Nghiên cứu ảnh hưởng của thành phần khoáng và các yếu tố khác nhằm nâng cao hàm lượng taxol trong nuôi cấy tế bào mô sẹo thông đỏ (taxus wallichiana zucc)

Nghiên cứu ảnh hưởng của thành phần khoáng và các yếu tố khác nhằm nâng cao
hàm lượng taxol trong nuôi cấy tế bào mô sẹo Thông Đỏ (Taxus wallichiana Zucc)

CHƯƠNG 1
GIỚI THIỆU
1.1 Đặt vấn đề
Bệnh ung thư hiện đang là căn bệnh gây tử vong với tỉ lệ cao nhất. Theo thống
kê của các cơ sở, tổ chức y tế Trung ương các nước hàng năm, trên thế giới có hơn
một triệu trường hợp mắc bệnh ung thư được phát hiện thêm. Trong đó, trường hợp
dẫn đến tử vong là hơn 65%. Ở Việt Nam, trong những năm gần đây, số người mang
bệnh ung thư không ngừng tăng cao với một hệ số rất lớn. Đồng thời, tỉ lệ tử vong
luôn rất cao, hơn 75%. Theo báo cáo của Viện Ung Thư Quốc Gia Hoa Kỳ, một trong
những nguyên nhân chính là do tình trạng thiếu thuốc đặc trị mà chỉ có thể điều trị
bằng phương pháp bổ trợ.
Ngoài việc nghiên cứu để tổng hợp các dược phẩm chống ung thư thì những năm
gần đây trên thế giới đã chuyển sang sử dụng các loại dược thảo để chữa bệnh cho con
người. Mà người Việt Nam lại có truyền thống sử dụng những bài thuốc dân gian để
chữa trị, hầu hết chúng đều bắt nguồn từ các cây thuốc. Những cây thuốc đã mang lại
ý nghĩa về mặt y học và kinh tế. Các cây thuốc chiếm 30% giá trị thuốc trên thị trường
thế giới. Ở Việt Nam, hơn 90% nguyên liệu phải nhập khẩu, chủ yếu là sản xuất các
dạng thuốc thông thường, để trị các bệnh thông thường.
Ngoài ra, việc ứng dụng công nghệ nuôi cấy tế bào thực vật để sản xuất các hợp
chất thứ cấp đã tạo ra một bước tiến xa trong khoa học thực vật. Trong đó, taxol một
alkaloid diterpenoid được thu nhận từ các bộ phận của cây thuộc nhóm Taxus (cây
thông đỏ ở Việt Nam), được sử dụng làm thuốc trị bệnh ung thư. Taxol đã được sử
dụng trong thành phần của hầu hết các lọai thuốc đặc trị cho phần lớn các loại bệnh
ung thư như ung thư phổi, ung thư dạ dày, ung thư ruột kết, ung thư cổ, đầu … hay
ngay cả các khối u hắc tố ác tính khác.
Taxol có nhiều trong vỏ cây Taxus wallichiana Zucc (Thông Đỏ Himalaya) hiện
đang bị đe dọa tuyệt chủng do nạn chặt phá rừng. Taxus wallichiana là loại cây thuộc

Page 1


Nghiên cứu ảnh hưởng của thành phần khoáng và các yếu tố khác nhằm nâng cao
hàm lượng taxol trong nuôi cấy tế bào mô sẹo Thông Đỏ (Taxus wallichiana Zucc)
nhóm tăng trưởng rất chậm, việc thu hoạch vỏ cây để chiết xuất Taxol sẽ làm cây chết,
gây thiệt hại cho nguồn tài nguyên rừng và ảnh hưởng đến môi trường sinh thái quốc
gia. Việc nuôi cấy tế bào Taxus wallichiana để thu nhận hợp chất Taxol là một việc
làm hết sức cần thiết giúp khai thác được nguồn dược liệu quý hiếm này mà không
làm ảnh hưởng đến nguồn giống tự nhiên cũng như môi trường sinh thái của Việt
Nam, đáp ứng nhu cầu tiêu thụ trên thị trường, làm giảm giá thành sản xuất các sản
phẩm có hoạt tính sinh học nguồn gốc từ thực vật. Với những lý do đó chúng tôi đi
đến thực hiện đề tài “Nghiên cứu ảnh hưởng của thành phần khoáng và các yếu tố
khác nhằm nâng cao hàm lượng taxol trong nuôi cấy tế bào mô sẹo Thông Đỏ (Taxus
wallichiana Zucc) ”.
1.2 Mục tiêu và yêu cầu thí nghiệm
1.2.1 Mục tiêu
Nghiên cứu tỉ lệ của thành phần khoáng và chất cảm ứng nhằm nâng cao hàm
lượng taxol tích lũy trong nuôi cấy mô sẹo cây Thông Đỏ (Taxus wallichiana).
1.2.2 Yêu cầu
Xác định nồng độ javel và thời gian xử lý mẫu thích hợp để khả năng vô trùng
mẫu nuôi cấy cây Thông Đỏ là cao nhất.
Xác định môi trường khoáng và chất điều hòa tăng trưởng thích hợp để tạo mô
sẹo cây Thông Đỏ.
Xác định môi trường khoáng và chất điều hòa tăng trưởng thích hợp để tăng
sinh khối mô sẹo cây Thông Đỏ.
Xác định ảnh hưởng của nước dừa để tăng sinh khối mô sẹo cây Thông Đỏ.
Xác định ảnh hưởng của hàm lượng đường để tăng sinh khối mô sẹo cây
Thông Đỏ.
1.2.3 Giới hạn đề tài

Do giới hạn của một luận văn tốt nghiệp nên tôi chỉ tiến hành thí nghiệm xung
quanh các vấn đề có liên quan đến kỹ thuật nuôi cấy mô sẹo cây Thông Đỏ.

Page 2


Nghiên cứu ảnh hưởng của thành phần khoáng và các yếu tố khác nhằm nâng cao
hàm lượng taxol trong nuôi cấy tế bào mô sẹo Thông Đỏ (Taxus wallichiana Zucc)

CHƯƠNG 2
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1 Giới thiệu chung về thực vật nhóm Taxus
2.1.1 Nguồn gốc - lịch sử
Các loài thực vật thuộc nhóm Taxus (Thông Đỏ) được con người biết đến và
sử dụng đã hàng ngàn năm nay. Từ lâu, người ta đã biết cây Thông Đỏ là loại cây có
độc tính rất cao và rất nguy hiểm. Ngày nay, các nhà khoa học đã xác định các độc tố
đó chủ yếu là do các hợp chất Taxine.
Thực vật thuộc nhóm Taxus gồm hơn 10 loài khác nhau phân bố ở nhiều vùng
từ châu Mỹ, châu Âu, đến châu Á, như: Taxus wallichiana (Thông Đỏ Himalaya),
Taxus brevifoia (Thông Đỏ Thái Bình Dương), Taxus baccata (Thông Đỏ Châu Âu),
Taxus cuspidata (Thông Đỏ Nhật Bản), Taxus chinesis (Thông Đỏ Trung Quốc), …,
cùng một số loài Taxus lai tạo giữa các loài Thông Đỏ trên.

Hình 2.1 Rừng Taxus baccata ở Châu Âu
Tại Việt Nam cây Taxus wallichiana Zucc sống chủ yếu ở Lâm Đồng, Khánh
Hòa thuộc lọai đại mộc, chiều cao có thể đến 30 mét, vỏ có màu nâu đỏ nhạt, hơi dày,
Page 3


Nghiên cứu ảnh hưởng của thành phần khoáng và các yếu tố khác nhằm nâng cao

hàm lượng taxol trong nuôi cấy tế bào mô sẹo Thông Đỏ (Taxus wallichiana Zucc)
thịt màu đỏ sẫm, giác có màu vàng trắng, lõi nâu đậm. Thân cây nhẵn, cành xèo rộng,
lá mọc cách xếp thành hai dãy, mặt trên lá có màu lục, mặt dưới hơi vàng, lá dài
khoảng 2,5 – 4 cm, rộng 2 – 4 cm, thót dần và nhọn phía đầu lá, lá mọc tạo thành một
góc 60 – 90o so với trục của cành mang lá, có gân nổi rõ ở mặt trên, mặt dưới màu
xanh vàng có hai dải khí khổng màu xanh nhạt hoặc xanh vàng trông rõ, cuống lá
ngắn khoảng 0,2 cm.
Thông Đỏ là cây đơn tính biệt chu. Hoa Thông Đỏ gồm 8 – 10 nhị, mỗi nhị có
4 – 8 túi phấn mọc ở các nách lá vùng đỉnh cành và thường tạo thành cụm màu vàng
nhạt, hình trứng cuống ngắn. Nón cái mọc riêng lẽ ở nhánh, phân bố dọc theo suốt
đoạn cành. Nón đực và nón cái chỉ phân bố ở cành mới. Quả Thông Đỏ có hình ô van
hay hình trứng, có muống nhỏ, gốc quả được bọc bởi các vảy xếp thành lớp tạo đế,
quả non có màu nâu sẫm, quả chín có màu nâu nhạt hay màu đỏ.
Cây Thông Đỏ sinh trưởng rất chậm, ưa sáng và ưa ẩm nhưng lại cần bóng râm
để nảy mầm và phát triển những năm đầu. Mùa hoa từ tháng 8 - 12 và kết trái vào
tháng 6 - 7 năm sau. Hoa đực ở nách lá hình cầu màu vàng lục có cuống ngắn, nón
đực gồm 3 - 14 nhị đực. Nón cái một noãn, ít khi có hai không cuống, một noãn thẳng
thuộc loại đơn tính khác gốc ở cuối cành. Hạt hình trứng, khô cứng, dài 0,6 - 0,7 cm,
ngoài có một lớp vỏ giả nạc mềm màu đỏ. Hạt phát tán không xa, nảy mầm và phát
triển nơi có độ ẩm cao, có cường độ ánh sáng trung bình. Tỷ lệ nảy mầm trong tự
nhiên rất thấp so với số lượng hạt cây mang hàng năm, hạt chỉ nảy mầm sau hai năm,
sau khi rụng.
Gỗ Thông Đỏ chắc, không cong vênh, không nứt nẻ, chịu ẩm, chịu nước có thể
dùng làm gỗ xây dựng và đồ gỗ gia dụng. Vì thế Thông Đỏ đã bị khai thác bừa bãi,
quá mức nếu không có biện pháp bảo vệ nghiêm ngặt, chúng có thể bị diệt vong trong
tương lai không xa.

Page 4

Nghiên cứu ảnh hưởng của thành phần khoáng và các yếu tố khác nhằm nâng cao
hàm lượng taxol trong nuôi cấy tế bào mô sẹo Thông Đỏ (Taxus wallichiana Zucc)

2.1.2 Phân loại khoa học

Giới

Plantae

Phân giới

Tracheobionta

Nhóm

Spermatophyta

Phân nhóm

Coniferophyta

Lớp

Pinopsida

Bộ

Taxales

Họ

Taxaceae

Giống

Taxus

Loài

Taxus Wallichiana Zucc

Page 5


Nghiên cứu ảnh hưởng của thành phần khoáng và các yếu tố khác nhằm nâng cao
hàm lượng taxol trong nuôi cấy tế bào mô sẹo Thông Đỏ (Taxus wallichiana Zucc)
Hình 2.2 Đặc điểm hình thái cây Thông Đỏ
Thực vật thuộc nhóm Taxus có hơn 10 loài khác nhau phân bố ở nhiều vùng ôn
đới ẩm, vùng cận nhiệt đới, vùng nhiệt đới núi cao bắc bán cầu từ châu Mỹ, châu Âu
đến châu Á gồm:
- Taxus brevifoia (Thông Đỏ Thái Bình Dương)
- Taxus baccata (Thông Đỏ châu Âu)
- Taxus cuspidate (Thông Đỏ Nhật Bản)
- Taxus chinesis (Thông Đỏ Trung Quốc)
- Taxus globosa (Thông Đỏ Mexico)
- Taxus marei (Thông Đỏ Đài Loan)
- Taxus wallichiana (Thông Đỏ Himalaya)
- Taxus sumatrana (Thông Đỏ Sumatra)
- Taxus floridana (Thông Đỏ Florida)
- Taxus Canadensis (Thông Đỏ Canada)

Trong đó có 3 loài ở khu vực Trung và Đông Á. 3 – 4 loài ở phía bắc Châu
Mỹ và 2 loài ở Việt Nam là T. Chinensis (Thông đỏ lá ngắn) và T. Wallichiana Zucc
(Thông đỏ lá dài). Thông Đỏ lá ngắn phân bố ở Trung Quốc, Ấn Độ, Malaysia, Việt
Nam. Ở Việt Nam, cây phân bố rãi rác ở 1 số vùng núi thuộc các tỉnh Lào Cai (Hoàng
Liên Sơn), Hà Tây (Ba Vì), Nghệ An (Quỳ Châu) độ cao: 900 – 1600 m. (Vũ Văn Vụ
và ctv, 1996, Sách đỏ VN). Thông Đỏ lá dài phân bố ở Nepal (vùng núi Himalaya),
phía bắc Mianma, Đông – Nam Trung Quốc, Ấn Độ, Indonesia, Philippin, Việt Nam.
Ở Việt Nam, loài này cũng chỉ thấy ở một số vùng núi cao thuộc các tỉnh Lào Cai
(Hoàng Liên Sơn), Khánh Hòa, Lâm Đồng (Đà Lạt, Đơn Dương), Hà Giang (Thái An
– Quản Bạ), độ cao phân bố từ 1400 đến 1600 m. (Nguyễn Tiệp, 1996 và 2001).

Page 6


Nghiên cứu ảnh hưởng của thành phần khoáng và các yếu tố khác nhằm nâng cao
hàm lượng taxol trong nuôi cấy tế bào mô sẹo Thông Đỏ (Taxus wallichiana Zucc)

Hình 2.3 Các loại Taxus trên thế giới
A.Taxus brevifoia

D. Taxus floridana

B.Taxus baccata

E. Taxus chinesis

C. Taxus cuspidate

F. Taxus wallichiana

Page 7


Nghiên cứu ảnh hưởng của thành phần khoáng và các yếu tố khác nhằm nâng cao
hàm lượng taxol trong nuôi cấy tế bào mô sẹo Thông Đỏ (Taxus wallichiana Zucc)
2.1.3 Thành phần hóa học
Trong các bộ phận của cây thuộc nhóm Taxus có rất nhiều hợp chất khác nhau.
Cấu tử chính và đặc trưng chung của cây này là Diterpenoid. Các hợp chất này thường
gọi chung là Taxoid, trong đó Taxol và đồng phân Taxoltere là hai hợp chất quan
trọng được tạo ra do sự chuyển hóa hợp chất 10-deacetybacctin III (là một hợp chất
trung gian quan trọng có trong lá của các loài thực vật nhóm Taxus).
2.2 Sơ lược về cây Thông Đỏ
Cây thông đỏ (Taxus wallichiana Zucc) thuộc họ Thanh Tùng (Taxaceae), gồm
các chi:
Taxaceae:
Austrotaxus - thanh tùng New Caledonia
Pseudotaxus - thông trắng (bạch đậu sam)
Taxus - thanh tùng (thông đỏ, hồng đậu sam)
Cephalotaxaceae:
Amentotaxus - dẻ tùng, sam bông
Cphalotaxus - đỉnh tùng (phỉ 3 mũi)
Torreya - phỉ
Bảng 2.1 Điểm khác biệt giữa chi Taxaceae và chi Cephalotaxaceae
Họ
Áo hạt
Độ dài hạt tưởng thành
Thời gian phát triển

Taxaceae
Bao phủ môt phần hạt

5 – 8 mm
6 – 8 tháng

Cephalotaxaceae
Bao phủ toàn bộ hạt
12 – 40 mm
18 – 20 tháng

2.2.1 Giá trị kinh tế và trong ngành y dược
Thông Đỏ là loài cây quý có giá trị kinh tế cao. Gỗ thông đỏ chắc, không cong
vênh, không nứt nẻ, chịu ẩm, chịu ướt, có thể dùng làm gỗ xây dựng và các đồ gia
dụng.
Lá Thông Đỏ là loại thuốc dân gian được dùng từ lâu đời để trị hen suyễn,
viêm phế quản, chứng tiêu hóa không bình thường… (Võ Văn Chi, 2004). Đặc biệt là
Page 8


Nghiên cứu ảnh hưởng của thành phần khoáng và các yếu tố khác nhằm nâng cao
hàm lượng taxol trong nuôi cấy tế bào mô sẹo Thông Đỏ (Taxus wallichiana Zucc)
vào năm 1994, một số nhà khoa học trên thế giới công bố từ cây thông đỏ có thể tìm
thấy các hoạt chất để chữa trị bệnh ung thư. Cụ thể, Taxol chiết xuất từ vỏ các loài: T.
brevifolia, T. cuspidata, T. yunnanensis, T. baccata và T. wallichiana,… đều có chất
lượng và hiệu suất cao, được dùng để chữa trị ung thư buồng trứng, ung thư vú, ung
thư đầu, cổ và có triển vọng xử lý hắc tố (melanomas)..., khoảng 1 kg Taxol/9000 kg
vỏ của T. brevifolia, còn các loài khác cho hiệu suất nhỏ hơn. Đặc biệt hàm lượng rất
biến động theo điều kiện sinh thái môi trường.
Hiện tại trong hoá trị ung thư, hai loại thuốc trị bệnh ung thư tuyến tiền liệt và
ung thư vú có hai dược phẩm sử dụng nhiều nhất và hiệu quả nhất là Taxol và
Taxotere. Thuốc Taxol được bào chế từ chất Paclitaxel và thuốc Taxotere được bào
chế từ chất Docetaxel. Hai dược chất trên đều có chung nguồn gốc và dược liệu, chiết

xuất từ cây thông đỏ (Taxus wallichiana). Thông thường 1 kg lá thông đỏ chiết xuất
được 20 mg Taxol và giá 1 mg Taxol trên thị trường thế giới hiện nay là 4,87 USD.
Ví dụ: Để có một liều thuốc trị bệnh ung thư, người ta cần khoảng 1kg taxol và
để có 1kg taxol, cần không dưới 7.000kg vỏ Thông Đỏ. Nghĩa là để có một liều thuốc
trị bệnh ung thư được bào chế, chúng ta phải "hy sinh" khoảng sáu cây Thông Đỏ
trưởng thành. Như vậy, toàn bộ rừng Thông Đỏ của Việt Nam nếu được dùng làm
nguyên liệu cũng chỉ đủ để điều chế trên 10 liều thuốc chữa trị ung thư.
Song Thông Đỏ cũng là loài cây độc nổi tiếng, gia súc khi ăn phải loài cây này
sẽ bị ngộ độc. Thông Đỏ được xếp vào nhóm thực vật hiếm ở Việt Nam (Trần Văn
Tiến, 1999).
2.2.2 Phân bố
Thông Đỏ là loài thực vật hạt trần quý hiếm, loài này có nhiều ứng dụng trong
lĩnh vực y - sinh học. Theo nghiên cứu của các nhà rừng học cho biết Thông Đỏ phân
bố hẹp ở các nước Châu Á như: Việt Nam, Ấn Độ, Trung Quốc, Myanmar,
Philippines, Indonesia, Nepal, Afghanistan…
Ở Việt Nam, năm 1995 Trung tâm khoa học tự nhiên và công nghệ quốc gia
khảo sát vùng Pà Cò, Mai Châu, Hoà Bình đã gặp 5 cây Thông Đỏ T. chinensis (còn
gọi là Thông Đá, Cây Tra) bên trái núi đá vôi. Riêng ở Lâm Đồng các nhà nghiên cứu
lâm sinh đã phát hiện 1 loài Thông Đỏ Himalaya (T.Wallichiana Zucc) có rải rác
Page 9


Nghiên cứu ảnh hưởng của thành phần khoáng và các yếu tố khác nhằm nâng cao
hàm lượng taxol trong nuôi cấy tế bào mô sẹo Thông Đỏ (Taxus wallichiana Zucc)
nhiều nơi trên độ cao khoảng 1.500 m, một vài địa điểm có Thông Đỏ như: khu vực
giáp ranh Xuân Thọ, Xuân Trường cách Đà Lạt 17 km phát hiện 2 cây Thông Đỏ 1
lớn và 1 nhỏ, cây lớn có 3 thân đường kính gốc đạt 115 cm, ba thân có đường kính
tương ứng là 57 cm, 41 cm và 15 cm, chiều cao cây khoảng 30 m. Cây nhỏ có đường
kính 33 cm, cao 15 m. Cả 2 cây đều mọc bên khe núi. Cành của các cây trên đã được
thu thập và giâm hom tại trung tâm lâm sinh Lâm Đồng và đã có nhiều cây hom, các

cây hom này đã được đưa về trồng tại trạm Mang Linh cho phù hợp với nhu cầu sinh
thái của loài.
2.2.3 Đặc điểm hình thái
Cây Thông Đỏ thuộc họ thanh tùng (Taxaceae). Ở Việt nam, Taxus
wallichiana phân bố ở các tỉnh Lào Cai, Yên Bái, Sơn La, Nghệ An, Hà Tĩnh, Phú
Yên, Khánh Hòa, Lâm Đồng.
Cây Thông Đỏ thuộc loài đại mộc, cây mọc cao đến 30m. Vỏ ngoài có màu
nâu đỏ nhạt, hơi dày, bong vảy, thịt màu đỏ sẫm, giác có màu vàng trắng, lõi màu nâu
đậm. Thân cây nhẵn, cành xòe rộng, cành non màu lục, gốc cành mang chồi do những
vảy màu lục xếp lợp.
Lá mọc cách xếp thành hai dãy mặt trên lá có màu lục, mặt dưới hơi vàng. Lá
dài khoảng 2,5 – 4 cm, rộng 2 – 4 cm, thót dần và nhọn phía đầu lá, lá mọc tạo thành
một góc 60 – 90o so với trục của cành mang lá. Thông Đỏ hầu như không có cuống lá
và là cây đơn tính biệt chu.
Hoa đơn tính khác gốc. Hoa đực Thông Đỏ gồm 8 – 10 nhị, mỗi nhị có 4 – 8
túi phấn mọc ở các nách lá vùng đĩnh cành và thường tạo thành cụm màu vàng nhạt,
hình trứng cuống ngắn. Hoa cái mọc riêng lẽ ở nhánh, phân bố dọc theo suốt đoạn
cành. Hoa đực và hoa cái chỉ phân bố ở cành mới.
Quả Thông Đỏ có hình ô van hay hình trứng, có muống nhỏ, gốc quả được
bọc bởi các vảy xếp thành lớp tạo đế, quả non có màu nâu sẫm, quả chín có màu nâu
nhạt hay màu đỏ nhạt, mềm, nhiều nước, ngọt.
2.2.4 Đặc điểm sinh trưởng
Thông Đỏ là loại cây có biên độ sinh thái hẹp, ưa bóng, thường phân bố ở
những vùng núi cao có độ dốc trên 300 m hay các vùng cận nhiệt đới ẩm trên đỉnh núi
Page 10


Nghiên cứu ảnh hưởng của thành phần khoáng và các yếu tố khác nhằm nâng cao
hàm lượng taxol trong nuôi cấy tế bào mô sẹo Thông Đỏ (Taxus wallichiana Zucc)
đá vôi ở độ cao 1000 – 2000 m. Điều kiện thổ nhưỡng, địa hình cũng đặc biệt đất có

thảm mục dày, xốp có lớp mặt màu đen, ở tầng sâu có màu nâu trắng, đất có kết cấu
tơi, có thành phần cơ giới nhẹ trên bề mặt đất, có các khối đá Granit xen kẽ, rải rác tạo
nên địa hình lồi lõm chia cắt mạnh (Nguyễn Thượng Hiền, 1998).
Thông Đỏ được xem là nhóm cây khỏa tử chịu bóng hoặc hơi ưa sáng, thường
mọc dưới tán một số cây gỗ thuộc các họ Lauraceae, Magnoliaceae, Fagaceae,
Illiaceae,...Thông Đỏ thích hợp vùng khí hậu có hai mùa rõ rệt trong năm, mùa mưa
kéo dài từ tháng 4 đến tháng 10, lượng mưa trung bình từ 1600 - 1800 mm, nhiệt độ
bình quân 200C, độ ẩm 80 - 90%.
Thông Đỏ thường ra lá non vào mùa xuân và hè, hoa đực xuất hiện sớm hơn
hoa cái từ cuối mùa đông, đến giữa mùa xuân năm sau cả hoa đực và hoa cái mới nở.
Thông Đỏ sinh trưởng rất chậm, tái sinh tự nhiên từ hạt rất khó. Tuy vậy, nếu trên
đỉnh núi có vài cây to, vẫn có thể tìm thấy cây con mọc từ hạt.
2.3 Sơ lược về hợp chất taxol
2.3.1 Công thức hóa học

Hình 2.4 Taxol (paclitaxel)
Công thức hóa học của taxol là C 47H51NO14. Trọng lượng phân tử 853,9. Cấu
tạo gồm một nhân Taxane với bốn vòng oxatane ở vị trí C4, C5 và một ester ở vị trí
C13.
Taxol có dạng tinh thể nhỏ, rất mịn, màu trắng , không tan trong nước chỉ tan
trong một số dung môi hữu cơ như cồn ethylic, methanol, chlorofrom, .., nhiệt độ
nóng chảy khoảng 216 – 2170C.

Page 11


Nghiên cứu ảnh hưởng của thành phần khoáng và các yếu tố khác nhằm nâng cao
hàm lượng taxol trong nuôi cấy tế bào mô sẹo Thông Đỏ (Taxus wallichiana Zucc)
2.3.2 Cơ chế hoạt động của Taxol
Taxol và Taxotere chỉ hoạt động duy nhất trên hoạt động phân chia của tế bào

ung thư. Taxol chỉ tác động trên vi ống của tế bào ung thư nhưng không tác động lên
DNA tế bào như các lọai thuốc trị ung thư khác.
Trong tế bào, vi ống có nhiệm vụ kiểm soát vị trí của nhiễm sắc thể trong suốt
quá trình phân chia tế bào và luôn ở trạng thái cân bằng động (một đầu vi ống luôn
không ngừng trùng hợp (polimer hóa), một đầu luôn khử trùng hợp (khử polimer
hóa), tốc độ polimer hóa và khử polimer hóa gần như luôn bằng nhau, chỉ thay đổi khi
có sự biến đổi của trạng thái tế bào).
Khi có sự hiện diện Taxol trong tế bào, Taxol sẽ bám vào vách trong vi ống,
kích thích sự polimer hóa đồng thời ngăn cản sự khử polimer hóa đầu còn lại, làm mất
tính cân bằng của vi ống, phá vỡ chức năng thông thường của vi ống, ảnh hưởng trực
tiếp đến sự phân chia tế bào và gây chết tế bào.
2.3.3 Sơ lược về quá trình sản xuất Taxol
Taxol có nhiều trong các bộ phận của cây Thông Đỏ, đặc biệt là vỏ cây, lá và
phần lỏi thân cây. Tuy nhiên, việc tách chiết Taxol từ các bộ phận của cây này rất khó
khăn, hiệu suất rất thấp và vô cùng tốn kém. Đồng thời, vỏ cây Thông Đỏ rất mỏng và
phát triển rất chậm, việc khai thác vỏ cây sẽ làm chết cây. Hiện nay, có bốn phương
pháp sản xuất và thu nhận Taxol mà không cần phải khai thác vỏ cây cây Thông Đỏ:
+ Tổng hợp hóa học: tổng hợp nhân tạo nhưng giá thành quá cao, khó có thể
đưa ra thị trường.
+ Bán tổng hợp từ tiền chất tự nhiên: tổng hợp từ tiền chất Taxol 10 –
deacetylbaccatin III có trong lá cây Taxus.
+ Sản xuất từ nấm hay vi khuẩn: sản xuất Taxol từ vi sinh vật có nhiều hứa hẹn
nhưng chưa có kết quả khả quan.
+ Nuôi cấy tế bào Taxus: phương pháp này được xem là ổn định và hiệu quả
nhất hiện nay.
Phần lớn các nghiên cứu về phương pháp nuôi cấy tế bào cây Thông Đỏ để thu
nhận Taxol cùng các hợp chất liên quan đều được thực hiện trên các loài Taxus
wallichiana (Thông Đỏ Himalaya), Taxus brevifoia (Thông Đỏ Thái Bình Dương),

Page 12

Nghiên cứu ảnh hưởng của thành phần khoáng và các yếu tố khác nhằm nâng cao
hàm lượng taxol trong nuôi cấy tế bào mô sẹo Thông Đỏ (Taxus wallichiana Zucc)
Taxus baccata (Thông Đỏ Châu Âu), Taxus cuspidata (Thông Đỏ Nhật Bản), Taxus
chinesis (Thông Đỏ Trung Quốc)…
Quá trình nuôi cấy tế bào cây Thông Đỏ thường sẽ lần lượt diễn ra qua các giai
đọan như : sự tạo mô sẹo, sự tạo huyền phù tế bào, sự sinh phôi sôma. Mô sẹo được
tạo ra từ mẫu cấy được đặt trên môi trường thích hợp. Huyền phù tế bào sẽ được tạo ra
bằng cách nuôi cấy tế bào mô sẹo trong môi trường lỏng, phôi. Sự sinh phôi sôma có
thể xảy ra trực tiếp trên môi trường thích hợp hoặc gián tiếp từ mô sẹo hay huyền phù
tế bào.
Việc nuôi cấy tế bào trong môi trường nhân tạo vẫn có thể buộc tế bào sản sinh
các hợp chất thứ cấp tương tự như trong cơ thể thực vật. Điều này được thực hiện dễ
dàng do mỗi tế bào thực vật đều là đơn vị cơ sở cấu trúc và chức năng độc lập, có khả
năng thực hiện mọi sự chuyển hóa, tăng trưởng, phát triển cũng như sinh sản của cơ
thể thực vật nói riêng và mọi sinh vật sống nói chung.
Việc thu nhận hợp chất thứ cấp đều có thể từ mô sẹo, từ huyền phù tế bào, từ
các cơ quan nuôi cấy hay từ lông rễ, tuy nhiên, huyền phù tế bào là hệ thống nuôi cấy
thường được sử dụng nhất và đã được áp dụng thành công với rất nhiều lọai thực vật
khác nhau hay với nhiều lọai hợp chất thứ cấp cũng như alkaloid khác nhau.
2.3.4 Ưu điểm của quá trình nuôi cấy Taxol
Hệ thống tế bào cung cấp sản phẩm đồng nhất, liên tục, không bị hạn chế,
không phụ thuộc mùa màng, sâu – dịch bệnh, thiên tai …
Các hệ thống tế bào có thể được nuôi cấy trong các bình phản ứng sinh học lớn
(bioreactor) và có thể được cảm ứng để sản xuất một lượng lớn Taxol bằng cách thay
đổi điều kiện môi trường hay điều kiện nuôi cấy.
Hệ thống tế bào sẽ dễ dàng thích nghi với những thay đổi điều kiện môi trường
hơn so với cây ngoài tự nhiên.
Các hệ thống tế bào có thể chỉ sản xuất một phổ các chất rất hạn chế so với khi

ly trích các chất từ các bộ phận khác, giúp ích cho việc tinh sạch sản phẩm về sau
được đơn giản hơn.
Bên cạnh việc cung cấp Taxol, các hệ thống tế bào nuôi cấy cũng có thể cung
cấp nhiều tiền chất của Taxane, nhằm mục đích sử dụng để bán tổng hợp Taxol hay
bán tổng hợp các dẫn xuất khác của Taxol.
Page 13


Nghiên cứu ảnh hưởng của thành phần khoáng và các yếu tố khác nhằm nâng cao
hàm lượng taxol trong nuôi cấy tế bào mô sẹo Thông Đỏ (Taxus wallichiana Zucc)
2.4 Nuôi cấy mô sẹo
2.4.1 Khái niệm
Đây là bước đầu tiên trong nhiều phòng nuôi cấy mô. Việc nhân số lượng lớn mô
sẹo từ mẫu cấy đầu tiên là cần thiết. Mẫu cấy đầu tiên có thể lấy từ cây con vô trùng
trong ống nghiệm hay từ thân, rễ, lá của cây bên ngoài đã vô trùng. Sau khi mô sẹo
được hình thành, có thể sử dụng làm nguồn nguyên liệu cho nhiều thí nghiệm khác
như nuôi cấy tế bào trần, nuôi cấy soma sản xuất các chất thứ cấp.
Mô sẹo là một khối tế bào phát sinh vô tổ chức, có hình dạng không xác định.
Được hình thành từ mặt cắt của thân hay rễ, bao gồm tế bào nhu mô hay thành phần tế
bào rây. Đặc tính mô sẹo phát triển không theo quy luật, có thể biệt hóa thành rễ, chồi
và phôi hoàn chỉnh.
Cảm ứng tạo mô sẹo chia làm 3 thời kỳ: thời kỳ cảm ứng các tế bào chuyển hóa
của mẫu cấy chuyển ngược trạng thái phát triển, biến đổi hình thái và chức năng theo
hướng tế bào phân sinh. Thời kỳ phân chia tế bào: các tế bào phân hóa của mô sẹo có
tần suất phân chia tương đối nhanh. Thời kỳ phân hóa tế bào: tốc độ phân chia và sinh
trưởng giảm đi cho tới khi dừng hẳn, trong mô sẹo xuất hiện cấu trúc mô dẫn.
Tác nhân chủ yếu cảm ứng mô sẹo là chất điều hòa sinh trưởng. Tùy vào từng
loại thành phần, liều lượng và nồng độ các loại kích thích tố mà cảm ứng mô sẹo khác
nhau. Thường mô sẹo được hình thành trên môi trường giàu auxin, có thể kết hợp với
cytokinin tùy từng loại cây. Hàm lượng hormon nội sinh và chiều di chuyển của các

hormon này trong mẫu cấy có ảnh hưởng đến phát sinh mô sẹo. Vì vậy nguồn mẫu
cấy, việc lấy mẫu, cách đặt mô sẹo trên môi trường nuôi cấy sẽ ảnh hưởng đến sự phát
sinh mô sẹo dẫn đến những phản ứng khác nhau của mẫu cấy.
Mô sẹo thường có màu vàng, trắng, xanh hay màu sắc tố anthocyanin. Sự biệt
hóa của tế bào hình thành những chất liệu cấu tạo mô, các tế bào rây, vùng mô phân
sinh trung tâm của sự tạo nên chồi và rễ. Nhiều nhà khoa học cho rằng, mô sẹo được
tạo ra từ những mô hay cơ quan có chứa diệp lục có khả năng quan tự dưỡng. Mô sẹo
có chứa diệp lục phụ thuộc vào lượng đường bổ sung trong môi trường và cường độ
ánh sáng. Có nhiều yếu tố ảnh hưởng đến khả năng quang tự dưỡng của tế bào chứa
diệp lục (tế bào có màu xanh) như: cường độ ánh sáng, ánh sáng màu xanh cần thiết
cho sự biệt hóa diệp lục hình thành các enzyme, đường thấp, auxin thấp, CO 2 cao,
Page 14


Nghiên cứu ảnh hưởng của thành phần khoáng và các yếu tố khác nhằm nâng cao
hàm lượng taxol trong nuôi cấy tế bào mô sẹo Thông Đỏ (Taxus wallichiana Zucc)
tăng hàm lượng phosphate và những tế bào quang tự dưỡng có khả năng cố định CO 2
bằng chu trình Calvin mặc dù có sự xuất hiện của các acid hữu cơ 4 carbon.
Một vấn đề quan tâm trong nuôi cấy mô sẹo là sự biến tính tế bào. Sự biến tính
này xảy ra do: độ già của mẫu, sự thay đổi tế bào chất của nhân, tế bào đa bội thể có
số lượng DNA cao, thời gian duy trì nuôi cấy mô sẹo, điều kiện nuôi cấy, thành phần
môi trường nhất là chất điều hòa sinh trưởng.
Để tạo mô sẹo trong môi trường nuôi cấy có bổ sung chất điều hòa sinh trưởng,
đôi khi dịch chiết. Phụ thuộc vào từng loại mô nuôi cấy mà chất điều hòa sinh trưởng
thêm vào có khác nhau. Chất điều hòa sinh trưởng thường tổ hợp thành 4 nhóm:
auxin, cytokinin, auxin kết hợp với cytokinin, dịch chiết (Trần Văn Minh, 2006).
2.4.2 Các yếu tố ảnh hưởng tới quá trình phát sinh mô sẹo
Hầu hết các mô và cơ quan thực vật đều có khả năng tạo mô sẹo. Khả năng này
phụ thuộc và trạng thái sinh lí, hóa sinh và kiểu gen. Sự tăng sinh mô sẹo là do sự cân
bằng giữa trạng thái sinh lí mẫu nuôi cấy và tác động của các chất điều hòa sinh

trưởng.
Cơ quan được nuôi cấy: các mô và cơ quan khác nhau của thực vật có thể được
sử dụng làm vật liệu nuôi cấy tạo mô sẹo như lá, thân, rễ, củ, chồi hoa, túi phấn, phôi
hợp tử chưa trưởng thành và trưởng thành. Tuy nhiên với mỗi loại mô hay cơ quan
thường phải sử dụng các chất điều hòa sinh trưởng và nồng độ sử dụng phù hợp với
độ nhạy cảm của tế bào trong mô hay cơ quan đó.
Sinh lí mẫu nuôi cấy: mẫu cơ quan nuôi cấy trưởng thành thường khó nuôi cấy
phát sinh cơ quan hay mô sẹo. Ngược lại với những mẫu nuôi cấy còn non, auxin kích
thích tạo mô sẹo dễ dàng trên những vết cắt.
Vai trò của ánh sáng: tùy loài thực vật hay mẫu nuôi cấy quá trình hình thành
mô sẹo cần ánh sáng hay trong tối. Ngoài ra ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng
thực vật như auxin có vai trò quan trọng trong sự tạo mô sẹo.
Chất điều hòa sinh trưởng thực vật: auxin có vai trò quan trọng trong sự tạo mô
sẹo. Trong môi trường nuôi cấy, auxin thường gây ra: sự tạo bướu ở các mô và cơ
quan, kích thích sự phân chia tế bào (tạo mô sẹo), kích thích sự tạo rễ bất định, gây ra
sự phát sinh phôi từ tế bào soma trong dịch huyền phù tế bào. Khi nồng độ auxin thấp
thì sự tạo rễ chiếm ưu thế, khi nồng độ auxin cao sẽ không có sự tạo rễ bất định nhưng
Page 15


Nghiên cứu ảnh hưởng của thành phần khoáng và các yếu tố khác nhằm nâng cao
hàm lượng taxol trong nuôi cấy tế bào mô sẹo Thông Đỏ (Taxus wallichiana Zucc)
lại xảy ra sự tạo mô sẹo. Auxin được sử dụng để tạo mô sẹo với loại và nồng độ thay
đổi tùy thuộc vào vật liệu nuôi cấy. Đa số các mẫu cấy thực vật thuộc nhóm song tử
diệp không có khả năng tạo mô sẹo trong môi trường chỉ có auxin mà cần phải có sự
phối hợp giữa auxin và cytokinin. Sự tạo mô sẹo từ lá solanum melongena xảy ra trên
môi trường có nhiều loại auxin khác nhau như NAA; 2,4-D; 2,4,5-T ở các nồng độ
thay đổi từ 0,1 - 10 mg/l, còn ở tử diệp cây mầm Azadirachta indica cần IAA ở nồng
độ 0,5 mg/l và BA 1,0 mg/l để có thể tạo mô sẹo (Nguyễn Đức Lượng và Lê Thị Thủy
Tiên, 2006).

2.4.3 Nuôi cấy mô tế bào và sản xuất hoạt chất thứ cấp
Các chất trao đổi thứ cấp hay còn gọi là các chất thứ cấp có thể xếp trong ba
nhóm chính: alkaloid, tinh dầu và glycoside. Các alkaloid có dạng tinh thể là các hợp
chất chứa nitrogen, có thể được tách chiết bằng cách dùng dung dịch acid. Alkaloid có
hoạt tính sinh trên tất cả động vật và được sử dụng trong công nghiệp dược. Họ alkaloid
bao gồm: codein, nicotine, caffeine và morphine. Các tinh dầu chứa hỗn hợp terpenoid
và được sử dụng như là chất mùi, chất thơm và dung môi. Glycoside bao gồm các
phenolic, tanin và flavonoid, saponin và các cyanogenic glycoside, một số trong chúng
được sử dụng làm chất nhuộm, các chất mùi thực phẩm và dược phẩm.
Kỹ thuật nuôi cấy tế bào thực vật có thể cải thiện các hợp chất có giá trị trong y
dược, gia vị, hương liệu và màu nhuộm mà không thể sản xuất chúng từ các tế bào vi
sinh vật hoặc tổng hợp bằng con đường hóa học. Những năm gần đây, sự phát triển
của các hợp chất thứ cấp quan trọng trong thương mại là kết quả được mong đợi nhất
trong lĩnh vực nghiên cứu này. Ưu thế về mặt nguyên lí của kỹ thuật nuôi cấy tế bào
thực vật là có thể cung cấp liên tục các nguồn nguyên liệu để tách chiết một tỉ lệ lớn
lượng hoạt chất từ tế bào thực vật nuôi cấy (Mulbagal và Tsay, 2004).
Một trong những nhân tố quan trọng ảnh hưởng đến việc sản xuất các hợp chất
thứ cấp từ tế bào thực vật là sự phân hóa hình thái. Nhiều hợp chất thứ cấp được sản
xuất trong suốt quá trình phân hóa tế bào, vì thế chúng được tìm thấy trong các mô có
khả năng phân hóa cao như rễ, lá và hoa. Do sự phân hóa hình thái và sự trưởng thành
không xuất hiện trong nuôi cấy tế bào nên các chất thứ cấp có khuynh hướng ngưng
tạo thành trong quá trình nuôi cấy. Tuy nhiên, các tế bào không phân hóa trong nuôi
cấy huyền phù thường tạo thành một khối vài trăm tế bào, các tế bào ở giữa khối có sự
Page 16


Nghiên cứu ảnh hưởng của thành phần khoáng và các yếu tố khác nhằm nâng cao
hàm lượng taxol trong nuôi cấy tế bào mô sẹo Thông Đỏ (Taxus wallichiana Zucc)
tiếp xúc với môi trường khác với các tế bào ở bên ngoài nên sự phân hóa sẽ xuất hiện
tới một mức độ nào đó trong khối để tạo các chất thứ cấp.

Nuôi cấy mô sẹo (trên môi trường thạch) có ưu điểm là thao tác đơn giản, dễ vận
chuyển nhưng nhược điểm là thể tích nuôi cấy bé nên khó phát triển ở quy mô công
nghiệp, mẫu nuôi cấy chỉ tiếp xúc được một mặt với nguồn dinh dưỡng, những sản
phẩm do mẫu nuôi cấy tạo ra trong quá trình trao đổi chất sẽ tích tụ xung quanh dẫn
đến làm chậm sự sinh trưởng của tế bào.
2.4.4 Các giai đoạn phát triển của mô sẹo
Mô sẹo cấy chuyền càng nhiều lần khả năng tái sinh càng giảm. Sự tăng trưởng
của mô sẹo thường theo đường cong sigma và gồm 5 pha: Thời kì đầu tế bào chuẩn bị
phân chia (lag phase), thời kì tăng trưởng nhanh tế bào phân chia cực đại (exponential
phase), thời kì tăng trưởng tuyến tính tế bào phân chia chậm dần và tăng kích thước
(linear stage), thời kì tăng trưởng chậm (decelerating growth), thời kì cân bằng số
lượng tế bào là hằng số (stationary phase) (Dương Công Kiên, 2003).
Auxin có vai trò khá quan trọng trong sự tăng sinh của mô sẹo. Mô sẹo sau khi
hình thành nếu được tiếp tục duy trì trong môi trường có auxin thì sẽ tăng sinh nhanh,
nhưng nếu chuyển sang môi trường có đầy đủ các thành phần dinh dưỡng nhưng
không có auxin thì sự tăng sinh của mô sẹo sẽ rất chậm. Tốc độ tăng trưởng của mô
sẹo phụ thuộc vào thành phân cũng như nồng độ của auxin (Nguyễn Đức Lượng và Lê
Thị Thủy Tiên, 2006).
2.4.5 Hình thái mô sẹo
Sau khi trưởng thành mô sẹo được cấy chuyền. Môi trường cấy chuyền cũng
giống như môi trường tạo mô sẹo nhưng chất điều hòa sinh trưởng được giảm nồng
độ. Kích thước tách mô sẹo nhỏ vừa phải để tế bào phát triển mạnh nhất, thường cụm
mô sẹo có kích thước 5 - 10 mm và có trọng lượng 20 - 100 mg, thời gian giữa 2 lần
cấy chuyền là 20 - 30 ngày phụ thuộc vào từng loại mô sẹo. Trong quá trình phát triển
mô sẹo thường xuất hiện 2 loại tế bào:
- Loại tế bào xốp, có không bào to, nhân nhỏ, tế bào chất loãng.
- Loại tế bào cứng, có không bào nhỏ, nhân to, tế bào chất đậm đặc.
Dạng mô sẹo cũng ảnh hưởng đến khả năng tái sinh của các cơ quan của khối mô.
Khả năng chồi sớm mất đi ở mô sẹo xốp nhưng vẫn duy trì ở mô sẹo cứng. Nguyên nhân
Page 17

Nghiên cứu ảnh hưởng của thành phần khoáng và các yếu tố khác nhằm nâng cao
hàm lượng taxol trong nuôi cấy tế bào mô sẹo Thông Đỏ (Taxus wallichiana Zucc)
có thể do tế bào mô sẹo mất đi khả năng tổng hợp một số chất thiết yếu cho sự tái sinh
của nó khi số lần cấy chuyền tăng lên (Gautht, 1962). Vì vậy nuôi cấy mô sẹo nhằm mục
đích tái sinh chồi cần cố gắng tìm điều kiện môi trường thích hợp cho sự hình thành khối
mô sẹo cứng, chắc. Các mô sẹo xốp cần được loại bỏ dần vì mô sẹo này phát triển rất
nhanh thường lấn át mô sẹo cứng có khả năng tái sinh phôi.
Chất điều hòa sinh trưởng thực vật hiện diện trong môi trường nuôi cấy cũng
có tác động khá lớn đến sự phát sinh hình thái của mô sẹo. Nếu giữ nguyên nồng độ
và loại auxin trong môi trường nuôi cấy nhưng thay đổi thành phần và nồng độ
cytokinin thì hình thái của mô sẹo sẽ thay đổi. Trong đa số các trường hợp, sự hiện
diện của BA trong môi trường nuôi cấy kích thích sự tạo mô sẹo dạng nốt, chắc, màu
nâu và có khả năng sinh phôi. Mô sẹo trên môi trường có kinetin có dạng bở và
thường không có khả năng sinh phôi. Nồng độ auxin tăng cao kích thích sự tạo mô sẹo
dạng bở nhưng khi giảm nồng độ auxin thì mô sẹo có dạng nốt và chắc (Nguyễn Đức
Lượng và Lê Thị Thủy Tiên, 2006).
2.5.6 Màu sắc của mô sẹo
Mô sẹo của nhiều loài thực vật khác nhau về cấu tạo (tổ chức), độ xốp và màu
sắc. Nó có thể có màu vàng úa hay trắng, có màu diệp lục hay màu sắc tố anthocyanin.
Sắc tố đôi khi đồng dạng hay bị phân bố có những vùng không có cấu trúc sắc tố. Cấu
trúc sắc tố thường giống như cấu trúc ở mô của mô sẹo và có lẻ mất dần đi qua cấy
chuyền nhiều lần. Mô sẹo có cấu trúc sắc tố xanh sinh trưởng ngoài sáng tốt hơn trong
tối. Cấu trúc sắc tố còn chịu ảnh hưởng ở các mức độ khác nhau của hàm lượng
đường, sự có mặt của tinh bột hòa tan, thiếu hụt nitrogen, nhiệt độ, ánh sáng và auxin
ngoại sinh.
Theo Mol và ctv (1996), anthocyanin là tác nhân tạo nên màu xanh, tím, đỏ và
cam ở thực vật bật cao. Trong tự nhiên, việc tổng hợp anthocyanin bị tác động bởi các
yếu tố như bức xạ ánh sáng, nhiệt độ, chất kích kháng và mức độ dinh dưỡng, hàm

lượng đường sucose (Nagira và Ozeki, 2004; Hennayake và ctv, 2006), nồng độ NH 4+
(Konczak và ctv, 2001; Piovan và Filippini, 2007). Trong đó, ánh sáng là một yếu tốt
khá quan trong. Cụ thể mô sẹo khi được nuôi cấy ngoài sáng có khả năng tổng hợp
anthocyanin cao hơn trong tối. Kết quả sự tổng hợp anthocyanin của mô thực vật khi
được chiếu sáng được quyết định bởi của các gen liên quan đến sinh tổng hợp
Page 18


Nghiên cứu ảnh hưởng của thành phần khoáng và các yếu tố khác nhằm nâng cao
hàm lượng taxol trong nuôi cấy tế bào mô sẹo Thông Đỏ (Taxus wallichiana Zucc)
anthocyanin (Mol và ctv, 1996). Mô sẹo phát triển trong điều kiện được chiếu sáng sẽ
có hoạt động trao đổi chất tốt hơn so với mô sẹo nuôi trong tối và một lượng lớn
protein được sản xuất, đây là một dấu hiệu của sự tăng biểu hiện gen. Bên cạnh đó,
một số nghiên cứu về tác động của ánh sáng đến một số gen tổng hợp anthocyanin chỉ
ra rằng sự biểu hiện của gen tổng hợp anthocyanin được kiểm soát chủ yếu bởi các cơ
quan thụ cảm UV-B và cơ quan này được điều chỉnh bởi ánh sáng. Cơ chế sự truyền
tín hiệu liên quan đến vai trò trung gian của ánh sáng như trong nghiên cứu nuôi cấy
mô sẹo Oxalis reclinata ánh sáng là một tác nhân kích thích tổng hợp anthocyanin hay
trong công trình nghiên cứu của Crouch và ctv (1993), người đầu tiên báo cáo về sự
tích lũy màu đỏ, màu của anthocyanin trong nuôi cấy mô sẹo Oxalis reclinata.
2.4.7 Phát sinh cơ quan trong nuôi cấy mô sẹo
Sự phát sinh cơ quan có thể hình thành trong khối mô sẹo được kiểm soát phát
sinh cơ quan tiềm sinh qua vận dụng môi trường dinh dưỡng và chất điều hòa sinh
trưởng. Sự tái sinh diễn ra trên môi trường đơn giản hơn là nhu cầu nuôi cấy mô.
Thông thường môi trường dinh dưỡng chứa các thành phần vô cơ, hữu cơ, chất điều
hòa sinh trưởng… Mỗi loại mô có nhu cầu riêng và đôi khi mô cần các chất hỗ trợ khi
sinh trưởng kém. Hiện tượng này phụ thuộc vào một số tác nhân như nguồn gốc mô
sẹo nuôi cấy, kiểu gen và tuổi sinh lý, hàm lượng chất điều hòa sinh trưởng và các tác
nhân vật lý.
Sự phát sinh cơ quan phụ thuộc vào kích thước mẫu nuôi cấy. Mẫu nuôi cấy

nhỏ khả năng tái sinh thấp, mẫu nuôi cấy lớn có chứa nhu mô tủy, mô mạch và tượng
tầng có khả năng phát sinh chồi mà không phụ thuộc vào nồng độ auxin và cytokinin.
Tuổi sinh lý mẫu nuôi cấy cũng là nhân tố ảnh hưởng đến quá trình hình thành cơ
quan. Ở Echevaria, lá già phát sinh chồi, lá non phát sinh rễ và lá có độ tuổi trung
bình phát sinh chồi và rễ. Chất lượng và cường độ ánh sáng tác động theo quy luật ảnh
hưởng đến hiện tượng phát sinh cơ quan. Vùng ánh sáng xanh thúc đẩy hình thành
chồi, ánh sáng đỏ thích hợp hình thành rễ. Trong tính chất tự nhiên quá trình biệt hóa
trong mô có thể bị kiểm soát bởi nhiều bước sóng ánh sáng khác nhau. Ánh sáng gia
tăng hình thành rễ ở vài mô tách rời và ức chế các mô khác.
 Sự hình thành chồi từ mô sẹo

Page 19


Nghiên cứu ảnh hưởng của thành phần khoáng và các yếu tố khác nhằm nâng cao
hàm lượng taxol trong nuôi cấy tế bào mô sẹo Thông Đỏ (Taxus wallichiana Zucc)
Sự hình thành chồi từ mô sẹo được kích thích bởi: các chất sinh trưởng đưa vào
môi trường, chất được sản sinh ra trong nuôi cấy mô sẹo, các chất có chứa sẵn trong
các mẫu nuôi cấy. Khả năng hình thành chồi từ mô sẹo phụ thuộc vào số lần cấy
truyền mà các chất có trong mẫu không có khả năng tổng hợp trong thời gian dài và
sự hình thành tế bào xốp. Sự hình thành chồi được điều khiển bằng: tỷ lệ
cytokinin/auxin từ 10 - 100, carbohydrate như sucrose và các chất hữu cơ như casein
hydrolysate, điều kiện nuôi cấy, dịch chiết. Tạo rễ cần auxin, đường, khoáng, nhiệt độ,
ánh sáng, adenin sulfate có tác dụng cản trở auxin. GA 3 cản trở sinh tổng hợp và tích
lũy hạt tinh bột, cần thiết trong hình thành chồi. Sự hình thành chồi nhiều khi lại xảy
ra trên môi trường không sinh trưởng, hay có cytokinin + IBA có hiệu quả hơn so với
chỉ dùng auxin.
Ở hầu hết mô sẹo, sự hình thành chồi thường bị giảm do tuổi sinh lý già và cấy
chuyền nhiều lần nhưng khả năng ra rễ có thể tồn tại nhiều năm như ở cây mía. Phát
sinh chồi đỉnh có thể phát sinh rễ và ngược lại hay chồi phát sinh có thể sinh trưởng

không cần rễ như ở loài Pergularia. Mô sẹo có thể duy trì khả năng không biệt hóa
qua sinh trưởng tăng sinh không cần hormone và trao đổi chất. Đây là quá trình sinh
trưởng mạnh mẽ và mô sẹo thường khó tái sinh (Trần Văn Minh, 2003).
2.4.8 Ứng dụng của nuôi cấy mô sẹo
- Nhân giống in vitro các loài thực vật mà phương pháp nhân giống đỉnh sinh
trưởng ít hiệu quả hay khó thực hiện.
- Nghiên cứu quá trình hình thành cơ quan.
- Làm nguồn nguyên liệu để nuôi cấy tế bào đơn cho chọn lọc dòng tế bào.
- Thu nhận các sản phẩm hoạt chất thứ cấp có hoạt tính sinh học cao.
- Làm nguyên liệu nuôi cấy huyền phù tế bào.
2.4.9 Những yếu tố ảnh hưởng đến quá trình sản xuất các hợp chất thứ cấp trong
nuôi cấy tế bào
Các thông số hóa học và vật lí như thành phần môi trường khoáng và nồng độ
pH môi trường, chất điều hòa sinh trưởng, nhiệt độ nuôi cấy, sự thông khí, sự lắc hoặc
khuấy và ánh sáng ảnh hưởng đến hàm lượng các hợp chất thứ cấp đã được nghiên
cứu nhiều (Goleniowski và Trippi, 1999; Wang và ctv, 1999). Một vài sản phẩm tích
lũy trong tế bào ở mức cao hơn so với ở trong cây trồng tự nhiên khi được nuôi cấy ở
Page 20


Nghiên cứu ảnh hưởng của thành phần khoáng và các yếu tố khác nhằm nâng cao
hàm lượng taxol trong nuôi cấy tế bào mô sẹo Thông Đỏ (Taxus wallichiana Zucc)
điều kiện tối ưu. Các thông số vật lí và yếu tố dinh dưỡng có thể gần như là yếu tố cơ
bản cho việc tối ưu hóa hiệu suất nuôi cấy.
− Các chất điều hòa sinh trưởng: chất điều hòa sinh trưởng cần thiết cho nuôi cấy
tế bào, ảnh hưởng đến quá trình biệt hóa tế bào hình thành cơ quan như chồi,
thân, lá, rễ. Ảnh hưởng đến sự tổng hợp các chất thứ cấp của nhóm auxin (IAA,
NAA, 2,4-D) và nhóm cytokinin (kinetin và BA).
− Nguồn đạm: chủ yếu là đạm hòa tan, đạm dạng nitrat hay hỗn hợp đạm nitrat
và amonium. Đôi khi sử dụng casein hydrolysate hay nguồn đạm tự nhiên.

− Nguồn cacbon: sucrose là nguồn cacbon và năng lượng chủ yếu được sử dụng
trong nuôi cấy mô. Trong nhiều trường hợp hàm lượng cacbon cũng ảnh hưởng
đến sự phát triển của tế bào và sản lượng của các chất trao đổi thứ cấp. Tùy vào
từng loại cây trồng mà sử dụng đường mannose, galactose hay glucose. Loại
đường và nồng độ đường được sử dụng cũng ảnh hưởng đến nồng độ các chất
thứ cấp được thu nhận.
− Nhiệt độ, pH, ánh sáng và oxygen: là tất cả những thông số cần được kiểm tra
trong nghiên cứu sản xuất hợp chất thứ cấp. Nhiệt độ từ 17 - 25 °C thường được
dùng trong nuôi cấy tạo mô sẹo và phát triển tế bào nuôi cấy. Nhưng mỗi loại
cây sẽ thích hợp với một nhiệt độ cụ thể. pH của môi trường 5,6 - 5,8 trước khi
hấp khử trùng.
− Ánh sáng: các chất thứ cấp được tạo ra trong quá trình nuôi cấy ở điều kiện tối
hay có ánh sáng phụ thuộc vào từng loài thực vật và trong quá trình dinh dưỡng
ở nuôi cấy in vitro là quá trình quang tự dưỡng. Mỗi loại thực vật có những
điều kiện tối ưu khác nhau để sinh trưởng và sản xuất các chất hữu dụng, vì thế
tùy từng trường hợp mà thay đổi các yếu tố cho phù hợp.
− Các chất khác: trong những nghiên cứu gần đây cho thấy sử dụng các cơ chất
trong quá trình nuôi cấy là cần thiết để tăng hiệu suất thu nhận các chất thứ cấp.
Điều này cho phép thực hiện các phản ứng sinh tổng hợp ra các chất thứ cấp
mới mà bản thân tế bào thực vật không có.
2.4.10 Các phương pháp nâng cao tổng hợp hoạt chât trong nuôi cấy tế bào
- Tối ưu hóa điều kiện nuôi cấy
- Phương pháp cố định tế bào
- Chọn lọc các dòng tế bào cho năng suất cao
Page 21


Nghiên cứu ảnh hưởng của thành phần khoáng và các yếu tố khác nhằm nâng cao
hàm lượng taxol trong nuôi cấy tế bào mô sẹo Thông Đỏ (Taxus wallichiana Zucc)
- Cung cấp tiền chất (precursor feeding)

- Chất kích kháng bảo vệ thực vật (chất cảm ứng)
2.4.10.1 Tối ưu hoá điều kiện nuôi cấy
Khả năng tổng hợp các hợp chất thứ cấp của tế bào có thể chịu ảnh hưởng bởi
nhiều yếu tố vật lý (như nhiệt độ, độ thoáng khí, ánh sáng, pH…) và hoá học (như
chất điều hoà sinh trưởng thực vật), thành phần các chất trong môi trường nuôi cấy…
Tuỳ từng loại tế bào mà sự đáp ứng với các yếu tố kể trên sẽ khác nhau. Khi xác định
được điều kiện nuôi cấy tối ưu thì sự sản xuất và tích luỹ các hợp chất thứ cấp trong tế
bào in vitro sẽ cao hơn so với cây trồng ngoài thiên nhiên (Verpoorte và ctv, 1994)
2.4.10.2 Chọn lọc dòng tế bào có khả năng sản xuất cao
Hệ thống tế bào nuôi cấy là một quần thể tế bào có nhiều kiểu gen khác nhau.
Do đó, các đặc tính sinh lý của tế bào sẽ khác nhau. Phương pháp chọn lọc dòng tế
bào là một kỹ thuật hữu hiệu để tăng sản lượng các hợp chất thứ cấp.
2.4.10.3 Bổ sung tiền chất
Sự bổ sung các tiền chất hữu cơ xuất phát từ quan niệm cho rằng những hợp
chất này có thể là chất trung gian hoặc là chất khởi đầu của một con đường sinh tổng
hợp các sản phẩm thứ cấp nào đó. Sự bổ sung các tiền chất của quá trình sinh tổng
hợp các hợp chất thứ cấp mong muốn vào môi trường nuôi cấy giúp nâng cao hiệu quả
sản xuất của tế bào trong một số trường hợp xác định. Phương pháp này sẽ có giá trị
khi giá thành của các tiền chất không quá đắt.
2.4.10.4 Cố định tế bào
Trong lĩnh vực nuôi cấy tế bào thực vật để thu nhận các sản phẩm thứ cấp, việc
cố định tế bào giúp kéo dài thời gian sử dụng, đặc biệt là trong các hệ thống phản ứng
sinh học. Mặt khác, những tế bào cố định ít bị tác động bởi điều kiện môi trường hơn
so với tế bào tự do. Tế bào cố định thường là những tế bào có khả năng tiết các sản
phẩm thứ cấp ra môi trường ngoài. Tế bào ở trạng thái cố định đôi khi tạo ra được các
hợp chất thứ cấp có sản lượng cao hơn tế bào ở trạng thái lơ lững tự do. Các chất được
sử dụng để cố định tế bào là agarose, carageenan, alginate, agar, các sợi propylen…
Sự cố định tế bào giúp tăng sản xuất các hợp chất thứ cấp nhưng cũng không loại trừ
khả năng chính những chất cố định lại là tác nhân kích thích sự sản xuất các hợp chất
thứ cấp.

Page 22


Nghiên cứu ảnh hưởng của thành phần khoáng và các yếu tố khác nhằm nâng cao
hàm lượng taxol trong nuôi cấy tế bào mô sẹo Thông Đỏ (Taxus wallichiana Zucc)
2.4.10.5 Nhân tố cảm ứng (elicitor)
Tiến trình cảm ứng biểu hiện gene của các enzyme xúc tác tổng hợp các chất
biến dưỡng thứ cấp trong nuôi cấy tế bào thực vật được biết đến nhờ là sự cảm ứng
(Ketchum và ctv, 1999). Sự cảm ứng trong sản suất hợp chất thứ cấp của tế bào thực
vật xảy ra do sự tiếp xúc giữa tế bào thực vật với các biotic và abiotic elicitor. Thuật
ngữ “elicitor” được sử dụng đầu tiên cho các tác nhân kích thích bất kỳ dạng phản ứng
phòng vệ nào của cây với các bệnh lý xuất hiện trên đồng ruộng. Thực vật có thể sản
xuất ra các chất kháng sinh biến dưỡng thứ cấp nhờ các phytoalexin trong các phản
ứng chống lại sự tấn công của vi khuẩn. Do đó, các vi sinh vật (đặc biệt là nấm và các
thành phần của chúng) đã được sử dụng rộng rãi để cảm ứng sản xuất hợp chất thứ
cấp trong tế bào thực vật (Dicosmo và ctv, 1985).
2.4.11 Đường cong sinh trưởng
Sự tăng trưởng của mô sẹo thường theo đường cong sigma. Có 5 pha được định
rõ: thời kì đầu tế bào chuẩn bị phân chia; thời kì tăng trưởng nhanh tế bào phân chia
cực đại (exponential phase); thời kì tăng trưởng tuyến tính tế bào phân chia chậm dần
và tăng kích thước (linear stage); thời kì tăng trưởng chậm (decelerating growth).
Cuối cùng là thời kì cân bằng số lượng tế bào là hằng số. Trong mỗi pha, các tế bào
đáp ứng khác nhau cần kiểm soát sự tổng hợp của các chất thứ cấp, xác định pha tăng
trưởng để thu được sản phẩm với năng xuất cao.
2.5 Một số nghiên cứu về nuôi cấy mô sẹo
Theo Quách Thị Liên và Nguyễn Đức Thành (2003), đã nghiên cứu “Những
kết quả bước đầu trong việc tái sinh cây trinh nữ hoàng cung (Crinum latifolium L.)
từ mô sẹo”. Môi trường thích hợp để tạo mô sẹo cây trinh nữ hoàng cung là môi
trường MS có bổ sung sucroza 20 g/l + agar 7,5 g/l + nước dừa 20% + kinetin 1 ml/l +
inostol 200 ml/l +NAA 1 mg/l + Casein 400 mg/l.

Đối với cây Đơn Nem, sử dụng môi trường (MS +3 mg/l 2,4-D) và môi trường
(MS + 3 mg/l NAA) là tốt nhất cho quá trình hình thành mô sẹo, cho tỷ lệ mô sẹo cao
và thời gian hình thành mô sẹo sớm (theo Quách Thị Liên và ctv, 2004).
Dựa vào các kết quả nghiên cứu của các tác giả Bùi Văn Lệ và ctv (2006), mô
sẹo xanh được cảm ứng từ lá cây dừa cạn (Catharanthus roseus) invitro được nuôi
trong môi trường MS lỏng có bổ sung chất điều hòa tăng trưởng thực vật ở nồng độ 1
Page 23


Nghiên cứu ảnh hưởng của thành phần khoáng và các yếu tố khác nhằm nâng cao
hàm lượng taxol trong nuôi cấy tế bào mô sẹo Thông Đỏ (Taxus wallichiana Zucc)
mg/l NAA + 0,5 mg/l kinetin thu nhận được sinh khối và alkaloid toàn phần trên cây
dừa cạn là cao nhất. Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ đường saccharose đế việc nuôi
cấy dịch huyền phù tế bào dừa cạn cho kết quả ở nồng độ 60g/l cho lượng sản phẩm
là cao nhất.
Qua kết quả “nghiên cứu tìm hiểu ảnh hưởng của auxin và cytokinin lên quá
trình phát sinh hình thái của mô lá hoắc hương (Pogostemon cablin Benth) nuôi cấy
invitro”. Cho thấy, tỷ lệ hình thành mô sẹo của lá hoắc hương cao nhất trên môi
trường MS khi bổ sung 0,7 g/l 2,4D (tỷ lệ hình thành mô sẹo 96,6%), sau đó đến 0,7
mg/l IBA (tỷ lệ hình thành mô sẹo 85,5%) và cuối cùng là NAA (tỷ lệ hình thành mô
sẹo cao nhất là 76,5% đạt được ở công thức bổ sung 1 mg/l NAA) (theo Tạ Như Thục
Anh và ctv, 2008).
Theo nghiên cứu của Nguyễn Trung Thành và ctv (2008), đã nghiên cứu nhân
nhanh rễ bất định nhân sâm Panax ginseng C.A. Meyer: ảnh hưởng của một số nhân
tố lý hóa lên sự tăng trưởng sinh khối và sản phẩm trao đổi chất ginsenosides. Các
mẫu rễ nhân sâm được nuôi cấy trên môi trường cơ bản MS có bổ sung 1 mg/l 2,4D,
0,1 mg/l kinetin, và 3% đường là thích hợp cho sự hình thành và phát triển mô sẹo.
Đối với cây dây chiều (Tetracera scandens L.), sự phát sinh mô sẹo từ lá tốt
nhất trên môi trường MS có bổ sung 2,4-D 2,5 mg/l và BA 0,5 mg/l (theo Phạm Thị
Bích Ngọc và ctv, 2009).

Dựa vào các kết quả nghiên cứu của tác giả Lê Hồng Giang và ctv (2010), mô
lá non của cây bí kì nam tạo mô sẹo 75% sau 40 ngày nuôi cấy trên môi trường MS
bổ sung 0,5 mg/l NAA đơn hay kết hợp với 2 mg/l BA hay môi trường bổ sung 2 mg/l
NAA kết hợp 2 mg/l BA.
Qua kết quả “nuôi cấy mô sẹo và dịch huyền phù tế bào cây bèo đất Drosera
burmanni Vahl cho mục tiêu thu nhận Quinone” cho thấy, môi trường tạo mô sẹo tốt
nhất là môi trường B5 có bổ sung sacchrose 20 g/l, casein 100 mg/l, PVP 1 g/l.
Hormone thích hợp để cảm ứng tạo sẹo là 2,4-D 0,2 mg/l, NAA 0,2 mg/l (theo Quách
Ngô Diễm Phương và ctv, 2010).
Theo Lê Hồng Giang và ctv (2011), đã nghiên cứu “sự hình thành mô sẹo, phôi
và cây con ở cây mỏ quạ (Dischidia rafflesia Wall.) invitro”. Kết quả nghiên cứu đã
đạt được sự hình thành mô sẹo từ đoạn thân non của cây mỏ quạ với tỷ lệ 100% sau
Page 24


Nghiên cứu ảnh hưởng của thành phần khoáng và các yếu tố khác nhằm nâng cao
hàm lượng taxol trong nuôi cấy tế bào mô sẹo Thông Đỏ (Taxus wallichiana Zucc)
30 ngày nuôi cấy trên môi trường MS bổ sung 2,4-D nồng độ 0,5 mg/l và 1,5 mg/l kết
hợp BA 1 mg/l.
2.5 Một số nghiên cứu về cây thông đỏ
Theo Mai Văn Trì và ctv (2002), từ lá cây thông đỏ lâm đồng, Việt Nam, ngoài
10-deaxetybaccatin –III là một hợp chất được tìm thấy trong Taxus wallichiana Zucc.,
thì các tác giả đã phân lập được 7,7”,4’-tri-O-metymentoflavon, một biflavon rất hiếm
trong thiên nhiên. Hợp chất này đã được khảo sát cấu trúc và nhận dạng nhờ các
phương pháp phổ hiện đại.
Theo Bùi Thị Tường Thu Và Trần Văn Minh (2005), đã nghiên cứu kỹ thuật
nuôi cấy đỉnh sinh trưởng trong bảo tồn và phát triển cây thông đỏ cho kết quả chồi
non phát sinh sau 45 ngày trên môi trường nuôi cấy MS + BA (5 mg/l). Chồi non tái
sinh được sử dụng làm propagules trong vi nhân giống trên môi trường MS +BA (5
mg/l) + Ki (1 mg/l). Chồi non được nuôi cấy phát sinh rễ trên môi trường WPM +

NAA (1 mg/l) + Rhizopon (50 mg/l) sau 75 ngày nuôi cấy. AgNO 3 thích hợp cho
nuôi cấy ức chế sự hóa nâu mẫu. Chồi đỉnh chiếm ưu thế nhiều hơn trong quá trình
phát sinh và sinh trưởng của chồi bên.
Dựa vào kết quả nghiên cứu của tác giả Nguyễn Hữu Toàn và ctv (2007),
nghiên cứu độ ẩm lá thông đỏ ( Taxus wallichiana Zucc.) dao động trong khoảng 59 –
71% và đạt cao nhất trong thời gian từ tháng 6 – 9. Hàm lượng 10-deaxetybaccatin III
trong lá thông đỏ khô tăng dần theo thời gian thu hái từ tháng 1 đến các tháng 6 – 7 và
sau đó giảm dần cho đến tháng 12, hàm lượng cao nhất (0,037%) đạt được khi thu hái
lá vào tháng 6 và tháng 7. Hàm lượng 19-hydroxybaccatin III trong lá thông đỏ khô
tăng dần theo thời gian thu hái từ tháng 1 đến tháng 6 và sau đó giảm dần cho đến
tháng 12, hàm lượng cao nhất (0,032%) đạt được khi thu hái lá vào tháng 6.
Qua kết quả “nghiên cứu nuôi cấy phát sinh và tái sinh phôi soma thogn6 đỏ
invitro” với mẫu nuôi cấy lá cho tỷ lệ phát sinh tế bào phôi soma và khả năng tăng
sinh khối cao nhất ở nồng độ NAA (3-5 mg/l) ở cả hai điều kiện nuôi cấy trong tối
hoàn toàn và có chiếu sáng 2000lux, trên môi trường WPM. Nghiên cứu nhân sinh
khối tế bào soma trên môi trường agar (WPM +Cw + Vitamin B1 (5 mg/l) +Glycin (5
mg/l) +Sucrose (30 g/l) ) khi bổ sung TDZ (0,5 mg/l) thì khả năng tăng sinh khối tế
bào soma cao nhất (5,07 g). Nghiên cứu nhân sinh khối trên môi trường lỏng (WPM
Page 25