Định lượng đồng thời theophylin, ephedrin hydroclorid, phenobarbital trong thuốc hỗn hợp trị hen suyễn bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao

B ộ Y TÊ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC Dược HÀ NỘI

TRẦN THẾ PHƯƠNG

ĐỈNH LƯỢNG ĐỒNG THÒI THEOPHYLIN,
EPHEDRIN HYDROCLORID,
PHENOBARBITAL TRONG THUỐC HỗN
HỢP TRị HEN SUYỄN BANG PHƯONG
PHÁP SẮC KỶ LỎNG HIỆU NĂNG CAO
( KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP

Dược s ĩ KHOÁ 1997-2002 )

Người hướng dẫn:

TS. THÁI PHAN QUỲNH NHƯ
TS. THÁI DUY THÌN

Nơi thực hiện:

Phòng Hoá Lý I - Viện Kiểm nghiệm

Thời gian thực hiện: 2/2000 đến 5/2002

M T H tv p ),

Hà Nội 5-2002

'\

Kl ế í ỉ ỳ /


Khoá luận này được thực hiện và hoàn thành tại phòng Hoá Lý I - Viện
Kiểm nghiệm - Bộ Y tế và Bộ môn Hoá Dược - Trường Đại học Dược Hà Nội.
Trong quá trình thực hiện khoá luận tốt nghiệp, tôi đã nhận được sự hướng
dẫn tận tình của các thầy cô hướng dẫn, các giảng viên, cán bộ của bộ môn
Hoá Dược và các cán bộ của phồng Hoá Lý I - Viện Kiểm nghiệm - Bộ Y tế.
Trước tiên tôi xin chân thành cảm ơn sự hướng dẫn tận tình của
TS. Thái Phan Quỳnh Như - Trưởng phòng Hoá Lý I - Viện Kiểm nghiệm và
TS. Thái Duy Thìn - Bộ môn Hoá Dược - Trường Đại học Dược Hà Nội đã
giúp tôi cố những tài liệu và kỹ năng cần thiết trong quá trình thực hiện khoá
luận. Đồng thời tôi cũng xin cảm ơn sự giúp đỡ của các thầy cô, các kỹ thuật
viên khác trong bộ môn Hoá Dược và các cán bộ phòng Hoá Lý I - Viện Kiểm
nghiệm đã giúp tôi hoàn thành khoá luận của mình trong thời gian ngắn nhất.
Tôi cũng xin chân thành cảm ơn Thư viện trường Đại học Dược Hà Nội
đã cung cấp những tài liệu liên quan, phòng Thí nghiệm trung tâm trường Đại
học Dược đã giúp xử lý một số mẫu mà điều kiện máy mốc ở phòng thí nghiệm
Bộ môn Hoá Dược chưa cho phép thực hiện được.

SỤ Trần Thê'Phương


MỤC LỤC

Trang
ĐẶT VẤN ĐỀ..............................................................................................................!
PHẦN 1: TỔNG QUAN............................................................................................ 2
1.1 Theophylin......................................................................................

3

1.1.1 Đại cương...........................................................................

3

1.1.2 Các phương pháp định lượng............................................................................ 3
1.1.3 Tác dụng dược lý.....................................................................

3

1.2 Phénobarbital..........................................................................

4

1.2.1 Đại cương.....................................................................................

4

1.2.2 Các phương pháp định lượng.......................................................................... 4
1.2.3 Tác dụng dược lý...............................................................................

5

1.3Ephedrin.......................................................................................

5

1.3.1 Đại cương................................................................................................

5

1.3.2 Các phương pháp định lượng............................................................................. 5
1.3.4 Phương pháp định lượng 3 thành phần trong hỗn hợp..................................... 5
1.4 Kỹ thuật sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)..................................................... 6
1.4.1 Khái quát phương pháp HPLC.......................................................................... 6
1.4.2 Các đại lượng đặc trưng trong kỹ thuật HPLC................................................. 7
1.4.3 Hệ thống HPLC................................................................................................ 10
1.4.4 Pha tĩnh trong kỹ thuật HPLC.......................................................................... 11


1.4.5 Pha động trong kỹ thuật HPLC.......................................................................13
1.4.6 Cách đánh giá pic...........................................................................

15

1.4.7 Cách tính kết quct..............................................................................

16

PHẦN 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN c ú ư ............................. 17
2.1 Đối tượng nghiên cứu..........................................................................

17

2.1.1 Viên nén Tiphasmin......................................................................

17

2.1.2 Viên bao đường Etadasmin............................................................................. 17

2.1.3 Viên nén Antasma.......................................................................................

17

2.1.4 Viên nén Asmin.............................................................................

17

2.2 Phương pháp nghiên cứu...........................................................................

18

PHẦN 3: THỰC NGHIỆM VÀ KÊT QUẢ.............................................................19
3.1 Thiết bị, hoá chất, dung môi...................................................................

19

3.1.1 Thiết bị.............................................................................................................. 19
3.1.2 Hoá chất, dung môi.......................................................................................... 19
3.2 Xây dựng chương trình sắc ký..........................................................................19
3.2.1 Khảo sát lựa chọn bước sóng...........................................................................19
3.2.2 Lựa chọn dụng môi pha động..........................................................................21
3.2.3 Khảo sát tốc độ dòng....................................................................................... 21
3.2.4 Chương trình sắc ký......................................................................................... 22
3.3 Khảo sát sự phụ thuộc tuyến tính giữa chất khảo sát và diện tích pic tương
ứng thu được........................................................................................................

23

3.4 Khảo sát độ lặp lại...............................................................................................26

3.5 Khảo sát độ đúng.................................................

30

3.6 ứng dụng chương trình để định lượng một số chế phẩm.................................. 31
3.6.1 Định lượng viên nén Tiphasmyl..........................................

31

3.6.2 Định lượng viên nén Asmin...............................................

33

3.6.3 Định lượng viên nén Antasma................................................

33

3.7 Bàn luận..........................................................

33

PHẦN 4: KẾT LUẬN.............................................................................................. 34
TÀI LIỆU THAM KHẢO......................................................................................... 35


ĐẶT VÂN ĐỂ
Với sự phát triển nhanh chóng các thành tựu khoa học của ngành Dược
các thuốc nhiều thành phần có tác dụng dược lý phối hợp ngày càng được sản

xuất, lưu hành và sử dụng rộng rãi trên thế giới, đặc biệt là ở nước ta, kể cả
thuốc nội và nhập ngoại. Ví dụ các thuốc hỗn hợp vitamin, hỗn hợp hạ nhiệt
giảm đau, chống dị ứng, chữa hen... Nghiên cứu các phương pháp để kiểm tra
chất lượng các thuốc này đang là vấn đề thu hút sự cố gắng của ngành kiểm
nghiệm.
Hiện nay trên thị trường có nhiều loại thuốc chữa hen có 3 thành
phần[l]: Theophylin, Ephedrin hydroclorid, Phénobarbital như biệt dược
Etadasmyl, Tiphasmyl ( Công ty Dược vật tư y tế Tiền Giang ); Asmin (Xí
nghiệp Dược phẩm trung ương 25 ); Dophasmin ( Xí nghiệp Dược phẩm trung
ương II ); Asmalin ( Xí nghiệp Dược phẩm trung ương 5 ); Antasma ( Công ty
vật tư y tế Bến Tre ); Tedralas ( Labomed - Pháp )... Trong các Dược điển hiện
có ở Việt Nam và một số tài liệu tham khảo khác [2][8][13][14] [16][18] 'ichỉ có chuyên luận kiểm nghiêm các dạng bào chế đơn thành phần của các
hoạt chất trên và phương pháp định lượng có thể là: đo mật độ quang, định
lượng trong môi trường khan, phương pháp chuẩn độ acid - base, phương pháp
so mầu... Như vậy muốn định lượng các thành phần trong hỗn hợp thì phải
thực hiện việc chiết tách phức tạp. Hơn nữa, sự chênh lệch về lượng giữa các
thành phần rất lớn trong đó lượng Phénobarbital rất nhỏ làm cho kết quả khó
chính xác phụ thuộc nhiều vào người thực hiện, có thể không định lượng được
bằng các phương pháp cổ điển.

1


Để khắc phục tình trạng này, chúng tôi đã tiến hành nghiên cứu đề tài
“Định lượng đồng thòi Theophylin, Ephedrin hydroclorid, Phénobarbital
trong thuốc hỗn hợp trị hen suyễn bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu
năng cao” với hai mục tiêu:
Khao sát và lựa chọn các điều kiện để xây dựng quy trình định lượng
đồng thời Theophylin, Ephedrin hydroclorid, Phénobarbital trong
hỗn hợp bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao ( HPLC ) với

điều kiện sắc ký lỏng pha đảo, đẳng dòng, detector uv.
- Áp dụng phương pháp trên để định lượng một số chế phẩm có thành
phần hoạt chất tương tự như trên đang lưu hành trên thị trường.

2


PHẦN 1

TỔNG QUAN
1.1.

THEOPHYLIN

1.1.1. Đại cương [8][14]:
• Cổng thức:

• Tên khoa hoc: 1,3 - dimethyl xanthin.
• Tính chất: tinh thể hình kim hay bột trắng không mùi, vị đắng, nóng chảy ở
270 - 2740C, khó tan trong nước, ethanol, cloroíorm. Dễ tan trong nước
nóng, ethanol nóng, trong các acid vô cơ, các dung dịch hydroxyd kim loại
kiềm và amoniac. Thực tế không tan trong ether.
1.1.2. Các phương pháp định lượng:
• Phương pháp chuẩn đồ mối trường khan r191: hoà chế phẩm vào anhydric
acetic, thêm benzen khan và định lượng bằng acid percloric 0,1N vói chỉ
thị tím tinh thể cho tới khi xuất hiện màu vàng bền.
• Phương pháp chuẩn đỏ acid - base r2ir3iri3115in6in Sl: hoà chế phẩm
vào nước, thêm dung dịch bạc nitrat. Chuẩn độ bằng dung dịch natri
hydroxyd cho tới khi xuất hiện màu xanh với chỉ thị là xanh bromothymol.
1.1.3. Tác dụng dược lý [5]: thuộc dẫn chất xanthin, nó có tác dụng kích

thích thân kinh, đặc biệt là trung tâm hô hấp và vận mạch, làm giãn phế quản,
giãn động mạch phổi, làm thông khí do tăng tần số, biên độ hô hấp.

3


1.2.

PHENOBARBITAL

1.2.1. Đại cương [8][14]:
• Cổng thức:
/N H -CO

C2H 5

0=c
XN H -C O
• Tên khoa hoc: acid 5 - ethyl - 5 - phenyl barbituric.
• Tính chất: tinh thể không màu hoặc bột kết tinh trắng, không mùi. Bền
vững ngoài không khí. Rất khó tan trong nước lạnh và hexan; khó tan trong
nước nóng, cloroíorm; tan trong ether; dễ tan trong ethanol 96°, các dung
dịch hydroxyd, carbonat kim loại kiềm. Nhiệt độ nóng chảy 176°c.
1.2.2. Các phương pháp định lượng:
• Phương pháp chuẩn đỏ acid - base:
- Hoà tan chế phẩm vào dimethylíormamid ( DMF ) đã được trung hoà
trước ( CT xanh thymol 1% trong D M F). Chuẩn độ bằng dung dịch natri
hydroxyd trong hỗn hợp methanol : benzen tới khi xuất hiện màu
xanh[3].
Hoà tan chế phâm vào pyridin, thêm dung dịch bạc nitrat trong pyridin

Chuẩn độ bằng dung dịch Natri hydroxyd trong ethanol cho đến khi có
màu xanh với chỉ thị thymolphtalein. Song song tiến hành làm mẫu
trắng[2][13][15][16][18].
• Phương pháp HPLC £19]:
- Cột LI ODS ( 250mm

X

4mm ) .

- Detector uv đặt ở bước sóng 254 nm.
- Pha động: methanol: đệm acetat pH4,5 ( 2 : 3 ) .
- Tốc độ dòng : 2ml/phút.
- Thể tích tiêm : lOịil.

4


1.2 .3 . Tác dụng dược lý [5]: Phénobarbital là một barbituric kinh điển có tác

dụng an thần, gây ngủ và chống co giật. Nó có tác dụng ức chế vỏ não,
vùng dưói đồi, đồi thị nên ức chế cả hai giai đoạn của giấc ngủ. Ngoài
ra, nó còn ức chế trung tâm hô hấp và trung tâm tuần hoàn, giảm sức
lọc cầu thận.
1.3.

EPHEDRIN HYDROCLORID

1.3.1. Đại cương [8][14]:
• Cổng thức:

• Tên khoa hoc: D ( - ) 2 - methyl - 2 - methylamino - 1 - phenyl ethanol
hydroclorid.
• Tinh chât: tinh thê nhỏ hoặc bôt kết tinh trắng, vi đắng. Dễ tan trong nước
cồn. Không tan trong ether. Nóng chảy ở 216 - 220°c. [a]ổ° = -33

-36°.

Do phân tử có 2 carbon bất đối nên có 4 đồng phân hoạt quang, 2 hỗn hợp
racemic. Dạng dược dụng là Ephedrin tả tuyền.

1.3.2. Các phương pháp định lượng:
• Đinh lương c r bằng phương pháp đo bac T81: dùng chỉ thị hấp phụ
Bromphenol xanh, môi trường acid acetic, chuẩn độ trực tiếp bằng bạc
nitrat cho đến khi tủa vón lại và dung dịch có màu tím.
• Phương pháp so màu T81: dựa vào phản ứng tạo phức màu với đồng Sulfat.
• Đinh lương mỏi trường khan r2ir3iri3iri5iri6iri7iri81: hoà tan chế phẩm
vào acid acetic băng, làm lạnh. Chuẩn độ bằng acid percloric với chỉ thị
tím tinh thể cho tới khi có màu xanh lá cây.

5


• Phương pháp HPLC T191:
-

Cột LI ODS ( 300mm X 4mm ).

-

Detector u v đặt ở bước sóng 280 nm.

- Pha động : 70ml acetonitril thêm đệm acetat cho đủ lOOOml ( Đệm
acetat: 2,72g natri acetat trihydrat + 200 ml nước, thêm lOml acid
acetic băng, thêm nước vừa đủ 2000 m l ).
- Tốc độ dòng : 2ml/phút.
- Thể tích tiêm : 10|Lil.
1.3.3. Tác dụng dược lý [5]:
Ephedrin thuộc nhóm cường giao cảm nên có tác dụng làm giãn phế
quản, kích thích trung tâm hô hấp, có tác dụng kích thích thần kinh trung
ương. Tác dụng của Ephedrin trung bình nhưng kéo dài. Ngoài ra còn có tác
dụng co mạch máu, giãn đồng tử.
1.3.4. Phương pháp định lượng 3 thànlr trong hỗn hợp :
• Phương pháp HPLC ri91:
- Cột LI ODS ( 300mm X 4mm ) .
- Detector u v đặt ở bước sóng 241 nm.
- Pha động: acetolnitril: đệm phosphat pH:7,8 (240 : 760).
- Tốc độ dòng : lml/phút.
- Thể tích tiêm : 10|al.
1.4.

KỸ THUẬT SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO (HPLC) [4] [6] [7]

1.4.1. Khái quát phương pháp HPLC
Sắc ký lỏng hiệu năng cao ( HPLC ) là phương pháp phân tích hoá lý
dùng để phân tách các thành phần của một hỗn hợp dựa vào ái lực khác nhau
của các chất khác nhau với hai pha luôn tiếp xúc và không hoà tan nhau.
Trong quá trình sắc ký luôn xảy ra quá trình cân bằng động về sự phân bố của

6

chất tan vào pha tĩnh và pha động khi pha động luôn luôn chảy qua cột với
một tốc độ nhất định.
Các chất cần phân tách trong dung dịch của hỗn hợp khi được đưa vào
cột sẽ được hấp phụ hoặc liên kết vói pha tĩnh tuỳ thuộc vào bản chất của cột
và kiểu sắc ký áp dụng. Dung môi pha động được bơm vào cột sắc ký dưới áp
suất cao. Các chất tan sẽ di chuyển qua cột với tốc độ khác nhau tuỳ thuộc vào
cấu trúc và tính chất của mỗi chất. Thời gian chất tan bị pha tĩnh lưu giữ được
quyết định bởi bản chất sắc ký của pha tĩnh, cấu trúc và tính chất của các chất
tan, bản chất và thành phần của pha động dùng để rửa giải chất tan ra khỏi cột.
Kết quả là các chất được phân tách khỏi nhau. Sau khi ra khỏi cột, các chất sẽ
được phát hiện bằng detector và được chuyển qua bộ phận xử lý kết quả. Kết
quả sau khi được xử lý sẽ được đưa ra máy ghi hoặc hiển thị trên màn hình.
Tín hiệu phân tích định tính mỗi thành phần trong hỗn hợp là thời gian
lưu của chất đó trên cột hay vị trí của pic tương ứng trên sắc ký đồ, còn tín
hiệu phân tích định lượng là diện tích pic ( hoặc chiều cao pic ) thu được, phụ
thuộc vào nồng độ của chất đó trong dung dịch đem đo HPLC.
1.4.2. Các đại lượng đặc trưng trong kỹ thuật HPLC
• Thời sian lưu ÜR-lvà thể tích lưu:
Thời gian lưu là thời gian cần thiết để một chất tan di chuyển từ nơi
tiêm mẫu qua cột sắc ký, tới detector và cho pic trên sắc đồ ( tính từ lúc tiêm
tới khi xuất hiện đỉnh của pic ). Dựa vào thời gian lưu có thể phát hiện định
tính chất đó là chất gì. Nếu gọi tRlà thời gian lưu của chất tan thì ta có:
Trong đó:

*R= *0 + í’r
- t0: thời gian chết hay thòi gian không lưu giữ
- t ’R: thời gian lưu giữ thực của chất tan.

Thời gian lưu phụ thuộc vào nhiều yếu tố như bản chất sắc ký của pha
tĩnh; bản chất, thành phần, tốc độ của pha động; cấu tạo và bản chất của phân
tử chất tan; pH của pha động, nồng độ chất tạo phức.

7


Tương ứng với thời gian lưu, đại lượng thể tích lưu của một chất là thể
tích của pha động chảy qua cột sắc ký trong khoảng thời gian từ lúc bơm mẫu
vào cột cho đến khi chất tan được rửa giải ra ở thời điểm có nồng độ cực đại.
ễignád

trong phép định lượng bằng HPLC

• Hê số phân bố ( K ):
Quá trình tách sắc ký của các chất là dựa trên cơ sở sự phân bố của chất
tan giữa pha động và pha tĩnh. Sự phân bố này được đặc trưng bỏi hệ số phân
bố, nó được tính theo công thức:

Trong đó:

cs và CMlần lượt là nồng độ chất tan trong pha tĩnh và pha động.

Khi nồng độ chất tan không cao quá thì K là một hằng số chỉ phụ thuộc
vào bản chất các pha và chất tan, vào nhiệt độ.

8


• Thừa số dung lương ( k ’ ):

Đây là một đại lượng quan trọng được dùng để mô tả tốc độ di chuyển
của một chất. Nó cho ta biết khả năng phân bố của chất tan trong mỗi pha như
thế nào. Thừa số dung lượng được tính theo công thức:
k’ =
Trong đó: Qs và QMlà lượng chất tan phân bố trong pha tĩnh và pha động.
Quan hệ giữa hệ số phân bố và thừa số dung lượng:
k’ = K

vs
s

V M

Trong đó:

vsvà VMlà thể tích pha tĩnh và pha động.

Ngoài ra có thể định nghĩa k ’ theo một cách khác:
T -T
k’ = R 0
T1 M
• Hê số chon loc ( ạ ):
Tốc độ di chuyển tỷ đối của hai chất được đặc trưng bởi hệ số chọn lọc:
_

K

B _

a ~ KA

k'

B _

ì?K A

t'

R, B

Y7
R, A

Theo quy ước, chất B là chất bị lưu giữ mạnh hơn chất A, như vậy a >1.
a càng lớn thì hai chất tách ra khỏi nhau càng xa, thường dùng a trong
khoảng 1,05 đến 2,0 để thời gian phân tích không quá dài.
• Số đĩa lý thuyết ( N ) và chiều cao của đĩa ( H ì :
Hiệu lực của cột thường được đo bằng hai thông số: số đĩa lý thuyết và
chiều cao đĩa lý thuyết. Cột sắc ký được coi như có n tầng lý thuyết, ở mỗi
tầng sự phân bố chất tan vào hai pha lại đạt đến một trạng thái cân bằng mới.
Mỗi tầng được giả định như là một lớp chất nhồi có chiều cao là H. Ta có thể
tính số đĩa lý thuyết N theo công thức sau:

9


( tR Y

Trong đó:

-

_ _ .

f

tR Y

WBlà chiều rộng pic ở đáy pic

- W 1/2 là chiều rộng pic đo ở nửa chiều cao của đỉnh.
Nếu gọi L là chiều cao của cột sắc ký, chiều cao của đĩa lý thuyết được
tính bằng công thức:

• Đỏ phân giải ( Rc ):
Độ phân giải là đại lượng đo mức độ tách hai chất trên một cột sắc ký.
Độ phân giải được định nghĩa như sau:
t R . B - t R,A

Rs = 1/ 2f W B+w a ^ị

khoả ng cách gi ữ a hai pic
độ rộng trung b ì nh gi ữ a hai pic

• Phương trình Van - Deemter:
Phương trình Van - Deemter mồ tả ảnh hưởng của tốc độ dòng pha
động và các thông số động học khác đến hiệu lực của cột sắc khí:

H= A + ỵy + c.u

Trong đó:

-

H: chiều cao đĩa lý thuyết.

- U: tốc độ dòng pha động.
- A,B,C: các hệ số thay đổi phụ thuộc vào từng cột sắc ký và
do các yếu tố sau quyết định:
+ Sự khuyếch tán xoáy.
+ Sự khuyếch tán phân tử.
+ Tốc độ trao đổi chất khác

10

nhau của các chất.


1.4.3. Hệ thống HPLC:
Theo thứ tự từ đầu đến cuối hệ thống, có các bộ phận chính như sau:
• Bình chứa dung môi.
• Bơm cao áp: đẩy pha động qua cột sắc ký.
• Van bơm mẫu: bơm vào cột một thể tích mẫu nhất định.
• Cột tách.
• Detector.
• Máy ghi sắc ký hoặc máy vi tính.
1.4.4. Pha tĩnh trong HPLC:
Cung như săc ký cột ở áp suất thường, pha tĩnh (stationenary phase)
trong HPLC chính là chất nhồi cột để làm nhiệm vụ tách một hỗn hợp chất
phân tích. Nó là những chất rắn, xốp và kích thước hạt rất nhỏ, đường kính cỡ

hạt từ 3 -1 0 micrômet, diện tích bề mặt riêng thường từ 50 - 500 m2/g.
• Phân loai pha tĩnh:
-

Căn cứ theo bản chất chính của quá trình sắc ký trong cột tách, người ta
chia nó thành nhiều loại như hấp phụ, phân bố, trao đổi ion và rây phân
tử. Tương ứng với loại chất nhồi như thế người ta có một loại sắc ký
riêng trong kỹ thuật tách HPLC.

-

Căn cứ vào trạng thái là rắn hay lỏng thì pha tĩnh được chia làm 2 loại:
nếu pha tĩnh là chất rắn, người ta có sắc ký lỏng rắn LSC ( Liquid Solid
Chromatography), nếu pha tĩnh là chất lỏng thì chúng ta có sắc ký lỏng
lỏng LLC ( Liquid Liquid Chromatography ).
Xét vê cấu trúc xốp của pha tĩnh là các hạt rắn thì pha tĩnh có 2 kiểu
xốp: xốp toàn phần hạt và xốp chỉ lớp vỏ ngoài ( xốp bề mặ t ).

11


• Điều kiên đối vói mốt pha tĩnh:
- Phải trơ và bền vững với các điều kiện của môi trường sắc ký.
-

Có khả năng tách chọn lọc một hỗn hợp chất tan nhất định trong điều
kiện sắc ký nhất định.

- Tính chất bề mặt phải ổn định.
- Cân bằng động học của sự tách phải xẩy ra nhanh và lặp lại tốt.

- Cỡ hạt phải tương đối đồng nhất.
• Chế tao pha tĩnh: pha tĩnh được chế tạo trên các chất nền sau:
- Pha tĩnh trên nền Silicagel.
- Pha tĩnh trên nền oxyd nhôm.
- Pha tĩnh trên nền cao phân tử hữu cơ.
- Pha tĩnh trên nền mạch carbon.
Trong các loại trên thì pha tĩnh trên nền Silicagle ưu việt hơn và được sử
dụng nhiều nhất.
• Pha tĩnh trẽn nền Silicagel: Trên nền Silicagel, có 2 loại Silicagel hấp phụ
cho sắc ký pha thuận và sắc ký pha đảo.
- Silicagel trung tính: sử dụng cho sắc ký hấp phụ pha thuận. Loại này
trên bề mặt của nó có chứa các nhóm -OH. Đó là các nhóm hoạt động
có tính chất phân cực và ái nước. Loại chất nhồi cột này dùng để tách
các chất không phân cực và ít phân cực. Pha động của loại này là những
chất không phân cực hoặc ít phân cực. Với loại pha tĩnh này, nước có
ảnh hưởng nhiều đến bề mặt hoạt động của chúng ( tức là các nhóm
-OH ái nước ). Chính yếu tố này làm ảnh hưởng đến độ lặp lại của quá
trình tách sắc ký.
- Silicagel đã alkyl hoá: được sử dụng cho sắc ký hấp phụ pha đảo. Nhóm
-OH của silicael trung tính được alkyl hoá bằng các gốc alkyl của mạch
carbon thẳng hay các gốc carbon vòng như nhân phenyl. Chính vì bị thế
mất nhóm -OH nên bề mặt của chất nhồi loại này không phân cực hay ít

12


phân cực. Loại chất nhồi cột này dùng để tách các chất không phân cực,
ít phân cực, các chất phân cực và có thể cả cho sắc ký cặp ion. Pha động
cho loại này là các chất hữu cơ phân cực như methanol, acetonnitril ...
hay nước hoặc là hỗn hợp của các chất này với nhau theo những tỉ lệ

nhất định. Pha tĩnh loại này là kỵ nước, nghĩa là bề mặt hoạt động của
nó không bị ảnh hưởng của các phân tử nước, mà trái lại nước lại là một
thành phần của dung môi rửa giải có ý nghĩa thực tế lớn. Sự tách các
chất nhồi loại này có độ lặp lại tốt hơn. Do đó loại này được ứng dụng
nhiều hơn loại Silica trung tính.
- Silicagel đã được Sunfonic hoá hay nitro hoá: được sử dụng cho sắc ký
trao đổi ion ( cation ). Đây là sản phẩm của sự sunfonic hoá hay nitro
hoá các silicagel trung tính đê thay các nhóm -OH trên bê mặt Silicagel
trung tính bằng các nhóm -SO3H hay -N 0 2H. Các nhóm chưc nay co
ion H+ có thể trao đổi được với các cation kim loại khác. Đây là các pha
tĩnh trao đổi cation mạnh, còn nếu thay thế nhóm -OH bằng nhóm -RCOOH thì ta có loại pha tĩnh trao đổi cation acid yếu. Pha tĩnh loại này
được dùng để tách các chất có cấu tạo ion như ion các kim loại và hợp
chất của chúng, hay các chất khi tan trong pha động thì phân ly thành
ion như các acid, base. Pha động sử dụng trong loại sắc ký này là các
dung dich nước của các muối có chứa chât đệm, chât tạo phưc, dung
dịch acid hay base, hoặc có thể có các chất hữu cơ tan trong nước.
- Các Silicagel được amin hoá: được sử dụng cho sắc ký trao đổi anion.
Các Silicagel này được chế tạo bằng các thay thế nhóm-OH bằng các
nhóm -NH2, -NH, -NR2, -NR3, -CH2(OH). Pha tĩnh loại này sử dụng để
tách các anion trong hợp chất có cấu trúc ion hay cac chât khi tan trong
pha động thì phân ly thành các ion như các base, acid. Pha động của
loại này cũng giống như trên.

13


1.4.5. Pha động trong HPLC:
Pha động là dung môi dùng để rửa giải các chất tan ( chất cần phân
tích ) ra khỏi cột tách để thực hiện một quá trình sắc ký. Đây là một yếu tố hết
sức linh động và dễ dàng thay đổi. Nó có thể là 1 dung môi hoặc có thể là một

hỗn hợp nhiều dung môi trộn lẫn vói nhau theo nhữngtỷ lệ nhấtđịnh. Nó
cũng có thể là dung dịch các muối có chứa chất đệm, chấttạophức...

Nói

chung mỗi loại sắc ký sẽ có các hệ dung môi rửa giải riêng để có được hiệu
quả phân tách tốt nhất.
Pha động là một trong những yếu tố quyết định hiệu quả và hiệu suất
tách sắc ký của một hỗn hợp mẫu. Nó quyết định thòi gian lưu giữ các chất
mẫu và hiệu quả sự tách sắc ký. Pha động có thể ảnh hưởng đến:
- Độ chọn lọc của hệ pha.
- Thời gian lưu giữ của chất tan.
- Hiệu lực của cột tách.
- Độ phân giải các chất trong một pha tĩnh.
- Độ rộng của pic sắc ký.
• Trong HPLC, pha động phải thoã mãn một số điều kiện sau:
- Trơ đối với pha tĩnh.
- Hoà tan được chất cần phân tích.
- Bền vững theo thời gian.
- Có độ tinh khiết cao.
- Phải nhanh đạt các cân bằng trong quá trình sắc ký
- Phù hợp vói loại detector được lựa chọn để phát hiện các chất phân tích.
- Có tính kinh tế, dễ kiếm.
• Trong sắc ký hấp phụ pha thuận, pha động phải là các dung môi hữu cơ
không phân cực hoặc ít phân cực như n - hexan, n-heptan, cloroform,
tetraclorocarbon... Trong quá trình chạy sắc ký, để cho quá trình tách được

14

ổn định, độ lặp lại cao, phải bão hoà pha động trước khi chạy sắc ký bằng
nước.
• Trong sắc ký hấp phụ pha đảo, pha động là hệ dung môi phân cực, là
những dung môi đồng tan với nước, có khi nước lại là thành phần chính
trong pha động ví dụ như methanol, acetonitril... Ta có thể tạo ra những
pha động có độ phân cực khác nhau bằng cách thêm vào đó những tỷ lệ
nước nhất định, do đó hệ pha này trở nên linh động và được ứng dụng
nhiều. Ngoài ra, trong nhiều trường hợp, thành phần pha động còn có thêm
các chất đệm pH để ổn định pH cho quá trình sắc ký, chất tạo phức để tạo
ra sự rửa giải chọn lọc, chất tạo cặp ion để sử dụng trong sắc ký cặp ion.
• Trong sắc ký trao đổi ion, pha động là dung dịch nước của các acid hay
base, hoặc là dung dịch nước của các muối kim loại kiềm, kiềm thổ, có
chứa chất đệm pH, chất tạo cặp ion, chất tạo phức. Trong loại sắc ký này
thì pH pha động và chất tạo phức có ý nghĩa rất lớn. Trong sắc ký cặp ion,
pha động vẫn sử dụng nước và methanol là dung môi chính thêm vào đó
các chất chứa ion tạo cặp, chất đệm pH, chất tạo phức.
•

Có 4 yếu tố quan trọng cần chú ý trong lựa chọn pha động:
- Bản chất của dung môi để pha chế pha động.
- Thành phần các chất tạo ra pha động.
- Tốc độ của pha động.
- pH của pha động ( đặc biệt chú ý ở sắc ký trao đổi ion và cặp i on).

1.4.6. Cách đánh giá pic:
•

Đánh giá diên tích pic: diện tích pic của một chất là tươngứng với tổng
lượng chất đó. Để tính diện tích pic, hiện nay người ta thườngdùng máy
tích phân điện tử gắn vói máy vi tính ( sai số khoảng 0,5% ) hoặc máy tích

phân cơ học ( sai số khoảng 1,3% ). Phương pháp này có thể dùng cho các
pic không bị trôi đường nền và cả pic có đường nền bị trôi. Phương pháp

15


này chỉ cần điểm đầu và cuối của pic được nhận ra chính xác và cho kết
quả tốt đối vói nồng độ trung bình vừa và cao.
• Đánh giá chiểu cao pic: khi pic có dạng không đổi thì chiều cao pic
( khoảng cách giữa đường nền và đỉnh pic ) là một đại lượng tỷ lệ vói diện
tích pic và nó cũng có thể được dùng để đánh giá sắc phổ. Một điều kiện
để áp dụng cho việc đánh giá bằng chiều cao pic là các chỉ số k ’ hằng định.
Với pic có đường nền bị nhiễu hoặc pic hẹp thì việc xác định chiều
cao pic sẽ dễ dàng hơn và chính xác hơn việc xác định diện tích pic.
1.4.7. Cách tính kết quả:
• Phương pháp ngoai chuẩn: là phương pháp dựa trên cơ sở so sánh mẫu
chuẩn và mẫu thử được phân tích trong cùng điều kiện. Kết quả của chất
chưa biết được tính toán so với mẫu chuẩn đã biết trước nồng độ hoặc suy
ra từ đường chuẩn.
• Phương pháp nối chuán: là phương pháp cho thêm vào mẫu chuẩn và mẫu
thử một lượng chất không đổi, mà trong cùng điều kiện sắc ký nó có thời
gian lưu gần thời gian lưu của chất cần phân tích trong mẫu thử. Nó được
tách hoàn toàn và có nồng độ gần bằng nồng độ của chất phân tích và có
cấu trúc hoá học tương ứng.
• Phương pháp thêm: chủ yếu được sử dụng trong kỹ thuật HPLC khi có vấn
đề ảnh hưởng của các chất phụ ( ví dụ: tá dược ). Dung dịch mẫu thử được
thêm một lượng xác định chất chuẩn. Các pic thu được của cả hai dung
dịch mẫu thử và mẫu thử thêm chất chuẩn phải được đo trong cùng một
điều kiện sắc ký.

16


PHẢN 2

ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN cứ u
2.1.

ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN c ứ u

2.1.1 Viên nén Tiphasmin:
• Cổng thức:

Theophylin

80 mg

Ephedrin.HCl

10 mg

Phénobarbital

5 mg

Tá dược vđ

1 viên

/,

o

• Nơi sản xuất: Công ty Dược vật tư y tế Tiền Giang.
• Số kiểm soát: 010600 và 020901.
2.1.2 Viên bao đường Etadasmyl:
• Cồng thức:

Theophylin

40 mg

Ephedrin.HCl

7,5 mg

Phénobarbital

2,5 mg

Tá dược vđ

1 viên

t.°

• Nơi sản xuất: Công ty Dược vật tư y tế Tiền Giang.
• SỐ kiểm soát: 011099.
2.1.3 Viên nén Antasma:
• Cổng thức:

Theophylin

120 mg

Ephedrin.HCl

25 mg

Phénobarbital

8 mg

Tá dược vđ

1 viên )

• Noi sản xuất: Công ty Dược vật tư y tế Bến Tre.
• Số kiểm soát: 23082000.

9


2.1.4 Viên nén Asmin:
• Cống thức:
Theophylin

120 mg

Ephedrin.HCl

25 mg

Phenobarbital

8 mg

Tá dược vđ

1 viên

• Nơi sản xuất: Xí nghiệp Dược phẩm trung ương 25.
• Số kiểm soát: 531100.

2.2.

PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN c ứ u

• Bằng thực nghiệm để lựa chọn các yếu tố và xây dựng chương trình sắc ký
cho hỗn hợp các hoạt chất trên dựa vào đặc tính hoá lý của chúng. Các kết
quả khảo sát được xử lý thống kê, rút ra kết luận và đưa ra quy trình định
lượng thích hợp.
• Phương pháp được sử dụng trong thực nghiệm: HPLC trong điều kiện sắc
ký lỏng pha đảo, đẳng dòng , detector u v .

18


PHẦN 3

THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ

3.1.

THIẾT BỊ, HOÁ CHẤT VÀ DUNG MÔI

3.1.1. Thiết bị:
-

Máy sắc ký lỏng hiệu năng cao MERCK-HITACHI655A-12.

- Detector UV 655A-22.
-

Cột Lichrosorb RP18 (250 mm X 4,6 mm; 10 |Lim).

- Bộ lọc dung môi vói màng lọc 0,45 ỊLim.
-

Máy lắc siêu âm.

-

Cân phân tích có độ chính xác 0,1 mg.

-

Các dụng cụ thuỷ tinh khác:Bình định mức, pipet, ống đong

3.1.2. Hoá chất và dung môi:
-

Chất chuẩn Phenolbarbital, Ephedrin hydroclorid, Theophylin do Viện
Kiểm nghiệm - Bộ Y tế cung cấp.

- Methanol tinh khiết sắc ký.
- Natri heptansulfonat tinh khiết sắc ký.
- Đệm phosphat pH = 3,5: hoà tan 12 g NaH 2P 0 4 trong nước cất vừa đủ
1000ml, thêm H 3P 0 4 tói pH = 3,5. Lọc qua màng lọc 0,45 |im.

3.2.

XÂY DỰNG CHƯƠNG TRÌNH SẮC KÝ

3.2.1. Khảo sát lựa chọn bước sóng:
Dựa trên nguyên tắc chọn bước sóng phát hiện ưu tiên cực đại hấp thụ
của chất có hàm lượng nhỏ hoặc có độ hấp thụ riêng nhỏ, chúng tôi đã tiến
hành thực nghiệm và chọn ra bước sóng để định lượng đồng thời hỗn hợp là
240 nm.

19


ABS
ABS

NM

0.2 3-666

Q. 27766

-0.0002
’

AK

2:61 .111

256.667

f . r r 2882

400.00
Page
3____m

Bagel ine_________________________________ OFE
DISPLAY DATA

OBS__________
Baseline
Erase

: B.flBBB -> 1.8BB8
View

Re-scale

HH

Zo o m

.«I'MIH

: 288.88 -> 480.00
Label

(tore

Use the graphicscursor■ track, slope___________________________________

Hình II: Phổ tử ngoại của Phenobarbital trong môi trường acid

0 .0 0 0 1

SSi„E’"’edr"dio|H3-lBU ft*'*"*

flBS_______________ Baseline_____ OFF

Pane

3

4 0 0 .0 0
_

DISPLAV DATA

Use the graphics cursor, track, sloi>e

Hình III: Phổ tử ngoại của Ephedrin trong môi trường acid.

20

Ht1