NUÔI CẤY MÔ THỰC VẬT

BỘ CÔNG THƯƠNG
TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP THỰC PHẨM TP.HCM
Khoa Công nghệ sinh học và Kỹ thuật môi trường
----------

TIỂU LUẬN
Đề tài: Nuôi cấy mô thực vật

1


MỤC LỤC
1.Đặt vấn đề ---------------------------------------------------------------------------- 3
2.Sơ lược về lịch sử hình thành và phát triển ------------------------------------- 4
3.Khái niệm ---------------------------------------------------------------------------- 7
4.Ứng dụng ----------------------------------------------------------------------------- 7
5.Thành tựu-Thực tiễn nuôi cấy mô ở Việt Nam --------------------------------- 8
6.Cơ sở khoa học của nuôi cấy mô thực vật --------------------------------------- 9
7.Hướng phát sinh hình thái khi nuôi cấy ----------------------------------------10
8.Quy trình nuôi cấy mô thực vật--------------------------------------------------12
9.Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình nuôi cấy mô thực vật -----------------13
9.1.Môi trường vật lý ------------------------------------------------------------------14
9.2.Vật liệu nuôi cấy ------------------------------------------------------------------15
9.3.Môi trường nuôi cấy --------------------------------------------------------------16
9.4.Điều kiện vô trùng ----------------------------------------------------------------23
10.Các phương pháp nuôi cấy mô thực vật --------------------------------------24
11.Các kỹ thuật dùng trong nuôi cấy mô thực vật ------------------------------27
11.1.Thụ phấn in vitro -----------------------------------------------------------------27
11.2.Dung hợp tế bào trần ------------------------------------------------------------27
11.3.Tạo dòng biến dị soma ----------------------------------------------------------28
11.4.Tạo dòng đơn bội ----------------------------------------------------------------30

11.5.Chuyển gen -----------------------------------------------------------------------31
12.Cây trồng chuyển gen (GMO) --------------------------------------------------34
13.Dụng cụ, hệ thống và thiết bị nuôi cấy mô thực vật -------------------------37
13.1.Hệ thống Bioreactor -------------------------------------------------------------38
13.2.Hệ thống nuôi cấy ngập chìm tạm thời (TIS) ---------------------------------40
14.Những thận lợi và khó khăn trong nuôi cấy mô thực vật ở Việt Nam ---43
15.Kết luận - Ý nghĩa khoa học ----------------------------------------------------44
16. Tài liệu tham thảo----------------------------------------------------------------45

2


1. Đặt vấn đề
Nuôi cấy mô thực vật là một trong những lĩnh vực ứng dụng đạt nhiều
thành công nổi bật của công nghệ sinh học thực vật. Bằng các kỹ thuật nuôi cấy
người ta đã nhân giống in vitro thành công nhiều loài cây trồng có giá trị.
So sánh ưu nhược điểm của các phương pháp nhân giống vô tính:
Ưu điểm:

Nhược điểm:
- Hệ số nhân giống thấp.
- Cây con không đảm bảo sạch

Tách

cây,

chiết cành,
giâm cành,
ghép

bệnh virus.
- Đơn giản, dễ làm.

- Phụ thuộc vào mùa vụ.

- Chi phí thấp.

- Tốn công lao động, đất đai và

- Sử dụng phổ biến.

thời gian.
- Một số cây trồng không áp dụng

cành...

được.
- Cây giống dễ bị thoái hoá qua
một số thế hệ.
- Hệ số nhân giống nhanh.
- Cho ra các cá thể tương đối - Chi phí cao so với các phương
đồng nhất về mặt di truyền.

pháp nhân giống vô tính khác nên

- Có thể nhân giống cây trồng ở giá thành không cạnh tranh.
Nuôi
mô
vật

cấy quy mô công nghiệp (kể cả trên - Không phải bất cứ loại cây nào
thực các đối tượng khó nhân bằng cũng có thể vi nhân giống.
phương pháp thông thường).

- Một số loài cây trồng rất dễ bị

- Chủ động kế hoạch sản xuất.

biến dị khi nhân giống in vitro.

- Tạo được cây sạch virus.

- Hiện tượng thủy tinh thể, bạch

- Các cây sau nhân in vitro có tạng.
xu hướng được trẻ hóa.

3


Hình: Cây dừa cho năng suất cao và cây thuốc lá kháng virus CMV .
Bằng cách nào người ta tạo được các giống cây trồng ấy?
2.Sơ lược về lịch sử hình thành và phát triển.
Trên thế giới:
Nuôi cấy mô thực vật đã được các nhà khoa học tiến hành vào cuối thế kỷ XIX.
Quá trình phát triển đó có thể tạm chia thành 3 giai đoạn:
- Giai đoạn 1902 – 1933: Khởi xướng và thử nghiệm.
- Giai đoạn 1934 – 1965:
+ Nghiên cứu sinh lý và phát sinh hình thái.

+ Phát hiện ra các hoocmon sinh trưởng đầu tiên.
+ Xây dựng được môi trường cơ bản: MS, N6, B5.
- Giai đoạn 1965 - đến nay:
+ Nghiên cứu di truyền.
+Ứng dụng các thành tựu vào sản xuất
Bảng: Những mốc chính trong lịch sử phát triển của nuôi cấy mô thực vật.
Haberlandt lần đầu tiên thí nghiệm nuôi cấy mô cây một lá mầm nhưng
1902 không thành công. Haberlandt G., Sitzungsber Akad. Wiss. Wien, Math.Naturwiss. Kl., 111: 69-92.
1904

1934

Hannig tiến hành các thí nghiệm nuôi cấy phôi đầu tiên ở các loài họ cải
Crucifers. Hannig B., Bot. Zeitung, 62: 45-80.
Kogl lần đầu tiên xác định được vai trò của IAA, 1 hoocmon thực vật
đầu tiên có khả năng kích thích sự tăng trưởng và phân chia tế bào.

4


Kogl F. Et al., Z. Physiol. Chem., 228: 90-103.
Gautheret, Nobecourt và White lần đầu tiên nuôi cấy mô sẹo thành
công trong thời gian dài từ mô thượng tầng (cambium) ở cà rốt và
1939 thuốc lá. Gautheret R. J., C. R. Acad. Sci. (Paris), 208: 118 -120;
Nobecourt P., C. R. Soc. Biol. (Paris), 130: 1270-1271; White P. R.,
Am. J. Bot., 26: 59-64.
Gautheret lần đầu tiên theo dõi sự hình thành chất trao đổi thứ cấp
1942 trong nuôi cấy mô sẹo thực vật. Gautheret R. J. Bull. Soc. Chim. Biol.
41: 13..
1944

1946

1950

1951

Skoog lần đầu tiên nghiên cứu sự hình thành chồi phụ từ nuôi cấy mô
thuốc lá in vitro. Skoog F., Am. J. Bot., 31: 19-24.
Sự tạo cây đầu tiên từ đỉnh chồi ở Lupinus và Tropaeolum. Ball E.,
Am. J. Bot., 33: 301-318.
Lần đầu tiên nuôi cấy thành công cây một lá mầm bằng nước dừa.
Morel G. C. R. Acad. Sci., 230: 2318-2320.
Nitsch lần đầu tiên nghiên cứu nuôi cấy noãn tách rời in vitro. Nitsch
J. P., Am. J. Bot., 38: 566-577.
Morel và Martin lần đầu tiên tạo được cây Dahlia sạch virus bằng nuôi

1952 cấy đỉnh sinh trưởng. Morel G. and Martin C., C. R. Hebd. Seances
Acad. Sci. (Paris), 235: 1324-1325.
1952

Morel và Martin lần đầu tiên thực hiện vi ghép in vitro thành công.
Morel G. and Martin C., C. R. Acad. Sci. (Paris), 235: 1324-1325.
Tulecke lần đầu tiên thành công trong nuôi cấy bao phấn và tạo mô sẹo

1953 đơn bội từ hạt phấn Ginkgo biloba. Tulecke W. R.., Science, 117: 599 600.
Tulecke lần đầu tiên thành công trong nuôi cấy bao phấn và tạo mô sẹo
1953 đơn bội từ hạt phấn Ginkgo biloba. Tulecke W. R.., Science, 117: 599 600.

5

Skoog và Miller đã khám phá vai trò tỷ lệ nồng độ các chất auxin :
1957

cytokinin trong môi trường đối với sự phát sinh cơ quan (rễ hoặc chồi).
Skoog F. and Miller C. O., In vitro Symp. Soc. Exp. Biol., No. 11: 118131.

1959

1960

Reinert và Steward lần đầu tiên tạo được phôi vô tính từ nuôi cấy mô
cà rốt.
Cocking lần đầu tiên đã sử dụng enzym phân giải thành tế bào để tạo
ra số lượng lớn tế bào trần. Cocking E. C., Nature, 187: 927-929.
Murashige và Skoog phát minh môi trường nuôi cấy mô tế bào thực

1962 vật- môi trường MS. Murashige T. and Skoog F., Physiol. Plant., 15:
473-497.
Guha và Maheshwari lần đầu tiên thành công trong tạo được cây đơn
1964 bội từ nuôi cấy bao phấn của cây cà rốt. Guha S. and Maheshwari S.
C., Nature, 204: 497 and Nature, 212: 97-98 (1966).
Carlson và cs tạo được cây từ lai xa tế bào trần đầu tiên nhờ dung hợp
1972 tế bào trần của 2 loài thuốc lá Nicotiana glauca và N. langsdorfii.
Carlson P. S. et al., P. N. A. S. (USA), 69: 2292-2294.
1977

Chilton và cs chuyển thành công T-DNA vào thực vật. Chilton M. D. et
al., Cell, 11: 263-271.

Tabata và cs nuôi tế bào thực vật ở quy mô công nghiệp phục vụ sản

1978

xuất shikonin (chọn lọc dòng tế bào cho sản lượng các sản phẩm thứ
cấp cao hơn). Tabata M. et al., Frontiers of Plant Tissue Culture 1978,
Univ. Calgary Press, Calgary,: 213-222.
Marton và cs xây dựng quy trình chuyển gen vào tế bào trần bằng

1979 đồng nuôi cấy tế bào và Agrobacterium. Marton L. et al., Nature, 277:
129-131
1982

Zimmerman sử dụng kỹ thuật xung điện trong dung hợp tế bào trần.
Zimmermann U., Biochim. Biophys. Acta, 694: 227-277.

6


Công ty Mitsui Petrochemicals lần đầu tiên đã sản xuất chất trao đổi
1983 thứ cấp trên quy mô công nghiệp bằng nuôi cấy tế bào dịch lỏng
Lithospermum spp. Mitsui Petrochemicals.
Chuyển gen vào tế bào trần cây một lá mầm và hai lá mầm bằng
1985 phương pháp điện thẩm. Fromm M. E., P. N. A. S. (USA), 82: 58245828.
1986

1988

Crossway và cs chuyển gen vào tế bào trần thuốc lá bằng vi tiêm AND
trực tiếp. Crossway A. et al., Mol. Gen. Genet., 202: 179-185.

Klein và cs tái sinh cây chuyển gen ổn định thông qua phương pháp
bắn gen. Klein T. M. et al., P. N. A. S. (USA), 85: 4305-4309.

Ở Việt Nam:
- Công nghệ nuôi cấy mô thực vật du nhập vào nước ta từ năm 1960, nhưng thực
sự phát triển từ năm 1980.
- Sau 1975, phòng thí nghiệm nuôi cấy mô thực vật đầu tiên được xây dựng tại
viện Sinh vật học, viện Khoa học Việt Nam do tiến sĩ Lê Thị Muội đứng đầu.
3.Khái niệm:
Nuôi cấ y mô thư ̣c vâṭ (plant tissue culture): là duy trì và nuôi dưỡng tế bào, mô, cơ
quan, hay cây hoàn chỉnh của thư ̣c vật trong điề u kiện in vitro.
Tất cả các dạng nuôi cấy mô đều được tiến hành qua hai bước :
- Các phần của thực vật hoặc một cơ quan nào đó của thực vật được tách ra khỏi
phần còn lại, đó là sự tách rời tế bào, mô hay cơ quan.
- Các phần tách ra khác nhau nói trên phải được đặt trong môi trường thích hợp để
nó có thể bọc lộ hết khả năng đáp ứng.
Nguyên liệu (mẫu nuôi cấy) có thể dùng nuôi cấy mô như: rễ, lá, thân, hoa, hạt
phấn, túi phấn, noãn, tế bào thực vật...
4.Ứng dụng:
- Nhân giống
- Chọn tạo giống cây trồng

7


- Khác: Nhân nhanh, phục tráng giống, sản xuất chất thứ cấp, làm sạch virut, duy
trì và bảo quản nguồn gen quý, nghiên cứu di truyền và đột biến…

Hình: Nhân giống lan Hồ Điệp và Viện Lúa Đồng bằng sông Cửu Long
5.Thành tựu-Thực tiễn nuôi cấy mô ở Việt Nam:

- Ở nước ta lĩnh vực áp dụng rộng rãi công nghệ nuôi cấy mô thực vật là lĩnh vực
nhân giống, bảo quản nguồn gen cây trồng. Nhưng mới chỉ được nghiên cứu ở các
viện, các phòng thí nghiệm, mà chưa được sản xuất ở quy mô lớn, đại trà như viện
Di truyền Nông nghiệp, viện Công nghệ sinh học, viện Lúa đông bằng sông Cửu
Long…và một số chương trình từ dự án quốc gia và quốc tế và thành công trong
việc chuyển một số gene diệt sâu, bệnh, kháng thuốc vào một số cây như lúa, ngô,
cải bắp…Nhìn sang các nước khác chúng ta thấy công nghệ sinh học của Việt
Nam còn đi một khoảng cách khá xa so với Trung Quốc, Đài Loan, Mỹ…
- Năm 2008, công nghệ nuôi cấy mô đã có những bước đột phá mới: Nhân giống
thành công giống sâm Ngọc Linh quý hiếm, khôi phục nhiều loài Lan rừng quý
hiếm khỏi nguy cơ tuyệt chủng đặc biệt là loài lan Hài hồng - loài lan hài duy nhất
có hương thơm trên thế giới…Việt Nam có thể trở thành nước sản xuất phong lan
lớn trong khu vực (20/02/2007).
- Từ năm 2001 đến nay, Sở Khoa học Công nghệ Lạng Sơn, hàng năm cung cấp
hàng vạn cây giống Bạch Đàn Europhylla.
Việt Nam đã bảo tồn thành công nguồn gene của các loại gỗ quý như: Vù hương - Loại gỗ chiết tinh dầu dùng trong dược, mỹ phẩm, cây Đăng lấy gỗ, cây trầm

8


hương, Chè vang - một loại chè rất khó trồng. Lai tạo thành công giống lúa chịu
hạn DR1, nhân nhanh nhiều loại hoa lan, mía , khoai tây sạch virut…
- Trung tâm Ứng dụng và chuyển giao tiến bộ công nghệ tỉnh Vĩnh Phúc nhân
giống thành công cây Lô hội - một loài dược liệu quý của địa phương.
- Ngày 16/5/2009, Lâm trường Tiền Phong, tỉnh Thừa Thiên-Huế, cho biết tỉnh
vừa đầu tư xây dựng và đưa vào hoạt động một nhà nuôi cấy mô, có công suất 1
triệu cây/năm để phát triển trồng rừng.
- Viện Sinh học Nông nghiệp Trường Đại học Nông Nghiệp I Hà Nội là một trong
50 cơ sở chuyên môn nuôi cấy mô tế bào, bước đầu cơ sở này đã đạt những kết
quả tốt: nuôi cấy các loài Phong lan, dứa Cayen, khoai tây giống siêu sạch bệnh…

Hầu hết các phòng nuôi cấy mô đều có sản phẩm đầu ra liên tục và ổn định…
- Dự án “Xây dựng cơ sở ứng dụng, sản xuất giống và sản phẩm cây trồng chất
lượng cao” được khởi công năm 2003, với hệ thống nhà kính với trang thiết bị
hiên đại rộng hàng ngàn mét vuông. Dự án được Trung tâm kĩ thuật rau quả thuộc
sở Nông Nghiệp và Phát triển Nông thôn Hà Nội đăng kí ở cấp thành phố.
6.Cơ sở khoa học của nuôi cấy mô thực vật:
Tính toàn năng: Là khả năng hình thành một cây hoàn chỉnh của tế bào, mô hay
cơ quan khi gặp điều kiện thuận lợi, do trong tế bào có chứa bộ gen mang toàn bộ
thông tin di truyền giống như cây mẹ.
Sự phân hóa-phản phân hóa của tế bào:
+ Phân hóa: từ một tế bào ban đầu được biến đổi thành các tế bào chuyên hoá đặc
hiệu cho các mô, cơ quan khác nhau.
+ Phản phân hóa: khi các tế bào đã phân hóa thành các tế bào chuyên biệt nhưng
vẫn có thể quay về dạng tế bào phôi sinh ban đầu khi gặp điều kiện thuận lợi.

9


7. Hướng phát sinh hình thái khi nuôi cấy:
Gồm 5 phương thức cơ bản:
- Hình thái rễ, trên rễ hình thành chồi
- Hình thành chồi, sau đó hình thành rễ từ chồi
- Hình thành mô sẹo, sau đó sản sinh ra chồi và rễ, cấu trúc liên tiếp thành một
trục thấp ví dụ như cà rốt.
- Hình thành thể dinh dưỡng khác như thân củ, thân vẩy và hình thành hình cầu, ví
dụ tạo củ lily, lay ơn, protocorm hoa lan.
- Hình thành chồi hoa hoặc một bộ phận cơ quan sinh sản, như khi nuôi cấy tế bào
trụ phôi cây phong lan thì tế bào nuôi cấy có thể phân hóa thành hạt phấn và
noãn...

Hình: Sơ đồ phân hóa mẫu mô trực tiếp tạo chồi và cây hoàn chỉnh (thông
qua phương thức tăng khả năng phát sinh chồi nách).

10


Hình: Nhân giống thông qua giai
đoạn tạo mô sẹo.
A. Mô sẹo cây tỏi sau 2 tuần nuôi cấy.
B. Mô sẹo sau 4 tuần nuôi cấy.
C. Tạo chồi từ mô sẹo.
D. Cây tái sinh từ mô sẹo.
E. Củ tỏi thu được từ cây con nuôi cấy
mô thông qua tạo mô sẹo.

Mô sẹo:
- Là các tế bào vách mỏng, không chuyên hóa, được tạo thành do sự phản phân
hóa của tế bào nuôi cấy, trải qua thời kỳ phân chia tế bào hình thành một khối tế
bào sinh trưởng vô tổ chức.
- Sự hình thành mô sẹo do chất điều tiết sinh trưởng điều khiển, có ba thời kỳ:
+ Thời kỳ cảm ứng: các tế bào chuyên hóa của mẫu cấy chuyển ngược trạng thái
phát triển, biến đổi hình thái chức năng theo hướng tế bào phân sinh.
+ Thời kỳ phân chia tế bào: các tế bào không phân hóa của mô sẹo có tần suất
phân chia tương đối nhanh.
+ Thời kỳ phân hóa tế bào: tốc độ phân chia và sinh trưởng tế bào giảm đi cho tới
khi ngừng hẳn, trong mô sẹo xuất hiện cấu trúc mô dẫn.
- Mô sẹo có màu lục, lục nhạt thì tiềm năng phát sinh cơ quan mạnh, các mô sẹo
màu vàng nhạt hoặc màu sữa, xốp giòn có tiềm năng phân hóa tế bào thể phôi, các
mô sẹo màu trắng hoặc màu xám có khả năng tái sinh.Vậy mô sẹo sinh trưởng
khỏe mạnh là những mô thể hiện màu vàng sữa hoặc màu trắng có độ sáng bóng,

cũng có mô thể hiện màu lục nhạt hoặc màu lục, mô sẹo lão hóa chuyển thành màu
vàng hoặc màu nâu.
Sự biến đổi sinh lý của tế bào nuôi cấy trong quá trình phát sinh cơ quan.
- Sự biến đổi axit nucleic và protein.

11


Ví dụ: nuôi cấy lá mầm cây sam hoa cho thấy sự phát sinh của chồi có mối quan
hệ với các protein có khối lượng phân tử 1600-20000U. Nhưng khi hình thành mô
sẹo thì xuất hiện các protein có khối lượng phân tử từ 60000-65000U.
- Sự biến đổi hô hấp và các chất hydracabon. Ví dụ: Tỷ lệ NADPH/NADP + trong
mô hình thành chồi giảm đến dưới 0.05 nhưng ở mô không hình thành chồi thì tỷ
lệ này được giảm ổn định.
- Sự biến đổi cân bằng phytohormon.Ví dụ: Khi hình thành chồi yêu cầu về auxin
ở mức độ cao hơn khi hình thành hoa thì.
- Biến đổi của axit amin. Ví dụ: Khi hình thành chồi, mô có hàm lượng nước
tương đối lớn, axit malic tăng lên, hàm lượng proline cao, tỷ lệ treosine/serine cao.
8. Quy trình nuôi cấy mô thực vật:

12


- Bước 1: Chọn lọc và chuẩn bị cây mẹ.
Trước khi tiến hành nuôi cấy cần chọn lọc cẩn thận các cây mẹ (cây cho nguồn
mẫu nuôi cấy). Các cây này cần phải sạch bệnh cùng với chế độ chăm sóc và
phòng trừ sâu bệnh hiệu quả trước khi lấy mẫu sẽ làm giảm tỉ lệ mẫu nhiễm, tăng
khả năng sống và sinh trưởng của mẫu cấy in vitro.
- Bước 2: Nuôi cấy khởi động.
Là giai đoạn khử trùng đưa mẫu vào nuôi cấy in vitro. Giai đoạn này cần đảm bảo

các yêu cầu: tỷ lệ nhiễm thấp, tỷ lệ sống cao, mô tồn tại và sinh trưởng tốt. Khi lấy
mẫu cần chọn đúng loại mô, đúng giai đoạn phát triển của cây: mô non, ít chuyên
hóa (đỉnh chồi, mắt ngủ, lá non, vảy củ…)
- Bước 3: Nhân nhanh
Là giai đoạn kích thích mô nuôi cấy phát sinh hình thái và tăng nhanh số lượng
thông qua các con đường: hoạt hóa chồi nách, tạo chồi bất định và tạo phôi vô
tính. Hệ số nhân ở giai đoạn này biến động từ 5-50 lần tuỳ thuộc vào loài cây, môi
trường và điều kiện ngoại cảnh thích hợp.
- Bước 4: Tạo cây in vitro hoàn chỉnh
Để tạo rễ cho chồi, người ta chuyển chồi từ môi trường nhân nhanh sang môi
trường tạo rễ có bổ sung một lượng nhỏ auxin. Một số chồi có thể phát sinh rễ
ngay sau khi chuyển từ môi trường nhân nhanh giàu cytokinin sang môi trường
không chứa chất điều tiết sinh trưởng. Đối với các phôi vô tính, chỉ cần gieo chúng
trên môi trường không có chất điều tiết sinh trưởng hoặc môi trường có chứa nồng
độ thấp của xytokinin để phôi phát triển thành cây hoàn chỉnh.
- Bước 5: Thích ứng cây in vitro ngoài điều kiện tự nhiên.
Để đưa cây từ ống nghiệm ra vườn ươm với tỷ lệ sống cao, cây sinh trưởng tốt cần
đảm bảo một số yêu cầu:
+ Cây trong ống nghiệm đạt những tiêu chuẩn hình thái ( số lá, rễ, chiều cao cây).
+ Có giá thể tiếp nhận cây in vitro thích hợp: giá thể sạch, tơi xốp, thoát nước.
+ Chủ động điều chỉnh ẩm độ, ánh sáng của vườn, có chế độ dinh dưỡng phù hợp.
9. Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình nuôi cấy mô thực vật:
13


9.1.Môi trường vật lý:
+ Ánh sáng: Đây là yếu tố cần thiết cho sự phát triển và phát sinh hình thái của
các mô nuôi cấy. Ánh sáng có ảnh hưởng tới mẫu cấy thông qua thời gian chiếu
sáng, cường độ ánh sáng và chất lượng ánh sáng.
Thời gian chiếu sáng có vai trò quan trọng trong quá trình phát triển của mô nuôi

cấy. Với đa số các loài cây, thời gian chiếu sáng thích hợp là 8-12 h/ngày.
Cường độ ánh sáng ảnh hưởng đến quá trình phát sinh hình thái mô nuôi cấy.
Cường độ ánh sáng cao kích thích sinh trưởng của mô sẹo trong khi cường độ thấp
gây nên sự tạo chồi (Ammirato, 1986). Nhìn chung, cường độ ánh sáng thích hợp
cho mô nuôi cấy là từ 1000 - 7000 lux (Moresin, 1974).
Bên cạnh thời gian chiếu sáng, cường độ ánh sáng thì chất lượng ánh sáng cũng
ảnh hưởng khá rõ tới sự phát sinh hình thái của mô nuôi cấy. Ánh sáng đỏ làm
tăng chiều cao của thân chồi hơn so với ánh sáng trắng, còn ánh sáng xanh thì ức
chế sự vươn cao của chồi nhưng lại ảnh hưởng tốt tới sự sinh trưởng của mô sẹo.
Chính vì vậy mà trong phòng thí nghiệm thường sử dụng ánh sáng của đèn huỳnh
quang với cường độ 2000 - 3000 lux, đặt cách bình nuôi cấy từ 35- 40cm.
Tỷ lệ quang tử của vùng ánh sáng
màu đỏ/gần đỏ/và xanh/đỏ ảnh
hưởng đến sự phát sinh hình thái.
Sự phát sinh hình thái xảy ra khi
ánh sáng có bước sóng thuộc ánh
sáng màu xanh (400-460 mm),
màu đỏ (620-680 mm), gần màu
đỏ (700-800 mm) và màu tím
(300-400 mm).
Hình: Nuôi cấy hoa cúc trong bình serum 125 ml dưới hệ thống chiếu sáng
đèn Compact 3U (trong) và đèn neon (ngoài, đối chứng).
+ Nhiệt độ: là nhân tố có ảnh hưởng rõ rệt đến sự phân chia tế bào và các quá trình
trao đổi chất của mô nuôi cấy, đồng thời nó có ảnh hưởng tới sự hoạt động của
14


Auxin, do đó làm ảnh hưởng đến khả năng ra rễ của cây mô. Theo kết quả nghiên
cứu của Vonanorld (1982) thì nếu nhiệt độ ngày/đêm là 20 oC /15 oC hoặc 20 oC
/18 o C tỷ lệ ra rễ đạt được khoảng 33%, thậm chí còn thấp hơn. Ở nhiệt độ trung

bình thì hoạt động trao đổi chất tốt hơn. Còn ở nhiệt độ cao lại thích ra nhiều tế
bào không có tổ chức. Trong nuôi cấy mô, nhiệt độ thường được duy trì ổn định,
ban ngày từ 25 – 30oC và ban đêm từ 17 - 20 o C. Nhìn chung nhiệt độ thích hợp
nhất cho sự sinh trưởng tốt ở nhiều loài cây là 25 oC (white, 1973).
+ Độ ẩm: Trong các bình nuôi cấy thì độ ẩm tương đối luôn bằng 100% nên
ta không cần phải quan tâm nhiều đến độ ẩm khi nuôi cấy mô.
+ Độ thoáng khí: Nồng độ khí CO2 trong bình nuôi cấy các cây có diệp lục thường
giảm thấp hơn điểm bù CO2 (50-100 mmol/mol) trong hầu hết các chế độ quang
chu kỳ.Nồng độ CO2 gia tăng trong giai đoạn tối (510 mmol/mol) nhưng giảm khi
chiếu sáng (100mmol/mol) trong vài giờ, khi được đưa lại và trong tối thì nồng độ
CO2 lại gia tăng trở lại. Ngay cả trong trường hợp thay nắp đậy có khả năng trao
đổi khí, nồng độ CO2 giảm xuống còn 100-200 mmol/mol trong thời gian có chiếu
sáng do đó cây invitro sống dị dưỡng (Kozai & Seikimoto, 1988).
9.2.Vật liệu nuôi cấy:
Ảnh hưởng của mẫu cấy bao gồm tuổi sinh lý của cây (mô, cơ quan), kiểu di
truyền, tình trạng sinh lý, vị trí của mẫu trên cây, vết thương, phương pháp cấy...
Việc lựa chọn vật liệu nuôi cấy quyết định đến sự thành bại của quá trình nhân
giống in vitro. Về nguyên tắc thì mọi tế bào của các mô chuyên hoá đều có tính
toàn năng, nghĩa là đều có thể nuôi cấy thành công. Thực tế cho thấy các loài tế
bào và các loại mô khác nhau có mức độ nuôi cấy thành công khác nhau. Một
nguyên tắc cơ bản trong nuôi cấy mô tế bào là các tế bào làm vật liệu nuôi cấy
càng non thì khả năng nuôi cấy thành công càng cao. Như vậy, tế bào và mô phôi
non là triển vọng nhất, rồi đến các tế bào của đỉnh sinh trưởng như: mô phân sinh
đỉnh ngọn, đầu rễ, lá non, tượng tầng…sau đó là các tế bào sinh dục như noãn bào
và tế bào hạt phấn ở giai đoạn non (Nguyễn Đức Thành, 2000); (Nguyễn Quang
Thạch, 1995).
15


9.3.Môi trường nuôi cấy:

Môi trường nuôi cấy mô thực vật tuy rất đa dạng nhưng đều gồm một số thành
phần cơ bản sau: Các muối khoáng đa lượng và vi lượng, vitamin, amino axít,
nguồn cacbon, chất điều hoà sinh trưởng, các chất hữu cơ bổ sung (nước dừa, dịch
chiết nấm men, dịch chiết khoai tây, bột chuối khô...) và chất làm thay đổi trạng
thái môi truờng: các loại thạch (agar).
Tất cả các hợp chất này đều tham gia vào một hoặc nhiều chức năng trong sự sinh
trưởng và phân hoá của thực vật nuôi cấy in vitro. Các nhà khoa học sử dụng các
môi trường nuôi cấy rất khác nhau. Việc lựa chọn môi trường nuôi cấy với thành
phần hoá học đặc trưng phụ thuộc vào một số yếu tố:
- Đối tượng cây trồng hoặc mô nuôi cấy khác nhau có nhu cầu khác nhau về thành
phần môi trường.
- Mục đích nghiên cứu hoặc phương thức nuôi cấy khác nhau (nuôi cấy tạo mô sẹo
phôi hoá hoặc phôi vô tính, nuôi cấy tế bào trần hoặc dịch lỏng tế bào, vi nhân
giống…)
- Trạng thái môi trường khác nhau (đặc, lỏng, bán lỏng…). Môi trường nuôi cấy
huyền phù tế bào thường là lỏng lắc, lỏng sục khí.
- Một số môi trường dinh dưỡng thường dùng: MS-62, WV3, N6, B5, LS…
+ Nguồn các bon: trong nuôi cấy mô, các tế bào chưa có khả năng quang hợp để
tổng hợp nên chất hữu cơ do vậy người ta phải đưa vào môi trường một lượng hợp
chất các bon nhất định để cung cấp năng nượng cho tế bào và mô (Debengh,
1991). Nguồn cácbon ở đây là các loại đường khoảng 20-30 mg/l có tác dụng giúp
mô tế bào thực vật tổng hợp các hợp chất hữu cơ, giúp tế bào tăng sinh khối, ngoài
ra nó đóng vai trò là chất thẩm thấu chính của môi trường. Người ta thường sử
dụng 2 loại đường đó là saccharose và glucose (Trần Văn Minh, 1994). Nhưng
saccharose được sử dụng phổ biến hơn, tùy theo mục đích nuôi cấy mà nồng độ
saccharose biến đổi từ 1-12%, thông dụng là 2-3%.
+ Các nguyên tố đa lượng: là những nguyên tố khoáng như: N, P, K, S, Mg,

16

Ca… cần thiết và thay đổi tuỳ đối tượng nuôi cấy. Nhìn chung, các nguyên tố này
được sử dụng ở nồng độ trên 30 ppm (tỷ lệ phần nghìn). Các nguyên tố này có
chức năng cung cấp nguyên liệu để mô hoặc tế bào thực vật xây dựng thành phần
cấu trúc hoặc giúp cho quá trình trao đổi chất giữa các tế bào thực vật với môi
trường được thuận lợi. Có nhiều môi trường với thành phần, tỷ lệ các chất khác
nhau, chúng ta có thể lựa chọn sử dụng. Nói chung, môi trường giàu Nitơ và Kali
thích hợp cho việc hình thành chồi, còn môi trường giàu Kali sẽ thúc đẩy quá trình
trao đổi chất mạnh hơn.
Thành phần khoáng của một môi trường cấy được xác định do sự cân bằng nồng
độ của những ion khác nhau trong dung dịch (nồng độ ion thể hiện bằng mg/l).
Việc lựa chọn thành phần và hàm lượng khoáng cho một đối tượng nuôi cấy là rất
khó đòi hỏi người làm công tác nuôi cấy mô phải có những hiểu biết cơ bản về
sinh lý thực vật đối với dinh dưỡng khoáng. Chẳng hạn, tỷ lệ nguồn nitơ tuỳ thuộc
vào loài cây và trạng thái phát triển mô. Thông thường, nguồn nitơ được đưa vào
môi trường ở hai dạng là HN4+ và NO3 - (nitrat). Trong đó, việc hấp thụ NO3- của
các tế bào thực vật tỏ ra có hiệu quả hơn so với HN 4+. Nhưng đôi khi NO3- gây ra
hiện tượng “kiềm hóa” môi trường vì vậy giải pháp sử dụng phối hợp cả 2 nguồn
nitrơ với tỷ lệ hợp lý được sử dụng rộng rãi nhất.
Bảng: Các muối khoáng đa lượng dùng trong nuôi cấy mô

17


+ Nhóm nguyên tố vi lượng: Fe, Cu, BO, Zn, Mn, Co, I… là các nguyên tố rất
quan trọng và không thể thiếu cho sự phát triển của mô và tế bào do chúng đóng
vai trò quan trọng trong các hoạt động của enzym. Chúng được dùng ở nồng độ
thấp hơn nhiều so với các nguyên tố đa lượng để đảm bảo sinh trưởng và phát triển
bình thường của cây (Nguyễn Văn Uyển, 1993).
Bảng:Các muối khoáng vi lượng dùng trong nuôi cấy mô

+ Các vitamin: Mặc dù cây nuôi cấy mô có thể tự tổng hợp được Vitamin, nhưng
không đủ cho nhu cầu (Czocnowki, 1952). Do đó, để cây sinh trưởng tối ưu một
số Vitamin nhóm B được bổ sung vào môi trường với lượng nhất định tuỳ theo
từng hệ mô và giai đoạn nuôi cấy. Các Vitamin B1 (Thiamin) và B6 (Pyridocin) là
những Vitamin cơ bản nhất thường dùng trong môi trường nuôi cấy với nồng độ
thấp khoảng 0,1-1mg/l (Trần Văn Minh, 1994). Các dung dịch stock vitamin dễ
hỏng do nấm khuẩn nhiễm tạp, vì vậy cần giữ trong điều kiện lạnh dưới 0 oC
(trong ngăn đá tủ lạnh).
Bảng: Các loại vitamin thường dùng trong nuôi cấy mô.

18


+ Dung dịch hữu cơ: có thành phần không xác định như nước dừa, dịch chiết nấm
men, cà rốt, chối, khoai tây... được bổ sung vào môi trường có tác dụng kích thích
sinh trưởng mô sẹo và các cơ quan.
Nước dừa đã được sử dụng vào nuôi cấy mô từ năm 1941 và được sử dụng khá
rộng rãi trong các môi trường nhân nhanh in vitro. Trong nước dừa thường chứa
các acid amine, acid hữu cơ, đường, ARN và DNA. Đặc biệt trong nước dừa còn
có chứa những hợp chất quan trọng cho nuôi cấy mô như: Myoinoxitol, các hợp
chất có hoạt tính Auxin, các Gluxit của Cytokinin (Nguyễn Văn Uyển, 1993).
Lượng nước dừa dùng trong môi trường nuôi cấy thường khá cao, từ 10-20% thể
tích môi trường.
Dịch chiết nấm men và dịch thủy phân casein là các chế phẩm thường dùng trong
nuôi cấy vi sinh vật, mô và tế bào động vật đã được tiêu chuẩn hóa và bán dưới
dạn thương phẩm, thành phần hóa học không rõ. Dung dịch thủy phân casein cung
cấp một số amino acid, lượng thường dùng là 1g/1 L môi trường.
+ Chất làm đông cứng môi trường: Agar (thạch) là một loại Polysacharid của tảo
có khả năng ngậm nước khá cao 6-12g/l. Độ thoáng khí của môi trường thạch có

ảnh hưởng rõ rệt đến sinh trưởng mô nuôi cấy. Nồng độ thạch dao động trong
khoảng 6-10g/l tuỳ thuộc mục tiêu nuôi cấy. Gelatin ở nồ ng đô ̣ cao (10%) cũng có
hiê ̣u quả taọ gel nhưng bi ̣ haṇ chế sử du ̣ng bởi vì nó nóng chảy ở nhiê ̣t đô ̣ thấ p

19


(25 oC). Công ty FMC Corp. gầ n đây đã phát triể n một loaị agarose đươ ̣c tinh sach
̣
cao go ̣i là Sea Plaque(k), loaị này có thể đươ ̣c dùng để phu ̣c hồ i các protoplast đơn
(single protoplast) trong nuôi cấ y. Cellophane đu ̣c lỗ (perforated cellophane), cầ u
giấ y lo ̣c (filter paper bridge), bấ c giấ y lo ̣c (filter paper wick), bo ̣t polyurethane
(polyurethane foam) và xố p polyester (polyester fleece) là các phương thức thay
đổ i giá thể đươ ̣c dùng trong môi trường nuôi cấ y mô hoăc̣ tế bào.
+ Các chất điều hoà sinh trưởng:
Các Phytohormon là những chất có tác dụng điều hoà sinh trưởng và phát triển của
thực vật. Chúng đóng vai trò quan trọng trong quá trình sinh trưởng và phát triển
của thực vật như: phân chia, biệt hoá tế bào… ngoài ra còn có ảnh hưởng đến quá
trình lão hoá mô và nhiều quá trình khác. Các phytohormon có thể chia thành 5
nhóm: Auxine, Cytokinin, Giberillin, Ethylen, Abscisic acid. Chúng là yếu tố quan
trọng nhất trong môi trường quyết định đến sự thành công của kết quả nuôi cấy.
Bảng : Giới thiệu tóm tắt về một số chất điều hoà sinh trưởng chính ở thực vật .
A

Nhóm auxin

1

Indole-3-acetic acid (IAA)

2

Indole-3-butyric acid (IBA)

3

1-naphthaleneacetic
(NAA)

Chức năng trong hệ thống nuôi cấy mô

- Phân chia tế bào

acid - Tạo và nhân callus
- Tạo rễ bất định(ở nồng độ cao)

2,4-dichlorophenoxy-

- Tạo chồi bất định(ở nồng độ thấp)

acetic acid (2.4D)

- Tạo phôi soma (2,4-D)

5

(2,4,5-T)

- ức chế chồi nách

6

Picloram , Dicamba, PAA

B

Nhóm cytokinin

1

Kinetin

- Tạo và nhân callus

2

6-Bezylamino-purine (BAP)

- Kích thích bật chồi nách.

3

Zeatin (Z)

4

- Phân chia tế bào

- Tạo chồi bất định (ở nồng độ cao)

20


4

Zeatinriboside (ZR)

- ức chế sự hình thành rễ

5

Isopentenyladenosine (iPA)

- ức chế sự kéo dài chồi.

6

Isopentenyladenine (iP)

- ức chế quá trình già (hoá vàng) ở lá.

7

Thidiazuron (TDZ), CPPU

C

Nhóm gibberellin

- Kéo dài chồi

1

Gibberellic acid (GA3)

- Phá ngủ ở hạt giống.

2

Gibberllin 1 (GA1)

- ức chế sự hình thành rễ bất định.

3

Gibberellin 4 (GA4)

- Các chất ức chế tổng hợp kích thích quá

4

Gibberellin 7 (GA7)

trình tạo củ (thân củ, thân hành và củ).

D

Nhóm các chất ĐHST khác

1

Ethylene

- Gây già hoá lá.
- Làm chín quả.
- Sự chín của thể phôi

2

Abscisic acid

- Kích thích hình thành thân hành, thân củ.
- Thúc đẩy phát triển của tình trạng ngủ.

3

Nhóm Polyamine

a

Putrescin

- Kích thích sự hình thành chồi.

b

Spermidine

- Đẩy mạnh sự phát sinh thể phôi.

c

Sspermine

4

- Kích thích sự tự hình thành rễ.

Jasmonic acid (Ja)

- Kích thích hình thành thân củ, thân hành.

Methyl jasmonate (MeJa)

- Đẩy nhanh hình thành đỉnh sinh trưởng.

21


Hình: Tương tác giữa BA và NAA trong phát sinh hình thái của vảy tỏi
Bowiea volubilis.
Ngoài ra, cần phải chú ý tới độ pH của môi trường vì nó ảnh hưởng khá rõ nét tới
khả năng hoà tan các chất khoáng trong môi trường. Sự ổn định của môi trường,
khả năng hấp thụ chất dinh dưỡng của cây. Nếu pH thấp (<4,5) hặc (>7,0) đều gây
ức chế sinh trưởng, phát triển của cây trong nuôi cấy in vitro. Nên việc xác định
được độ pH ban đầu của môi trường cho quá trình sinh trưởng và phát triển của
mô cấy là cần thiết. Độ pH thường được sử dụng trong nuôi cấy mô tế bào thực
vật nói chung từ 5,6 - 6.

22

Hình : Đồ thị biễu diễn sự gia tăng trọng lượng mô sẹo khi nuôi cấy bắp cải
tím trong điều kiện pH thay đổi từ 1-14.
Ví dụ: Môi trường phân lập (Protoplast Isolation medium –PI) theo Trigiano &
Gray, 2000

9.4.Điều kiện vô trùng:
Đây là điều kiện cơ bản đầu tiên quyết định sự thành bại của quá trình nuôi
cấy in vitro. Nếu điều kiện này không được đảm bảo thì mẫu nuôi cấy hoặc môi
trường sẽ bị nhiễm, mô nuôi cấy sẽ bị chết, các thí nghiệm ở giai đoạn sau sẽ bị
ngừng lại. Do đó, trong toàn bộ quá trình nuôi cấy in vitro cần đảm bảo điều kiện
vô trùng tuyệt đối. Muốn đảm bảo điều kiện vô trùng cần có phương pháp khử
trùng mẫu thích hợp, phương tiện khử trùng hiện đại, buồng và bàn nuôi cấy vô
23


trùng. Chọn đúng phương pháp khử trùng sẽ cho tỷ lệ sống cao, môi trường dinh
dưỡng thích hợp sẽ đạt tốc độ sinh trưởng nhanh. Các kỹ thuật vô trùng: khử trùng
dụng cụ cấy, môi trường, mẫu cấy, nơi thao tác cấy …
Bảng : Những dung dịch khử trùng phổ biến dùng cho nuôi cấy mô thực vật.
Chất khử trùng

Nồng độ (%) Thời gian khử trùng (phút)

Calcium hypocholorite

9 - 10

5 - 30

Sodium hypocholorite

0.5 - 5

5 - 30

Hydrogen peroxide

3 - 12

5 - 15

Bromine water

1-2

2 - 10

Ethyl alcohol

70 - 95

0.1 - 5.0

Silver nitrate

1

5 - 30

Murcuric choloride

0.1 - 1.0

2 - 10

Benzalkonium choloride 0.01 - 0.1

5 - 20

Antibiotics

30 - 60

4 - 50 mg/l

10.Các phương pháp nuôi cấy mô thực vật:

Hình: Một số phương pháp dùng trong nuôi cấy mô thực vật.
A. Mô sẹo từ Catharanthus roseus. (B)Nuôi cấy dịch tế bào từ Coryphanta spp. (C)
Nốt sần C. roseus. (D) Đầu rễ từ C. roseus. (E)Tái sinh cây từ C. roseus callus. (F)

24


Protoplasts từ Coffea arabica (G) Vi nhân giống của Agave tequilana. (H) Phôi vô
tính của cây Coffea canephora. (I) Nuôi cấy rễ cây Psacalium decompositum.
- Nuôi cấy mô phân sinh: mẫu cấy là mầm non, các chồi mới hình thành hoặc các
cành non có kích thước 0,1mm ÷ 1cm

- Nuôi cấ y đỉ nh sinh trưởng (meristem culture): mẫu cấy là mô hình chóp
không lớn hơn 0,1 mm. Thường đươ ̣c tách từ rễ ngo ̣n dưới kính hiể n vi.
- Nuôi cấy đỉ nh ngo ̣n (shoot tip culture): Sử du ̣ng đỉnh sinh trưởng chồ i ngo ̣n,
chồi đỉnh, chồi nách kích thước từ 0,1 đế n 1,0 mm.
- Nuôi cấy cơ quan (organ culture): Duy trì và phát triể n toàn bô ̣ hay mô ̣t phầ n
cơ quan thư ̣c vâṭ trong điề u kiê ̣n in vitro.
- Nuôi cấy bao phấn và hạt phấn tách rời: Dựa trên nguyên lý sinh sản đơn tính
đực , mẫu cấy là bao phấn chứa hạt phấn và hạt phấn tách rời.

Hình: Quy trình nuôi cấy bao phấn (Anther) và hạt phấn (pollen).

25