Phương pháp phân tích vi sinh vi khuẩn Solancearum

PHỤ LỤC

Lời Mở Đầu
- Cây lạc là cây nông nghiệp ngắn ngày, cây thực phẩm có giá trị kinh tế cao và ngày
càng được trồng phổ biến ở nhiều nước trên thế giới. Việt Nam hện đứng thứ 10 thế
giới và thứ 5 châu Á về diện tích trồng lạc.
- Cây khoai là loại cây thực phẩm có giá trị dinh dưỡng. ở Việt Nam, năm 2009 diện
tích trồng khoai tây đạt 35000 ha, sản lượng đạt 370000 tấn.
- Tuy nhiên năng suất lạc, khoai tây của nước ta còn thấp. Phát triển và mở rộng diện
tích giống lạc, khoai tây mới có năng suất cao, chất lượng tốt, chống chịu sâu bênh là
1 trong những hướng nghiên cứu nhằm đẩy mạnh sản xuất lạc, khoai tây ở nước ta.
Trong sản xuất lạc, khoai tây bệnh héo xanh vi khuẩn Raltonia solanacearum Smith
là bệnh gây hại nghiêm trọng đến năng suất và chất lượng.
- Bên cạnh một số dịch hại như: sâu đục trái, bệnh sương mai, bệnh thối trái, bệnh
xoăn lá... thì bệnh héo xanh vi khuẩn (Pseudomonas solanacearum) cũng là một dịch
hại quan trọng và khá phổ biến trên cây cà chua. Bệnh có thể gây hại trong suốt thời
kỳ sinh trưởng của cây cà, nhưng thường hại nhiều ở giai đọan ra hoa kết trái trở đi.
Nếu bị nhiễm sớm ở giai đọan cây con, thường làm cho toàn bộ lá héo rũ rất nhanh,
cây gục xuống và chết. Nếu cây đã lớn mới bị nhiễm bệnh thì lá ngọn héo rũ trước,
có thể héo một cành hay một vài nhánh nhỏ, sau đó các lá phía dưới tiếp tục héo và
cụp xuống, cuối cùng dẫn đến tòan bộ cây bị héo rũ, gẫy gục, rũ xuống và chết. Mặc
dù bị héo nhưng bộ lá và thân cành của cây cà chua vẫn còn giữ được mầu xanh, vì
thế người ta gọi là bệnh héo xanh (hay bệnh héo rũ tái xanh vi khuẩn). Tuy bộ lá của
cây bị héo, nhưng phần gốc của cây vẫn rắn chắc (chứ không bị thối như một số bệnh
1


do nấm gây ra), và vỏ thân bị xù xì. Nếu cắt ngang thân cành sẽ thấy bó mạch dẫn
mô gỗ có mầu nâu đen, bên trong bó mạch chứa đầy dịch nhờn vi khuẩn. Bóp nhẹ
chỗ bó mạch có mầu nâu đen có thể thấy dịch nhờn vi khuẩn mầu trắng sữa chẩy ra.
Còn nếu ngâm đọan cắt vào ly nước trong, sau vài phút bạn sẽ thấy dịch vi khuẩn

mầu trắng sữa, đùn chẩy qua miệng cắt ra ngòa Qua thực tế kiểm tra đồng ruộng ở
những vùng chuyên canh rau của các tỉnh phía Nam cho thấy:Bệnh thường phát sinh,
phát triển và gây hại nặng trong điều kiện nhiệt độ không khí cao, ẩm độ không khí
cao. Như vậy, ẩm ướt của mùa mưa là điều kiện tốt cho bệnh phát sinh, phát triển và
gây hại nặng. Ngoài ra ở những chân ruộng hay những vùng mà bà con thường trồng
các lọai cây thuộc họ cà như cà chua, cà pháo, cà tím... họ đậu đỗ như đậu que, đậu
cô ve... tần ô (cải cúc)... cũng thường dễ bị bệnh gây hại nặng hơn; vì, những lọai cây
này cũng là ký chủ của bệnh, từ đó lây truyền bệnh cho cây cà chua. Vi khuẩn gây
bệnh xâm nhập vào trong cây cà chua khỏe thông qua những vết thương cơ giới do
con người vô ý tạo ra trong quá trình chăm sóc, do côn trùng, do tuyến trùng gây ra
tại vùng rễ, gốc thân, cuống lá của cây cà hoặc qua những lỗ hở tự nhiên trên cây.
- Xuất phát từ thực tiễn, đồ án đã chọn và thực hiện đề tài: quy trình phân tích vi
khuẩn Raltonia solanacearum Smith gây bệnh héo trên cây trồng.

2


Chương I: Tổng quan về Vi khuẩn Ralstonia solanacearum
1.

Lịch sử phát hiện

- Vi khuẩn Ralstonia solanacearum là vi khuẩn gây bệnh mạch dẫn gây hại trên
200 loài thực vật. Halted đã nghiên cứu bệnh này năm 1892, năm 1896 E.F.Smith
nghiên cứu, mô tả và định tên là Pseudomonas solanacearum. Những năm sau đó,
bệnh héo rũ được nhiều nhà khoa học trên thế giới đi sâu, nghiên cứu một cách
toàn diện như Kelman 1953, Hayward 1964, Cook and Backer 1983, Yabuuchi
1992, 1995 (Vũ Triệu Mân và Lê Lương Tề, 1998) [7].Bệnh có nhiều tên gọi như:
Southern wilt (theo cách gọi của người Hoa Kỳ), Bacterial wilt (theo cách gọi của
người Anh), ở Việt Nam được gọi với tên là bệnh héo xanh, héo rũ. Bệnh này có

nguồn gốc trong đất, phổ biến và gây tổn thất nghiêm trọng trong sản xuất nông
nghiệp, nhất là đối với các cây trồng có ý nghĩa kinh tế như lạc, cà chua, khoai tây
làm giảm đáng kể đến năng suất và chất lượng của nông sản phẩm. Vi khuẩn
Nghiên cứu bệnh héo xanh vi khuẩn (Raltonia solanacearum Smith) .... và biện
pháp phòng trừ 726 thường gặp ở dạng đơn lẻ, ghép đôi hoặc bốn hiếm khi thấy
3


chúng kết hợp thành chuỗi.. Ở Việt Nam vi khuẩn R. solanacearum gây hại trên
nhiều loại cây trồng. Bệnh héo xanh vi khuẩn (HXVK) là một trong những loại
bệnh hại phổ biến trên cà chua, cà, lạc, khoai tây, thuốc lá ở vùng Hà Nội và phụ
cận (Đỗ Tấn Dũng, 1998). Đỗ Tấn Dũng, 2002 trong kết quả nghiên cứu về bệnh
héo rũ hại cây trồng cạn và biện pháp phòng chống cho rằng: sử dụng các vi sinh
vật đối kháng bằng cách xử lý củ giống trước khi trồng và đưa vi sinh vật đối
kháng vào vùng rễ cây khoai tây ngay từ giai đoạn đầu sau trồng 7-10 ngày sẽ có
khả năng hạn chế và giảm tác hại của bệnh héo xanh vi khuẩn trên đồng ruộng.
Biện pháp dùng hóa chất bảo vệ thực vật phòng chống bệnh HXVK được cho là ít
có hiệu quả do vi khuẩn này có nguồn gốc từ đất xâm nhiễm gây bệnh và sinh sản
trong hệ thống bó mạch của cây. Xử lý đất bằng các loại thuốc xông hơi ít có tác
dụng hạn chế bệnh (Murakoshi, 1984). Dùng các chế phẩm kháng sinh được coi
là biện pháp có triển vọng, do thuốc kháng sinh được hấp phụ tốt, chuyển dịch
trong mạch dẫn, trong mô cây dễ dàng. Farag(1982) và Wang (1982) cho biết việc
khảo nghiệm thuốc trừ bệnh HXVK cho lạc đã được tiến hành từ những năm
1960 - 1970. Một số thuốc có hiệu quả là Clopicrin liều lượng 300 kg/ ha xử lý
đất trước khi trồng lạc 10 ngày cho hiệu quả tốt. Một số thuốc khác như:
Thiabendazol (C5H6N6S2 ) có thể giảm tỷ lệ bệnh xuống 50% nhưng do thuốc
này có độ độc cấp tính cao với con người và gia súc nên cho đến nay thuốc này
chưa thể áp dụng vào sản xuất (Tan, 1990). Trong thực tế sản xuất, phòng chống
bệnh héo xanh vi khuẩn là vấn đề rất khó khăn. Vi khuẩn gây bệnh R.
solanacearum là loài có nhiều chủng sinh lý và nòi sinh học khác nhau, phân bố

ký chủ rộng, tồn tại lâu trong tàn dư thực vật và trong đất. Vì vậy bước đầu
nghiên cứu bệnh héo xanh vi khuẩn hại cây khoai tây và biện pháp phòng trừ để
nâng cao hiệu quả phòng trừ bệnh héo xanh trên cây khoai tây vùng Hà Nội và
các vùng phụ cận là điều cấp thiết hiện nay.
Phân loại
Phân loại theo đặc tính gây hại có hai cách Race và Biovar:
Phân loại theo Race dựa trên phạm vi kí chủ được chia làm 4 loại như
2.

sau :


Race 1: Tấn công cây trên vùng địa lý, tấn công vào các loại cây trồng

khác nhau như lạc, khoai tây , cà chua…
4




Race 2: Vi khuẩn tấn công trên các cây thuộc họ chuối như chuối tam

bội, chuối lá, chuối sợi.

Race 3: Tấn công trên cây khoai tây khác với race 1 , race 3 thì cây
thường bị tấn công nơi có nhiệt độ thấp và vĩ độ cao

Race 4: Tấn công trên các cây họ dâu như dầu tằm ….
Phân loại theo Biovar:


Phân loại dựa vào đặc điểm sinh lý sinh hóa khác nhau của các mẫu
phân lập gồm có 5 Biovar khác nhau cho từng loại race, có thể nhận dạng dựa
vào 3 nhóm Disacharides và 3 nhóm rựou 6 cacbon .
Phân loại theo vật chủ kí sinh

5


Mẫu phân lập vi khuẩn R. solanacearum
3.

Đặc điểm

Vi khuẩn R. solanacearum Smith là vi khuẩn Gram âm, có hình gậy ngắn, tròn ở
hai đầu.
- Kích thước của chúng trong khoảng 1,0 - 1,5 x 0,5 - 06µm. Chúng có từ một
đến vài tiên mao và luôn chuyển động.
- Khuẩn lạc có bề mặt trơn, nhẵn, ít khi gồ ghề, hơi chảy hoặc không chảy, có thể
có màu trắng, trắng đục hoặc phớt hồng trên môi trường TZC.
- Cả nguồn vi khuẩn có tính độc cao và nguồn có tính độc thấp đều có lông nhỏ ở
rìa (Mehan, 1994).
- Vi khuẩn R. solanacearum có khả năng ký sinh trên 200 loài cây trồng, cây rừng
thuộc hơn 35 họ thực vật khác nhau (Kelman, 1953).

Chương II: Quy trình phân tích vi khuẩn Ralstonia solanacearum
Sơ đồ tổng quát:

Nguồn Mẫu

Phân Lập

Xác định hình thái, câu trúc, và đặc điểm
sinh hóa

Khảo sát đặc điểm có hại Vi Sinh Vật

6


Định danh VI Sinh Vật bằng sinh học phân
tử

Kết luận

Phương pháp truyền

1.

thống:
Nguyên tắc xác định:

1.1

Phân lập trên môi trường phù hợp (TZC).
- Từ cây bị bệnh héo xanh, chọn chủng độc rồi trữ 40C với môi trường King’s B
agar.
- Khẳng định bằng các phương pháp sinh hóa phù hợp.
- Kết luận có sự hiện diện của Raltonia Solanacearum trong 25 gam mẫu hay
không?
Để xác định vi khuẩn Raltonia Solanacearum đúng kỹ thuật, phải đảm bảo 3

nguyên tắc:
-Đúng vị trí: Lấy ở nơi đang có biểu hiện bệnh, trong các nơi nhiễm bệnh thì nên
lấy ở ranh giới giữa nơi lành và nơi tổn thương.
-Đúng thời gian: Lấy đúng lúc cây nhiễm bệnh có nhiều vi khuẩn hoặc khi chưa
dùng thuốc bảo vệ thực vật.
-Phải vô khuẩn: Không để vi khuẩn từ bên ngoài nhiễm vào mẫu bệnh làm sai kết
quả và không gây nhiễm khuẩn thêm cho mẫu.
-Sau khi bệnh phẩm lấy xong cho vào các dụng cụ vô trùng, dán nhãn đề tên cây
lấy mẫu, tên chất thử, thời gian lấy mẫu… Đóng gói đúng quy cách rồi mang về
xét nghiệm. Đa số mẫu bệnh cần được nuôi cấy nên phải giữ cho VSV còn sống
đến lúc làm xét nghiệm. Muốn vậy thì mẫu bệnh phải được chuyển và làm xét
7


nghiệm ngay. Nếu chưa có điều kiện phải giữ mẫu bệnh trong môi trường hoặc
dung dịch bảo quản ở nhiệt độ thích hợp.
1.2

Môi trường nuôi cấy Ralstonia solanacearum:
-Vi khuẩn hình gậy 0,5 × 1,5 µm, háo khí, chuyển động có lông roi (1 - 3) ở đầu.
Nhuộm gram âm. Trên môi trường Kelman (1954) khuẩn lạc màu trắng kem nhẵn
bóng, nhờn (vi khuẩn có tính độc gây bệnh). Nếu khuẩn lạc chuyển sang màu nâu,
nhăn nheo là isolate vi khuẩn mất tính độc. Để phát hiện dòng vi khuẩn có tính
độc thường dùng môi trường chọn lọc TZC. Trên môi trường này isolate vi khuẩn
có tính độc sẽ có khuẩn lạc ở giữa màu hồng, rìa trắng. Vi khuẩn phát triển thích
hợp ở pH 7-7,2. Nhiệt độ thích hợp 24-37oC. Nhiệt độ gây chết 52oC. Đây là vi
khuẩn đa thực: hại trên 200 loài cây trồng.
-Môi trường Tetrazolium chloride (Kelman 1954)
- Peptone 10
- Casein hydrolysate 1 g

- Glucose 5 g
- Agar 17 g
- Triphenyl tetrazolium chloride 0,05 g
- Nước cất 1 L
- (Bổ sung 1ml dịch 0,5 % TZC vô trùng trong 100 ml môi trường đã khử trùng
trước khi đổ ra đĩa petri).
- Môi trường nuôi cấy tăng sinh khối: Môi trường SPA
- Thành phần môi trường (gam/lít)
- Pepton:5,00
- Sacharoza:20,00
- K2H PO4:0,50
- MgSO4.7H2O:0,25
- Thạch:15,00
8


- Nước cất: 1 lít pH: 7,2-7,4 (pH môi trường được điều chỉnh bằng HCl 1N hoặc
NaOH 1N)

1.3

Quy trình xác đinh:

9


Sử dụng các thử nghiệm phản sinh
hóa

Kết Quả

Thuyết minh quy trình
Chuẩn bị mẫu
-

Đầu tiên từ thân cây bệnh chọn và cắt một đoạn thân dài khoảng 3-4cm.
Dùng giấy hoặc bông thấm cồn 70o lau đoạn thân đã cắt để khử trùng.
Dùng dao mổ đã khử trùng trên ngọn lửa đèn cồn để nguội tiến hành

cắt đoạn thân đã khử trùng thành từng miến nhỏ dày khoảng 6-7mm.
Cho các miến đã cắt ở trên vào ống nghiệm chứa 10ml nước muối sinh
lý 0.90/0 để yên đợi cho địch vi khuẩn ứa ra từ các miến cây làm đục môi
trường.
Đưa mẫu đi cấy.
Cấy mẫu
- Dùng que cấy vòng đã khử trùng trên ngọn lủa đèn cồn và để nguội nhúng vào
dung dịch vi khuẩn sau đó cấy ria lên mặt thạch của đĩa Pitri chứa môi trường TZC,

10


thực hiện khoảng 10 cho tới 15 đĩa Pitri để đảm bảo đủ mẫu cho các thí nghiệm sinh
hóa tiếp theo.
- Ủ các đĩa Pitri đã cấy mẫu ở nhiệt độ 25-30oC trong vòng 48h.
Chọn khuẩn lạc và kiểm tra sinh hóa
- Sau 48h tiến hành quan sát hình thái các khẩn lạc hình thành, ghi nhận các khuẩn
lạc trơn, màu trắng kem, trung tâm có màu hồng đó chính là hình dạng khuẩn lạc của
R. solanacearum.
- Từ các đĩa Pitri có xuất hiện khuẩn lạc, chọn các khuẩn lạc đồng nhất có hình dạng
như trên để tiến hành các phản ứng sinh hóa.
- Các thí nghiệm sinh hóa được sử dụng cho R. solanacearum gồm có: nhuộm Gram,

Catalase, O/F, Urease, Citrate, Oxidase, thử nghiệm di động, thử nghiệm thủy phân
lipid, thủy phân tinh bột, thử nhiệm Indole, thủy phân Gelatin.
Đọc kết quả và khẳng định
- Sau khi tiến hành các phản ứng sinh hóa nếu khết quả là: Gram âm, Catalase dương
tính, Oxidative dương tính, Fermentative âm tính, Urease dương tính, Citrate dương
tính, di động dương tính, thủy phân tinh bột âm tính, thủy phân lipid dương tính,
Indole âm tính, Gelatin âm tính thì kết luận chính là R. solanacearum.
Thí nghiệm: Kết quả
Thí nghiệm

Kết quả

Nhuộm Gram

(-)

Catalase

+

O/F [Oxidative]

+

O/F [ Fermentative]

_

Urease

+

Citrate

+

Indole

_

Gelatin

_
11


Thủy phân tinh bột

_

Thủy phân lipid

+

Di động

+

Nhuộm Gram: Thử nghiệm gram
- Cơ sở sinh hóa: vi khuẩn gram dương sau khi nhuộm gram sẽ bắt màu tím do có

vách peptidoglycan dày và giữ được màu tím của dung dịch gentians sau khi rửa cồn
còn vi khuẩn gram âm có vách peptiddolycan mỏng không giữ được màu tím của
gentians khi rửa cồn và sẽ bắt màu hồng khi nhuộm với dung dịch fuchsin ngay sau
đó. Vi khuẩn Ralstonia solanacerum là vi khuẩn gram âm vì sau khi nhuộm gram soi
dưới kính hiển vi quan học thấy tế bào vi khuẩn bắt màu hồng của dung dịch fuchsin.
Thử nghiệm Catalase:
- Thí nghiệm nhằm mục đích phát hiện vi sinh vật có khả năng sản xuất enzyme
catalase khi nhỏ dung dịch hydrogen penroxide (H2O2) 30%. Tạo ra nước với oxy
làm xủi bọt
H2O2 -------> H2O + O2
Thử nghiệm Urease:
- Thử nghiệm này nhằm xác định ở ralstonia solanacearum có khả năng phân hủy
urea thành ammonia (NH3) và CO2 dưới sự xúc tác của enzyme urease do vi khuẩn
ralstonia solanacearum tiết ra, NH3 sinh ra làm cho môi trường khiềm hóa với chỉ thị
màu là phenol red trong môi trường kiềm sẽ chuyển từ màu vàng ban đầu san màu
đỏ hồng.
(NH2)2CO + H2O ---------> 2NH3 + CO2
Thử nghiệm citrate:
- Cơ sở sinh hóa của thử nghiệm này là viêc sử dụng citrate như nguồn carbon duy
nhất
12


- Để nuôi cấy vi sinh vật, vi sinh vật sử dụng citrate sẽ sinh ra CO2 làm kiềm hóa
môi trương nuôi cấy, đồng thời vi sinh vật sử dụng muối ammonium làm nguồn nito
duy nhất tạo ra NH3 làm kiềm hóa môi trường với thuốc thử là Bromothymol blue
trong môi trường khiềm sẽ tạo phức màu xanh dương.
Thử nghiệm Indol
- Tryptophan là aminoacid có thể bị oxy hóa bởi một số vi sinh vật có hệ enzyme
tryptophanase tạo ra sản phẩm chứa gốc indol.

- Các hợp chất trung gian trong quá trình thủy giải tryptophan là acid indolpyruvic,
từ đó indol được hình thành thông qua quá trình khử amin, hình thành skatol (methy
indol) là quá trình khử carboxyl của acid indol acetic.
- Enzyme tryptophanase xúc tác phản ứng khử amin của tryptophan và tách nhân
thơm ra khỏi phân tử tryptophan hình thành indol. Việc phát hiện indol được thực
hiện bằng phản ứng giữa phân tử này với các thuốc thử chứa pdimethylaminobenzaldehyde (p-DMAB). Nhân pyrrol của indol chứa nhóm –CH2 sẽ
kết hợp với nhân benzene của p-DMAB tạo nên phức chất dạng quinone có màu đỏ.
Thử nghiệm Gelatin.
- Thử nghiệm nhằm xem xét khả năng Ralstonia Solanacearum có thể tiết ra
gelatinase thủy giải gelatin có trong môi trường để làm nguồn năng lượng. Gelatin là
một protein có khối lượng phân tử lớn môi trường nuôi cấy chứa gelatin sẽ ở dạng
đông đặc sau khi nuôi cấy với vi khẩn có khả năng tiết ra enzyme gelatinase ở một
khoản thời gian xát định thì môi trường xẽ chuyển từ dạng đông đặc ban đầu san
dạng lỏng do gelatin đã bị phân giải làm mất cấu trúc dạng đông đăc ban đầu. Kết
quả thí nghiệm với vi khuẩn R. Solanacearum không làm cho môi trường hóa lỏng
sau 7 ngày khi nuôi cấy.
Thử nghiệm tinh bột.
- Xác định R. Solanacearum có khả năng sinh hệ enzyme amylase thủy phân tinh bột
thành glucose hay không?
- Tinh bột là một đại phân tử có cấu trúc từ các đơn phân là glucose gồm có 2 dạng
là amylose và amylopectin. Amylose là phân tử tinh bột dạng thẳng không phân
13


nhánh, cấu tạo từ 200 – 300 đơn vị, amylopectin là phân tử phân nhánh. Tinh bột dễ
dàng bị thủy phân bởi các R. Solanacearum có khả năng sản sinh enzyme amylase để
tạo thành dextrin, maltose và glucose.
- Để phát hiện khả năng thủy phân tinh bột, sử dụng Iodine là chất chỉ thị. Khi có sự
hiện diện của tinh bột, iodine tạo phức màu nâu. Khi tinh bột bị thủy phân, iodine
không tạo phức nâu nên biến mất.

- Kết quả sau khi nuôi cấy R. Solanacearum sau 24 giờ ở 30oC cho kết quả âm tính,
toàn bộ đĩa xuất hiện màu nâu phức hợp của iodine và tinh bột.
Thử nghiệm khả năng di động.
- Vi khuẩn R. Solanacearum được cấy sâu vào môi trường thạch mềm (chứa 0.5%
agar) để kiểm tra khả năng di động của R. Solanacearum, đối với vi khuẩn có tiên
mao sẽ có khả năng di chuyển, trông môi trường thạch mềm sẽ làm cho môi trường
đục từ vết cấy lan rộng ra xung quanh, còn đối với vi khẩn không có tiên mao không
có khả năng di chuyển thì chỉ phát triển ngay tại vết cấy và làm đục môi trường ngay
tại vị trí vết cấy chứ không lan rộng ra xung quanh. Kết quả thử nghiệm với R.
Solanacearum cho thấy môi trường từ vết cấy bị đục và lan rộng ra xung quanh vết
cấy, ta kết luận dương tính.

14


2.2 Phương pháp hiện đại

- Tinh sạch tổng DNA của bộ gen của vi khuẩn được thực hiện bằng cách sử dụng
Winzax ® ADN hệ gen purifications Kit (Promega, Madison, WI). Tất cả các PCR
được thực hiện cho ra một khối lượng cuối cùng là 25 ml, có chứa 1 X Taq
polymerase đệm (100 mM Tris-HCL pH 8.5, 500 mM KCl); 30 ng DNA mục tiêu và
nước cất qua một Milli-Q .Hệ thống nước (nước Milli-Q, Millipore, Bedford, MS).
Các mẫu được trình khuếch đại trong một thermocycler PT-100TM (MJ Research,
Watertown, Mass) và sử dụng nguộn điện 85 V trong một giờ. Sau khi chạy điện di,
gel được nhuộm màu, destained và chụp ảnh trong một hệ thống LPix từ Loccus®.

15


Các điểm đánh dấu được sử dụng là 100 bp-Ladder® (Promega, Madison, WI). Sự

khác biệt cho mỗi mồi như sau:
Xác định với cặp mồi đặc hiệu loài
- Từ DNA tinh khiết một đoạn rDNA từ vùng 16S được khuếch đại bằng PCR, sử
dụng mồi PS-1 (5 'AGT CGA ACG GCA GCG GGG G 3') và PS-2 (5 'GGG GAT
TTC ACA TCG GTC TTG CA 3 '), mà ủ với trình tự cụ thể cho R. solanacearum
(Pastrik & Mays, 2000). Các phản ứng được thực hiện bao gồm: 1.5 mM MgCl 2, 0,1
mM của mỗi của các nucleotide deoxy (dATP, dTTP, dCTP, dGTP), 0,2 mM của mỗi
oligonucleotide, 0,5 U của enzyme polymerase Taq DNA. Ban đầu các mẫu được đun
nóng đến 95ºC trong 5 phút, sau đó nộp cho 35 chu kỳ của 95ºC trong 30 s cho biến
tính, 30 giây ở 68ºC cho ủ mồi và 72ºC trong 45 s gia hạn, với phần mở rộng cuối
cùng ở 72ºC trong 5 phút. điều khiển tích cực đã được tinh sạch DNA từ các chủng
UNB 575, UNB 1018 và UNB 1173 của R. solanacearum (Bảng 1), và kiểm định âm
tính là nước vô trùng.
Sơ đồ quy trình:
Sinh Khối
Ly tâm
PCR
Giải trình tự gen

-

So sánh với ngân hàng gen
Sinh khối : Sau khi định danh sơ bộ , nuôi cấy và thu sinh khối và đưa

đi phá vỡ tế bào . dung dung dịch tách chiết DNA lắc kỹ chuyển sang bếp
nhiệt 5- 10 phút. Làm lạnh nhanh để phá vỡ tế bào và phá hủy hoạt tính sinh
học tránh gây ảnh hưởng đến phản ứng PCR
Ly tâm: Ly tâm dung dịch tách chiết 1300 vòng / phút trong 5 phút
PCR: lấy 25 ul mẫu phản ứng PCR với cặp mồi . Tiếp đến chu trình
nhiệt PCR:Các phản ứng được thực hiện bao gồm: 1.5 mM MgCl 2, 0,1 mM

của mỗi của các nucleotide deoxy (dATP, dTTP, dCTP, dGTP), 0,2 mM của
mỗi oligonucleotide, 0,5 U của enzyme polymerase Taq DNA. Ban đầu các
16


mẫu được đun nóng đến 95ºC trong 5 phút, sau đó nộp cho 35 chu kỳ của
95ºC trong 30 s cho biến tính, 30 giây ở 68ºC cho ủ mồi và 72ºC trong 45 s gia
hạn, với phần mở rộng cuối cùng ở 72ºC trong 5 phút.
Giải trình tự gen: Sử dụng phần mềm PAUP4.0 phân tích kết quả .Sử
dụng Statgraphics 4.0 xử lý thống kê và biểu đồ phân tích chọn ra dòng vi
khuẩn
-

So sánh với ngân hàng gen: Sau khi có kết quả phân tích từ máy giải

trình tự động. So sánh mức độ đồng hình dị hình của dòng vi khuẩn phân lập .
nếu đồng hình cao tên 99% là chấp nhận . Xác nhận loài vi khuẩn

Chương III Kết luận
- Raltonia Solanacearum là dòng vi khuẩn có khả năng gây hại rất rộng lên nhiều
loại cây ăn quả ngắn ngày như cây họ cà, khoai tây, ớt, dưa,… gây thiệt hại không
nhỏ cho nền nông nghiệp ở nước ta cũng như trên thế giới, ngoài ra chúng có thể tồn
tại và lây truyền qua nhiều thế hệ cây trồng khác nhau thông qua hạt giống cũng như
đất trồng, việc phân tích để xác định rõ ràn các đặc điểm về hình thái cấu trúc cũng
như số lượng chủng lọi, khả năng gây hại của từng chửng là hết sức cần thiết nhằm
làm cơ sở cho các nghiên cứu và đưa ra các biện pháp phòng trừ cụ thể đối với loài vi
khuẩn này. Qua quá trình nghiên cứu phân tích chúng tôi đưa ra quay trình với từng
bước lần lược như sau: thu mẫu cây bệnh là thân cây bệnh tiếp theo cần khử trùng
mẫu bằng cồn 70oC bằng cách lau mẫu bằng cách này sẽ không gây chết vi khẩn bên
trong thân cây mẫu từ đó sẽ thu đươc nguồn vi khuẩn gây bệnh tốt hơn, tiếp theo

bằng phương pháp cắt lát và ngâm mẫu vào dung dịch nước muối sinh lý để khuất tán
vi khuẩn vào môi trường lỏng từ đó dùng dây cấy ria để lấy dịch vi khẩn đậm đặc cấy
ria lên môi trường TZC để phân lập bước đầu sau đó chọn khuẩn lạc nghi ngờ cấy
chuyền lần nữa để thuần hóa, tiếp theo là dùng các thử nghiệm sinh hóa như thử
nghiệm kết quả như sau: gram âm, Catalase dương tính, Oxidative dương tính,
Fermentative âm tính, Urease dương tính, Citrate dương tính, di động dương tính,
thủy phân tinh bột âm tính, thủy phân lipid dương tính, Indole âm tính, Gelatin âm
tính. Từ kết quả trên để khẳng định rõ hơn chúng tôi tiến hành dùng phương pháp
phân tích PCR phân tích trình tự rDNA 16s để khẳng định và kết luận về loài. Quá
trình nghiên cứu chỉ mới dừng lại ở phương pháp phân tích về đặc điểm hình thái
17


sinh hóa và phân loại theo rDNA 16s chưa nghiên cứu phân tích mức độ gây hại cũng
như khả năng bị ức chế bởi các tác nhân ức chế sinh học cũng như vật lý và hóa học
đề nghị tiếp tục nghiên cứu thêm các phần trên để có thể đưa ra các biện pháp hữu
hiệu để phòng và trừ bệnh do loài vi khuẩn này gây ra.

Chương IV Tài liệu tham khảo
18


-

/>
-

/>
/>_18669.pdf

-

/>
19