Bài giảng công nghệ di truyền chương 3 simple cloning

Simple cloning
Tp. Hồ Chí Minh
24-9-2014


Vector pUC
• Ori: vùng tự tái bản
• ampR or bla (betalactamase) : gen kháng
ampiciline
• lacZ’: betagalactosidase gene
• MCS: multi cloning site
• lacI: lac repressor gene


Vai trò của các gene
• bla: mã hóa beta-lactamase, enzyme thủy
phân vòng beta-lacta của ampiciline


Vai trò của các gene
• lacZ’: mã hóa beta-galactosidase, enzyme thủy
phân các đường đôi bao gồm X-gal tạo màu
xanh


Cấu trúc của…
(c) IPTG: isopropyl --D-thiogalactoside


Cắt vector và DNA

Nối bằng ligase được…


… hay…


… và cuối cùng là…

… DNA tái tổ hợp (recombinant).


Chuyển tất cả cấu trúc vào E.coli
• Hóa biến nạp (competence cell + thermal
shock)
• Điện biến nạp (electroporation)


Operon lacZ và IPTG


Operon lacZ và IPTG


Chọn dòng mang DNA tái tổ hợp
+ ampiciline
+ IPTG
+ XGal

Blue + White Systems

Khẳng định dòng vi khuẩn
mang DNA tái tổ hợp
– Dùng enzyme cắt và điện di
– Colony PCR (dùng primer chuyên biệt)


Yêu cầu cần có của Vector
1. Điểm khởi đầu nhân đôi (an origin of replication)
2. Chỉ thị chọn lọc (selectable marker)
3. Những trình tự nhận biết duy nhất của các RE
(suitable single restriction sites)
4. Kích thước phù hợp (suitable size)
5. Chỉ thị nhận biết đoạn DNA chèn
6. Nhiều bản sao trong tế bào vật chủ
7. Tàn tật , không có khả năng chuyển sang tế bào vi
khuẩn khác (loại bỏ những trình tự tham gia trong
quá trình tiếp hợp)


Vector nhân tạo đầu tiên, pBR322


Polycloning vector
• Chứa vùng polylinkers hay multicloning sites
• Chứa đoạn DNA ngoại lai từ 3 -10 kb


Nhóm pUC

Nhóm pUC


Nhóm pGEM


Nhóm pBluescript


Biến nạp (transformation)
• Lựa chọn phương pháp phụ thuộc vào:
– Số lượng DNA tái tổ hợp
– Kiểu DNA tái tổ hợp
– Vật chủ

• Hóa biến nạp (calcium chloride)
• Điện biến nạp (electroporation)


Tế bào chủ (host)
• Tế bào mang DNA tái tổ hợp, DNA tái tổ hợp
được nhân lên.
• Chọn vật chủ rất quan trọng như chọn vector.


Tính chất của tế bào chủ
1. Hiệu quả biến nạp
-

Khả năng tiếp nhận DNA, (chưa hiểu rõ).
Hiện diện hệ thống phân hủy DNA nội sinh.
 sử dụng các dòng E. coli đột biến làm giảm khả
năng phân hủy DNA ngoại sinh.

2. Sự bền vững của plasmid trong tế bào vật chủ
-

Hệ thống tái tổ hợp của tế bào vật chủ
 Sử dụng các dòng đột biến hạn chế sự tái tổ hợp


Tính chất của tế bào chủ
3. Dị tật: hạn chế khả năng sống sót khi phát tán
ra bên ngoài
4. Chứa cấu trúc lacZ’ hữu dụng cho chọn lọc
5. Các marker khác