nghiên cứu ảnh hưởng của liều chiếu xạ tia gamma (co60) đến tần suất xuất hiện biến dị khi chiếu xạ callus hạt của một số dòng lúa chịu mặn

BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PHÁT TRIỂN NÔNG THÔN
HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VN VIỆN KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP VN
-----------------*-------------------

TRẦN HUY DŨNG

NGHIÊN CỨU ẢNH HƯỞNG CỦA LIỀU CHIẾU XẠ
TIA GAMMA (CO60) ĐẾN TẦN SUẤT XUẤT HIỆN
BIẾN DỊ KHI CHIẾU XẠ CALLUS HẠT CỦA
MỘT SỐ DÒNG LÚA CHỊU MẶN

LUẬN VĂN THẠC SĨ NÔNG NGHIỆP

HÀ NỘI, 2015


BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PHÁT TRIỂN NÔNG THÔN
HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VN

VIỆN KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP VN

- - - - - - - - - - *- - - - - - - - - -

TRẦN HUY DŨNG

NGHIÊN CỨU ẢNH HƯỞNG CỦA LIỀU CHIẾU XẠ TIA GAMMA
(CO60) ĐẾN TẦN SUẤT XUẤT HIỆN BIẾN DỊ KHI CHIẾU XẠ
CALLUS HẠT CỦA MỘT SỐ DÒNG LÚA CHỊU MẶN

Chuyên ngành: Khoa học cây trồng
Mã số: 60.62.01.10

LUẬN VĂN THẠC SĨ NÔNG NGHIỆP
NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:
TS. VÕ THỊ MINH TUYỂN

HÀ NỘI, 2015


LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan rằng số liệu và các kết quả nghiên cứu được trình bày
trong luận văn này là hoàn toàn trung thực và chưa từng sử dụng cho bảo vệ
một học vị nào khác.
Mọi sự giúp đỡ cho việc hoàn thành luận văn đều đã được cảm ơn và các
thông tin đều được chú thích một cách cụ thể rõ nguồn gốc.

Hà Nội, ngày 30 tháng 12 năm 2015
Tác giả luận văn

Trần Huy Dũng

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp

Page ii


LỜI CẢM ƠN
Trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu, để hoàn thành được luận văn
thạc sĩ này, ngoài sự nỗ lực phấn đấu của bản thân, tôi đã nhận được nhiều sự giúp
đỡ quý báu của các thầy cô giáo, cá nhân, tập thể, bạn bè và gia đình.
Nhân dịp này tôi xin bày tỏ lòng cảm ơn sâu sắc tới TS. Võ Thị Minh

Tuyển, người đã tận tình giúp đỡ, trực tiếp hướng dẫn tôi trong suốt thời gian
thực hiện đề tài và hoàn thành luận văn này.
Tôi xin trân trọng cảm ơn Ban lãnh đạo Viện Di truyền Nông nghiệp,
Bộ môn Đột biến và Ưu thế lai đã cho phép, tạo điều kiện cho tôi tham gia
học tập, nghiên cứu và hoàn thành luận văn Thạc sĩ này. Tôi xin chân thành
cảm ơn bạn bè đồng nghiệp đã cung cấp những vật liệu cần thiết và giúp đỡ
tôi trong quá trình thực hiện đề tài.
Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới các thầy giáo, cô giáo và tập thể
cán bộ Ban đào tạo sau đại học - Viện Khoa học Nông nghiệp Việt Nam đã
tận tình dạy bảo và giúp đỡ tôi trong quá trình học tập và hoàn thành luận văn
tốt nghiệp.
Cuối cùng là lòng biết ơn những người thân trong gia đình, bạn bè đã
động viên, khích lệ tôi, giúp đỡ công sức trong suốt quá trình học tập, nghiên
cứu và hoàn thành luận văn này.
Một lần nữa tôi xin chân thành cảm ơn!
Hà Nội, ngày 30 tháng 12 năm 2015
Tác giả luận văn

Trần Huy Dũng

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp

Page iii


MỤC LỤC
Trang phụ bìa ............................................................................................................... i
Lời cam đoan .............................................................................................................. ii
Lời cảm ơn ................................................................................................................. iii
Mục lục ...................................................................................................................... iv

Danh mục các chữ viết tắt......................................................................................... viii
Danh mục các bảng ................................................................................................... ix
Danh mục hình vẽ, đồ thị ............................................................................................ x
MỞ ĐẦU .................................................................................................................... 1
1. Tính cấp thiết của đề tài ........................................................................................ 1
2. Mục tiêu và yêu cầu của đề tài .............................................................................. 2
2.1. Mục tiêu ............................................................................................................... 2
2.2. Yêu cầu ................................................................................................................ 2
3. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài .............................................................. 2
3.1. Ý nghĩa khoa học ................................................................................................ 2
3.2. Ý nghĩa thực tiễn ................................................................................................. 3
4. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu của đề tài ........................................................ 3
4.1. Đối tượng nghiên cứu ........................................................................................... 3
4.2. Phạm vi nghiên cứu .............................................................................................. 3
4.3. Địa điểm và thời gian nghiên cứu ......................................................................... 3
Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU ....................................................................... 4
1.1. Khái quát về chi Oryza và vị trí cây lúa trồng trong chi Oryza .............................. 4
1.2. Kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật .................................................................... 5

1.2.1. Định nghĩa................................................................................................ 5

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp

Page iv


1.2.2. Cơ sở sinh học của kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật .......................... 6
1.2.2.1. Tính toàn năng của tế bào ............................................................... 6
1.2.2.2. Sự phản phân hoá và phân hoá của tế bào ...................................... 6
1.2.3. Lịch sử phát triển kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật ............................ 8

1.3. Tác nhân phóng xạ gây đột biến.......................................................................... 10

1.3.1. Phân loại ................................................................................................ 10
1.3.2. Ảnh hưởng của tia gamma (Co60) lên vật chất di truyền ......................... 11
1.3.2.1. Tác động của tia gamma lên vật chất di truyền ở cấp độ phân tử .. 11
1.3.2.2. Tác động của tia gamma (Co60) lên vật chất di truyền ở cấp độ tế
bào ............................................................................................................. 12
1.3.2.3. Tác dụng của tia phóng xạ đối với thực vật .................................. 13
1.3.3. Lược sử nghiên cứu hiệu quả gây đột biến của tia gamma khi xử lý
callus................................................................................................................ 15
1.3.4. Một số thành tựu về chọn giống lúa bằng đột biến thực nghiệm trên thế
giới và ở Việt Nam............................................................................................ 16
1.4. Chỉ thị phân tử và ứng dụng trong chọn tạo giống cây trồng ............................... 20

1.4.1. Chỉ thị phân tử........................................................................................ 20
1.4.2. Ứng dụng chỉ thị phân tử trong chọn giống cây trồng ............................ 21
1.4.2.1 Phân tích đa dạng di truyền............................................................ 21
1.4.2.2 Tìm chỉ thị phân tử liên kết gen và lập bản đồ gen .......................... 22
1.4.2.3 Chọn giống nhờ chỉ thị phân tử (Marker-Assisted Selection - MAS)23
1.5. Tổng quan về chọn tạo giống lúa chịu mặn ......................................................... 26

1.5.1. Tính chống chịu mặn của cây lúa ........................................................... 26

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp

Page v


1.5.2. Một số kết quả và thành tựu trong chọn tạo giống lúa chịu mặn trên thế
giới và trong nước ............................................................................................ 27

1.5.2.1. Kết quả và thành tựu trong chọn tạo giống lúa chịu mặn trên thế
giới ............................................................................................................. 27
1.5.2.2. Kết quả và thành tựu trong chọn tạo giống lúa chống chịu mặn ở
Việt Nam .................................................................................................... 29
Chương 2: VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU......... 32
2.1. Vật liệu nghiên cứu ............................................................................................. 32
2.2. Nội dung và phương pháp nghiên cứu................................................................. 32
2.3. Phương pháp phân tích số liệu ............................................................................ 39
Chương 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN .................................... 41
3.1. Kết quả tạo callus chiếu xạ và tái sinh cây xanh từ callus chiếu xạ...................... 41

3.1.1. Ảnh hưởng của phương pháp khử trùng đến tỷ lệ mẫu nhiễm ................. 41
3.1.2. Ảnh hưởng của thời gian khử trùng đến tỷ lệ tạo callus .......................... 43
3.1.3. Kết quả tạo callus hạt và tái sinh cây xanh từ callus chiếu xạ ................ 45
3.2. Nghiên cứu xác định liều lượng chiếu xạ phù hợp khi chiếu xạ callus................. 46

3.2.1. Nghiên cứu ảnh hưởng của liều chiếu xạ đến chất lượng callus ............. 46
3.2.2. Nghiên cứu ảnh hưởng của liều chiếu xạ đến tỷ lệ tái sinh cây xanh ...... 48
3.2.3. Ảnh hưởng của liều chiếu xạ tia Gamma (Co60) đến tần suất xuất hiện
một số biến dị ở cây xanh tái sinh..................................................................... 50
3.3. Kết quả chọn lọc dòng đột biến chịu mặn bằng chỉ thị phân tử và thành lọc mặn
nhân tạo ..................................................................................................................... 54

3.3.1. Kết quả chọn lọc các dòng mang gen chịu mặn saltol bằng chỉ thị phân
tử ...................................................................................................................... 54

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp

Page vi

3.3.2. Kết quả thanh lọc mặn nhân tạo của các dòng lúa thu được từ callus
chiếu xạ ............................................................................................................ 57
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ...................................................................................... 67
1. Kết luận ................................................................................................................ 67
2. Đề nghị ................................................................................................................. 67
DANH MỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp

Page vii


DANH MỤC KÍ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT

2,4D

2,4-dichlorophenoxyacetic acid

NAA

1-naphthaleneacetic acid

BAP

6-benzylaminopurine

PCR

Polymerase Chain Reaction

QTL

Quantitative Trait Loci (Tính trạng số lượng)

RFLP

Restriction Fragment Length Polymorphism
(Đa hình chiều dài đoạn cắt giới hạn)

IRRI

International Rice Resarch Institute
(Viện Nghiên cứu Lúa Quốc Tế)

ĐB

Đột biến

TB

Trung bình

Đ/c

Đối chứng

CT

Công thức

CS

Cộng sự

CTLK

Chỉ thị liên kết

ĐBSCL

Đồng bằng Sông Cửu Long

NSLT

Năng suất lý thuyết

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp

Page viii


DANH MỤC BẢNG

STT
bảng
1.1

Tên bảng
Phân tích QTL theo phương pháp cách quãng (interval)

Trang
28

đối với tính trạng hấp thu K, Na và tỉ số Na/Ka ở chồi thân
3.1

Ảnh hưởng của phương pháp khử trùng đến tỷ lệ mẫu nhiễm

41

3.2

Ảnh hưởng của thời gian khử trùng đến tỷ lệ tạo callus

44

3.3

Kết quả tạo callus hạt và tái sinh cây xanh từ callus chiếu xạ

46

3.4

Tỷ lệ sống sót của callus sau 2 tuần chiếu xạ

47

3.5

Tỷ lệ cây xanh tái sinh ở các liều chiếu xạ khác nhau

49

3.6

Tần suất xuất hiện một số biến dị ở cây xanh tái sinh

51

3.7

Kết quả chọn lọc gen Saltol trên 12 cây xanh hữu dục

56

3.8

Kết quả đánh giá mặn nhân tạo các dòng đột biến

58

3.9

Một số đặc tính nông sinh học chính của các dòng lúa đột biến

59

(vụ Mùa 2015)
3.10

Một số sâu bệnh hại chính (vụ Mùa 2015)

62

3.11

Một số yếu tố cấu thành năng suất và năng suất lý thuyết của
các dòng lúa đột biến (vụ Mùa 2015)

64

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp

Page ix


DANH MỤC HÌNH

STT
hình

Tên hình

Trang

1.1

Đoạn gen Saltol trên nhiễm sắc thể số 1 của lúa, vị trí xác
định của các SSR marker

30

1.2

Bản đồ QTL của những tính trạng mục tiêu liên quan đến hiện
tượng chống chịu mặn trên quần thể F8 (RIL) của tổ hợp lai
Tenasai 2/CB

31

3.1

Ảnh hưởng của phương pháp khử trùng đến tỷ lệ mẫu nhiễm

42

3.2

Số callus sống sót sau 10 ngày ở các liều chiếu xạ khác nhau

48

3.3

Số chồi và số cây xanh tái sinh ở các liều chiếu xạ

49

3.4

Biến dị dạng đơn thân (không đẻ nhánh)

52

3.5

Biến dị về chiều cao cây

53

3.6

Biến dị về hình dạng hạt

53

3.7

Kết quả phân tích sản phẩm PCR trên gel agarose 2%

55

3.8

Phản ứng của các dòng dòng lúa thu được từ callus chiếu xạ
với độ mặn 12 dSm-1 - vụ Xuân 2015

58

3.9

Năng suất lý thuyết của các dòng đột biến triển vọng (vụ Mùa
– 2015)

65

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp

Page x


MỞ ĐẦU
1. Tính cấp thiết của đề tài
Lúa gạo là nguồn lương thực chính của khoảng 50% dân số thế giới.
Hơn 90% lúa trồng được phân bố ở Châu Á. Trong những năm gần đây Việt
Nam đã đạt được những thành tựu to lớn trong sản xuất lúa gạo, luôn là một
trong những nước có tỷ trọng xuất khẩu gạo đứng hàng đầu thế giới. Kết quả
xuất khẩu gạo trong năm 2013 đạt 6,61 triệu tấn, trị giá đạt 2,95 tỷ USD
(Tổng cục Thống kê, 2013)[31]. Đạt được những thành tựu đó có sự góp phần
rất lớn của khoa học công nghệ, đặc biệt là trong công tác chọn tạo giống mới.
Việc sử dụng các phương pháp truyền thống để chọn tạo giống lúa
mới tốn rất nhiều thời gian, có thể từ 8 đến 10 năm. Chi phí cho việc chọn
tạo giống mới cũng rất tốn kém. Một hướng mới trong công tác chọn tạo
giống mới đó là sự kết hợp giữa nuôi cấy in vitro và xử lý đột biến bằng
phóng xạ, cùng với sự giúp đỡ của các chỉ thị phân tử việc chọn lọc các
dòng đột biến có lợi được tiến hành dễ dàng và chính xác hơn.

Gây đột biến thực nghiệm là một trong những phương pháp được áp
dụng rộng rãi trên Thế giới và ở Việt Nam, cung cấp nguồn nguyên liệu đa
dạng và phong phú cho quá trình chọn tạo giống mới. Đột biến nhân tạo tạo
ra nguồn vật liệu khởi đầu phong phú, tạo được nhiều biến dị có ích như
tăng tính chịu rét, chịu hạn, tính kháng bệnh, năng suất cao,… Ngoài ra,
bằng phương pháp gây đột biến nhân tạo, các nhà chọn giống có thể thu
được những dạng chưa hề có trong tự nhiên.
Năng suất và sản lượng lúa luôn bị đe dọa bởi thiên tai, sâu bệnh và
các yếu tố môi trường. Trong đó, yếu tố đáng chú ý là hiện tượng đất
nhiễm mặn. Việt Nam với đường bờ biển dài 3.620 km trải dài từ Bắc vào
Nam, hàng năm những vùng trồng lúa ven biển chịu ảnh hưởng rất nhiều

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp

Page 1


do sự xâm thực của biển. Như vậy, đất nhiễm mặn là một trong những yếu
tố chính gây khó khăn cho chiến lược phát triển sản lượng lúa gạo, và ảnh
hưởng xa hơn là mục tiêu đảm bảo an ninh lương thực sẽ khó hoàn thành.
Để đáp ứng được yêu cầu này, việc chọn tạo các giống lúa chịu mặn là rất
cần thiết.
Từ cơ sở lý luận và thực tiễn nêu trên, nhằm đánh giá ảnh hưởng của
phóng xạ tia gamma (nguồn Co60) khi chiếu xạ ở giai đoạn calus, chúng tôi
tiến hành đề tài "Nghiên cứu ảnh hưởng của liều chiếu xạ tia gamma
(nguồn Co60) đến tần suất xuất hiện biến dị khi chiếu xạ callus hạt của một
số dòng lúa chịu mặn"
2. Mục tiêu và yêu cầu của đề tài
2.1. Mục tiêu
- Xác định được liều chiếu xạ thích hợp cho hiệu quả tạo biến dị cao khi chiếu

xạ vào giai đoạn callus hạt lúa.
- Tạo được nguồn vật liệu là các dòng lúa chịu mặn mang các biến dị mới.
2.2. Yêu cầu
- Đánh giá các biến dị xuất hiện và chọn lọc các dòng lúa chịu mặn bằng chỉ
thị phân tử và thử mặn nhân tạo.
3. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài
3.1. Ý nghĩa khoa học
- Bước đầu nghiên cứu quy trình chọn tạo giống lúa chịu mặn mới bằng
phương pháp chiếu xạ callus hạt lúa kết hợp chỉ thị phân tử.

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp

Page 2


3.2. Ý nghĩa thực tiễn
- Tạo được nguồn vật liệu mang các biến dị mới phục vụ cho công tác chọn
tạo giống lúa chịu mặn có năng suất cao và chất lượng tốt.
4. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu của đề tài
4.1. Đối tượng nghiên cứu:
- Dòng lúa thuần mang gen chịu mặn saltol do bộ môn Đột Biến và Ưu thế lai
chọn tạo: BT.3 (được chọn từ tổ hợp lai Bắc thơm 7/FL478).
4.2. Phạm vi nghiên cứu:
- Nghiên cứu và xác định liều lượng chiếu xạ tối ưu khi chiếu xạ callus hạt
lúa.
- Nghiên cứu chọn dòng biến dị chịu mặn bằng chỉ thị phân tử và thử mặn
nhân tạo.
4.3. Địa điểm và thời gian nghiên cứu
- Địa điểm thực hiện các thí nghiệm: Phòng nuôi cấy mô tế bào – Bộ môn Đột
biến và Ưu thế lai, Viện Di truyền Nông nghiệp; Khu thí nghiệm xã Thượng

Cát – Bắc Từ Liêm – Hà Nội.
- Thời gian thực hiện đề tài từ tháng 6 năm 2014 đến tháng 10 năm 2015.

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp

Page 3


Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Khái quát về chi Oryza và vị trí cây lúa trồng trong chi Oryza
Chi Oryza lần đầu tiên được Linne mô tả vào năm 1753. Ông chỉ phát
hiện ra một loài là O. sativa dựa trên các mẫu lúa trồng từ Ethiopia. Qua hai
thế kỷ sau đó, đã có hơn 100 loài thuộc chi Oryza được các tác giả khác nhau
công bố, điều này cho thấy đây là một chi rất phức tạp về mặt phân loại học.
Chi Oryza L. thuộc tộc Oryzeae, họ phụ Oryzoideae, họ hòa thảo Poaceae
(Gramineae). Chi này gồm có: hai loài lúa trồng là O. sativa L., O. graberrima
Steud. và 22 loài lúa dại phân bố khắp các vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới.
Lúa trồng ở Châu Á (O. sativa) là cây có ý nghĩa kinh tế quan trọng và
bậc nhất vì nó là cây lương thực của hơn một nửa dân số trên thế giới. Tất cả
các loài lúa trong chi Oryza, bao gồm cả lúa dại và lúa trồng tạo nên một vốn
gen (genepool) cực kỳ có giá trị trong việc mở rộng nguồn di truyền trong các
chương trình chọn tạo giống lúa.
Hiện nay trên thế giới có hai loài lúa trồng: O. sativa L. và O.
glaberrima Steud. Loài lúa O. sativa L. được trồng ở Châu Á nên được gọi là
lúa trồng châu Á. Loài O. sativa L. có hai thứ là O. sativa var. utitissima A.
Camus (lúa tẻ) và O. sativa var. glutinosa Tanka (lúa nếp). Loài lúa trồng
châu Á O. sativa L. có nguồn gốc từ O. perennis Moench (hay O. rufipogon).
Loài O. glaberrima được thuần hóa ở châu Phi, được trồng ở Tây Phi, xuất
hiện vào khoảng 1500 trước Công nguyên, có nguồn gốc từ O. breviligulata
Chev. Hai loài lúa trên được thuần hóa thành lúa trồng một cách độc lập với

nhau. Năm 1930 Kato đã phân biệt trong loài O.sativa có hai loài phụ: O.
sativa ssp. Indica Kato và O. sativa ssp. Japonica Kato. Hai nhóm này khác
nhau về hình thái, phân bố địa lý, có hiện tượng khó khăn khi lai giữa hai
nhóm cũng như tính bất thụ của con lai tùy theo các dạng bố mẹ đem lai. Năm

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp

Page 4


1954, Morinaga lại xác định trong loài O. sativa có trong nhóm thứ trong O.
sativa javanica, được tìm thấy ở Indonesia.
Đến nay địa điểm xuất hiện của lúa trồng châu Á được cho là một vết
dài từ chân phía Tây Nam và Đông Nam dãy núi Himalaya, qua Assam, tỉnh
Yunnan của Trung Quốc, Burma, Lào, biên giới Thái Lan – Myanma và vùng
Tây Bắc của Việt Nam. Có thể có trung tâm xuất hiện sớm nhất của cây lúa
trồng châu Á: trung tâm Assam, trung tâm biên giới Thái Lan – Myanma và
trung tâm Tây Bắc Việt Nam. Ý kiến này đã được nhiều nhà khoa học trên thế
giới về nguồn gốc vùng trồng lúa và cây lúa trồng tán thành.
Địa điểm xuất hiện cây lúa trồng châu Phi đơn giản hơn nhiều. Đó là vùng
đồng bằng Mali, cùng một số nơi khác như vùng đất cao Guinec, đồng bằng ven
biển Casamance, thượng lưu sông Niger, phần Tây Nam bờ biển Guinea.
Hiện nay, lúa đang được trồng trong những điều kiện sinh thái và khí
hậu rất khác nhau. Có thể nói, hầu hết các vùng trồng lúa trên thế giới đều là
địa bàn của cây lúa châu Á, kể cả ở châu Phi, dồn cây lúa thuần hóa ở lục địa
này (O. glaberrima Steud) vào Tây Phi và chỉ chiếm một diện tích nhỏ ở
Guyana – Nam Mỹ. Điều này đã cho thấy sự đa dạng rất lớn của nguồn gen
cây lúa châu Á. Đến năm 1995, viện nghiên cứu lúa quốc tế (IRRI) đã có một
ngân hàng gen lúa của khắp thế giới với hơn 81.000 mẫu giống, trong đó lúa
châu Á có 76200 mẫu, lúa châu Phi có 3000 mẫu và lúa dại có 2400 mẫu.

1.2. Kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật
1.2.1. Định nghĩa
Nuôi cấy mô tế bào thực vật là phạm trù khái niệm chung cho tất cả các
loại nuôi cấy nguyên liệu thực vật hoàn toàn sạch các vi sinh vật, trên môi
trường dinh dưỡng trong điều kiện vô trùng [11].

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp

Page 5


Nuôi cấy mô tế bào thực vật bao gồm:
- Nuôi cấy cây non và cây trưởng thành.
- Nuôi cấy cơ quan: rễ, thân, lá, hoa, quả, bao phấn, noãn chưa thụ tinh.
- Nuôi cấy phôi: phôi non và phôi trưởng thành.
- Nuôi cấy mô sẹo (callus).
- Nuôi cấy tế bào đơn (huyền phù tế bào).
- Nuôi cấy protoplast: nuôi cấy phần bên trong tế bào thực vật tách vỏ, còn
gọi là nuôi cấy tế bào trần
1.2.2. Cơ sở sinh học của kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật
1.2.2.1. Tính toàn năng của tế bào
Haberlandt (1902) lần đầu tiên đã quan niệm rằng mỗi tế bào bất kỳ của
một cơ thể sinh vật đa bào đều có khả năng tiềm tàng để phát triển thành một
cá thể hoàn chỉnh. Theo quan niệm của sinh học hiện đại thì mỗi tế bào riêng
rẽ đã phân hoá đều mang toàn bộ lượng thông tin di truyền cần thiết và đủ của
cả sinh vật đó. Khi gặp điều kiện thích hợp, mỗi tế bào đều phát triển thành
một cá thể hoàn chỉnh. Đó là tính toàn năng của tế bào (totipotency).
Như vậy, tính toàn năng của tế bào thực vật là khả năng của các tế bào
đã được biệt hóa (trừ một số tế bào đã được biệt hóa sâu như ống mạch, mao
dẫn) có khả năng thể hiện toàn bộ hệ thống di truyền và có thể trong điều kiện

phù hợp sẽ phát triển theo chu trình giống như sự phát triển phôi dẫn đến sự
hình thành cây hoàn chỉnh mới.
1.2.2.2. Sự phản phân hoá và phân hoá của tế bào
Cơ thể thực vật trưởng thành là một nhóm chính thể thống nhất bao
gồm nhiều cơ quan chức năng khác nhau, được hình thành từ nhiều loại tế bào

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp

Page 6


khác nhau. Tuy nhiên tất cả các loại tế bào đó đều bắt nguồn từ một tế bào
đầu tiên (tế bào hợp tử). Ở giai đoạn đầu, tế bào hợp tử tiếp tục phân chia hình
thành nhiều tế bào phôi sinh chưa mang chức năng riêng biệt (chuyên hoá).
Sau đó từ các tế bào phôi sinh này chúng tiếp tục được biến đổi thành các tế
bào chuyên hóa đặc biệt cho các mô, cơ quan có chức năng khác nhau.
Sự phân hoá tế bào là sự chuyển các tế bào phôi sinh thành các tế bào
mô chuyên hoá, đảm nhận các chức năng khác nhau. Ví dụ: Mô dậu làm
nhiệm vụ quang hợp, mô bì làm nhiệm vụ bảo vệ, nhu mô dự trữ làm nhiệm
vụ dự trữ, mô dẫn làm chức năng dẫn nước và dẫn dinh dưỡng.
Quá trình phân hoá tế bào có thể biểu thị:
Tế bào phôi sinh

Tế bào dãn

Tế bào phân hoá có chức năng

riêng biệt.
Tuy nhiên, khi tế bào đã phân hoá thành các tế bào có chức năng
chuyên hóa, chúng không hoàn toàn mất khả năng biến đổi của mình. Trong

trường hợp cần thiết, ở điều kiện thích hợp, chúng lại có thể trở về dạng tế
bào phôi sinh và phân chia mạnh mẽ. Quá trình đó gọi là phản phân hoá tế
bào, ngược lại với sự phân hoá tế bào.
Phân hoá tế bào
Tế bào phôi sinh

Tế bào dãn

Tế bào chuyên hoá

Phản phân hoá tế bào
Về bản chất thì sự phân hoá và phản phân hoá là một quá trình hoạt
hoá, ức chế các gen. Tại một thời điểm nào đó trong quá trình phát triển cá
thể, có một số gen được hoạt hoá (mà vốn trước nay bị ức chế) để cho ra tính
trạng mới, còn một số gen khác lại bị đình chỉ hoạt động. Điều này xảy ra

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp

Page 7


theo một chương trình đã được mã hoá trong cấu trúc phân tử ADN của mỗi
tế bào khiến quá trình sinh trưởng và phát triển của cơ thể thực vật luôn được
hài hoà.
Mặt khác, khi tế bào nằm trong một khối mô của cơ thể thường bị ức
chế bởi các tế bào xung quanh. Khi tách riêng từng tế bào hoặc giảm kích
thước của từng khối mô sẽ tạo điều kiện thuận lợi cho sự hoạt hoá các gen của
tế bào.
Quá trình phát sinh hình thái trong nuôi cấy mô, tế bào thực vật thực
chất là kết quả của quá trình phân hoá và phản phân hoá tế bào. Kỹ thuật nuôi

cấy mô, tế bào xét cho đến cùng là kỹ thuật điều khiển sự phát sinh hình thái
của tế bào thực vật (khi nuôi cấy tách rời trong điều kiện nhân tạo và vô
trùng) một cách định hướng dựa vào sự phân hoá và phản phân hoá của tế bào
trên cơ sở tính toàn năng của tế bào thực vật. Để điều khiển sự phát sinh hình
thái của mô nuôi cấy, người ta thường bổ sung vào môi trường nuôi cấy hai
nhóm chất điều tiết sinh trưởng thực vật là auxin và cytokinin.
1.2.3. Lịch sử phát triển kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật
Năm 1902, Haberlandt lần đầu tiên thí nghiệm nuôi cấy mô cây một lá
mầm nhưng không thành công.
Năm 1934, Kogl lần đầu tiên xác định được vai trò của IAA, một
hoocmon thực vật đầu tiên thuộc nhóm auxin có khả năng kích thích sự tăng
trưởng và phân chia tế bào.
Năm 1939, ba nhà khoa học Gautheret, Nobecourt và White đã đồng
thời nuôi cấy mô sẹo thành công trong thời gian dài từ mô thượng tầng
(cambium) ở cà rốt và thuốc lá, mô sẹo có khả năng sinh trưởng liên tục.

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp

Page 8


Năm 1955, Miller và cộng sự đã phát minh cấu trúc và sinh tổng hợp
của kinetin – một cytokinin đóng vai trò quan trọng trong phân bào và phân
hoá chồi ở mô nuôi cấy.
Đến năm 1957, Skoog và Miller đã khám phá vai trò của tỷ lệ nồng độ
các chất auxin : cytokinin trong môi trường đối với sự phát sinh cơ quan (rễ
hoặc chồi). Khi tỷ lệ auxin/ cytokinin (ví dụ: nồng độ IAA/ nồng độ kinetin)
nhỏ hơn 1 và càng nhỏ, mô có xu hướng tạo chồi. Ngược lại khi nồng độ
IAA/ nồng độ kinetin lớn hơn 1 và càng lớn, mô có xu hướng tạo rễ. Tỷ lệ
nồng độ auxin và cytokinin thích hợp sẽ kích thích phân hoá cả chồi và rễ, tạo

cây hoàn chỉnh.
Năm 1960, Morel đã thực hiện bước ngoặt cách mạng trong sử dụng kỹ
thuật nuôi cấy đỉnh sinh trưởng trong nhân nhanh các loại địa lan Cymbidium,
mở đầu công nghiệp vi nhân giống thực vật.
Năm 1964, Guha và Maheshwari lần đầu tiên thành công trong tạo
được cây đơn bội từ nuôi cấy bao phấn của cây cà rốt.
Năm 1971 Takebe và cộng sự đã tái sinh được cây từ tế bào trần mô
thịt lá ở thuốc lá.
Năm 1978, Melcher và cộng sự đã tạo được cây lai soma cà chua – thuốc lá
bằng dung hợp tế bào trần.
Năm 1979, Marton và cộng sự đã xây dựng được quy trình chuyển gen
vào tế bào trần bằng đồng nuôi cấy tế bào trần và Agrobacterium.
Từ năm 1980 đến nay, hướng chuyển gen vào tế bào thông qua việc
nuôi cấy mô tế bào và vi khuẩn Agrobacterium được triển khai rộng rãi.

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp

Page 9


1.3. Tác nhân phóng xạ gây đột biến
1.3.1. Phân loại
Dựa vào khả năng ion hóa vật chất bị nhiễm xạ, có thể chia tác nhân
phóng xạ gây đột biến thành 2 nhóm:
* Nhóm phóng xạ ion hóa: Là loại phóng xạ gây phản ứng hóa phóng xạ, tạo
ra các cặp ion hóa trong môi trường mà chúng thâm nhập hoặc gây ra sự kích
động phân tử. Nhóm này được chia làm 2 nhóm phụ:
+ Nhóm bức xạ hạt: Nhóm bức xạ hạt được đặc trưng bởi khối lượng và điện
tích khác nhau. Nhóm này gồm các hạt sơ cấp và dòng nguyên tử có vận tốc
không đổi (V = const)

Nhóm bức xạ hạt được chia làm 3 phân nhóm:
- Nhóm hạt mang điện tích: gồm điện tử (e) và positon sinh ra do phản ứng
hạt nhân.
- Nhóm hạt nặng mang điện: gồm proton, hạt α và các hạt khác.
- Nhóm trung tử (nơtron): hạt không mang điện nên có thể thâm nhập vào mọi
hạt nhân nguyên tử.
+ Nhóm bức xạ sóng điện từ: nhóm này đặc trưng bởi vận tốc, độ dài bước
sóng và được biểu thị bằng công thức:
C = T.λ

Trong đó:

C – Vận tốc
T – Tần số
λ – Bước sóng

Tia gamma (γ), tia Rơnghen (tia X) thuộc nhóm này. Do bước sóng rất
ngắn (10-12 – 10-9 A0) và vận tốc rất lớn, không có khối lượng và điện tích,
không bị lệch trong điện trường nên chúng có sức xuyên sâu lớn. Chúng
không có khả năng điện ly trực tiếp mà chỉ có tác dụng gián tiếp. Năng lượng
của tia gamma tùy thuộc vào tần số sóng, được biểu thị bằng công thức:

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp

Page 10


E=

Trong đó:

h.C

λ

- C: Tốc độ ánh sáng

- E: Năng lượng của tia gamma
- h: Hằng số Plăng (h = 6,62.10

-27

erg/s)

- λ : Bước sóng

- T: Tần số sóng

Nguồn xạ thường dùng để tạo tia gamma là Co60.
* Nhóm phóng xạ không gây ion hóa:
Đại diện cho nhóm này là tia tử ngoại ( λ = 10-7 – 10-5 A0). Khi xuyên qua
các mô của cơ thể sinh vật, nó không gây ion hóa mà chỉ kích động phân tử, do
sức xuyên thấu yếu nên nó thường được dùng để xử lý hạt phấn và bào tử.
1.3.2. Ảnh hưởng của tia gamma (Co60) lên vật chất di truyền
1.3.2.1. Tác động của tia gamma lên vật chất di truyền ở cấp độ phân tử
Theo Oganhexian (1969), tính đặc thù của sự phát sinh đột biến có liên
quan đến đặc điểm của quá trình từ thời điểm bắt đầu xâm nhập của các tác
nhân vào tế bào, vận động đến một thời điểm nào đó trên nhiễm sắc thể, rồi
gây ra biến đổi cấu trúc phân tử của gen dẫn đến trở thành đột biến.
Khi chiếu xạ bằng tia gamma vào dung dịch ADN sẽ gây ra những biến

đổi chủ yếu như sau:
- Gây đứt đơn: đứt một mạch đơn của phân tử ADN, làm phân tử ADN biến
dạng, tạo cuộn, giảm thể tích phân tử.
- Gây đứt kép: phân tử ADN bị giảm chiều dài, giảm độ nhớt của dung dịch.
- Tạo cầu giữa các phân tử: Làm tăng khối lượng phân tử, tăng độ nhớt, giảm
độ hòa tan và tạo các búi không tan.
- Tạo các phân tử phân nhánh: do sự gắn một số đoạn của phân tử bị đứt vào
phân tử khác còn nguyên vẹn.

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp

Page 11


- Tạo liên kết protein-ADN: làm cho phân tử protein bị dính hay liên kết giữa
bazơ pirimidin biến tính với các axit amin.
- Phá hủy cấu trúc không gian của ADN (làm biến tính ADN)
- Gây hiện tượng nhị trùng phân Timin.
- Phá hủy gốc dị vòng chứa nitơ.
- Hydrat hóa các bazơ nitơ.
- Gây ra hiện tượng hỗ biến: Tia gamma làm thay đổi vị trí của nguyên tử
hidro, dẫn tới hình thành các gốc lactim hay imin, hậu quả là sự sao chép sai
của ADN, tạo ADN đột biến ở các thế hệ sau.
1.3.2.2. Tác động của tia gamma (Co60) lên vật chất di truyền ở cấp độ tế bào
* Tác động của tia gamma (Co60) lên cấu trúc nhiễm sắc thể
Theo Xvenson, bức xạ ion hóa có thể gây nên sự phân đoạn của nhiễm
sắc thể. Có hai kiểu phân đoạn NST là:
- Loại đứt thật: đứt rời thành từng khúc.
- Loại tiềm tàng: chưa đứt rời mà ở trạng thái tiềm tàng, có thể chuyển sang
đột biến sau một thời gian nhất định hoặc phục hồi lại trạng thái ban đầu.

Crogodin và Lutxomic cho rằng, phóng xạ ion hóa có thể hủy hoại
nhiễm sắc thể một cách trực tiếp và kéo dài. Nếu có các điều kiện tương ứng
và đủ về thời gian thì sự hủy hoại tiềm tàng có thể trở thành hiện thực và đột
biến bắt đầu xuất hiện trong cấu trúc của NST.
Nói chung, khi xử lý các tác nhân phóng xạ ion hóa ở liều lượng trung
bình cho đến liều lượng không qua ngưỡng chịu đựng của tế bào thì ở kỳ sau
của nguyên phân thấy xuất hiện cầu, đoạn, vòng khuyên... Hiện tượng chuyển
đoạn lớn và nhỏ hoặc đảo đoạn thường được phát hiện trong giảm phân, đó là

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp

Page 12


sai hình NST. Mức độ sai hình NST thể hiện bằng các kiểu cấu trúc lại NST
tăng dần theo liều chiếu xạ.
* Tác động của tia gamma (Co60) lên quá trình phân chia tế bào
Trong quá trình nguyên phân, tia gamma có thể gây các hiệu quả sau:
- Làm kìm hãm hay tạm dừng quá trình nguyên phân bằng cách kéo dài một
pha nào đó trong chu kỳ tế bào.
- Làm dừng hoàn toàn quá trình nguyên phân nhưng không gây chết tế bào mà
làm mất khả năng phân chia tế bào.
- Làm tăng độ nhớt và kết dính NST dẫn đến sự chết tế bào.
- Đôi khi chiếu xạ liều thấp lại kích thích sự phân chia tế bào.
Trong quá trình giảm phân: Khi dùng tia X gây bức xạ ion hóa ở
Longgiforum, Mistra đã thu được kết quả như sau:
- Gây sai hình NST ở diplonem: các bivalent có thể kết dính với nhau tạo vòng
NST lớn, phần lớn các vòng này đều do chuyển đoạn phức tạp tạo nên.
- Gây sai hình NST ở hậu kỳ I hoặc II. Các kiểu sai hình NST thường thấy trong
giảm phân là: đứt đoạn NST, tạo 1 hoặc 2 đoạn NST và cầu NST, đứt cầu cromatit

tạo ra sự lặp đoạn, tạo cầu cromatit, vòng và hai đoạn do chuyển đoạn, đứt
cromatit, tạo nên cầu cromatit, vòng cromatit ở trạng thái kép; tạo NST có 2 tâm
và 2 đoạn, hình thành các đoạn riêng rẽ và cầu cromatit ở kỳ sau I. (Mistra 1958,
Sutka 1974, Nguyễn Minh Công và cộng sự 1975-1978)
1.3.2.3. Tác dụng của tia phóng xạ đối với thực vật
Khi xử lý phóng xạ có thể tiến hành theo các phương pháp sau:
- Chiếu xạ hạt khô hoặc hạt ướt.
- Ngâm hạt trong dung dịch đồng vị phóng xạ.

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp

Page 13


- Trồng cây trên đất có bón chất đồng vị phóng xạ.
- Đưa chất đồng vị phóng xạ vào cây.
- Phóng xạ thực vật trong quá trình sinh trưởng và phát triển.
Ngày nay người ta còn chiếu xạ các cơ quan, bộ phận riêng rẽ của cây
như: chồi, nụ hoa, bao phấn, bầu nhụy, hoặc xử lý cây đang trồng trong từng
thời kỳ bằng trường Gamma hoặc thiết bị chiếu xạ chuyên dùng của các trung
tâm chiếu xạ.
Hiệu quả chiếu xạ thực vật ở thế hệ đầu thể hiện ở những biến đổi
dương tính, đó là những biến đổi về cấu trúc, hình thái, sinh lý, sinh trưởng,
sinh sản và gây chết. Người ta phân biệt tác dụng ngay sau khi xử lý phóng xạ
(hiệu quả tức thời) với những biến đổi sau khi xử lý phóng xạ (hiệu quả chậm
hay hiệu quả kéo dài). Về hiệu quả tức thời có thể kể ra một số hình thức chủ
yếu sau:
- Biến đổi hóa sinh và lý hóa sinh.
- Biến đổi sinh lý giới hạn ở một số cấu trúc trong vật liệu bị phóng xạ.
- Biến đổi vật chất di truyền.

Hiệu quả chậm cũng gây ra những biến đổi như trên, nhưng diễn ra
trong thời gian dài suốt quá trình sinh trưởng và phát triển của thực vật.
Đối với các loài thực vật, chiếu xạ ở liều lượng thấp có tác dụng kích
thích sinh trưởng, còn chiếu xạ ở liều lượng cao lại kìm hãm, cao quá giới hạn
chịu đựng sẽ gây chết tế bào và cơ thể. Ở lúa, khi xử lý hạt khô bằng tia
gamma ở các liều lượng 5krad, 10krad nhiều khi kích thích quá trình sinh
trưởng và phát triển.
Tác dụng của phóng xạ vào hạt có thể gây hiệu quả ở mọi giai đoạn
trong quá trình phát triển cá thể, chẳng hạn:
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp

Page 14