Nghiên cứu điều trị thực nghiệm bệnh xơ gan trên mô hình chuột bị xơ gan sử dụng liệu pháp tế bào gốc

ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP.HCM
TRƯỜNG ĐH KHOA HỌC TỰ NHIÊN

TRƯƠNG HẢI NHUNG

NGHIÊN CỨU ĐIỀU TRỊ THỰC NGHIỆM BỆNH XƠ
GAN TRÊN MÔ HÌNH CHUỘT BỊ XƠ GAN SỬ DỤNG
LIỆU PHÁP TẾ BÀO GỐC
Chuyên ngành: SINH LÝ HỌC NGƯỜI VÀ ĐỘNG VẬT
Mã số: 62 42 30 01

TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ NGÀNH SINH HỌC

Tp. Hồ Chí Minh – Năm 2015









Công trình được hoàn thành tại: PTN Nghiên cứu và Ứng dụng Tế bào gốc,
Trường ĐH Khoa học Tự nhiên, ĐHQG Tp.Hồ Chí Minh
Người hướng dẫn khoa học: GS.TS. Nguyễn Văn Thanh
PGS.TS. Huỳnh Nghĩa
Phản biện 1:

PGS.TS. Phạm Thị Lệ Hoa

Phản biện 2:

GS.TS. Nguyễn Văn Thuận

Phản biện 3:

PGS.TS. Lê Văn Đông

Phản biện độc lập 1:

PGS.TS. Lê Văn Đông

Phản biện độc lập 2:

TS.BS. Ngô Quốc Đạt

Luận án sẽ được bảo vệ trước Hội đồng chấm luận án họp tại

vào lúc

giờ

ngày

tháng

năm

Có thể tìm hiểu luận án tại thư viện:
-

Thư viện Khoa học Tổng hợp Tp.HCM

-

Thư viện Trường Đại học Khoa học Tự Nhiên


MỞ ĐẦU
Gan là cơ quan có khả năng tái sinh nhưng trong các trường hợp
tổn thương mạn tính khả năng tự tái tạo của gan không còn và sau đó dẫn
đến tình trạng xơ hóa. Hiện nay, xơ gan được xếp vào danh sách 25 căn
bệnh gây tử vong cao nhất trên toàn thế giới. Việt Nam là nước có tỷ lệ
viêm gan và xơ gan rất cao (~20%) so với nhiều nước trên Thế giới. Các
biện pháp điều trị xơ gan hiện tại chưa thực sự mang lại kết quả như mong
đợi.
Hiện nay, ghép gan được cho là phương pháp điều trị hiệu quả và là
lựa chọn tốt nhất cho các bệnh nhân mắc bệnh gan giai đoạn cuối. Rào cản
lớn nhất của ghép gan là sự khan hiếm nguồn tạng. Ngoài ra, ghép gan trên
bệnh nhân xơ gan có nhiều rủi ro liên quan đến quá trình phẫu thuật.
Với các kiến thức nền tảng và chuyên sâu về tế bào gốc và y học tái
tạo, các nhà khoa học có thể đặt niềm tin vào việc sử dụng tế bào gốc trong
tái tạo mô gan ở các bệnh nhân xơ gan. Liệu pháp sử dụng tế bào gốc
trưởng thành có nhiều ưu điểm như: nguồn thu nhận dồi dào, có thể ghép tự
thân, vượt qua rào cản về đạo lí. Nhiều nghiên cứu lâm sàng và cận lâm
sàng trên thế giới, đã cho thấy những phát hiện đáng chú ý về hiệu quả và
vai trò của tế bào gốc.
Ở Việt Nam, chưa có nhiều nghiên cứu về liệu pháp tế bào gốc
trong điều trị xơ gan, do đó việc phát triển liệu pháp mới ứng dụng tế bào
gốc trong điều trị xơ gan là rất cấp thiết và sẽ mở ra hướng mới trong điều

trị xơ gan nói riêng và các bệnh về thoái hoá tế bào nói chung. Từ cơ sở
phân tích và nhận định, chúng tôi đề xuất đề tài “Nghiên cứu điều trị thực
nghiệm bệnh xơ gan trên mô hình chuột bị xơ gan sử dụng liệu pháp tế
bào gốc” nhằm đánh giá hiệu quả và vai trò điều trị của tế bào gốc trung
mô từ mô mỡ tự thân trên mô hình chuột xơ gan.
MỤC TIÊU CỦA LUẬN ÁN



1


Luận án được tiến hành với mục tiêu chung là nghiên cứu điều trị thực
nghiệm chuột bệnh xơ gan bằng tế bào gốc. Mục tiêu cụ thể như sau:
-

Thu nhận được tế bào gốc trung mô từ mô mỡ chuột (mADSC) xơ
gan

-

Gây tạo được mô hình bệnh xơ gan trên chuột bằng CCl4

-

Phân tích và đánh giá hiệu quả điều trị thực nghiệm của tế bào gốc
mô mỡ trên chuột bệnh xơ gan.

-

Phân tích và đánh giá vai trò điều trị của tế bào gốc trung mô từ mô
mỡ trên mô hình chuột thực nghiệm

NỘI DUNG NGHIÊN CỨU LUẬN ÁN:

Ý NGHĨA KHOA HỌC CỦA LUẬN ÁN:
Nghiên cứu này sử dụng nguồn tế bào gốc trưởng thành được thu nhận từ
nguồn mẫu không gây tranh cãi về mặt đạo lí. Mô hình chuột bị xơ gan
bằng CCL4, đây là mô hình kinh điển, dễ tiếp cận, hiệu quả của liệu pháp
dễ dàng đánh giá và có độ tin cậy cao. Kết quả nghiên cứu của luận án rút
ra được một số kết luận có ý nghĩa khoa học như sau:



2


-

mADSC thu nhận từ chuột xơ gan có biểu hiện cao các gen liên
quan đến tế bào gan. mADSC biểu hiện dương tính mạnh CYP1A1
và HGF.

-

CCl4 1ml/kg (phác đồ uống 3 lần/tuần mỗi 02 ngày và kéo dài
trong 11 tuần) là liều tối ưu để gây tạo mô hình chuột xơ gan trên
giống chuột đực Swiss.

-

Phác đồ mADSC (5.105 tế bào/con) tự thân cho hiệu quả cải thiện
các chỉ tiêu liên quan đến xơ hoá trên chuột. 100% chuột sau điều
trị. mADSC kết hợp với huyết tương giàu tiểu cầu (PRP) cho hiệu
quả điều trị vượt trội hơn so với sử dụng mADSC riêng lẻ.

-

Khi được nuôi cấy trong môi trường chứa dịch chiết gan xơ,
mADSC biến đổi theo chiều hướng biệt hoá thành tế bào gan sau
21 ngày cảm ứng. Sau khi ghép vào cơ thể chuột (truyền toàn thân),
mADSC có khả năng: 1. Di cư và “homing” về gan; 2. Ức chế các
tế bào bạch cầu hạt; 3. Kích thích sự biểu hiện các gen tan xơ hoá;
4. Biệt hoá in vivo thành tế bào gan sau 21 ngày cấy ghép.

BỐ CỤC CỦA LUẬN ÁN:
Luận án có 169 trang với 24 Bảng và 52 Hình.
Ngoài phần mở đầu (3 trang), kết luận – kiến nghị (2 trang), danh mục công
bố (2 trang) và tài liệu tham khảo (22 trang) luận án được chia thành các
chương như sau
Chương 1: Tổng quan (38 trang)
Chương 2: Vật liệu - phương pháp (38 trang)
Chương 3: Kết quả - biện luận (52 trang)
ĐÓNG GÓP MỚI CỦA LUẬN ÁN:
1. Đã nghiên cứu và đánh giá được mức độ biểu hiện các gen/protein
liên quan đến tế bào gan trên mADSC. Kết quả cho thấy: mADSC
biểu hiện cao các gen liên quan đến tế bào gan như ALB, CK18,
CK19, TNF, c-met, CYP1A1, AFP, MUC1 và LDL receptor.

3


mADSC không biểu hiện HNF4α.

mADSC biểu hiện dương tính

mạnh với các protein liên quan đến tế bào gan như CYP1A1 và
HGF; dương tính trung bình với các protein anfa-fetoprotein, AAT
và Albumin. Kết quả thu được không chỉ mang tính chất tham khảo
mà còn cung cấp thêm cơ sở khoa học cho đề xuất ứng dụng ADSC
trong điều trị xơ gan.
2. Đã nghiên cứu thử nghiệm điều trị thành công chuột bệnh xơ gan
do CCl4 bằng liệu pháp cấy ghép mADSC có và không có kết hợp
với PRP. Liệu pháp điều trị an toàn, 100% chuột sống và cải thiện
các chỉ tiêu sau ghép. Hiện tại, đã có các công bố trên thế giới về
việc ứng dụng ADSC và PRP trong điều trị xơ gan. Tuy nhiên,
nghiên cứu kết hợp 2 thành phần này thì vẫn chưa được công bố.
3. Đã nghiên cứu và phân tích được vai trò điều trị của mADSC trên
chuột xơ gan. Kết quả cho thấy mADSC có khả năng di cư và
“homing” về gan, số lượng tế bào tồn tại ở gan đạt cực đại sau 3
ngày ghép (70%). Việc ghép mADSC giúp giảm tế bào viêm và
kích thích tăng biểu hiện các gen tan xơ. Trong giới hạn nghiên cứu
này, mADSC đã biệt hoá thành tế bào gan trong điều kiện in vitro
(dịch chiết gan xơ) và in vivo sau 21 ngày.
PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU:
Sử dụng các phương pháp phân lập và nuôi cấy tế bào để tăng sinh
số lượng tế bào gốc.
Sử dụng các kĩ thuật thao tác trên chuột để gây tạo chuột xơ gan và

thu nhận mô từ động vật phục vụ cho đánh giá.
Sử dụng phương pháp qRT-PCR (PCR phiên mã ngược định
lượng) để đánh giá biểu hiện gen.
Sử dụng phương pháp nhuộm hoá mô, hoá mô miễn dịch để đánh
giá cấu trúc mô học.



4


Sử dụng máy phân tích tế bào theo dòng chảy (flow cytometer) để
đánh giá kiểu hình miễn dịch, phân tích máu ngoại vi và đánh giá sự di cư
của tế bào.
Sử dụng phương pháp xử lý thống kê Student's t-Tests (độ tin cậy
là 0.05) trong phân tích số liệu.
KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN
3.1. Kết quả nội dung 1: Thu nhận, nuôi cấy tăng sinh và xác định
đặc điểm của tế bào gốc trung mô từ mô mỡ chuột
3.1.1.

Kết quả thu nhận tế bào đơn từ mô mỡ chuột xơ gan do

CCl4
Kết quả thu nhận tế bào từ mô mỡ chuột xơ gan (cỡ mẫu = 5) cho thấy các
tế bào sau khi phân tách có tỷ lệ sống khoảng 85% (Bảng 3.1), tế bào sau
khi thu nhận được nuôi cấy để tăng sinh số lượng tế bào gốc trung mô ứng
viên phục vụ cho các đánh giá tiếp theo.
Bảng 3. 1. Kết quả thu nhận tế bào đơn từ mô mỡ chuột xơ gan

Hình thái tế bào sau nuôi cấy
mADSC là tế bào có khả năng bám dính, dạng hình thoi, thuôn dài hai đầu
đặc trưng của tế bào gốc trung mô. Sau 72 giờ, tế bào gốc trung mô bắt đầu
trải trên bề mặt bình nuôi, có hình dạng đặc trưng (Hình 3.1). Các tế bào
sau cấy chuyền lần đầu có tốc độ tăng trưởng nhanh hơn khi so với các tế
bào sơ cấp, sau một tuần các tế bào sẽ đạt mật độ 70-80% diện tích bề mặt
nuôi cấy, hình dạng các tế bào tương đối đồng nhất, hình dạng giống
nguyên bào sợi.



5


B

A

C

D

Hình 3. 1. Hình thái tế bào sau nuôi cấy. A. Thời điểm 0 giờ; B. Thời điểm
72 giờ; C. Sau cấy chuyền lần 3; D. Sau cấy chuyền lần 10
3.1.2.

Đánh giá kiểu hình miễn dịch, khả năng biệt hoá thành

tế bào mỡ của mADSC.
Tế bào gốc ở các thế hệ thứ 3, 5, và 10 được đánh giá kiểu hình miễn dịch

bằng phương pháp flow cytometry (dòng chảy tế bào) (bảng 3.2).
Nhận xét:
mADSC thu nhận được có kiểu hình miễn dịch như sau: CD14-/CD34/CD45-/CD44+/CD90+/CD105+, đây là kiểu hình đặc trưng của tế bào gốc
trung mô. Kiểu hình này duy trì qua nhiều thế hệ nuôi cấy (từ P3-P10).
Bảng 3. 2. Tổng kết phần trăm biểu hiện marker của mADSC ở các thế hệ



6


3.1.3.

Kết quả đánh giá khả năng biệt hoá thành tế bào mỡ

Các mADSC được cảm ứng trong môi trường biệt hoá thành mỡ đã chuyển
dạng và tích luỹ các giọt mỡ trong tế bào chất. Nhuộm Oil Red O cho kết
quả dương tính (Hình 3.2).

A

B

Hình 3. 2. mADSC sau 21 ngày biệt hoá thành tế bào mỡ. A. Tế bào chứa
giọt mỡ bên trong tế bào chất; B. Tế bào mỡ dương tính với thuốc nhuộm
Oil red O (màu đỏ)
Theo các tiêu chí đã đặt ra, chúng tôi kết luận rằng mADSC phân lập được
theo quy trình này là phù hợp cho các nghiên cứu tiếp theo. Kết quả này
tương tự với các nghiên cứu khác [141, 252].
3.2.

Kết quả nội dung 2: Nghiên cứu tiềm năng của ADSCs trong trị
liệu bệnh gan thông qua đánh giá sự biểu hiện gen liên quan
đến dòng tế bào gan và khả năng biệt hoá thành tế bào gan in
vitro của mADSC

3.2.1.

Kết quả đánh giá sự biểu hiện các gen: HGF, HNF4α,

CK18, CK19, c-met, CYP1A1, ALB, AFP và SDF-1 của mADSC
P3
Kết quả cho thấy mADSC gần như không biểu hiện HNF4α. Ngược lại,
mADSC biểu hiện một lượng cao xấp xỉ các gen đặc trưng cho tế bào gan
(ALB, CK18, CK19, c-met, CYP1A1, MUC1 và LDL receptor), trong đó
ALB và LDL biểu hiện ở mức thấp hơn so với các gen còn lại. Điều này
gợi ý cho tiềm năng điều trị các bệnh về gan của nguồn tế bào gốc này. Kết
quả phân tích FCM một số protein liên quan đến gan trên mADSC P3 như
trình bày ở Bảng 3. 3



7


Hình 3. 3. Kết quả đánh giá sự biểu hiện các protein liên quan đến tế bào
gan
Bảng 3. 3. Kết quả phân tích phần trăm dương tính các protein liên quan
đến tế bào gan trên dòng mADSC P3

Nhận xét: mADSC ở thế hệ P3 biểu hiện mạnh các protein HGF và
CYP1A1, biểu hiện ở mức trung bình yếu (từ 30-50%) các marker như
anfa – FP, AAT và ALB. Kết quả này củng cố thêm cho kết quả đánh giá
sự biểu hiện gen đã nêu trên. Việc biểu hiện mạnh HGF chỉ ra khả năng tiết
yếu tố HGF, nhân tố quan trọng trong quá trình tái tạo gan.
3.2.2. Thử nghiệm cảm ứng mADSC thành tế bào gan sử dụng môi
trường bổ sung yếu tố tăng trưởng và các chất cảm ứng khác.
Sự thay đổi hình thái tế bào sau khi cảm ứng bằng môi trường
Tại thời điểm 10 ngày sau cảm ứng, mADSC vẫn duy trì hình dạng giống
nguyên bào sợi. Từ ngày 14 đến ngày thứ 21, mADSC thay đổi thành dạng
tế bào hình oval và hình tròn với vùng nhân lõm và dễ quan sát (Hình 3.4).
Kết quả này tương tự nghiên cứu của Yoshihiro Kamada et al (2009).



8


A

B

C

D

Hình 3. 4. Sự thay đổi hình dạng của mADSC khi nuôi trong môi trường
biệt hoá gan. A. mADSC chưa biệt hoá; B. Tế bào HepG2; C. Sau 14 ngày
cảm ứng; D. Sau 21 ngày cảm ứng. Mũi tên đen: tế bào hình đa giác; Mũi
tên trắng: tế bào hình sỏi, nhân lõm và đa nhân.

Sự thay đổi biểu hiện các protein

Hình 3. 5. Kết quả nhuộm kháng thể kháng AAT và ALB sau biệt hoá bằng
hoá chất.
Kết quả đánh giá sự biểu hiện protein AAT và ALB cho thấy, thời điểm
ngày 14, tế bào biểu hiện ít 02 protein này. Tuy nhiên đến thời điểm 21
ngày, chúng tôi ghi nhận mADSC dương tính mạnh với AAT và ALB



9


(Hình 3.5). Kết quả này khác biệt với mẫu chứng âm (mADSC không biệt
hoá) và tương đồng với mẫu chứng dương là HepG2.
Sự thay đổi khả năng dự trữ glycogen
Kết quả nhuộm PAS cho thấy mADSC 21 ngày sau biệt hoá dương tính với
thuốc nhuộm (có màu đỏ, Hình 3.6). Kết quả này khác biệt với mẫu chứng
âm (mADSC không biệt hoá) và tương đồng với mẫu chứng dương là
HepG2.

Hình 3. 6. Kết quả nhuộm PAS sau 21 ngày cảm ứng, sử dụng HepG2 là
chứng dương và mADSC nuôi trong môi trường bổ sung nhân tố biệt hoá
làm chứng âm.
Bàn luận
mADSC có đặc điểm biểu hiện gen hứa hẹn tiềm năng trong trị liệu các
bệnh về gan. Kết quả đánh giá biểu hiện gen cho thấy nhiều điểm độc đáo
về biểu hiện gen của ADSC. Kết quả nghiên cứu của chúng tôi cho thấy
mADSC sau biệt hoá mang các đặc điểm về hình thái và chức năng giống
tế bào gan. Các kết quả này tương đồng với các nghiên cứu của các tác giả

khác [43, 225] [15, 32, 134, 197, 205].
3.3. Kết quả nội dung 3: Nghiên cứu gây tạo mô hình chuột xơ gan
bằng hoá chất carbon tetraclorua (CCl4)
3.3.1.

Kết quả khảo sát liều CCl4

CCl4 (1.0 ml/kg) gây ra sự giảm khối lượng cơ thể và tỷ lệ chết trên
chuột sau 8 tuần
Vào tuần thứ 4, khối lượng cơ thể của chuột ở lô cho uống CCl4
giảm so với nhóm đối chứng. Nhóm II (1,0 ml/kg) giảm khối lượng từ tuần



10


0 đến tuần 8 (27,91 ± 2,2 xuống 23,90 ± 2,51g), kết quả giảm khối lượng
tương tự được ghi nhận ở nhóm III (1,2 ml/kg). Trong khi đó, nhóm đối
chứng và nhóm I (0,8 ml/kg) vẫn tăng trọng sau 8 tuần thí nghiệm.
Sau 8 tuần, chúng tôi ghi nhận chuột tử vong vào ngày đầu tiên của
tuần 1 ở tất cả các lô xử lý với CCl4. Trong thời gian 7 tuần tiếp theo không
có ghi nhận thêm trường hợp tử vong ở các lô.
Sự thay đổi các men AST/ALT sau 8 tuần xử lý CCl4
Lô ĐC: các men gan này ở mức bình thường, kết quả này tương đồng với
công bố của Domitrovic, R. và cs (2009) [61].
Lô I không có sự khác biệt về hoạt độ ALT/AST giữa tuần 0 và tuần 8.
Lô II, lô III có sự khác biệt ở cả 2 men AST, ALT giữa tuần 0 với tuần 8. Ở
tuần thứ 8 cả men AST và ALT đều cao hơn so với tuần 0 kết quả này
tương tự của Chia-Fang Tsai và cộng sự (2009) [230].

Sự thay đổi biểu hiện một số gen liên quan đến xơ hoá
Sau 8 tuần xử lý với CCl4, fibronectin biểu hiện ở nhóm II, III và không
biểu hiện ở nhóm I và nhóm đối chứng. Procollagen anfa 1 biểu hiện nhiều
hơn ở nhóm thí nghiệm khi so sánh với nhóm đối chứng (Hình 3.11).

Hình 3. 7. Kết quả điện di sản phẩm RT-PCR
Sự thay đổi hình thái và mô học
Lô ĐC: bề mặt gan nhẵn bóng, gan màu đỏ tươi, kích thước gan bình
thường. Lô I: bề mặt gan có nhiều nốt sần, màu gan đậm màu, gan săn lại
không có sự thay đổi rõ về kích thước gan. Lô II, Lô III bề mặt gan có
nhiều nốt sần, màu gan nhạt hơn gan bình thường, gan săn lại không có sự
thay đổi rõ về kích thước gan.



11


Kết quả cho thấy CCl4 đã tác động đến tế bào gan, gây các tổn thương và
làm thay đổi đến hình thái bên ngoài của gan chuột.
Nhận xét về mô học và mức độ xơ hoá
Bảng 3.4 Mức độ viêm và xơ gan
được đọc theo hệ thống tính điểm
Knodell-Ishak

Hình 3.8. Kết quả nhuộm HE. A. Đối
chứng; B, C, D. Nhóm I, II, III
Nhóm đối chứng có mức độ viêm là 1/18 và không có thay đổi về
cấu trúc mạch máu, ống mật.
Ngược lại, nhóm thí nghiệm có các biểu hiện chung là sự hoại tử ở

một số vùng trong tiểu thùy, quanh khoảng cửa và quanh tĩnh mạch trung
tâm. Nhân tế bào phân mảnh, có sự xuất hiện các dãy tế bào lympho và các
dãy xơ, mô gan được thay thế bằng mô liên kết, tất cả các mẫu được ghi
nhận là xơ gan từ 3-5/6 (theo hệ thống tính đểm của HAI) (Bảng 3.4, Hình
3.8). Từ các kết quả ghi nhận được, chúng tôi chọn CCl4 liều 1.0 ml/kg là
liều tối ưu để xây dựng mô hình chuột Swiss xơ gan.
3.3.2. Kết quả gây tạo mô hình xơ gan với liều CCl4 đã chuẩn hoá
Sự thay đổi khối lượng và men gan
Khối lượng cơ thể chuột thay đổi rõ rệt sau 11 tuần cảm ứng với CCl4 (1.00
ml/kg). Sự tăng AST và ALT trong máu cho thấy hiệu quả gây độc của
CCl4 trên gan chuột. Ngoài ra, sự thay đổi bilirubin trực tiếp và albmin
cũng chỉ ra sự thay đổi chức năng gan sau khi xử lý với CCl4 (Bảng 3.5).
Kết quả này tương tự với nghiên cứu của Ohashi và cs (2012)[170].



12


Bảng 3.5. Chỉ số các loại men gan

Hình 3.9. Biểu đồ so sánh mức độ
biểu hiện các gen giữa nhóm thí
nghiệm.
Hơn nữa, tỉ lệ AST/ALT trong nhóm mô hình nhỏ hơn 1 đã chỉ ra tình trạng
viêm cấp tính trên nhóm chuột uống CCl4 [228]. Tuy nhiên, để khẳng định
mức độ xơ gan thì việc đánh giá các chỉ tiêu về phân tử và mô học là cần
thiết.
Sự thay đổi mức độ biểu hiện các gen xơ hoá
Kết quả cho thấy mức độ biểu hiện gen của fibronectin, TGF-β1, integrin,

nt5e, và procollagen thay đổi so với nhóm chứng. Integrin, fibronectin và
procollagen tăng đáng kể trên nhóm mô hình. TGF-β1 và nt5e tăng nhẹ so
với nhóm chứng (Hình 3.9).
Sự thay đổi cấu trúc mô học và chỉ số xơ gan
Cấu trúc vi thể cho thấy sự khác biệt rõ rệt giữa nhóm mô hình và nhóm
chứng. Trên nhóm mô hình (CCl4 1 ml/kg, 11 tuần), các tế bào gan bị hoại
tử nhiều, tại vị trí xung quanh mạch máu và ống mật xuất hiện các dãy sợi
collagen. Sợi collagen chiếm phần lớn cấu trúc gan (Hình 3.10). 100%
chuột được ghi nhận ở các mức độ xơ 3-5/6.



13


Hình 3. 10. Kết quả nhuộm mô bằng H&E và Masson Trichrom. A, B.
Nhuộm HE trên Chuột thường và chuột xơ gan; C, D. Nhuộm Masson
Trichrom trên chuột xơ gan.
Sự biểu hiện protein liên quan đến xơ gan như collagen type I và sma-anfa

Hình 3. 11. Kết quả nhuộm collagen trên nhóm đối chứng, nhóm uống dầu
olive và nhóm chuột uống CCl4

Hình 3. 12. Kết quả nhuộm sma-anfa trên nhóm đối chứng, nhóm uống dầu
olive và nhóm chuột uống CCl4 (mũi tên màu vàng: các tế bào dương tính
với sma-anfa)
Kết quả cho thấy, nhóm chuột uống CCL4 tích tụ nhiều collagen type I
(Hình 3.11) trong mô gan (dương tính bắt màu đỏ). Dãy collagen có xu

14


hướng bắt cầu tạo thành các hòn trong mô gan, một dạng của xơ gan nhiều
hòn. Mô gan chuột cũng dương tính với marker của nguyên bào sợi cơ smaanfa. Kết quả này khẳng định mô hình chuột xơ gan được tạo ra theo quy
trình trên mang đầy đủ các tiêu chí cần thiết để phục vụ nghiên cứu.
3.4. Kết quả nội dung 4: Nghiên cứu điều trị thực nghiệm xơ gan
trên chuột bằng liệu pháp cấy ghép tế bào gốc
Trong nội dung nghiên cứu này, chúng tôi tiến hành khảo sát hiệu quả
điều trị xơ gan của mADSC có và không có kết hợp với huyết tương
giàu tiểu cầu. Chuột sau điều trị được đánh giá các chỉ tiêu tương tự
chuột mô hình xơ gan.
3.4.2.1.

Cấy ghép mADSC cải thiện mức độ hoại tử tế bào gan

(cải thiện chỉ số AST và ALT)
Sau 11 tuần xử lý CCl4, giá trị men AST (246.6 ± 65.86) và ALT (187.7 ±
50.65) trên nhóm mô hình cao từ 7-8 lần so với nhóm đối chứng (p<0,05).
Tại thời điểm sau 7 ngày ghép tế bào, AST (304.9 ± 57.55) và ALT (214.9
± 36.) trên nhóm tiêm PBS tiếp tục tăng so với nhóm mô hình. Mức giảm
AST, ALT (từ 2-4 lần so với nhóm PBS) có ý nghĩa thống kê (p<0,05)
được ghi nhận trên 02 nhóm ghép mADSC có và không có kết hợp mPRP
sau 7 ngày ghép. Sau 21 ngày ghép, AST và ALT trên các nhóm thí nghiệm
có thay đổi nhưng khi so sánh thống kê với nhóm đối chứng tiêm PBS thì
giá trị không khác biệt (p>0,05). Các kết quả cho thấy ghép ADSC giúp
bảo vệ tế bào gan khỏi sự hoại tử.
3.4.2.2.

Cấy ghép mADSC giúp cải thiện chức năng gan (cải

thiện chỉ số albumin và bilirubin trực tiếp)
Sau 7 ngày cấy ghép tế bào, bilirunin trực tiếp trên nhóm ghép
mADSCs/PRP (0.04167 ± 0.0252525) giảm hơn 5 lần so với chuột tiêm
PBS (p<0,05). Kết quả so sánh cho thấy, sau 7 ngày ghép lô mADSC/PRP
cho hiệu quả cải thiện bilirubin và albumin tốt hơn nhóm ghép mADSC và
PRP riêng lẻ.



15


Taị thời điểm 21 ngày, chỉ số bilirubin ở 02 nhóm ghép ADSC vẫn duy trì ở
mức thấp hơn so với nhóm PBS (0.0678 ± 0.0345 (nhóm mADSCs) và
0.1025 ± 0.0067 (nhóm mADSCs/PRP)). Về chỉ số albumin, nhóm ghép
ADSC cải thiện so với nhóm PBS. Sau 21 ngày, nhóm chuột tiêm giả dược
PBS và nhóm mô hình có tự phục hồi các chỉ số men, tuy nhiên sự cải thiện
tốt và có ý nghĩa (p<0,05) được ghi nhận ở các nhóm ghép mADSC. Kết
quả tương tự nghiên cứu của HJ.Harn và cộng sự năm 2012 [81]
3.4.2.3.

Cấy ghép mADSC cải thiện mức độ biểu hiện các gen

liên quan đến sự xơ hoá
Sau 21 ngày cấy ghép tế bào, nhóm chuột tiêm PBS có giảm biểu hiện các
gen (trừ fibronectin). Tuy nhiên mức giảm biểu hiện gen có ý nghĩa được
ghi nhận trên các nhóm điều trị. Trên tổng thể, nhóm ghép mADSC/PRP
cho hiệu quả ức chế sự biểu hiện các gen gây xơ hoá là tốt nhất, tiếp đến là

nhóm ghép mADSC và nhóm tiêm PRP (Hình 3.13). Đáng chú ý là chỉ số
giảm biểu hiện các gen procollagen (104 lần), nt5e (119 lần), TGF (10 lần)
so với đối chứng.

Hình 3.13. Kết quả biểu các gen liên quan đến xơ hoá sau 21 ngày cấy
ghép mADSC. Livak: 2-ΔΔCt thường hoá theo đối chứng (chuột bình thường
uống dầu olive)
3.4.2.4.

Cấy ghép mADSC giúp phục hồi cấu trúc mô học và chỉ

số xơ gan
Kết quả nhuộm HE cho thấy những thay đổi đáng kể trong cấu trúc mô học
giữa nhóm ghép mADSC và nhóm tiêm giả dược (tiêm PBS).



16


Dãy sợi collagen xuất hiện nhiều và tạo thành các hòn nhỏ/thuỳ giả trong
gan của nhóm chuột mô hình và nhóm tiêm PBS (Hình 3.14 ). Ngược lại,
cấu trúc mô học của các nhóm tế bào cấy ghép đã có sự khác biệt rõ ràng so
với nhóm PBS. So với nhóm mô hình và nhóm giả dược, vùng dương tính
với Trichrome trên 02 nhóm ghép ADSC là ít hơn, nhóm mPRP vẫn còn
các dãy sợi xơ (Hình 3.14). Kết quả cho thấy ghép ADSC cải thiện chỉ số
viêm và mức độ xơ gan. Đặc biệt, 21 ngày sau khi cấy ghép tế bào 100%
chuột phục hồi mức độ xơ về mức 0/6, trong khi nhóm giả dược vẫn còn
66,7% chuột có mức độ xơ 1/6.

Hình 3. 14. Kết quả nhuộm Massion Trichrome sau 21 ngày cấy ghép tế
bào. Control: nhóm chuột bình thường; Model: nhóm chuột uống CCl4;
PBS: nhóm chuột tiêm PBS; mADSC: nhóm ghép tế bào; mPRP: nhóm
ghép PRP; mADSC/PRP: nhómg ghép tế bào và PRP.
3.4.2.5.

Cấy ghép mADSC/PRP giảm sự biểu hiện protein liên

quan đến xơ gan như collagen type I và sma-anfa
Mặc dù, mức độ dương tính collagen trên nhóm tiêm PBS (17,47 ±
2,62%) có giảm so với nhóm mô hình (29,46 ± 5,64 %), nhưng mức độ
giảm collagen trên các nhóm ghép mADSC là hiệu quả hơn (Hình 3.15).
Trên nhóm ghép mADSC, tỷ lệ diện tích dương tính collagen type 1
(0,14 ± 0,02%) đã giảm đáng kể so với nhóm chuột tiêm PBS (17,47 ±
2,62%) (Hình 3.15 A). Ghép mADSC giảm các tế bào dương tính α-



17


sma so với nhóm PBS và các nhóm mô hình (Hình 3.15 B). Việc giảm
biểu hiện protein α-sma cho thấy sự cải thiện chức năng gan sau khi cấy
tế bào.

A

B

Hình 3.15. A. Kết quả định lượng phần trăm diện tích mô gan dương tính

với collagen I sau 21 ngày ghép mADSC; B. Kết quả nhuộm kháng thể smaanfa sau 21 ngày ghép tế bào
Trong nghiên cứu này, ADSC được thu nhận từ chuột xơ gan và cấy ghép
lại vào chính cơ thể chuột bệnh. PRP được thu nhận từ nhiều chuột khoẻ
mạnh.
Điều khác biệt ở gan chuột so với gan người đó là tốc độ tái sinh. Người ta
nhận thấy gen PPARα có liên quan đến khả năng tái sinh nhanh hay chậm ở
chuột. Thí nghiệm cắt một phần gan trên những con chuột mang gen
PPARα của người cho thấy tốc độ tái sinh gan ở những con chuột này là rất
chậm. Ngược lại trên các con chuột bình thường thì ghi nhận sự tái tạo của
gan sau thủ thuật cắt 2/3 gan chỉ sau 7 đến 10 ngày [94].
Các nghiên cứu đã chỉ ra, tiểu cầu tiết/hoặc kích thích các tế bào gan tiết ra
yếu tố tăng trưởng giúp tái tạo gan trong thí nghiệm sinh thiết một phần gan
[87, 165, 171]. Tuy nhiên, trong xơ gan người ta ghi nhận sự thiếu hụt
nghiêm trọng số lượng tiểu cầu, điều này dẫn đến tình trạng tổn thương gan
không thể đảo ngược [83, 165, 174]. Ngoài ra, tế bào gan đóng vai trò tiết
thrombopoietin (TPO) để kích thích sản sinh tiểu cầu [165, 174]. Trong xơ



18


gan, số lượng tế bào gan giảm đi đáng kể dẫn đến việc thiếu hụt TPO từ đó
lượng tiểu cầu bị giảm đi, tiểu cầu giảm dẫn đến thiếu các yếu tố kích thích
tái tạo tế bào gan, số lượng tế bào gan lại càng thiếu hụt, điều này tạo ra
một vòng xoắn bệnh lý trong xơ gan [165, 174].
Sự kết hợp ADSC và PRP đã cho thấy hiệu quả trên nhiều bệnh [178],
nhưng trên xơ gan thì chưa được nghiên cứu nhiều. Trong nghiên cứu này,
việc ghép ADSC (không kết hợp PRP) giúp cải thiện tình trạng xơ gan trên
chuột, nhưng khi kết hợp với PRP thì hiệu quả thu được tốt hơn.

3.5. Kết quả nội dung 5: Nghiên cứu đánh giá vai trò của tế bào gốc
mô mỡ trong trị liệu xơ gan
3.5.1.

Đánh giá ở mức độ in vitro

3.5.1.1.

Kết quả thu nhận dịch chiết

Định lượng dịch chiết gan
Chúng tôi xây dựng được đường tuyến tính giữa khối lượng gan và lượng
protein thu được với phương trình là: y = 2133.x + 447.1.
Kết quá đánh giá chất lượng protein dịch chiết thu được bằng SDS-page:
cho thấy dịch chiết thu được bảo toàn các protein và đạt yêu cầu cho nghiên
cứu.
Kết quả khảo sát nồng độ dịch chiết phù hợp cho cảm ứng lên tế bào
Đường cong độc tính của dịch chiết gan xơ lên mADSC có phương trình: y
= 28.36ln (x) -124.3 với R2 = 0.938. Giá trị IC50 của dịch chiết gan xơ
trong thí nghiệm này là: x = 0.467 mg/ml. Do đó, các thí nghiệm cảm ứng
dịch chiết tiếp theo sau chỉ sử dụng các nồng độ dịch chiết thấp hơn giá trị
0.467 mg/ml.
3.5.1.2.

Dịch chiết gan xơ làm thay đổi hình thái mADSC thành tế

bào giống tế bào gan
Tế bào có biểu hiện chuyển dạng từ ngày thứ 7 và từ ngày thứ 14 ghi nhận
các tế bào chuyển dạng từ hình thoi thuôn dài 2 đầu thành dạng tế bào đa

19


giác. Từ ngày 21 các tế bào có hình sỏi với nhân lõm và đa nhân, hình dạng
tương đồng với tế bào ung thư gan HepG2 (Hình 3.16).

Hình 3.16. Sự thay đổi hình dạng của mADSC khi nuôi trong môi trường
biệt hoá gan. Mũi tên đen: các tế bào hình đa giác; mũi tên trắng: các tế
bào nhân lõm, đa nhân
3.5.1.3.

mADSC biểu hiện các protein liên quan đến tế bào gan

trong môi trường dịch chiết gan xơ

Hình 3. 17. Kết quả nhuộm kháng thể AAT và ALB sau 14 và 21 ngày cảm
ứng trong môi trường bổ sung dịch chiết
Từ ngày thứ 14, mADSC đã biểu hiện dương tính với AAT và ALB. Tế bào
dương tính mạnh ở ngày nuôi cấy thứ 21. Kết quả cho thấy dịch chiết cảm
ứng mADSC biểu hiện marker của tế bào gan (Hình 3.17).
3.5.1.4.

mADSC biểu hiện chức năng dự trữ glycogen khi nuôi cấy

trong môi trường dịch chiết gan xơ

20


Tế bào sau cảm ứng dịch chiết gan xơ 21 ngày có khả năng dự trữ glycogen
(bắt màu đỏ), kết quả này tương tự chứng dương và khác biệt với tế bào
không cảm ứng (Hình 3.18).

Hình 3.18. Kết quả nhuộm Pass sau 21 ngày cảm ứng dịch chiết
3.5.2.

Đánh giá ở mức độ in vivo

3.5.2.1.

Đánh giá khả năng di cư và “homing” của mADSC trên cơ

thể chuột xơ gan.
Trong liệu pháp truyền tĩnh mạch trên chuột xơ gan, sau 3 ngày ghép số
lượng tế bào mắc kẹt tại phổi là khoảng dưới 10%. Khoảng 70% tế bào
ghép tồn tại ở gan sau 3 ngày, đây cũng là giá trị cực đại mà chúng tôi khảo
sát được (Hình 3.19).

Hình 3.19. Phần trăm tế bào dương tính CFDA tại gan và phổi ở các thời
điểm sau ghép.

Hình 3. 20. Kết quả nhuộm IHC mô gan sau 21 ngày cấy ghép



21

Kết quả nhuộm mô gan sau 21 ngày ghép cho thấy sự hiện diện của tế bào
ghép (tế bào màu xanh lá cây (Hình 3.20). Điều này chứng tỏ tế bào ghép
đã di cư về gan sau 21 ngày cấy ghép.
3.5.2.2.

Đánh giá vai trò ức chế tế bào viêm/miễn dịch của mADSC

Sau xử lý CCl4, chuột xơ gan biểu hiện tăng bạch cầu hạt trung tính (từ
9,75± 0,94% lên 28,34 ± 7,87%), giảm tế bào lympho và mono. Kết quả
cho thấy tình trạng viêm của chuột sau gây tổn thương. Sự giảm đáng kể số
lượng tế bào bạch cầu hạt trung tính sau 3 ngày (6,77 ± 0,56% so với lô
PBS là 48,54 ± 10,44%) và 7 ngày (10,52 ± 5,67% so với lô PBS là 26,2 ±
12,44%) sau ghép mADSC cho thấy tác động của tế bào ghép (p<0,05)
trong ức chế tế bào viêm.
3.5.2.3.

Đánh giá sự thay đổi các gen liên quan đến sự tan xơ

Kết quả khác biệt trên nhóm ghép mADSC, sự biểu hiện vượt mức MMP9
(khoảng 80 lần) và MMP2 (khoảng 13 lần) sau 7 ngày cấy ghép (p<0,05) so
với nhóm tiêm PBS. Kết quả này tương đồng với một số nghiên cứu trước
đó [162] [80, 199].

Hình 3. 21. Kết quả phân tích biểu hiện gen tan xơ sau 7 và 21 ngày cấy
ghép mADSC
Sau 21 ngày cấy ghép, sự biểu hiện MMP2 và MMP 9 giảm so với trước
ghép. Trong giới hạn nghiên cứu, chúng tôi ghi nhận được sự khác biệt ý
nghĩa thống kê về sự tăng biểu gen VEGF sau 7 ngày ghép mADSC và

SDF-1 sau 7 và 21 ngày (p<0,05). Sự thay đổi biểu hiện gen IL-1b không
khác biệt ý nghĩa trước và sau khi ghép (Hình 3.21).



22


3.5.2.3.

Đánh giá khả năng biệt hoá của mADSC trong cơ thể

chuột xơ gan sau ghép mADSC.
Tế bào trước ghép được đánh dấu với CFDA nhằm giúp chúng tôi truy dấu
tế bào sau ghép. Sau 7 ngày ghép, kết quả cho thấy có sự tồn tại của tế bào
dương tính với CFDA và các marker như AFP, CYP1A, ALB và HGF.

Hình 3.22. Kết quả nhuộm kháng thể AAT và ALB mô gan chuột sau 21
ngày cấy ghép
Kết quả nhuộm hoá mô miễn dịch chỉ ra sự tồn tại của tế bào đánh dấu tại
mô gan sau 21 ngày cấy ghép. Các tế bào này sát nhập vào mô gan và biểu
hiện dương tính khi nhuộm với kháng thể AAT và ALB (Hình 3.22).
KẾT LUẬN
Từ những kết quả hoàn thành nội dung luận án, chúng tôi rút ra một
số kết luận chính như sau:
1. Thu nhận và nuôi cấy thành công tế bào gốc trung mô từ mô mỡ
chuột.
2. mADSC biểu hiện cao các gen liên quan đến tế bào gan như ALB,
CK18, CK19, TNF, c-met, CYP1A1, AFP, MUC1 và LDL
receptor. mADSC biểu hiện dương tính mạnh với các protein liên

quan đến tế bào gan như CYP1A1 và HGF. Biểu hiện dương tính
trung bình với các protein anfa-fetoprotein, AAT và Albumin.



23