Screening of mycosporine like compounds in the dermatocarpon genus phytochemical study of the lichen dermatocarpon luridum (with ) j r laundon

ANNÉE 2014

THÈSE / UNIVERSITÉ DE RENNES 1
sous le sceau de l’Université Européenne de Bretagne
pour le grade de

DOCTEUR DE L’UNIVERSITÉ DE RENNES 1
Mention : Chimie

Ecole doctorale Sciences De La Matière

Thi Thu Tram NGUYEN
Préparée dans l’unité de recherche UMR CNRS 6226
Equipe PNSCM (Produits Naturels Synthèses Chimie Médicinale)
(Faculté de Pharmacie, Université de Rennes 1)

Screening of
mycosporine-like
compounds in the
Dermatocarpon genus.
Phytochemical study
of the lichen
Dermatocarpon luridum
(With.) J.R. Laundon.

Thèse soutenue à Rennes
le 19 décembre 2014
devant le jury composé de :

Marie-Dominique GALIBERT
Professeur à l’Université de Rennes 1 / Examinateur

Holger THÜS
Conservateur au Natural History Museum Londres /
Rapporteur

Erwan AR GALL
Mtre de conférences à l’Université de Bretagne
Occidentale / Rapporteur

Kim Phi Phung NGUYEN
Professeur à l’Université des sciences naturelles
d’Hơ-Chi-Minh-Ville Vietnam / Examinateur

Marylène CHOLLET-KRUGLER
Mtre de conférences à l’Université de Rennes1 /
Co-directeur de thèse

Joël BOUSTIE
Professeur à l’Université de Rennes 1 / Directeur de
thèse



Remerciements
En premier lieu, je tiens à remercier Monsieur le Dr Holger Thüs et Monsieur le Dr Erwan
Ar Gall d’avoir accepté d’être les rapporteurs de mon manuscrit, ainsi que Madame la
Professeure Marie-Dominique Galibert d’avoir accepté de participer à ce jury de thèse.
J’exprime toute ma gratitude au Dr Marylène Chollet-Krugler pour avoir guidé mes pas
dès les premiers jours et tout au long de ces trois années. Je la remercie particulièrement pour
sa disponibilité et sa grande gentillesse, son écoute et sa patience. Sa parfaite mtrise

scientifique et ses idées qui m’ont si souvent sortie de l’embarras et parfois des impasses.
Je remercie très sincèrement le Professeur Joël Boustie, mon directeur de thèse, de
m’avoir accueillie dans son laboratoire et de m’avoir permis d’accéder à l’univers passionnant
de la chimie des lichens. Je lui suis reconnaissante de m’avoir laissée une grande liberté afin
que je puisse développer mes propres idées au cours de cette thèse. Je le remercie vivement de
sa disponibilité et de sa rigueur scientifique qui m'ont permis de travailler dans les meilleures
conditions.
Je remercie chaleureusement Madame la Professeure Kim Phi Phung Nguyen, qui a été
ma directrice de master recherche au Vietnam. C’est auprès d’elle que j’ai acquis mes
premières connaissances en chimie des produits naturels et en chimie moléculaire. C’est
également grâce à son aide que j’ai pu rencontrer le Professeur Joël Boustie.
Je tiens également à exprimer ma gratitude à l’ensemble de l’équipe qui m’a soutenue
ces trois années, pour leurs conseils avisés, leurs remarques pertinentes, leur écoute, leur aide
et leur gentillesse. Ils ont fait de ce travail le fruit d’une véritable réflexion collective. Je
voudrais adresser plus particulièrement tous mes remerciements Franỗoise pour mavoir
guidộe dans la rộalisation des tests biologiques afin de valoriser les molécules que j'avais
isolées. Merci à Aurélie de m’avoir expliqué le fonctionnement des appareillages les premiers
jours et de m’avoir procuré les produits chimiques dont j’avais besoin. Isabelle et Solenn, merci
pour votre aide dans la réalisation des tests biologiques. Merci à Sophie et à Béatrice pour vos
relectures. Merci à Audrey de m’avoir donné l’accès aux herbiers (H. des Abbayes et L. J-C.
Massé). Anne-Cécile, Claudia, David, Maryse, Marie-Laurence, Patricia, Philippe, Pierre,

i


Michèle, Gilles, Nicolas, Jacques, Myriam, Mickaël, Jeff, Jean-Charles un grand merci à tous
d’avoir été là pour moi.
J’adresse mes remerciements sincères à Monsieur Jean-Yves Monnat, Biologiste à
l’Université de Bretagne Occidentale (Brest, France) pour m’avoir aidée à collecter et identifier
les lichens. Je remercie ộgalement les autres membres de lAssociation Franỗaise de

Lichộnologie pour m’avoir fourni des échantillons de Dermatocarpon.
Je remercie Isabelle Gallais et le Pr. Odile Sergent (UMR Inserm 1085, IRSET,
Université de Rennes 1) pour la réalisation des tests antioxydants portant sur la peroxydation
lipidique.
Je tiens également à exprimer ma reconnaissance à tout le personnel du CRMPO pour les
analyses de masse effectuées sur les produits que j'avais isolées.
Merci à tous les étudiants et post-doctorants pour les discussions et les agréables
moments: Pierre, Delphine, Nathalie, Friardi, Maïwenn, Sarah Komaty et Vianney.
Je remercie tous mes amis vietnamiens, surtout Binh, Duy, Linh, Tu, Hung, Huyen et Ha,
qui ont partagé ma vie au quotidien pendant mon séjour en France. Un grand merci à Tam pour
ton aide sur les analyses statistiques.
J’exprime toute ma gratitude envers le Gouvernement vietnamien pour l'attribution de la
bourse qui m’a permis de mener cette thèse. Je remercie également le laboratoire du professeur
Joël Boustie pour le complément de financement qui a permis la réalisation de ce travail en
France.
Je remercie du fond du cœur ma famille pour leurs encouragements et leur soutien au
quotidien. Merci à mes parents qui ont tant fait pour moi. Merci à mon frère né et à ma sœur
pour notre complicité. J’ai une pensée toute particuliốre pour mon petit garỗon Khanh, qui ma
fait sourire dans les moments difficiles; à ma belle-sœur Thuy qui m’a aidée dans les dộmarches
administratives surtout quand cộtait en franỗais; mon mari Thien pour ses encouragements,
son dévouement auprès de notre fils pendant mon absence et son amour inconditionnel.
Enfin merci à tous ceux qui liront cette thèse pour l’intérêt qu’ils porteront à mon travail…

ii


Table of Contents
Remerciements .......................................................................................................................... i
Table of Contents ................................................................................................................... iii
List of abbreviations ..............................................................................................................vii

List of Tables ........................................................................................................................... ix
List of Figures .......................................................................................................................... xi
Résumé en franỗais ................................................................................................................ xv
Introduction .............................................................................................................................. 1
CHAPTER 1: LICHENS AND PHOTOPROTECTION ..................................................... 3
1 Presentation of lichens ................................................................................................... 5
1.1 Definition ................................................................................................................ 5
1.2 Thallus morphology and anatomy........................................................................... 5
1.3 Symbiosis ................................................................................................................. 8
1.4 Chemical compounds ............................................................................................... 9
2 Photoprotective responses of lichens ........................................................................... 11
2.1 Harmful effects of UV radiation ............................................................................ 11
2.2 Photoprotective mechanisms .................................................................................. 12
2.2.1 Screening mechanism ................................................................................ 13
2.2.2 Quenching mechanism .............................................................................. 13
2.2.3 Repair mechanism ..................................................................................... 15
2.3 Chemical features of UV absorbing compounds ................................................... 15
3 Mycosporines and MAAs – natural photoprotectants .................................................. 18
3.1 History .................................................................................................................... 18
3.2 Characteristics ........................................................................................................ 19
3.3 Biosynthesis ........................................................................................................... 22
3.4 Role of mycosporine-like compounds in nature .................................................... 23
3.5 Mycosporine-like compounds in lichens ............................................................... 24
CHAPTER 2: SCREENING AND QUANTIFICATION OF MYCOSPORINE-LIKE
COMPOUNDS IN THE DERMATOCARPON GENUS ...................................... 29
Purpose of this study ......................................................................................................... 31
1 Screening of mycosporine-like compounds ................................................................. 33
1.1 Materials and methods ........................................................................................... 33
1.1.1 Lichen material .......................................................................................... 33
1.1.2 Extraction and purification of mycosporine-like compounds ................... 40

1.1.3 HPTLC-UV spectrophotodensitometry and HPLC-DAD-MS analysis .... 42
1.1.4 Esterification conditions of mycosporine glutamicol ................................ 43
1.2 Results and discussion ........................................................................................... 44
1.2.1 Extraction and purification of mycosporine-like compounds ................... 44
1.2.2 HPTLC-UV spectrophotodensitometry ..................................................... 45
1.2.3 HPLC-DAD-MS analysis .......................................................................... 46
iii


1.2.4 Esterification conditions of mycosporine glutamicol ................................ 48
2 Quantification of mycosporines ................................................................................... 53
2.1 Materials and methods ........................................................................................... 53
2.1.1 Lichen materials ........................................................................................ 53
2.1.2 Extraction of mycosporines ....................................................................... 54
2.1.3 Quantification of mycosporines ................................................................ 55
2.2 Results and discussion ........................................................................................... 56
3 Experimental ................................................................................................................ 60
3.1 Identification of mycosporines and MAAs ............................................................ 60
3.1.1 Extraction and purification of mycosporines and MAAs .......................... 60
3.1.2 Analysis ..................................................................................................... 60
3.2 Quantification of mycosporines ............................................................................. 61
3.2.1 Extraction of mycosporines ....................................................................... 61
3.2.2 Mycosporines standards ............................................................................ 61
3.2.3 Internal standard ........................................................................................ 61
3.2.4 Validation of analytical procedure ............................................................ 62
3.2.5 HILIC-HPLC-DAD analysis ..................................................................... 62
CHAPTER 3: PHYTOCHEMICAL STUDY ON DERMATOCARPON LURIDUM
(WITH.) J.R. LAUNDON ....................................................................................... 63
Purpose of this study ......................................................................................................... 65
1 Description of Dermatocarpon luridum (With.) J.R. Laundon ..................................... 66

1.1 Ecology .................................................................................................................. 66
1.2 Botany and description........................................................................................... 67
1.3 Chemical studies .................................................................................................... 68
2 Materials and methods ................................................................................................. 70
2.1 Lichen material....................................................................................................... 70
2.2 Extraction ............................................................................................................... 70
2.3 Purification ............................................................................................................. 71
2.3.1 Mycosporines ............................................................................................ 71
2.3.2 Other isolated compounds ......................................................................... 73
2.4 Determination of physico-chemical properties of mycosporines........................... 73
2.4.1 The molar extinction coefficient ............................................................... 73
2.4.2 pKa values .................................................................................................. 73
3 Results and discussion ................................................................................................. 75
3.1 Mycosporines ......................................................................................................... 76
3.1.1 Extraction and purification ........................................................................ 76
3.1.2 Structure elucidation .................................................................................. 79
3.1.3 Determination of physico-chemical properties ......................................... 83
3.2 Other isolated compounds ...................................................................................... 87
3.2.1 Isolation ..................................................................................................... 87
3.2.2 Structure elucidation .................................................................................. 89
4 Experimental ................................................................................................................ 96
iv


4.1 Extraction ............................................................................................................... 96
4.2 Purification and identification of mycosporines .................................................... 96
4.2.1 Purification on cation exchange resin........................................................ 96
4.2.2 Purification by CPC ................................................................................... 96
4.2.3 A new purification protocol....................................................................... 97
4.2.4 Sources, physico-chemical and spectroscopic data ................................... 99

4.3 Other isolated compounds .................................................................................... 107
4.3.1 Purification and identification ................................................................. 107
4.3.2 Structure elucidation ................................................................................ 109
4.4 Determination of the (ε) and pKa values of the isolated mycosporines .............. 122
4.4.1 The molar absorption coefficient............................................................. 122
4.4.2 pKa values ................................................................................................ 122
CHAPTER 4: BIOLOGICAL TESTS AND PHOTOPROTECTIVE EVALUATION125
Purpose of this study ....................................................................................................... 127
1 Cytotoxic activity ....................................................................................................... 129
2 Photoprotective activity ............................................................................................. 130
2.1 UV-filters ............................................................................................................. 131
2.2 Cytotoxic and phototoxic activities ...................................................................... 134
2.3 Antioxidant activity.............................................................................................. 135
2.3.1 DPPH and NBT assays ............................................................................ 136
2.3.2 Lipid peroxidation assay.......................................................................... 137
2.4 Photostability under UVA and UVB.................................................................... 140
3 Experimental .............................................................................................................. 142
3.1 Cytotoxic activity ................................................................................................. 142
3.2 UV filters.............................................................................................................. 142
3.2.1 Emulsion preparation............................................................................... 142
3.2.2 Sample preparation .................................................................................. 143
3.2.3 Measurements and calculations ............................................................... 143
3.3 Antioxidant activity.............................................................................................. 145
3.3.1 DPPH assay ............................................................................................. 145
3.3.2 NBT assay ............................................................................................... 145
3.3.3 Lipid peroxidation assay.......................................................................... 146
3.4 Cytotoxic and phototoxic activities ...................................................................... 148
3.5 Photostability under UVA and UVB.................................................................... 149
Discussion–Conclusion ........................................................................................................ 151
References ............................................................................................................................. 157

General experimental procedures ...................................................................................... 169
Appendix ............................................................................................................................... 173

v


vi


List of abbreviations
1D
2D
Ac
ACN
AcOH
aq.
AUC
brs
BuOH
calcd
CC
CHCl3
CH2Cl2
COSY
CPC
d
dd
D2O
DEPT
DL1

DL2
DM1
DM2
DMSO
DNA
dw.
Eq.
EtOAc
EtOH
F.C
h
HILIC
HMBC
HPLC
HPLC-DAD-MS
HPTLC-UV
HRMS-ESI
HSQC
IR
IS
m
MAAs

one dimensional
two dimensional
Acetone
Acetonitrile
Acetic acid
aqueous
Area Under the Curve

broad singlet
n-Butanol
calculated
Silica gel Column Chromatography
Chloroform
Dichloromethane
Correlation Spectroscopy
Centrifugal Partition Chromatography
doublet
doublet of doublets
Deuterium Oxide
Distortionless Enhancement by Polarisation Transfer
crude aq. extract of D. luridum
semi-purified aq. extract of D. luridum
crude aq. extract of D. miniatum
semi-purified aq. extract of D. miniatum
Dimethyl sulfoxide
Deoxyribonucleic acid
dry weight
Equation
Ethyl Acetate
Ethanol
Flash Chromatography
hours
Hydrophilic Interaction Liquid Chromatography
Heteronuclear Multiple Bond Correlation Spectroscopy
High Performance Liquid Chromatography
High Performance Liquid Chromatography coupled to a Diode Array
Detector and a Mass Spectrometer
High Performance Thin Layer Chromatography coupled to a

spectrophotodensitometer
High Resolution Mass Spectrum Electrospray Ionization
Heteronuclear Single Quantum Correlation spectroscopy
Infrared Spectrophotometry
Internal Standard
multiplet
Mycosporine-like Amino Acids

vii


MDA
Me
MeOH
min
m.p
MS
NMR
PE
ppm
Prep. HPLC
Prep. TLC
q
ROS
rpm
rt
s
t
TLC
Tol

UV

Malondialdehyde
Methyl
Methanol
minutes
melting point
Mass Spectrum
Nuclear Magnetic Resonance
Petroleum Ether
parts per million (chemical shift value)
Preparative High Performance Liquid Chromatography
Preparative Thin-Layer Chromatography
quartet
Reactive Oxygen Species
round per minute
room temperature
singlet
triplet
Thin Layer Chromatography
Toluene
ultraviolet

viii


List of Tables
Table 1: Mycosporine-like compounds distribution in lichens ...................................... 26
Table 2: Collected samples data for screen mycosporine-like compounds .................... 34
Table 3: Morphological comparison of the four Dermatocarpon species ..................... 36

Table 4: Physico-chemical properties and mass fragmentation of 1, 2 and 3 ................ 51
Table 5: Linearity validation results of mycosporines 1 and 2 ...................................... 57
Table 6: List of metabolites isolated from D. luridum ................................................... 76
Table 7: pKa and molar extinction coefficient values of mycosporines 1 and 3 ............ 86
Table 8: Summary of the collected tubes corresponding to the mode used in CPC
experiment ........................................................................................................ 97
Table 9: Preparation of buffer solutions with pH>2 ..................................................... 122
Table 10: Preparation of buffer solutions with pH<2 ................................................... 123
Table 11: Measured absorbance at 310 nm depending on pH of two mycosporines 1 and
3 (n=6) ............................................................................................................ 124
Table 12: IC50 values for compound 7 on the eight cell lines and selectivity indexes (SI)
relative to HaCaT and Fibroblast ................................................................... 130
Table 13: Absolute, relative indexes and predicted results of the aq. extracts along with
the three mycosporines comprared to three commercialized UV filters ........ 133
Table 14: Cytotoxicity and phototoxic activities of aq. extracts and mycosporines .... 135

ix


x


List of Figures
Figure 1: Major growth forms of lichen ........................................................................... 5
Figure 2: Structure thallus homoeomerous (a) and heteromerous (b) .............................. 7
Figure 3: Reproductive organs of lichens ......................................................................... 7
Figure 4: The nutritional exchange between partners of lichens ...................................... 8
Figure 5: Probable pathways leading to the major groups of lichen products ............... 10
Figure 6: Electromagnetic spectrum of UV radiation and biologic effects .................... 12
Figure 7: Defence strategies adopted by lichens to counteract the harmful effects of UV

radiation ....................................................................................................... 12
Figure 8: Two major xanthophyll cycles involved in the dissipation of excess light energy
..................................................................................................................... 14
Figure 9: UV absorption characteristics of common functional groups......................... 16
Figure 10: Chemical structures of compounds from lichens reported as UV screens .... 17
Figure 11: Organisms contain mycosporines and MAAs............................................... 19
Figure 12: Structure characteristics of oxo- and imino-mycosporines ........................... 20
Figure 13: Common fungal mycosporines (a) and MAAs from marine organisms (b):
structures, chemical and spectroscopic characteristics ................................ 21
Figure 14: Postulated convergent pathways of MAAs biosynthesis in cyanobacteria ... 22
Figure 15: The two different habitats of the four Dermatocarpon species investigated 33
Figure 16: Purification process of lichen crude aq. extract by cation exchange resin
Dowex chromatography .............................................................................. 42
Figure 17: TLC profile of D. miniatum extracts before and after using NaCl in Dowex
purification chromatography ....................................................................... 44
Figure 18: Comparative amounts (dry residue weight) of aq. extracts obtained from 100
mg lichen material ....................................................................................... 45
Figure 19: The obtained UV absorption profiles of each extract screened by
spectrophotodensitometry (C = 1 mg/mL) .................................................. 46
Figure 20: (a) and (b): PDA chromatogram of crude aq. extract and semi-purified aq.
extract of D. miniatum; (c), (d), (e): UV spectra of mycosporines 1, 2, and
3; (f), (g), and (h): MS spectra of mycosporines 1, 2, and 3, respectively .. 49
Figure 21: The proposed fragmentation patterns of mycosporines 1, 2 and 3 ............... 50
Figure 22: UV absorption profiles obtained in different conditions investigating
esterification by spectrophotodensitometry (C = 1 mg/mL) ....................... 52
Figure 23: View of lichens samples analysed from H. des Abbayes herbarium (a) and
Natural History Museum (London, UK) (b) for mycosporines quantification
..................................................................................................................... 54
Figure 24: Biphasic solvent distribution at silica surface in HILIC mode ..................... 55
Figure 25: HILIC-HPLC chromatogram of D. miniatum (UV detector at 310 nm) and

inset absorbance spectra of compounds 1 and 2 .......................................... 56
Figure 26: Calibration curves of mycosporine 1 (a) and mycosporine 2 (b).................. 57

xi


Figure 27: Information of Dermatocarpon species in H. des Abbayes herbarium before
and after analysis ......................................................................................... 59
Figure 28: Distribution of D. luridum in France ............................................................ 66
Figure 29: D. luridum on submerged rock (a), macroscope observation of dried thallus
(b), microscope observation of thallus transverse cut stained with cotton blue
(c) ................................................................................................................. 67
Figure 30: Polyol and steroid constituents in the Dermatocarpon genus ...................... 68
Figure 31: Free amino acids in the Dermatocarpon genus ............................................ 69
Figure 32: Carotenoids in the Dermatocarpon genus .................................................... 70
Figure 33: Kromaton Technologies FCPC 50mL apparatus .......................................... 72
Figure 34: Extraction procedure of Dermatocarpon luridum ........................................ 75
Figure 35: The TLC profile of semi-purified aq. extract of D. luridum using CPC in
multiple dual mode ...................................................................................... 78
Figure 36: A novel isolation protocol of mycosporines from aq. extract of D. luridum 80
Figure 37: IR spectra of mycosporines 1 (a), 2 (b) and 3 (c) ......................................... 81
Figure 38: 1H NMR spectrum of 3 (D2O, 300 MHz) ..................................................... 82
Figure 39: 13C NMR spectrum of 3 (D2O, 75 MHz) ...................................................... 82
Figure 40: Key 1H-1H COSY (bold line) and HMBC (1H→13C) correlations of 3 ........ 83
Figure 41: UV spectra of compounds 1, 2 and 3 at C= 2.5×10-5M in water .................. 83
Figure 42: UV spectra of mycosporine 3 at pH range from -1 to 7 (C= 1.56×10-5M) ... 84
Figure 43: UV spectra of mycosporine 1 at pH range from -1 to 3.84 (C0= 6.82×10-5M)
..................................................................................................................... 85
Figure 44: UV spectra of mycosporine 3 at pH range from -1 to 3.62 (C0= 1.56×10-5M)
..................................................................................................................... 85

Figure 45: Resonance delocalization of the base form B ............................................... 86
Figure 46: Distribution diagramm of mycosporines 1 or 3 ............................................ 87
Figure 47: Isolation procedure of ten compounds from D. luridum............................... 88
Figure 48: Three possible structures (a): -L-glutamylglycine, (b): -L-glutamylglycine
and (c) of dipeptide 6 ................................................................................... 91
Figure 49: The similar fragmentation patterns observed of two structures (a) and (b) .. 91
Figure 50: Key 1H–1H COSY (bold line) and HMBC (1H→13C) correlations of
compound 7 ................................................................................................. 92
Figure 51: ESI-MS fragmentation of 8 ........................................................................... 94
Figure 52: Galactosylceramides isolated in lichen Ramalina celastri (Gal: galactose) . 95
Figure 53: 1H NMR spectrum of 2 (D2O, 500 MHz) ................................................... 103
Figure 54: 13C NMR spectrum of 2 (D2O, 125 MHz) .................................................. 103
Figure 55: 1H-1H COSY NMR spectrum of 3 .............................................................. 106
Figure 56: HSQC NMR spectrum of 3 ......................................................................... 106
Figure 57: HMBC NMR spectrum of 3 ........................................................................ 107
Figure 58: 1H NMR spectrum of 4 (D2O, 300 MHz) ................................................... 110
Figure 59: 13C NMR spectrum of 4 (D2O, 75 MHz) .................................................... 110
Figure 60: 1H NMR spectrum of 6 (D2O, 300 MHz) ................................................... 113
Figure 61: 13C NMR spectrum of 6 (D2O, 75 MHz) .................................................... 113
xii


Figure 62: 1H NMR spectrum of 7 (CDCl3, 300 MHz) ................................................ 116
Figure 63: 13C NMR spectrum of 7 (CDCl3, 75 MHz)................................................. 116
Figure 64: 1H NMR spectrum of 8 (pyridine-d5, 500 MHz) ........................................ 119
Figure 65: 13C NMR spectrum of 8 (pyridine-d5, 125 MHz) ....................................... 119
Figure 66: HSQC NMR spectrum of 8 ......................................................................... 120
Figure 67: Cytotoxicity of compounds 2, 3, 4, 6, 7 and 8 against eight cell lines at C =
25µM ......................................................................................................... 129
Figure 68: Cross section of the skin and penetration of sunlight radiation into the tissues

................................................................................................................... 131
Figure 69: Principal component analysis (PCA) of the tested compounds and extracts
discriminating UV absorbing properties ................................................... 133
Figure 70: Mycosporine contents in crude aq. extract and semi-purified aq. extract of D.
luridum and D. miniatum ........................................................................... 134
Figure 71: Antioxidant activity of the aq. extracts and three mycosporines 1, 2, 3 through
DPPH and NBT methods compared to the positive control quercetin ...... 137
Figure 72: Proposed model for the role of early ROS-induced fluidizing effect of ethanol
in the amplification of oxidative stress ...................................................... 138
Figure 73: Effect of DM2 extract (5.20 µg/mL) and mycosporine 3 (4.00 µg/mL ~ 12
µM) on WIF-B9 cell line by ethanol-induced lipid peroxidation assay .... 139
Figure 74: HPLC chromatograms of trolox (left) and mycosporine 1 (right) .............. 141
Figure 75: Solution preparation for UV-filters test ...................................................... 143
Figure 76: Reaction leads to the formation of superoxide anion .................................. 145

xiii


xiv


Rộsumộ en franỗais
INTRODUCTION
Notre ộtude sinscrit dans lune des thộmatiques de l’équipe PNSCM, consacrée aux
substances naturelles lichéniques et à leurs applications dans le domaine de la photoprotection.
Pour en comprendre le lien, il faut s’intéresser d’un peu plus près aux lichens. Les lichens sont
des organismes symbiotiques constitués de l’association entre une algue verte et/ou une
cyanobactérie (photosymbiote), un champignon (mycosymbiote) et des bactéries associées [1].
Ils sont apparus il y a environ 680 millions d’années, primitivement aquatiques ils ont réussi à
s’adapter au milieu terrestre. Notre attention s’est particulièrement portée sur le fait qu’ils

résistent bien à des conditions écologiques extrêmes, tel un ensoleillement intense, des
températures extrêmes, une dessiccation importante... En effet cette association leur confère
une structure unique : le thalle lichénique. Cette symbiose leur confère aussi une reproduction
différente comparée à celle de chaque organisme seul, un métabolisme spécifique avec la
production de métabolites secondaires généralement originaux. Ils sont aussi capables de
stopper leur métabolisme lorsqu’ils sont à l’état sec pour reprendre leur activité lorsque les
conditions hydriques redeviennent favorables. En réponse aux radiations UV, ils ont
notamment développé au cours du temps des systèmes de protection efficaces tels que la
production de composés aromatiques polyfonctionalisés [2]. Récemment, une autre classe de
photoprotecteurs, connus dans d’autres branches du monde vivant, a été décelée au sein des
lichens. Il s’agit des mycosporines et des MAAs (Mycosporine-like Amino Acids). Le chapitre
1 sera donc consacré à la description des lichens, aux mécanismes de photoprotection qu’ils
ont mis en place et à la présentation des mycosporines et MAAs.
Récemment au laboratoire, un protocole de criblage de ces molécules particulières a été
mis au point dans les lichens [3] et a permis de mettre en évidence la présence de ces composés
uniquement dans des cyanolichens, organismes issus de la symbiose entre un champignon et
une cyanobactérie. Alors que les chlorolichens (cyanobactérie remplacée par une algue verte)
correspondent à 90% des espèces de lichens, aucun composé de type mycosporine n’y a été
jusqu’ici détecté. La poursuite de ce criblage nous a donc semblé importante pour plusieurs
raisons : recherche de nouvelles mycosporines, confirmation de leur intérêt en tant que
marqueurs chimiotaxonomiques de différents genres et élucidation de leur biogenèse au sein

xv


de l’association lichénique. Une étude préliminaire sur deux chorolichens et deux cyanolichens
a permis de repérer la présence de composés de type mycosporine dans les deux cyanolichens
mais aussi dans un des deux chlorolichens. Ce repérage inédit de mycosporines dans un
chlorolichen : Dermatocarpon luridum nous a amené à focaliser notre étude sur ce genre et tout
particulièrement cette espèce qu’il était possible de collecter en quantité suffisante en Bretagne

pour une étude phytochimique. Il s’agit d’un lichen foliacé saxicole hydrophile appartenant au
genre Dermatocarpon (Verrucariaceae), vivant sur les rochers retrouvés dans des milieux
fréquemment inondés comme les cours d’eau. Nous avons aussi décidé de poursuivre ce
criblage sur les trois autres Dermatocarpon aquatiques/semi-aquatiques présents en Bretagne :
D. meiophyllizum, D. leptophyllodes et D. miniatum. Si D. miniatum a un habitat un peu
différent [4] elles contiennent toutes l’algue verte Diplosphaera chodatii (Trebouxiophyceae)
comme photobionte.
Dans le chapitre 2, nous présentons le résultat du criblage. Celui-ci doit nous permettre
de confirmer ou non la présence de composés types mycosporines dans les trois autres espèces,
de confirmer aussi leur intérêt en tant que marqueurs chimiotaxonomiques et d’avancer
d’éventuelles hypothèses sur leur biogénèse. Nous espérons pouvoir aussi faire un lien entre
l’écologie du lichen, la date de la collecte et leur contenu en mycosporines. Pour cela nous
avons cherché à mettre au point une méthode de quantification des mycosporines à partir d’une
faible biomasse. Nous avons eu l’opportunité de collaborer avec le Dr. Holger Thüs,
conservateur de l’herbier lichen au Natural History Museum de Londres, spécialiste des
Verrucariaceae qui nous a fourni 49 échantillons mis en herbier depuis plus de 170 ans. Cette
étude a été complétée avec 30 échantillons provenant de l’herbier de Rennes (herbiers des Pr.
Henry des Abbayes et Dr. Louis, Jean-Claude Massé) et 15 échantillons récoltés depuis moins
de 10 ans. Nous avons aussi visé à démontrer qu’un herbier peut être une source importante
d’informations pour nos études, au-delà de ses fonctions habituelles.
Suite à ce criblage, Dermatocarpon luridum (With.) J.R. Laundon 1984, en quantité
suffisante dans le Finistère et espèce non menacée [69], est choisi afin de l’étudier plus en détail
d’un point de vue phytochimique (chapitre 3). Nous espérons ainsi isoler les mycosporines
détectées au cours du criblage, préciser leur structure et déterminer de nouvelles propriétés
spectroscopiques et physicochimiques. L’étude phytochimique doit aussi nous permettre
d’identifier d’autres métabolites originaux, étant donné qu’aucun composé polyphénolique
habituellement retrouvé dans les lichens n’a été à ce jour décrit dans le genre Dermatocarpon.
xvi

Dans le cadre d’une évaluation dans le domaine de la photoprotection, le chapitre 4 est
consacré aux activités biologiques des composés isolés en quantité suffisante ainsi que
d’extraits aqueux de deux espèces de Dermatocarpon. Un test préliminaire consistera à évaluer
leur activité cytotoxique sur 8 lignées cellulaires sur la plateforme ImPACcell à l’Université
de Rennes 1. Outre leur intérêt possible dans le traitement du cancer pour les composés
hautement cytotoxiques, le profil cytotoxique sur un panel de lignées cellulaires est une
première étape importante pour sélectionner les composés ainsi que la dose appropriée pour
d'autres tests. En ce qui concerne l’évaluation des capacités photoprotectrices, un premier test
consistera à évaluer leur capacité en tant que filtre UV. Ensuite leur phototoxicité sur cellules
non tumorales de kératinocytes humains, soumises à des radiations UVA, sera étudiée.
L’oxydation au sein des systèmes biologiques fait appel à différents processus. Trois tests in
vitro et in cellulo, mettant en jeu des mécanismes différents, seront donc réalisés pour
déterminer l’activité antioxydante des composés et extraits. Enfin, dans le but de confirmer leur
potentielle utilisation en tant photoprotecteur d’origine naturelle, leur photostabilité sous
irradiations UVA et UVB sera évaluée.
Indépendamment de notre contribution au profilage chimique du genre Dermatocapon,
avec l'accent mis sur la présence de mycosporines, nous espérons que ce travail apportera de
nouvelles perspectives dans le métabolisme des lichens et qu’il soulignera l'intérêt général des
lichens comme une source prometteuse de substances biologiquement actives.

CHAPITRE 1: LICHENS ET PHOTOPROTECTION
Afin de mieux présenter les espèces sur lesquelles nous avons travaillé et le cadre de
nos travaux, ce chapitre donne quelques précisions sur les lichens et leurs métabolites en
mettant l’accent sur les propriétés photoprotectrices de quelques métabolites. Dans la symbiose
lichénique, le mycosymbiote est le partenaire englobant le photosymbiote dans une structure
originale : le thalle lichénique. Il présente une grande diversité de formes et de couleurs et peut
aussi porter un certains nombres d’organes divers. On distingue 3 grands groupes de thalles
pour les macrolichens en fonction de leur forme : crustacés, foliacés et fruticuleux [5]. Le
mycosymbiote appartient au groupe des ascomycètes (98%) et plus rarement au groupe des
basidiomycètes (2%). Quant aux photosymbiotes, les plus fréquents sont les algues vertes des

xvii


genres Trebouxia et Trentepohlia, et la cyanobactérie du genre Nostoc. On décrit environ 18500
espèces de lichens dans le monde colonisant tous les milieux terrestres [6]. Certains lichens
appelés tripartites (moins de 5%) incorporent les deux photosymbiotes : algue verte et
cyanobactérie. Au sein de l’association, le champignon assure la protection physique à
l’ensemble et fournit au photosymbiote l’eau, les sels minéraux et la vitamine C. Le
photosymbiote apporte de son côté la matière organique carbonée sous forme de glucose ou
polyols et fait du lichen un organisme autotrophe (Figure 4). Les métabolites lichéniques
secondaires résultent de différentes voies de biogénèse, la majorité d’entre eux dérivent de la
voie des acétates polymalonates, les voies de biogénèse de l’acide shikimique et de l’acide
mévalonique sont également présentes (Figure 5). Le nombre de substances lichéniques
identifiées à ce jour dépasserait les 1050 [14].
En réponse aux radiations UV, les lichens ont développé des systèmes de protection
efficaces mettant en œuvre des mécanismes physiologiques et biochimiques (Figure 7). Parmi
ceux-ci on peut citer la production et l’accumulation de composés aromatiques
polyfonctionnalisés dans la couche corticale du lichen [2]. Ces métabolites appartiennent à la
famille des depsidones, depsides, diphenyl éther, anthraquinones, xanthones, acides
pulviniques et scytonémine. Leurs structures ainsi que leurs caractéristiques spectrales sont
résumées dans la Figure 10.
D’autres métabolites présentant un intérêt dans la photoprotection, ont été récemment
décelés au sein des lichens. Il s’agit des mycosporines et des MAAs (Mycosporine-like Amino
Acids). Ils sont formés par un noyau cyclohexènone (oxo-mycosporine) ou cyclohexènimine
(imino-mycosporine) (Figure 12). Leur voie de biosynthèse dans les lichens mérite d’être
précisée. Chez les champignons et les cyanobactéries, ils sont dérivés de la voie de l’acide
shikimique, cependant une nouvelle voie de biosynthèse à partir de la voie des pentoses
phosphates a été décrite chez des cyanobactéries [54] (Figure 14). Ils ont des coefficients
d’extinction molaires compris entre ε=28 000 M-1.cm-1 et ε=50 000 M-1.cm-1 (310-365 nm),

sont très polaires, hydrosolubles et de faible poids moléculaire (<400 g/mol). Outre leur
principale propriété d’être de bons filtres UV, de nombreuses études ont montré leur
implication dans le stress osmotique, la reproduction fongique, la dessiccation et enfin leur rôle
en tant qu’antioxydants. Enfin, un bilan de la distribution des composés de type mycosporine
dans 40 lichens montre que seuls les cyanolichens et quelques lichens tripartites produisent des
mycosporines (Tableau 1). La poursuite du criblage sur deux chorolichens et deux cyanolichens
xviii


nous a permis de mettre en évidence pour la première fois des composés types mycosporines
dans un chlorolichen : Dermatocarpon luridum.

CHAPITRE 2: CRIBLAGE ET QUANTIFICATION DE COMPOSES
DE TYPE MYCOSPORINE DANS LE GENRE DERMATOCARPON
Afin de confirmer ce résultat inédit, nous avons choisi de cribler les quatre espèces
appartenant au genre Dermatocarpon présentes en Bretagne par une collecte dans le Finistère :
D. luridum, D. meiophyllizum, D. leptophyllodes et D. miniatum. Après une description
botanique des quatre espèces, un protocole d’extraction aqueuse, de purification et d’analyse
par HPTLC-UV et HPLC-DAD-MS est appliqué. La comparaison des profils d’absorption en
spectrophotométrie UV et en spectrométrie de masse des extraits (Figures 19 et 20) avec les
données bibliographiques (Appendice 2), met en évidence pour la première fois dans les quatre
chlorolichens la présence de deux composés de type oxo-mycosporine. Il s’agit de la
mycosporine glutaminol 1 et de la mycosporine glutamicol 2 (Tableau 4). Ces deux
mycosporines sont présentes dans l’extrait brut mais on peut noter qu’au cours de l’étape de
purification de l’extrait, la mycosporine glutaminol 1 est instable et s’hydrolyse en
mycosporine 2. Ces deux substances (y compris leur forme glycosylée) ont été observées pour
la première fois dans des ascomycètes terrestres, puis dans une cyanobactérie terrestre pour la
mycosporine 1 et un cyanolichen pour la mycosporine 2. Un troisième composé, la
mycosporine 3 a été détecté dans deux extraits D luridum et D. miniatum, il correspond à l’ester
éthylique de la mycosporine glutamicol. Nous avons démontré qu’il n’était pas d’origine

naturelle et qu’il se formait au cours de l’étape de purification. Néanmoins il s’agit d’un
composé nouveau.
La présence systématique des mycosporines 1 et 2 dans les quatre espèces de
Dermatocarpon apporte un argument supplémentaire quant à leur rôle en tant que marqueurs
chimiotaxonomiques de genre. Cette découverte apporte aussi des arguments en faveur d’une
biogenèse où le mycosymbiote serait impliqué dans la biosynthèse des mycosporines au sein
des lichens.
Afin de confirmer ces résultats, nous avons eu l’opportunité d’étendre le criblage sur
des échantillons d’herbier appartenant à 12 espèces différentes de Dermatocarpon en
xix


provenance d’Amérique du Nord et d’Europe, soit un total de 94 échantillons (Appendice 3).
Notre travail a consisté dans un premier temps, à partir d’une courbe de calibration, à valider
une méthode de dosage rapide et sensible étant donné la faible biomasse mise à disposition
(entre 15 et 50 mg de lichen) (Tableau 5). Ainsi, une méthode comprenant une extraction
aqueuse suivie d’un dosage par HPLC-DAD basée sur une séparation en mode HILIC est
appliquée pour la première fois, elle a permis de séparer et de déterminer le contenu en
mycosporines 1 et 2 avec une séquence d’analyse de 16 min (Figure 25). Sur le panel
d’échantillons, cette étude a montré que le contenu global en mycosporine variait entre 4.56 et
46.77 mg/g d’extrait sec correspondant à 0.1 et 1.4 mg/g de lichen. L’étude a montré une
instabilité de la mycosporine glutaminol 1 dont la teneur devient nulle dans les échantillons
collectés depuis plus de 15 ans alors que la teneur en mycosporine glutamicol 2 est mesurable
et importante dans la plupart des échantillons Il est difficile de faire une cinétique de
dégradation au cours du temps car nous ne connaissons pas le contenu initial en mycosporine
mais notre travail apporte un point de départ à une analyse de ces échantillons sur le long terme.
Concernant les quatre lichens frais collectés le même jour à des endroits différents (D. luridum,
D. meiophyllizum, D. leptophyllodes et D. miniatum), nous remarquons une différence notable
en contenu en mycosporine totale ; il est beaucoup plus élevé dans le D. miniatum. Ceci peut
être corrélé à leur écologie différente : exposition au soleil sur rochers secs pour D. miniatum

et une exposition à l’ombre sur rochers immergés pour les 3 autres. Une étude complémentaire
à partir des quatre espèces collectées dans la même zone devra être mise en place pour
confirmer l’influence de l’exposition ou des saisons sur le contenu en mycosporines.

CHAPITRE 3: ETUDE PHYTOCHIMIQUE DU DERMATOCARPON
LURIDUM (WITH.) J.R. LAUNDON
Une étude phytochimique plus approfondie de D. luridum a été entreprise dans le but
d’isoler dans un premier temps les mycosporines décrites précédemment. Le chapitre débute
par une présentation de l’écologie et de la morphologie du D. luridum suivie d’un bilan
bibliographique concernant les constituants retrouvés dans le genre Dermatocarpon. Il appart
que ce genre est très pauvre en métabolites secondaires polyfonctionnalisés. En revanche, il est
riche en polyols, en acides aminés et en caroténoïdes.

xx


A partir de 150 g de lichen séché et broyé, nous avons procédé à une extraction successive
par des solvants de polaritộ diffộrente en commenỗant par leau puis le chloroforme (aprốs
sộchage du lichen) et enfin l’acétone (Figure 34). L’extrait aqueux, le plus riche
quantitativement et contenant les mycosporines a été traité en premier. La purification a
consisté en une première étape de chromatographie échangeuse de cations afin d’éliminer les
polyols. Puis, après quelques essais non concluants de chromatographie de partage centrifuge
(CPC) pour éliminer les acides aminés, nous avons adopté une nouvelle combinaison pour la
purification de ces composés : une flash chromatographie en mode HILIC suivie d’une
chromatographie en phase inversée sur colonne ouverte et enfin une chromatographie semipréparative en phase inversée (Figure 36). Cela a conduit à l’isolement de 5 mg de mycosporine
glutaminol 1, 6,5 mg de mycosporine glutamicol 2 et 6 mg de la mycosporine ester 3. Leur
spectre UV dans l’eau a été enregistré permettant ainsi de calculer leur coefficient d’extinction
molaire à max = 310 nm. Une détermination de la constante d’acidité pKa des mycosporines
1 et 3 par spectrophotométrie a ensuite été entreprise pour la première fois. Les pKa de l’ordre
de 1.2 montrent que les deux mycosporines se comportent comme des acides très forts.

L’intérêt de cette étude est d’une part, de conntre sous quelle forme se trouve la mycosporine
en fonction du pH du milieu et d’autre part, de mettre en évidence une forte délocalisation des
électrons au sein du noyau cyclohexenone (Figures 45 et 46).
Trois autres composés polaires 4, 5 et 6 ont été isolés à partir de l’extrait aqueux (Figure
47). Il s’agit

de trois substances azotées.

Le composé

4

(acide 2-amino-3-

acétylaminopropionique) est un composé appartenant à la famille des acides aminés non
protéiques qui n’ont jusqu’ici jamais été isolés dans les lichens, ils auraient un rôle défensif
contre les insectes herbivores. Le composé 5, la L-Proline est un acide aminé classique déjà
décrit dans un Dermatocarpon, il joue un rôle de composé osmotiquement efficace dans les
lichens et les algues vertes. Le composé 6 (-L-Glutamylglycine) est un dipeptide composé
d’une unité glycine associé à un acide glutamique, la structure exacte a été élucidée grâce à la
RMN et à la fragmentation en masse. Ce type de composé n’a jamais été décrit dans un lichen.
A partir des extraits acétone et chloroforme quatre composés 7, 8, 9 et 10 ont été isolés. Le
cerevisterol 7 est un stérol comportant 3 hydroxyles, la configuration absolue a pu être
déterminée en comparant son pouvoir rotatoire avec celui de la littérature, il a déjà été décrit
dans les lichens mais pas dans le genre Dermatocarpon. Le composé 8 est un céramide ou un
sphingolipide constitué d’une sphingosine formant une liaison amide avec un acide gras. La
xxi


longueur des deux chnes alkyles a pu être déterminée à partir de la fragmentation MS. C’est

la première fois qu’un sphingolipide non glycosylé est décrit dans un lichen. Les céramides
sont des composés très hydrophobes, par conséquent ils jouent un rôle d’imperméabilisant en
empêchant la perte d’eau et pourraient aussi empêcher l’entrée de microorganismes. Les
composés 9 et 10 ont été isolés en mélange 85:15, il s’agit de deux polyols, respectivement le
D-volémitol et le D-mannitol.
Au total, 10 composés ont été identifiés à partir du D. luridum. Il est intéressant de
souligner que ce lichen est pauvre en constituants polyphénoliques. Son profilage chimique est
à rapprocher de celui d’un cyanolichen connu pour accumuler des polysaccharides et des
substances azotées telles que les mycosporines.

CHAPITRE 4: TESTS BIOLOGIQUES ET EVALUATION DE LA
PHOTOPROTECTION
Les différents composés obtenus en quantité suffisante ainsi que des extraits aqueux ont pu
être testés pour leurs activités cytotoxiques et certains évalués pour leurs propriétés
photoprotectrices. Ainsi la cytotoxicité des six composés isolés 2, 3, 4, 6, 7 et 8 a été évaluée
sur six lignées cellulaires cancéreuses: Huh7, CaCo-2, MDA-MB-231, HCT116, PC3, NCIH727, et deux lignées cellulaires de la peau non cancéreuses: HaCaT et Fibroblastes. La plupart
des composés testés ne sont pas toxiques à une concentration de 25 µM, à l'exception du
stéroïde cérevisterol 7 (Figure 67). Le composé 7 est en effet toxique sur sept lignées cellulaires
avec des valeurs de CI50 comprises entre 5 à 24 µM, à l'exception de la lignée cellulaire de
cancer du sein humain MDA-MB- 231. Ce résultat est en accord avec l’activité cytotoxique du
stéroïde décrite il y a peu [138].
L’absence de toxicité des mycosporines sur les cellules de la peau est un résultat très
encourageant pour une éventuelle application dans le domaine de la photoprotection. Aussi
l’évaluation des capacités photoprotectrices des trois mycosporines a été entreprise ainsi que
celle des extraits aqueux bruts et semi-purifiés de D. luridum (respectivement DL1 et DL2) et
D. miniatum (respectivement DM1 et DM2). Tout d’abord, nous avons commencé à évaluer
leur capacité en tant que filtre UV étant donné que les mycosporines 1-3 possédaient un
coefficient d’extinction moléculaire supérieur à 10000 M-1.cm-1 et une absorption maximale
xxii

dans les UV à 310 nm. L’activité photoprotectrice a été déterminée in vitro en enregistrant le
spectre d’absorption dans une émulsion huile/eau contenant 10% de chaque produit. En
utilisant une analyse en composantes principales (ACP), il appart que les 3 mycosporines
ainsi que l’extrait DM2 (extrait semi-purifié de D. miniatum) s’avèrent être de bons candidats
comme filtres UVB en comparaison du 4-methylbenzylidene Camphor (4-MBC), un filtre
commercial (Figure 69). Nous avons aussi démontré que l’activité des extraits était corrélée
avec leur teneur en mycosporines.
Suite à ces observations, leur phototoxicité sur cellules non tumorales de kératinocytes
humains, soumises à des radiations UVA a été évaluée dans l’hypothèse d’une application
cosmétique. Les résultats suggèrent que les extraits lichéniques et les composés purs sont nonphototoxiques (Tableau 14).
Un filtre solaire est d’autant plus intéressant qu’il possède une capacité antioxydante. En
effet, les dommages dus aux UV passent par des mécanismes d’oxydation directs ou indirects
des constituants de la peau et plus particulièrement de l’ADN, ce qui peut mener à terme
l’apparition de cancers cutanés. Après un bilan bibliographique des propriétés antioxydantes
des oxo-mycosporines et imino-mycosporines décrites à ce jour (Appendice 4), nous avons
testé leur activité antioxydante en effectuant deux tests in vitro (DPPH et NBT) et un test in
cellulo (peroxydation lipidique) mettant en jeu des mécanismes différents. Le test DPPH
consiste à mesurer la capacité des composés à réduire un composé radicalaire (par transfert
d’électrons) alors que le test NBT concerne principalement la capacité des molécules à piéger
l’anion superoxyde O2.-. Les mycosporines 1-3 ainsi que les extraits semblent présenter peu
d’activité réductrice sur le test DPPH alors que la mycosporine 3 et les extraits DL2 et DM2
présentent une activité notable dans le piégeage de O2.- comparée au témoin positif, la
quercétine (Figure 68). On note également une activité modérée des mycosporines 1 et 2
suggérant une interaction synergiste entre les constituants présents dans les extraits DL2 et
DM2. Le dernier test de peroxydation lipidique a été effectué en collaboration avec Mme
Isabelle Gallais et le Pr. Odile Sergent au sein de l’UMR Inserm 1085, IRSET à l’Université
de Rennes 1. Ce test consiste à mesurer la quantité de malondialdehyde (MDA) formée suite à
la production de ROS sous l’effet de l’éthanol sur des cellules WIF-B9. Seul l’extrait DM2 et
la mycosporine 3 ont été testés car ils présentaient la meilleure activité antioxydante sur l’essai

NBT. Le résultat de ce test préliminaire (car seulement issu de deux expériences) semble

xxiii