Tài liệu ôn tập môn vi sinh vật thực phẩm

I.

Câu hỏi tiểu luận

CHƯƠNG TỔNG QUAN
 Lactobacillus
-

Gram(+), hình que, thường kết thành chuỗi

-

Âm tính với catalase

-

Trong thực phẩm, chúng là những vi khuẩn hiếu khí. Một số loài trong môi
trường kị khí bắt buộc: ruột kết, dạ cỏ động vật

-

Chúng phổ biến ở các sản phẩm sữa, rau cải

-

L.suebicus : thịt đông, thịt đóng gói chân không

 Staphylococcus
-

Phân bố rộng: đất, nước, dịch mũi, khoang miệng, họng, da.

-

Cầu khẩu (kết chùm), Gram (+), hiếu khí tùy tiện, dương tính với catalase.

-

Topt: 37oC, 75-80oC(20’): chết.

-

CNaCl: 12%, Cđường: 50%.

-

pHotp: 6-7, pH<4: chết.

-

S. aureus là tác nhân gây bệnh ở người, và một số vi khuẩn đường ruột có nguồn
gốc từ thực phẩm.

 Aspergillus
-

Nấm mốc Aspergillus có hình dạng sợi, phân nhánh và có vách ngăn, không màu ,
màu nhạt hoặc trở nên nâu, nâu nhạt ở một số vùng nhất định của khuẩn lạc

-

Có hai hình thức sinh sản là sinh sản hữu tính và vô tính

-

Tạo ra các điểm thối đen trên trái cây.

-

Một số tạo độc tố aflatoxyn và một số khác tạo ochratoxyn

 Mucor


-

Khuẩn ty không vách ngăn được tạo ra và nâng các cuống túi bào tử, nó có hình
thái như bông.

-

Được tìm thấy ở thực phẩm lên men thịt, thịt lợn xông khói và các loại rau và một
số loài khác thuộc giống này có khả năng lên men sữa đậu nành.

-

là nấm đơn bào cấu tạo dạng sợi, sinh bào tử. Bào tử được tạo thành trong các túi
(bào tử nang) và thuộc loại bào tử nội sinh. Cuống bào tử nang có phân nhánh và
mọc lên từ bất kì chỗ nào của sợi nấm.

-

Mucor là giống lớn nhất trong bộ Mucorales. Chúng bao gồm các loài: M.mucedo,
M. cremois, M. rouxii, M. hiemalis, M. silvaticus, M. subtilis

-

Mucor là một loại nấm phát triển rộng rãi, thường tìm thấy trong đất, phân bón,
trái cây, bánh mì, và những thực phẩm giàu tinh bột khác. Chúng phát triển tốt
trong điều kiện hiếukhí. Ở điều kiện yếm khí Mucor. sppr phân tách thành những
sợi nấm nhỏ hình trònhay hình bầu dục và nảy chồi, vì thế người ta hay gọi loài
này là men của nấm mốc.

-

Chúng có khả năng sử dụng một cách hiếu khí nhiều nguồn carbon, lên
mencarbonhydrate, có thể sử dụng ammoniac hay nitơ hữu cơ cho quá trình sinh
trưởng, vàcòn có thể phát triển trên một thang nhiệt độ rộng

 Saccharomyces
-

Sinh sản bằng cách nảy chồi nhiều hướng và tạo bào tử có hình cầu trên nang.
Là giống lưỡng bội không lên men lactose.
Rất quan trọng trong công nghệ sản xuất rượu, bia…

 Brettanomyces
-

Không sinh bào tử, tế bào dạng hình cung nhọn, sinh sản bằng nảy chồi.

-

B. intermedius là loài phổ biến.

-

Brettanomyces gây hư hỏng bia, rượu, nước ngọt không cồn

CHƯƠNG BẢO QUẢN THỰC PHẨM
 Tại sao phải bảo quản thực phẩm?
- Bảo quản thực phẩm là quá trình xử lý thực phẩm nhằm ngăn chặn hoặc làm chậm

việc quá trình hư hỏng, nhờ đó thực phẩm được giữ lâu hơn.


Để ngăn ngừa sự phát triển của vi sinh vật có hại
Làm chậm quá trình oxy hóa chất béo để tránh ôi thiu.
Kiềm chế sự suy giảm thẩm mỹ của thức ăn.
Bảo quản thực phẩm bằng chất bảo quản và các biện pháp sinh học
VSV ảnh hưởng tới chất lượng, tuổi thọ của sản phẩm thực phẩm
Thực phẩm bị nhiễm vsv từ các nguồn khác nhau:nguyên liệu, thiết bị sản xuất,
con người
- Sản phẩm thực phẩm phải đảm bảo an toàn, không gây độc, có thời gain xử lý hợp
lý
- Phụ gia chốn vsv có vai trò quan trọng trong quá trình bảo quản thực phẩm
 Khái niệm phụ gia chống vi sinh vật
- Chất chống vsv được sử dụng để kiểm tra hay ngăn ngừa sự phát triển của vsv,
đóng vai trò làm tăng tính an toàn cho thực phẩm và làm tăng độ bền của thực
phẩm trước vsv . việc lựa chọn các chất chống vsv tùy thuộc vào các yếu tố:
+ Tính chất hóa học , hoạt tính của các chất chống vi sinh vật

+ Tính chất của thành phần thực phẩm.
+ Phương pháp bảo quản thực phẩm.
+ Số lượng và đặc tính của các chất chống vsv
+ Giá thành và hiệu quả khi sử dụng các chất chống vsv.

-

P/S:
•
•
•

Tăng tính an toàn cho sản phẩm thực phẩm
Tăng độ bền của thực phẩm trước vsv
Để kiểm tra, ngăn ngừa sự phát triển của vsv

CHƯƠNG VSV TRONG BẢO QUẢN CHẾ BIẾN THỦY SẢN
 Quá Trình Nhiễm Vi Sinh
- Vi sinh vật xâm nhập
• Xâm nhập qua đường ruột
• Xâm nhập từ mang cá


•
•
•

-

Xâm nhập từ niêm dịch biểu bì

Xâm nhập qua vết thương
Xâm nhập qua nguồn nước

Sự thối rữa của cá
• Cá tươi sẽ không được bảo quản lâu nếu không xử lý sơ bộ như róc
mang, ruột cá vì đây là những bộ phận chứa nhiều vsv có thể gây hư
hỏng cá. Khi các chết các vsv trong mang, ruột và trên da cá sẽ xâm
nhập vào các mô làm cá bị ươn. Sau đó protein bị thủy phân làm cho
cá bị thối rữa, cá bắt đầu thối rữa khi số lượng vsv lên tới 107-108 tế
bào / 1g.
• Ngoài quá trình vi sinh thì còn có quá trình sinh hóa do hoạt động
của các enzyme gọi là hiện tượng tự phân
• Các vk thường thấy : Bacillus micoides, bacillus subtilis, bacillus
mesentericus..

 Các dạng hư hỏng của cá
- Nguyên nhân do sự phát triển của VSV gây nên.

Mức độ tươi của cá thường được chia làm 3 dạng

CHƯƠNG RAU QUẢ

•
•
•

QUÁ TRÌNH NHIỄM VI SINH
Quá trình nhiễm vi sinh vật vào rau quả thường diễn ra như sau
Quá trình nhiệm vsv từ đất
Nhiễm từ nguồn nước tưới

Bản thân qau quả mang bệnh


•


•

•
•
•
•
•

-

-

•
•
•
•

Nguồn lây nhiễm : do hạt giống hay quá trình chăm bón hữu cơ hay do vsv trong
đất trong nước. Do quá trình thu hái vận chuyển và chế biến vsv xâm nhiễm vào
rau quả
Các tác nhân gây hư hỏng thực phẩm:
Tác nhân nấm.
Nấm mốc là nguyên nhân đầu tiên gây hư hỏng rau quả, do pH của rau quả <4.5
tạo điều kiện cho nấm mốc phát triển nhanh cho đến khi pH tăng lên vi khuẩn

khác sẽ tấn công rau quả
Thối do mốc xám: Do Botrytis cinerea gây ra.
Thối chua: Do Geotrichum candidum gây ra.
Thối do Rhizopus: Do Rhizopus stolonnifer gây ra.
Thối do Phytophthora: Do Phytophthora spp. gây ra.
Tác nhân vi khuẩn
Các giống vi khuẩn có liên quan đến sự hư hỏng của rau tươi ( còn ngoài đồng
ruộng) và rau bảo quản là Pseudomonas, Pectobacterium, Erwinia, Xanthomonas
Lên men lactic (muối chua):
Dựa vào tính chất lên men lactic của một số vi khuẩn tạo môi trường acid để tạo
các sản phẩm muối chua rau quả. Môi trường này ức chế sự phát triển các vi sinh
vật khác nên giúp kéo dài thời gian bảo quản.
Khi muối chua pH giảm nên môi trường có tính acid cao vì vậy sẽ ức chế các vi
khuẩn gây thối rữa. tuy nhiên trong môi trường nấm mốc và nấm men vẫn phát
triển và gây hư hỏng sản phẩm. khi nấm mốc phát triển làm giảm độ pH của môi
trường tạo điều kiện vi khuẩn gay thối rữa phát triển và làm hư hỏng sản phẩm.
Một số phương pháp:
Muối chua với nồng độ muối thấp.
Muối chua với nồng độ muối cao.
Muối chua không sử dụng muối.
Tuy nhiên vẫn tồn tại một số loại vi sinh vật làm hư hỏng quá trình này.

 Sử dụng hàm lượng đường cao
• Ở hàm lượng đường cao, vi sinh vật bị ức chế. Khi nồng độ đạt 60%, tất cả vi sinh

vật đều không phát triển được nên tp bảo quản được lâu.
 VI SINH VẬT TRONG MỘT SỐ SẢN PHẨM TỪ RAU QUẢ
- Đồ hộp rau quả
• Đồ hộp được chia làm ba nhóm:
+ Nhóm 1: có pH > 5,2: có khả năng có Clostridium tạo ra chất độc.

+ Nhóm 2: pH= 4,6 – 5,2: có bào tử
+ Nhóm 3: pH= 3,2 – 4,6: bào tử không phát triển và không gây độc.
• Các dạng hư hỏng:


Hư hỏng nhẹ: do quá trình phân giải glucid thành các acid hữu cơ
tạo vị chua.
+ Hư hỏng nặng: do phân giải glucid thành CO 2 và H2 gây nổ đồ hộp
và tạo vị tanh.
+ Hư hỏng do tạo khí sulfurơ: do phản ứng thủy phân protein tạo thành
H2S dưới tác dụng của Clostridium nigrificans.
+

•

Rau muối chua:

Một số dạng hư hỏng như sau:
Rau bi biến màu tạo sắc tố như màu hồng, đỏ sáng, tạo váng do nấm men
Torulopsis.
+ Bị mềm nhũn do nhiệt độ cao và sự hiện diện của Lactobacterium
pentoacetium.
+ Rau bị nhớt do Lactobacterium cucumeris fermentari và Lactobacterium
plantarum gây ra.
Nguyên nhân
Do nguyên liệu: quá trình rửa, ngâm, muối, thanh trùng sẽ diệt được khoảng 90%
lượng vsv, còn 10% sẽ phát triển nhanh và gây hư hại đồ hộp
Do khâu chuẩn bị đóng hộp:
Nước quả
Quả  rửa sạch ép lấy dịch lọc và pha chế.

Để giảm thiểu vsv xâm nhập đóng chai và thanh trùng bảo quản 0-15oC hoặc
dùng CO2.
Lưu ý: Sau khi thu hái phải sản xuất nhanh để tránh hiện tượng hư hỏng.
+

•
+
+
•
•
•

II.
1.1.
1.2.
-

Câu hỏi lý thuyết
1. Các phương pháp kiểm nghiệm vsv
Thử nghiệm sinh hóa
Thử nghiệm khả năng lên men
Xác định khả năng sử dụng một nguồn cacbon nhất định bởi vi sinh vật phát triển
theo con đường lên men
Sản phẩm tạo thành làm giảm pH môi trường, làm thay đổi nồng độ môi trường
Co2 tạo ra
Môi trường sử dụng : đỏ (pH 7,4)→ vàng (pH 6,8): cùng ngồn Carbon tùy theo
vsv
Thử nghiệm khả năng biến đổi citrate (X)
Xác định khả năng sử dụng citrat làm nguồn carbonhydrat duy nhất của VSV.

-

Sản phẩm tạo thành là CO2 kết hợp với Na+ giải phóng Na-citrat làm kiềm hóa
môi trường, làm thay đổi màu của môi trường.

-

Môi trường Simmons citrat agar chứa chỉ thị bromothymol blue, xanh lục (pH
trung tính), xanh dương (pH>7,6)

- Sau phản ứng:
+ xanh lục: + Xanh dương: +
1.3.

Thử nghiệm catalase

- dùng để phân biệt vsv hiếu khí và kị khí
- vsv hiếu khí có enzym catalase, có khả năng phân giải thành H2O và O2.
- hóa chất: H2O2 30%

1.4.

Thử nghiệm Coagulase

- thường dùng để định danh Staphylococcus. Loài này có khả năng tiết ra enzym
coagulase có tác dụng làm kết tủa các thành phần huyết tương.
- thử nghiệm được thực hành trên phiến kính hay trong ống nghiệm
1.5.

thử nghiệm indol (X)

- thử nghiệm được xác định khả năng chuyển hóa các sản phẩm trung gian của quá trình
oxh thành indol.
- Indol được xác định như phản ứng với thuốc thử p-dimethylaminobenzaldehide tạo
phức hồng
-sau phản ứng:
+ xuất hiện lớp màu nâu trên bề mặt môi trường: +
+ không suất hiện lớp màu: - Vi sinh vaät: E.coli (+), Klebsiella (-), Serratia marcescen (-), Proteus rettgeri (+)


thử nghiệm MR (Methyl Red) (X)

1.6.

- thử nghiệm nhằm phân biệt vsv dựa vào sự khác biệt trong quá trình tạo và duy trì các
sản phẩm có tính acid tạo sự lên men glucose. Vi sinh vật lên men glucose tạo và duy trì
sản phẩm acid, làm đổi màu thuốc thử. Nếu sản phẩm acid tiếp tục biến đổi thành các sản
phẩm trung tính, không làm mất mầu thuốc thử
- chất đổi màu pH môi trường là methyl đỏ
- môi trường thử nghiệm MR-VP
- sau thử nghiêmk:
+ mt chuyển đỏ: +
+ ko mất màu: - chủng vsv: Proteus rettgeri (+), Serratia marcescens (-)
thử nghiệm VP (Voges-Proskauer) (X)

1.7.
-

Phản ứng dùng phân biệt các loại trung hòa vi khuẩn trong ruột Enterobacteriaceae

-

2,3-butanediol Acetoin Diacetyl + α napthol và KOHđỏ

-

Dựa vào sự oxh acetoin được tạo ra từ 2,3-butanediol thành diacetyl. Diacetyl
được xác định và phản ứng kết hợp với guanidine của pepton tạo phức đỏ.

- môi trường thử nghiệm MR-VP
- thuốc thử: Barritt, Koblentz… chứa α napthol và KOH
- Sau thử nghiệm:
+ xuất hiện màu đỏ trên bề mặt môi trường: +
+ bề mặt môi trường ko đổi màu: - vsv: E. coli (-), Enterobacter cloacea (+)
2. Các phương pháp định lượng
2.1.
Phương pháp đếm khuẩn lạc
- Dùng để xác định các loại vsv sống trong mẫu
- Có độ nhạy cao, định lượng vsv ở mật độ thấp
- Có thể định lượng các vsv kích thước nhỏ, di động


2.1.1. Quy trình phân tích coliform, coliform phân và E.coli bằng pp đếm khuẩn lạc

2.1.2.
2.1.3.

Ưu nhược điểm pp đếm khuẩn lạc
Ưu điểm : cấy trong một thể tích lớp nên không bị hao hụt mẫu trong quá trình cấy

Nhược điểm: hạn chế với những vi khuẩn nhạy nhiệt
Công thức tính

 Phương pháp đếm khuẩn lạc trực tiếp

m: số ô lớn
n: độ pha loãng
A: tổng
 Hoặc

N/ml = 0,25.a. 106 TB/ml
a: trung bình cộng số tế bào trong


2.2.
Phương pháp MPN
2.2.1. Ý nghĩa
- Đánh giá số lượng vsv theo số lượng vsv có xác suất lớn nhất hiện diện theo đơn
-

vị thể tích mẫu
Là pp định lượng dựa trên kq định tính của một loạt thí nghiệm được lặp lại ở một
số độ pha loãng khác nhau
Độ chính xác phụ thuộc vào số ống nghiệm lặp lại ở mỗi nồng độ
Dùng để định lượng mọi vsv nuôi trên mt chọn lọc ,c số lần dương tính được ghi
nhận và so sánh với bảng thống kê để đưa ra gia trị ước đoán số lượng vsv trong
mẫu

2.2.2. Quy trình định lượng vsv bằng pp MPN
- Bước 1: chuẩn bị các ống nghiệm có chứa môi trường thích hợp cho sự tăng

-

trưởng của đối tượng vsv cần định lượng
Bước 2: cấy thể tích chính xác dung dịch mẫu ở 3 nồng độ pha lãng bậc 10 liên
tiếp
Bước 3: đem ống nghiệm ủ ở điều kiện thích hợp
Bước 4: quan sát các biểu hiện chứng minh sự phát triển của vsv cần kiểm định
Bước 5: ghi nhận số lượng ống dương tính ở từng độ pha loãng
Bước 6: tra bảng Mac Crady để suy ra mật độ vsv

2.2.3. Quy trình phân tích Colifom chịu nhiệt và E.coli Coliform phân bằng pp

MPN
 Công thức :

R : tỉ lệ khẳng định ( số khuẩn lạc cho thử nghiệm (+) trong ống đem đi thử nghiệm )
C : tổng số khuẩn lạc được chọn
V : thể tích cho vào
n : số hộp petri cấy tại độ pha loãng thứ i
d : hệ số pha loãng tương ứng



3. Quy trình xác định staphylococus aureus bằng phương pháp MPN và phương

pháp đếm khuẩn lạc

-

Phương pháp tính khuẩn lạc

F: hệ số pha loãng tương ứng
Nt: tổng số KL đặc trưng
Na : tổng số KL không đặc trưng


Ht : tỉ số giữa số KL đặc trưng cho thử nghiệm dương tính so với số KL đặc trưng
Ha : tỉ số giữa số KL không đặc trưng cho thử nghiệm dương tính so với số KL
không đặc trưng
4. Định danh vi sinh vật bằng kỹ thuật PCR
4.1.
Khái niệm
- Là phản ứng chuỗi trùng hợp hay "phản ứng khuếch đại gen".
- Là một kỹ thuật nhằm khuyếch đại (tạo ra nhiều bản sao) một đoạn DNA mà
-

không cần sử dụng các sinh vật sống.
Phương pháp PCR cho phép tổng hợp rất nhanh và chính xác từng đoạn DNA
riêng biệt.
Ðây là phương pháp hiện đại và thuận tiện cho việc xác định sự có mặt của một
gen của một đối tượng vi sinh vật với độ chính xác cao
Quy trình

4.2.

-

Quy trình thực hiện phản ứng PCR
+ PCR mix:
• Các thành phần chính tham gia : DNA khuôn mẫu (Template),

Primer , Taq polymerase , dNTP ,
+ PCR
+ Điện di
+ Đọc kết quả


4.3.
-

-

Các thành phần chính tham gia
DNA khuôn mẫu (Template):
+ Được ly trích từ nhiều bộ phận khác nhau của đối tượng nghiên cứu
bằng nhiều phương pháp khác nhau.
+ DNA thực vật thường được ly trích từ mô lá, DNA động vật được ly
trích từ máu, lông, mô …
+ yêu cầu về độ tinh sạch của DNA mẫu không cần cao. để thu được
kết quả tốt nhất nên sử dụng DNA mẫu tinh khiết.
+ Số lượng DNA cần cho một phản ứng PCR khoảng 5-10 ng DNA
thuần khiết. Nồng độ DNA có thể xác định được nhờ sự đo OD (mật
độ quang) ở độ dài sóng 260nm và 280nm
Primer :
Mồi là những đoạn DNA đơn có kích thước từ khoảng 18-30 bps, có
thể bắt cặp theo nguyên tắc bổ sung vào đoạn khởi đầu và đoạn kết
thúc của DNA mục tiêu khi DNA bị biến tính thành sợi đơn bởi
nhiệt. Trong thử nghiệm PCR, mồi có hai vai trò chính :
• Quyết định nên tính đặc hiệu của thử nghiệm
• Khởi động enzyme polymerase
+ Nguyên tắc lựa chọn mồi

• Trình tự của mồi được lựa chọn sao cho không có sự bắt cặp
bổ sung giữa mồi xuôi và mồi ngược.
• Tm của mồi xuôi và mồi ngược không cách biệt quá xa.
+ Có hai loại :
• Primer universal ( không đặc hiệu )
• Primer specific (đặc hiệu) :đặc trưng cho một hoặc một số đối
tượng
Taq polymerase :
+ cần cho quá trình tổng hợp DNA không chịu được nhiệt độ lớn hơn
90ºC ở giai đoạn tách hai sợi của phân tử DNA.
+
dNTP (dATP, dCTP, dTTP, dGTP):
+ là đơn vị để có thể tổng hợp được các bản sao của DNA mục tiêu.
+ cấu tạo gồm một đường deoxyribose có gắn một base, bao gồm dATP,
dTTP, dCTP, dGTP
+ Năng lượng để cho phản ứng này xảy ra được lấy từ các nối phosphate giàu
năng lượng của triphosphate trên dNTP.
+ Bốn loại nucleotide thường được sử dụng ở nồng độ là 20 - 200µM/ mỗi
loại.
+

-

-


Nồng độ cao hơn dễ dẫn tới khuếch đại “kí sinh”. Sự mất cân bằng trong
thành phần các nucleotide sẽ làm tăng các lỗi sao chép của enzyme
polymerase.
- Buffer & MgCl2 :

+ Buffer : Tạo môi trường thuận thích hợp nhất để Taq polymerase hoạt
động.
+ MgCl2 :Tạo điều kiện thuận lợi cho Taq polymerase hoạt động
5. Quá trình tách chiết DNA
- Giai đoạn 1: Phá vỡ tế bào bằng phương pháp vật lí hay hóa học.
• Tuỳ từng loại tế bào, có cấu tạo thành và và màng tế bào khác nhau, chọn
phương pháp áp dụng thích hợp, riêng lẽ hay phổi hợp.
• Thông thường người ta nghiền tế bào, mô trong một hợp chất tẩy (SDS)  phá
vỡ màng tế bào và màng nhân, giải phóng DNA ra khỏi môi trường.
- Giai đoạn 2: Loại bỏ các thành phần không mong muốn trong mẫu (protein, lipit,
polysaccharide, RNA...) chủ yếu là protein  Thêm proteinase K, Rnase  phân
hủy protein, RNA
- Giai đoạn 3: thu DNA
Nhằm thu nhận NA dưới dạng cô đặc, một mặt nhằm bảo vệ chúng khỏi sự phân
huỷ của các enzyme, mặt khác đế có thể hoà tan chúng lại trong dung dịch theo nồng
độ mong muốn
+

6. điện di sản phẩm DNA
•
•
•
•

Tách các hạt tích điện như ADN, ARN, protein...
Các phân tử nucleic acid tích điện âm và khi đặt chúng trong một điện trường 
sẽ di chuyển từ cực âm sang cực dương
Tiến hành điện di trên bản gel , các phần tử này sẽ dịch chuyển qua các lỗ gel để
đến cực dương
Các hạt có kích thước nhỏ dễ dàng di chuyển qua các lỗ gel, các hạt có kích thước

lớn thì di chuyển chậm hơn  có thể phân tách các hạt tích điện này theo kích
thước bằng cách điện di trên gel.

7. Các vùng gen dùng để định danh vi khuẩn, nấm
7.1.
Vi khuẩn-vùng rDNA 16s

- gen 16S rDNA được bảo tồn ở mức độ cao trong phạm vi từng loài và giữa các loài
được phân vào chung “giống”, và như vậy, việc PCR trình tự rDNA 16S có thể được
dùng như là một công nghệ mới cho việc định danh vi khuẩn đến mức độ loài.
- kích thước tối đa là 1500bp, có 9 vùng nhỏ đều có ý nghĩa định danh


7.2.

Nấm mốc-vùng ITS (Internal transcribed spacer)

- Nằm giữa các RNA cấu trúc của ribosom
- Có tính bảo tồn cao
- Không tham gia mã hóa protein
- Có ý nghĩa trong phân loại nấm mốc và thực vật
- thang chuẩn đo giao động 700-800 bp
7.3.

Nấm men-vùng rDNA 28S

Chiều dài khoảng 200-300bp