làm lạnh bằng các bao nước đá. Nước đá phải không được tan chảy
trong suốt quá trình vận chuyển mẫu về phòng thí nghiệm.
Tại phòng thí nghiệm mẫu được chuyển vào trong tủ đông và được phân tích ngay
khi có thể. Nếu không phân tích ngay, mẫu phải được bảo quản ở -20 oC cho đến khi
phân tích. Trường hợp mẫu không thể bảo quản đông thì có thể được bảo quản trong tủ
lạnh ở 0 – 4oC nhưng không được quá 36 giờ. Các loại thực phẩm như đồ hộp, thực
phẩm có độ ẩm thấp hay thực phẩm khó hư hỏng có thể được bảo quản ở nhiệt độ
phòng cho đến khi phân tích.
2.2.3 Chuẩn bị mẫu
 Rã đông mẫu trước khi phân tích

Mẫu đông lạnh phải được giải đông trong điều kiện vô trùng trước khi được phân
tích. Trường hợp phải phối trộn mẫu trước khi phân tích, mẫu phải được giải đông bên
trong các dụng chứa đã được sử dụng để thu mẫu và chuyển mẫu về phòng thí nghiệm,
không chuyển mẫu sang dụng cụ chứa khác.

Việc giải đông được thực hiện ở nhiệt độ 2 – 5 oC trong khoảng 18 giờ. Khi cần
thiết, có thể giải đông nhanh ở 45 oC trong 15 phút. Trường hợp này, cần liên tục lắc
bình chứa mẫu để làm tăng tốc độ giải đông và làm đồng nhất nhiệt độ bên trong mẫu.
 Cân mẫu
Cân chính xác một lượng mẫu xác định để tiến hành phân tích tùy theo yêu cầu
của chỉ tiêu phân tích với sai số cho phép là ±0,1g. Lượng mẫu này được cho vào trong
các bình chứa bằng nhựa hay các bao nhựa vô trùng.
Với kỹ thuật đếm khuẩn lạc các mẫu cần phân tích được pha loãng liên tiếp và
được xác định một vài nồng độ pha loãng nhất định để cấy vào các môi trường thích
hợp. kỹ thuật pha loãng thường qua các bước như sau:
• Dung dịch pha loãng mẫu: một số dung dịch dùng pha loãng có thể làm chết tế
bào như nước muối nước cất.các dung dịch pha loãng sau khi lấy ra từ tủ lạnh không

GVHD: NGUYỄN THỊ MỸ LỆ

9

NHÓM 1


TIỂU LUẬN PHÂN TÍCH VI SINH THỰC PHẨM

được dùng ngay vì có thể gây sóc cho vi sinh vật làm cho vi sinh vật không thể phát
triển được
• Chuẩn bị các chuỗi pha loãng: bơm chính xác 9ml dung dịch pha loãng vào ống
nghiệm có nắp.
Mẫu cần phân tích là mẫu thực phẩm thao tác tiến hành pha loãng như sau: cân
25g mẫu thực phẩm cần phân tích cho vào túi dựng thêm vào túi 225ml dung dịch pha
loãng ta được độ pha loãng 10 -1, hút 1ml mẫu 10 -1 cho vào ống nghiệm chứa 9ml dung
dịch pha loãng lắc đều ta có 10-2 tương tự ta lấy 1ml 10-2 cho vào 9ml dung dịch pha

loãng đã chuẩn bị sẵn ta có mẫu 10-3. Theo cách này ta làm cho đến khi có nồng độ pha
loãng như mong muốn ( hình 3.1).

Hình 3 : Pha loãng mẫu
 Đồng nhất mẫu

GVHD: NGUYỄN THỊ MỸ LỆ

10

NHÓM 1


TIỂU LUẬN PHÂN TÍCH VI SINH THỰC PHẨM

Do sự phân bố không đều của vi sinh vật bên trong mẫu nên mẫu cần được làm
đồng nhất trước khi phân tích. Việc đồng nhất các mẫu lỏng được thực hiện bằng cách
lắc kỹ trước khi phân tích. Các mẫu rắn được lắc hay đảo trộn bằng các dụng cụ chuyên
dùng, ví dụ như: thiết bị dập mẫu (Stomacher), trong điều kiện vô trùng.
Sau khi mẫu được đồng nhất, tùy yêu cầu của chi tiêu phân tích, thực hiện thu một
lượng xác định của mẫu để tiến hành phân tích. Ví dụ, đối với các chỉ tiêu định lượng,
lượng mẫu trích ra để phân tích là 10g, đối với các chỉ tiêu định tính, lượng mẫu trích ra
để phân tích là 25g.
2.3 Định lượng tổng vi sinh vật hiếu khí
2.3.1 Nguyên tắc phân tích tổng số vi khuẩn hiếu khí
Quy trình phân tích bao gồm các bước:
- Cân mẫu
- Đồng nhất mẫu
- Pha loãng thành dãy các nồng độ thập phân
- Chuyển và phân phối đều một thể tích xác định mẫu lên mặt môi trường rắn trong đĩa

petri bằng phương pháp hộp trải, hoặc hộp đổ.
- Ủ ở nhiệt độ và thời gian quy định
Phương pháp hộp đổ được sử dụng phổ biến trong các phòng kiểm nghiệm vi sinh.
Thông qua số lượng khuẩn lạc đếm được trên các đĩa peptri cho phép xác định được
lượng vi sinh vật còn có khả năng sinh trưởng trong môi trường trong mẫu ban đầu
Để đếm kết quả chính xác thì số vi khuẩn trong đĩa phải trong giới hạn 25-250
khuẩn lạc. Nếu vượt quá giới hạn thì phải tiến hành pha loãng và chọn những độ pha
loãng lớn hơn.
Điều kiện nhiệt độ và thời gian ủ thay đổi tùy theo yêu cầu phân tích và quy định
của từng quốc gia. Tiêu chuẩn của nhiều quốc gia quy định ủ ở 30 0C trong 3 ngày. Một
số tiêu chuẩn khác quy định ử ở 20 – 22 0C trong cùng thời gian trên. Theo yêu cầu của
tiêu chuẩn Việt Nam chỉ tiêu này được ủ 30 oC trong 72 giờ ± 6 giờ hoặc 37 oC trong 48
giờ ± 6 giờ.

GVHD: NGUYỄN THỊ MỸ LỆ

11

NHÓM 1


TIỂU LUẬN PHÂN TÍCH VI SINH THỰC PHẨM

2.3.2 Môi trường sử dụng
- Môi trường pha loãng mẫu: Saline Pepton Water ( SPW) hoặc Buffer Pepton
Water (BPW).
- Môi trường nuôi cấy : Plate Count Agar (PCA)
2.3.3 Quy trình phân tích

Định lượng mẫu

10g hoặc 10 ml
Đồng nhất và pha loãng mẫu
Cấy mẫu và rót môi trường vào đĩa Petri
Ủ mẫu
30±1oC trong 72 giờ
Đếm khuẩn lạc
Chọn đĩa có 25→250 khuẩn lạc
Sơ đồ quy trình định lượng tổng số vi khuẩn hiếu khí
2.3.4 Thuyết minh quy trình
1. Định lượng mẫu
Bước 1: Cân chính xác hay 25 g mẫu cho vào bao PE vô trùng.
2. Đồng nhất và pha loãng mẫu
Bước 2: Thêm vào 225ml môi trường BPW đã hấp khử trùng để nguội.
Bước 3: Tiến hành đồng nhất mẫu bằng máy dập mẫu (stomacher). Thời gian dập
mẫu tùy thuộc vào từng loại mẫu nhưng không quá 150 giây.

GVHD: NGUYỄN THỊ MỸ LỆ

12

NHÓM 1


TIỂU LUẬN PHÂN TÍCH VI SINH THỰC PHẨM

Bước 4: Tất cả các thao tác trên phải thực hiện trong điều kiện vô trùng. Khi đó, ta
sẽ được dung dịch pha loãng 10-1.
Bước 5: Dịch được pha loãng sẽ được pha loãng theo dãy thập phân bằng cách
dùng pipetman hút 1ml từ độ pha loãng 10 -1 cho vào 9ml nước muối sinh lý đã hấp khử
trùng, đồng nhất ta đươc 10-2. Hút 1ml từ độ pha loãng 10-2 cho tiếp vào 9ml nước muối

sinh lý, đồng nhất ta được 10-3. Tiếp tục thực hiện tương tự để có được các độ pha
loãng cần thiết.
Bước 6: Trộn mẫu trong ống nghiệm cho đều bằng máy vortex mixer hay lắc
mạnh bằng tay.
3. Cấy mẫu và rót môi trường vào đĩa Petri
Bước 7: Chọn độ pha loãng từ 10-2 đến 10-4.
Bước 8: dùng pipetman hút 1ml mỗi độ pha loãng cho vào 2 đĩa petri đã khử
trùng.
Bước 9: Tiếp tục đỗ khoảng 15ml môi trường PCA đã hấp khử trùng để nguội
khoảng 45oC.
Bước 10: lắc đều bằng cách xoay tròn đĩa petri xuôi và ngược chiều kim đồng hồ
từ 3-5 lần. Đặt đĩa lên mặt phẳng ngang và chờ môi trường đặc lại, lật ngược đĩa
4. Ủ mẫu
Bước 11: ủ 30oC sau 72 giờ hoặc37oC trong 48 giờ (hình 3.2).
5. Đếm khuẩn lạc
Bước 12: Chọn tất cả đĩa có số khuẩn lạc từ 25-250 khuẩn lạc để đếm

GVHD: NGUYỄN THỊ MỸ LỆ

13

NHÓM 1


TIỂU LUẬN PHÂN TÍCH VI SINH THỰC PHẨM

Hình 4 Phương pháp thực hiện đổ đĩa phân tích tổng vi sinh hiếu khí [10]

-

Nếu ở nồng độ pha loãng cao nhất, số khuẩn lạc đếm được trên 1 đĩa lớn hơn

250. Ví dụ: ở nồng độ 10-5 số đếm được lớn hơn 250, kết quả được ghi: >2,5x107
CFU/ml
-

Nếu ở độ pha loãng thấp nhất, số khuẩn lạc đếm được trên 1 đĩa nhỏ hơn 25. Ví

dụ: ở nồng độ 10-1 số đếm được nhỏ hơn 25, kết quả được ghi: <2,5x102 CFU/ml
-

Khuẩn lạc mọc loang tính là 1 khuẩn lạc.

GVHD: NGUYỄN THỊ MỸ LỆ

14

NHÓM 1


TIỂU LUẬN PHÂN TÍCH VI SINH THỰC PHẨM

GVHD: NGUYỄN THỊ MỸ LỆ

15

NHÓM 1


TIỂU LUẬN PHÂN TÍCH VI SINH THỰC PHẨM

Hình 5: Mẫu khuẩn lạc
Công thức tính kết quả
Đếm tất cả các số khuẩn lạc xuất hiện trên các khi ủ. Chọn các đĩa có số đếm từ
25- 250 để tính kết quả. Mật độ tổng số vi khuẩn hiếu khí trong 1g hay 1ml mẫu được
tính theo cong thức sau

A=

N
n1 × V1 × f1 + ... + ni × Vi × f i

(cfu/g)

Trong đó: A: số tế bào vi khuẩn (khuẩn lạc ) trong 1g mẫu
N: Tổng số khuẩn lạc đếm được trên các đĩa đã chọn
ni: Số lượng đĩa cấy tại độ pha loãng thứ i
V: Thể tích dịch mẫu (ml) cấy vào môi trường
fi: Độ pha loãng tương ứng
Ví dụ: Trong 1 trường hợp phân tích 1g mẫu cụ thể nhận được kết quả như sau:

Kết quả:

Nồng độ pha loãng

10-3

10-4

10-5

Đĩa 1

235

26

16

Đĩa 2

246

21

10

GVHD: NGUYỄN THỊ MỸ LỆ

16

NHÓM 1


TIỂU LUẬN PHÂN TÍCH VI SINH THỰC PHẨM

A=

235 + 246 + 26
= 2,4.105 (CFU / g )

2.1.0,001 + 1.1.0,0001

2.3.5 Ý nghĩa
Chỉ tiêu tổng vi sinh vật hiếu khí được dùng để đánh giá chất lượng của mẫu về vi
sinh vật, nguy cơ hư hỏng, thời hạn bảo quản của sản phẩm.
Đánh giá mức độ vệ sinh trong quá trình chế biến, bảo quản sản phẩm.
2.4 Định lượng tổng vi sinh vật hiếu khí trên thịt và một số sản phẩm từ thịt (theo
TCVN 5667-1992):
Tiêu chuẩn này quy định phương pháp xác định tổng số vi khuẩn hiếu khí trên 1cm bề
mặt sản phẩm và trong 1g cho các loại thịt và sản phẩm chế biến từ thịt trừ đồ hộp thịt.
1) Xác định tổng số vi khuẩn hiếu khí trên 1cm2
1.1 ) Nguyên tắc
Phương pháp xác định tổng số vi khuẩn hiếu khí trên 1cm 2, bề mặt sản phẩm được áp
dụng để đánh giá độ nhiễm khuẩn trên bề mặt các sản phẩm thịt bằng phương pháp đếm
số khuẩn lạc vi khuẩn hiếu khí có trên 1cm mẫu thử đã được chuyển tương đương với
1ml dung dịch huyền phù ban đầu dưới các điều kiện thử được xác định trong tiêu
chuẩn này.
1.2 ) Lấy mấu theo TCVN 5153 – 90 và TCVN 4886 – 89.
1.3 ) Thiết bị và dụng cụ
- Giấy thấm vô khuẩn, kích thước 2 x 2 hoặc 5 x 5 cm;
- Khung bằng kim loại không rỉ vô khuẩn có kích thước trong là 2 x 2 hoặc x 5 cm;
- Bi thuỷ tinh vô khuẩn, có đường kính phù hợp;
- Tăm bông;
- Kẹp gắn kim loại;
- Ống nghiệm 18 x 180mm;

GVHD: NGUYỄN THỊ MỸ LỆ

17

NHÓM 1


TIỂU LUẬN PHÂN TÍCH VI SINH THỰC PHẨM

- Cốc đong các loại;
- Bình tam giác các loại;
- Bình định mức dung tích 100, 500 và 1000 ml;
- Pipét 1,0 và 100ml, chia độ tới 0,1ml;
- Đĩa petri có đường kính trong 90 – 100mm;
- Phích đá duy trì được nhiệt độ từ 0 đến + 20C;
- Tủ ấm điều chỉnh được ở 30 ± 10C;
- Tủ sấy khô;
- Tủ hấp ướt;
- Bếp cách thuỷ điều chỉnh được từ 30 đến 560C;
- Cân phân tích;
- Máy đo pH;
- Kính lúp phóng đại từ 3 đến 5 lần;
- Hộp đếm khuẩn lạc;
- Bếp điện;
- Buồng cấy vô khuẩn.
1.4 ) Hoá chất và môi trường
1.4.1) Hoá chất
- Nước cất
- Natriclorua, tinh khiết phân tích (TKPT)
- Dinatri hydro phot phat (Na2HPO4), TKPT;
- Kalidihydro photphat (KH2PO4), TKPT;

GVHD: NGUYỄN THỊ MỸ LỆ

18

NHÓM 1


TIỂU LUẬN PHÂN TÍCH VI SINH THỰC PHẨM

- Thạch dùng cho vi sinh vật
- Trypton dùng cho vi sinh vật
- Glucaza.TKPT
- Cao men dùng cho vi sinh vật
- Pepton dùng cho vi sinh vật .
1.4.2) Môi trường
a) Nước muối sinh lý
- Thành phần: Natriclorua 8,5g;
- Nước cất, đủ 100ml;
- Cách pha chế:
Hoà tan muối trong nước, tiệt khuẩn trong nồi hấp ở 1200 C trong 15 phút.
b) Dung dịch đệm pepton
- Thành phần: Pepton 10g;
Natriclorua 5g;
Dinatrihydro phophat 9g;
Kalidihydro phophat 1,5g;
Nước cất, đủ 1000ml.
- Cách pha chế:
Đun sôi để hoà tan các chất trên, để nguội. Điều chỉnh độ pH bằng natrihydroxit 0,1N
sao cho sau khi tiệt khuẩn pH ở 250C là 7,0±0,2. Rót 100ml môi trường vào bình dung
tích 250ml và 10 ml vào một ống nghiệm. Tiệt khuẩn trong nồi hấp ở nhiệt độ 120 ±
10C trong 15 phút. Nếu không dùng ngay, môi trường cần được bảo quản nơi khô ráo,
tối ở nhiệt độ từ 0 đến + 50C và không quá 30 ngày.

GVHD: NGUYỄN THỊ MỸ LỆ

19

NHÓM 1


TIỂU LUẬN PHÂN TÍCH VI SINH THỰC PHẨM

c) Thạch trypten glucoza
- Thành phần: Trypton

5g;

- Cao men

2,5g

- Glucoza

1g

- Thạch

12 – 18g

- Nước cất, đủ

100ml

- Cách pha chế:
Vừa đun nhỏ lửa vừa khuấy nhẹ để hoà tan các chất đến khi dung dịch sôi. Điều chỉnh
pH sao cho sau khi tiệt trùng pH ở 250 là 7,0 ± 0,2. Rót môi trường vào bình với lượng
môi trường không quá 1/2 dung tích mỗi bình. Tiệt khuẩn trong nồi hấp ở nhiệt độ 120
± 10C trong 15 phút. Để nguội trong nồi cách thuỷ tới 45 ± 10C để sử dụng. Nếu chưa
dùng ngay cần bảo quản môi trường ở nơi khô ráo, tối, ở 0 đến + 5 0 và không quá 30
ngày. Trước khi dùng, đun cách thuỷ cho chảy môi trường và để nguội trong nồi cách
thuỷ tớ 45 ± 10C.
d) Thạch màng
- Thành phần: Thạch

12 – 18g

- Nước cất, đủ

100ml

- Cách pha chế:
Vừa đun nhỏ lửa vừa khuấy nhẹ để hoà tan thạch đến khi sôi, điều chỉnh pH sao cho
sau khi tiệt khuẩn pH ở 250C là 7,0 ± 0,2. Rót môi trường với lượng 4ml vào mỗi ống
nghiệm và 100 ml vào mỗi bình tiệt khuẩn, sử dụng và bảo quản nôi trường như mục C.
1.5 )Trình tự xác định
1.5.1) Chuẩn bị mẫu

GVHD: NGUYỄN THỊ MỸ LỆ

20

NHÓM 1

TIỂU LUẬN PHÂN TÍCH VI SINH THỰC PHẨM

a) Dùng giấy thấm vô khuẩn (1.3) được làm ướt trước bằng nước muối sinh lý và có
tổng diện tích là 100cm (gồm 4 mảnh 5 x 5 cm hoặc 25 mảnh 2 x 2 cm) dán lên các vị
trí khác nhau của bề mặt mẫu (1.2) cần dám sao cho toàn bộ diện tích giấy thấm tiếp
xúc trực tiếp với bề mặt mẫu. Sau 2 phút, chuyển toàn bộ số giấy thấm trên vào ống
nghiệm đã chứa sẵn 10 ml dung dịch đệm pepton.
Có thể chuẩn bị mẫu theo cách: áp các khung kim loại vô khuẩn có kích thước tương tự
(1.3) lên bề mặt mẫu ở các vị trí khác nhau với tổng diện tích là 100cm 2 ( 4 lần với
khung 5 x 5 cm hoặc 25 lần với khung 2 x 2cm). Nhẹ nhàng quét đầu tăm bông đã được
thấm ẩm bằng nước muối sinh lý lên toàn bộ diện tích đã được khung kim loại giới hạn.
Cchuyển toàn bộ số lên đầu tăm bông trên vào ống nghiệm chữa sẵn 10ml dung dịch
đệm pepton. Các ống nghiệm chứa mẫu có thể được bảo quản ở 0 đến + 2 0 trong vòng
6h.
b) Chuyển toàn bộ lượng mẫu trong ống nghiệm vào bình tam giác dung tích 100 ml
chứa khoảng 10 viên bi thuỷ tinh vô khuẩn. Tráng ống nghiệm chứa mẫu bằng dung
dịch đệm pepton và đổ cả vào bình chứa mẫu, lắc nhẹ cho giấy thấm hoặc bông tan
vụn, sau đó cho thêm dụch dịch đệm pepton tới khoảng 100ml
c) Để lắng hoặc tiến hành ly tâm dung dịch mẫu khoảng 5 phút ở tốc độ 200 vòng/
phút. Gạn lấy lớp dng dịch trong vào bình định mức dung tích 100ml và cho thêm dung
dịch đệm pepton tới vạch mức 100ml (tương đương với 100cm 2 bề mặt mẫu được
chuẩn bị). Dung dịch này được gọi là dung dịch huyền phù ban đầu. Cần tiến hành
kiểm tra ngay sau khi chuẩn bị xong dung dịch, nếu chưa kiểm tra, dung dịch cần được
bảo quản ở 0 đến + 50C nhưng không quá 1h.
1.5.2) Pha loãng mẫu
Dùng dung dịch đệm tepton ( mục b điều 1.4.2) để pha loãng dung dịch huyền phù ban
đầu theo tỉ lệ 1/9 tới các độ pha loãng thập phân khác nhau (10 -1, 10-2…10n). Cần căn cứ
mức độ nhiễm khuẩn của mẫu để tiến hành pha loãng dung dịch mẫu tới các độ pha

loãng phù hợp.

GVHD: NGUYỄN THỊ MỸ LỆ

21

NHÓM 1


TIỂU LUẬN PHÂN TÍCH VI SINH THỰC PHẨM

1.5.3) Tiến hành nuôi cấy
a) Với mỗi mẫu phải nuối cấy ít nhất 3 độ pha loãng liên tiếp, mỗi độ pha loãng nuối
cấy 2 đĩa, phải dùng pipet riêng trong mỗi độ pha loãng.
b) Dùng pipet khác nhau lấy 1 ml dung dịch mẫu ở các độ pha loãng khác nhau cho vào
giữa các đĩa petri. Rót vào mỗi đĩa khoảng 15 ml môi trường thạch trypton glucoza
(mục c điều 1.4.2). Lắc vòng tròn 5 lần theo chiều kim đồng hồ và 5 lần ngược lai để
trộn đều môi trường và dung dịch mẫu. Đặt các đĩa chứa môi trường trên mặt phẳng
ngang sao cho môi trường đông tự nhiên. Thời gian từ khi pha loãng mẫu (1.5.2) đến
khi nuôi cấy xong không quá 20 phút.
c) Nếu nghi trong sản phẩm có chứa các vi sinh vật mà khuẩn lạc của chúng có thểm
mọc lan trên bề mặt môi trường thì sau khi môi trường đã đông rót thêm 4 ml thạch
màng lên bề mặt đĩa.
d) Khi môi trường đã đông, lật úp các đĩa peptri và đặt vào tủ ấm đã duy trì ở 30 ± 10C
trong 72 h.
1.6) Tính kết quả
1.6.1) Cứ sau 24h đếm sơ bộ số khuẩn lạc đã mọc và sau 72h đếm chính thức để tính
kết quả.
Chỉ tính kết quả khi sự phân bố khuẩn lạc trên các đĩa là hợp lý với mối tương quan
nghịch giữa độ pha loãng và số khuẩn lạc mọc trên đó.

Dùng mắt thường hoặc kính lúp để đếm số khuẩn lạc mọc trên mỗi đĩa petri, chỉ đếm
những đĩa có số khuẩn lạc mọc riêng biệt và từ 15 đến 300 khuẩn lạc.
Đếm tất cả số khuẩn lạc mọc trong mỗi đĩa, trong trường hợp số lượng khuẩn lạc lớn và
phân bố đều, có thể phần đáy đĩa theo đường kính thành các phần đều nhau có bội số là
2 để đếm một phần sau đó nhân kết quả với tổng số phần đã chia.

GVHD: NGUYỄN THỊ MỸ LỆ

22

NHÓM 1


TIỂU LUẬN PHÂN TÍCH VI SINH THỰC PHẨM

1.6.2) Tổng số vi khuẩn hiếu khí trên 1cm2 mẫu thử ( X1) được quy ra tổng số vi khuẩn
hiếu khí có trong 1ml dung dịch huyền phù ban đầu của mẫu thử được tính ở 2 độ pha
loãng liên tiếp, mỗi độ pha loãng gồm 2 đĩa theo công thức sau:
X1 =

∑C
(n1 + 0,1nz ) xd

Trong đó:
∑C - tổng số khuẩn lạc trên tất cả các đĩa ở 2 độ pha loãng liên tiếp được đếm
n1 - số lượng đĩa ở độ pha loãng thứ nhất được đếm;
nz - số lượng đĩa ở độ pha loãng thứ hai được đếm;
d - hệ số pha loãng ứng với độ pha loãng thứ nhất được đếm.
Kết quả được làm tròn tới số hàng nghìn và biều thị dưới dạng tích của một số thập
phân hai chữ số ( 1,0 ….9,9) với 10n ( n= số chữ số nguyên của kết qủa trừ 1).

Thí dụ: Hai đĩa ở độ pha loãng thứ nhất được đếm ( 10-2) có số khuẩn lạc là 168 và 215;
Hai đĩa ở độ pha loãng liên tiếp thứ hai được đếm ( 10-3) có số khuẩn lạc là 14 và 25.
X1 =

∑C
168 + 215 + 14 + 25
422
=
=
= 19182
−2
(n1 + 0,1nz )d
[ 2 + ( 0,1x2) ) x10
0,022

Kết qủa 19182 được làm tròn thành 19000 và được biểu thị dưới dạng 1,9 x 10 2 khuẩn
lạc/cm2.
1.6.3) Nếu các đĩa của hai độ pha loãng liên tiếp có số khuẩn lạc từ 15 đến 30, tính số
khuẩn lạc của mỗi độ pha loãng và kết quả là trung bình số học của hai giá trị thu được.
Lấy trường hợp tỷ số của giá trị cao so với giá trị thấp lớn hơn hai lấy giá trị thấp là kết
quả.
1.6.4) Nếu hai đĩa chứa dịch huyền phù ban đầu đều có số khuẩn lạc thấp hơn 15, kết
quả là trung bình số học của số khuẩn lạc mọc trong hai đĩa đó.

GVHD: NGUYỄN THỊ MỸ LỆ

23

NHÓM 1

TIỂU LUẬN PHÂN TÍCH VI SINH THỰC PHẨM

1.6.5) Nếu hai đĩa chứa dịch huyền phù ban đầu đều không có khuẩn lạc nào, kết quả
là: ít hơn 1 vi khuẩn hiếu khí trên 1cm2 bề mặt sản phẩm.
2. Xác định tổng số vi khuẩn hiếu khí trong 1 g
2.1) Nguyên tắc
Tổng số vi khuẩn hiếu khí có trong 1 g mẫu được tính theo phương pháp đếm số khuẩn
lạc vi khuẩn hiếu khí quy ra 10ml dung dịch huyền phù ban đầu dưới các điều kiện xác
định của tiêu chuẩn này.
2.2) Lấy mẫu, theo TCVN 5153 –90
2.3) Thiết bị và dụng cụ, xem điều 1.3
2.4) Hoá chất và môi trường, xem điều 1.4
2.5) Trình tự xác định
2.5.1) Chuẩn bị mẫu, theo TCVN 4887 – 89
Khối lượng mẫu được chuẩn bị để pha loãng là 10 ± 1g.
2.5.2) Pha loãng mẫu, theo điều 1.5.2
2.5.3) Tiến hành nuôi cấy, theo các mục a, b, c điều 1.5.3
2.6) Tính kết quả
Cách đếm khuẩn lạc, tính toán và biểu thị kết quả theo các điều 1.6.1; 1.6.2 và 1.6.3.
2.6.1) Nếu 2 đĩa chứa dịch huyền phù ban đầu đều có số khuẩn lạc thấp hơn 15, lấy
trung bình số học m của chúng và kết quả X2 được tính:
X2 = m x

1
= 10m
d

(d là hệ số pha loãng của dịch huyền phù ban đầu bằng 10-1).
2.6.2) Nếu 2 đĩa chứa dịch huyền phù ban đầu đều không có khuẩn lạc nào, kết quả X 2

được tính:

GVHD: NGUYỄN THỊ MỸ LỆ

24

NHÓM 1


TIỂU LUẬN PHÂN TÍCH VI SINH THỰC PHẨM

X2< 1

1
d

X2 <10

2.5. Xác định tổng nấm men, nấm mốc trong thực phẩm
2.5.1 Nguyên tắc
Trong thực phẩm, nấm men và nấm mốc hiện diện có thể tăng trưởng làm thay đổi
màu của thực phẩm, một số có thể tạo độc tố gây ngộ độc thực phẩm.
Mật độ nấm men và nấm mốc trong mẫu được xác định chung dưới dạng tổng
nấm men nấm mốc bằng kỹ thuật pha loãng, trải và để khuẩn lạc trên môi trường
Dichloran Glycerol Agar ( DG18) hay Dichloran Rose Bengal Chloramphenicol Agar
(DRBC). Môi trường DG18 được sử dụng cho các loại mẫu thực phẩm có hàm lượng
nước thấp như các loại thực phẩm khô, gạo, ngũ cốc, tiêu, các loại thực phẩm có dầu,
có hàm lượng đường hay muối cao. Môi trường DRBC được sử dụng cho các mẫu có
hàm lượng nước cao như sữa và các sản phẩm từ sữa, các loại rau quả và trái cây tươi,
các loại đồ hộp... Đối với mẫu có mật độ nấm mốc thấp, ví dụ như mỹ phẩm, môi

trường được sử dụng là môi trường Malt Extract Agar (MEA) hay Potato Dextrose
Agar (PDA) chứa 40ppm Chloramphenicol hay cholotetracyline.
2.5.2 Môi trường và hóa chất
- Dung dịch pha loãng ( nước pepton 1%)
- Môi trường thạch DBRC.
- Môi trường thạch MEA.
- Môi trường thạch PDA.
- Môi trường thạch SDA
- Môi trường thạch SDB
Các loại môi trường thạch được chuẩn bị trong đĩa petri, làm khô bề mặt trong đều
kiện vô trùng, tránh ánh sáng trước khi sử dụng. Môi trường thạch Sabouraud Dextrose
Agar còn được chuẩn bị dưới dạng các ống thạch nghiêng.

GVHD: NGUYỄN THỊ MỸ LỆ

25

NHÓM 1