thu nhận và xác định đặc tính của enzyme chitosanase kỹ thuật từ vi khuẩn bacillus licheniformis nn1

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM

NGUYỄN THỊ LƯƠNG

THU NHẬN VÀ XÁC ĐỊNH ĐẶC TÍNH CỦA ENZYME
CHITOSANASE KỸ THUẬT TỪ VI KHUẨN
BACILLUS LICHENIFORMIS NN1

LUẬN VĂN THẠC SĨ

NHÀ XUẤT BẢN ĐẠI HỌC NÔNG NGHIỆP - 2015


HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM
----------

----------

NGUYỄN THỊ LƯƠNG

THU NHẬN VÀ XÁC ĐỊNH ĐẶC TÍNH CỦA ENZYME
CHITOSANASE KỸ THUẬT TỪ VI KHUẨN
BACILLUS LICHENIFORMIS NN1

Chuyên ngành : CÔNG NGHỆ SAU THU HOẠCH
Mã số

: 60 54 01 04

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:
PGS.TS. NGÔ XUÂN MẠNH

HÀ NỘI, NĂM 2015
ii


LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan rằng, số liệu và kết quả nghiên cứu trong luận văn
này là trung thực và chưa hề được sử dụng.
Tôi xin cam đoan, mọi sự giúp đỡ cho việc thực hiện luận văn đã được cảm
ơn và các thông tin trích dẫn trong luận văn này đã được ghi rõ nguồn gốc.
Hà nội, ngày tháng năm 2015
Học viên

Nguyễn Thị Lương

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp

Page i


LỜI CẢM ƠN

Để hoàn thành luận văn tốt nghiệp này, ngoài sự cố gắng của bản thân, tôi
còn nhận được rất nhiều sự quan tâm, giúp đỡ của nhiều tổ chức và cá nhân.
Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến thầy PGS.TS Ngô Xuân Mạnh,
bộ môn Hóa sinh – Công nghệ sinh học Thực phẩm, khoa Công nghệ Thực phẩm,
học viện Nông nghiệp Việt Nam đã tận tình dìu dắt và hướng dẫn chuyên môn cho
tôi trong thời gian thực hiện và hoàn chỉnh luận văn.
Tôi xin cảm ơn sự giúp đỡ của các thầy cô giáo trong khoa Công nghệ

Thực phẩm, khoa Công nghệ sinh học đã tạo điều kiện thuận lợi trong quá
trình tôi thực hiện đề tài tốt nghiệp.
Đặc biệt, con xin bày tỏ tình cảm sâu sắc nhất đến bố mẹ và những người
thân trong trong gia đình đã luôn luôn quan tâm, lo lắng và tạo điều kiện tốt nhất
cho con trong quá trình học tập, để con hoàn thành tốt luận văn tốt nghiệp này.
Mặc dù đã rất cố gắng nhưng bản luận văn này không tránh khỏi những
thiếu sót và hạn chế. Vì vậy, tôi kính mong nhận được sự quan tâm và đóng
góp ý kiến của quý thầy cô để bản luận văn này được hoàn thiện hơn.
Một lần nữa tôi xin chân thành cảm ơn!
Hà nội, ngày tháng năm 2015
Học viên

Nguyễn Thị Lương

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp

Page ii


MỤC LỤC
Lời cam đoan

i

Lời cảm ơn

ii

Mục lục

iii

Danh mục bảng

vi

Danh mục hình

vii

Danh mục chữ viết tắt

viii

PHẦN I: MỞ ĐẦU

1

1.1

Đặt vấn đề

1

1.2.

Mục đích – yêu cầu

2

1.2.1.

Mục đích

2

1.2.2. Yêu cầu

2

PHẦN II: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

3

2.1.

Enzyme chitosanase

3

2.1.1.

Khái niệm

3

2.1.2.

Phân loại enzyme chitosanase

3

2.1.3.

Cấu tạo và khối lượng phân tử enzyme chitosanase

6

2.1.4.

Cơ chế xúc tác của enzyme chitosanase

7

2.1.5.

Tính đặc hiệu cơ chất của enzyme chitosanase

8

2.1.6.

Ảnh hưởng của nhiệt độ và pH tới sự hoạt động của enzyme chitosanase 10

2.1.7.

Ảnh hưởng của ion kim loại và các chất phản ứng khác tới sự hoạt động của
enzyme chitosanase

11

2.1.8.

Ứng dụng của enzyme chitosanase và chitosan oligosaccharide

12

2.2.

Thu nhận và tinh sạch enzyme chitosanase

15

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp

Page iii


2.2.1.

Nguồn thu nhận enzyme chitosanase đã dùng trong sản xuất chitosanase 15

2.2.2.

Vi khuẩn Bacillus licheniformis

15

2.2.3.

Các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng sinh tổng hợp chitosanase

16

2.2.4.

Thu nhận chitosanase kỹ thuật

19

2.3.

Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước về enzyme chitosanase

20

2.3.1.

Tình hình nghiên cứu enzyme chitosanase trên thế giới

20

2.3.2.

Tình hình nghiên cứu enzyme chitosanase trong nước

21

PHẦN III VẬT LIỆU – NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

24

3.1.

Vật liệu

24

3.1.1.

Đối tượng nghiên cứu

24

3.1.2.

Môi trường nuôi cấy

24

3.1.3.

Dụng cụ, thiết bị và hóa chất sử dụng

24

3.1.4.

Địa điểm nghiên cứu

25

3.1.5.

Thời gian nghiên cứu

25

3.2.

Nội dung nghiên cứu

25

3.3.

Bố trí thí nghiệm

25

3.3.1.

Xác định điều kiện nuôi cấy tối ưu vi khuẩn Bacillus licheniformis NN1

25

3.3.2.

Xây dựng quy trình thu nhận chế phẩm enzyme chitosanase kỹ thuật.

28

3.3.3.

Phương pháp xác định hoạt tính enzyme chitosanase kỹ thuật

30

3.3.4.

Xác định đặc tính của enzyme chitosanase

33

3.4.

Phương pháp thống kê và xử lý kết quả

33

PHẦN IV. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN
4.1.

34

Xác định điều kiện nuôi cấy tối ưu vi khuẩn Bacillus licheniformis NN1
sinh tổng hợp cao chitosanase

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp

34

Page iv


4.1.1.

Kết quả thực nghiệm thăm dò đơn yếu tố

34

4.1.2.

Mô hình hóa và tối ưu hóa quá trình nuôi cấy từ vi khuẩn Bacillus
licheniformis NN

36

4.1.3.

Kiểm tra mô hình

40

4.1.4.

Xác định đường cong động học sinh trưởng của vi khuẩn Bacillus licheniformis
NN1

4.2.

41

Xác định điều kiện thu nhận chitosanase từ vi khuẩn Bacillus licheniformis
NN1

42

4.2.1.

Nuôi cấy

42

4.2.2.

Cô đặc dịch enzyme thô

42

4.2.3.

Tủa phân đoạn enzyme chitosanase bằng muối amoni sunphate

43

4.2.4.

Quy trình thu nhận enzyme chitosanase kỹ thuật từ vi khuẩn Bacillus
licheniformis NN1

4.3.

44

Xác định một số đặc tính enzyme chitosanase thu nhận từ vi khuẩn Bacillus
licheniformis NN1

46

4.3.1.

Xác định nhiệt độ tối thích đến hoạt tính của enzyme chitosanase

46

4.3.2.

Xác định pH tối thích của enzyme chitosanase

47

4.3.3.

Ảnh hưởng của một số ion kim loại đến hoạt tính của enzyme chitosanase

49

PHẦN V: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ

51

5.1.

Kết luận

51

5.2.

Đề nghị

51

TÀI LIỆU THAM KHẢO

52

PHỤ LỤC

56

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp

Page v


DANH MỤC BẢNG

STT

Tên bảng

Trang

2.1:

Các chủng vi sinh vật đại diện cho mỗi họ enzyme

4

2.2:

Phân loại Chitosanase dựa vào sự phân cắt đặc hiệu của cơ chất

5

2.3:

Khối lượng phân tử của một số enzyme chitosanase

7

2.4:

Cơ chất đặc hiệu của enzyme chitosanase từ Bacillus sp. KCTC 0377BP

9

2.5:

Nhiệt độ và pH tối ưu cho hoạt động của chitosanase thu được từ một số vi
sinh vật khác nhau

10

2.6:

So sánh đặc tính của một số enzyme chitosanase được sản xuất từ vi sinh vật

2.7:

Điều kiện nhiệt độ, pH và thời gian nuôi cấy của một số chủng vi sinh vật
sinh chitosanase

12

19

3.1:

Ma trận thực nghiệm

27

4.1:

Các mức thí nghiệm

36

4.2:

Ma trận thực nghiệm

37

4.3:

Ma trận kết quả

38

4.4:

Kết quả kiểm tra mô hình

40

4.5:

Hoạt tính của enzyme chitosanase trước và sau khi cô đặc

42

4.6:

Hoạt tính, hàm lượng protein và hoạt tính riêng của enzyme chitosanase trước
và sau cô đặc ở các nồng độ muối khác nhau

43

4.7:

Ảnh hưởng của nhiệt độ tới hoạt tính của enzyme chitosanase

47

4.8:

Ảnh hưởng của pH tới hoạt tính của enzyme chitosanase

48

4.9:

Ảnh hưởng của các ion kim loại đến hoạt tính enzyme chitosanase

49

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp

Page vi


DANH MỤC HÌNH
STT

Tên hình

2.1: Cấu trúc protein 3D của enzyme chitosanase

Trang
thu được từ Bacillus

circulans MH-K1

6

2.2: Cơ chế xúc tác của enzyme chitosanase

8

3.1: Enzyme chitosanase thuỷ phân chitosan tạo các oligosaccharide

30

3.2: Phản ứng 3,5–dinitrosalicylic acid bị khử tạo thành 3–amino,5–nitrosalicylic acid

30

4.1: Ảnh hưởng của nhiệt độ tới quá trình sinh tổng hợp chitosanase từ vi khuẩn
Bacillus licheniformis NN1

34

4.2: Ảnh hưởng của pH tới quá trình sinh tổng hợp chitosanase từ vi khuẩn
Bacillus licheniformis NN1

35

4.3: Ảnh hưởng của nồng độ chitosan tới quá trình sinh tổng hợp chitosanase từ vi
khuẩn Bacillus licheniformis NN1

35

4.4: Đường cong sinh trưởng và hoạt tính chitosanase của vi khuẩn Bacillus
licheniformis NN1

41

4.5: Quy trình thu nhận enzyme chitosanase kỹ thuật từ vi khuẩn Bacillus
licheniformis NN1

45

4.6: Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt tính của enzyme chitosanase

48

4.7: Ảnh hưởng của pH đến hoạt tính của enzyme chitosanase

49

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp

Page vii


DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

Chữ viết tắt

Tên đầy đủ

COS

Chitosan Oligosaccharide

DA

Degree of deacetylation

DP

Degree of polymerization

DNS

Acid dinitro salisylic

DEAE

Diethylaminoethyl

GlcN

D – Glucosamine

GlcNAc

N-acetyl-D-Glucosamine

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp

Page viii


PHẦN I
MỞ ĐẦU
1.1 Đặt vấn đề
Ngày nay, cùng với sự phát triển mạnh mẽ của công nghệ sinh học, các chế
phẩm enzyme ngày càng được sử dụng rộng rãi trong các lĩnh vực như : hóa học,
công nghiệp nhẹ, y tế, nông nghiệp, chăn nuôi,… và nhất là trong công nghệ thực
phẩm. Hàng năm lượng enzyme được sản xuất trên thế giới đạt khoảng trên 300.000
tấn với giá trị hàng trăm triệu đô la. Thực tế đã có hàng nghìn chế phẩm enzyme bán
trên thị trường thế giới, các chế phẩm này đã được khai thác và tinh chế có mức độ
tinh khiết theo tiêu chuẩn công nghiệp và ứng dụng. Các chế phẩm enzyme phổ
biến như amylase, protease, catalase, cellulase, lipase, glucoseoxydase… [7]. Tuy
nhiên ở nước ta hiện này ngành công nghiệp này vẫn còn rất mới mẻ. Do vậy, việc
nghiên cứu tìm kiếm các loại enzyme mới, tìm hiểu các đặc tính, ứng dụng của
chúng luôn là mục tiêu của các nhà khoa học. Một trong số các enzyme đó là
enzyme chitosanase.
Chitosanase kỹ thuật là một enzyme ngoại bào thủy phân liên kết nội phân tử
cơ chất chitosan, được biết đến ứng dụng chủ yếu để sản xuất ra Chitosan –
oligosaccharide (COS).
COS được ứng dụng giống chitosan nhưng do đặc tính dễ hoà tan trong nước
mà COS được ứng dụng nhiều trong y học và dược phẩm: COS giúp kích thích tiêu
hoá thức ăn, tăng tính thèm ăn ở vật nuôi, tăng cường sức đề kháng, tăng khả năng
miễn dịch, ngăn cản sự phát triển của tế bào ung thư… [7,8]

Enzyme chitosanase có thể thu nhận từ vi khuẩn, nấm, hay một số thực vật,
động vật…nhưng enzyme chitosanase thu nhận từ chủng vi khuẩn là có hoạt tính
cao hơn cả và đặc biệt có ưu thế trong sản xuất công nghiệp. Hơn nữa, các vi sinh vật
này lại có khả năng sinh sản, phát triển với một tốc độ cực kỳ lớn, do đó cho phép thu
được một lượng enzyme trong thời gian ngắn một cách dễ dàng. Mặt khác, môi trường
nuôi cấy lại dễ kiếm, rẻ tiền… [7].
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp

Page 1


Trong các loại vi sinh vật thu nhận enzyme chitosanase kỹ thuật được sử
dụng hiện nay, thì vi khuẩn Bacillus licheniformis có ưu điểm là nguồn phổ biến và
giá thành có ý nghĩa kinh tế nhất.
Trên thế giới cũng đã có khá nhiều đề tài nghiên cứu về enzyme chitosanase
được tổng hợp từ các loài vi sinh vật. Tuy nhiên, ở Việt Nam cho đến thời điểm này,
những nghiên cứu về chitosanase và các loài vi sinh vật sản sinh ra nó còn tương
đối hạn chế. Do đó, để góp phần vào việc nghiên cứu và ứng dụng chitosanase,
chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài: “Thu nhận và xác định đặc tính của
enzyme chitosanase kỹ thuật từ vi khuẩn Bacillus licheniformis NN1”
1.2. Mục đích – yêu cầu
1.2.1. Mục đích
Nghiên cứu tối ưu hóa quá trình nuôi cấy vi khuẩn Bacillus licheniformis NN1
để tổng hợp enzyme chitosanase kỹ thuật và xác định một số đặc tính của enzyme
này.
1.2.2. Yêu cầu
- Xác định được các điều kiện nuôi cấy và xây dựng được quy trình nuôi
cấy tối ưu vi khuẩn Bacillus licheniformis NN1 có khả năng sinh tổng hợp enzyme
chitosanase cao
- Xác định được điều kiện thu nhận enzyme chitosanase kỹ thuật từ vi

khuẩn Bacillus licheniformis NN1
-

Xác định được một số đặc tính của enzyme chitosanase kỹ thuật thu

nhận từ vi khuẩn Bacillus licheniformis NN1.

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp

Page 2


PHẦN II
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1. Enzyme chitosanase
2.1.1. Khái niệm
Enzyme chitosanase có tên gọi đầy đủ theo danh pháp quốc tế là: Chitosan
N–acetylglucosaminohydrolase.
Chitosanase (EC 3.2.1.132) là enzyme xúc tác cho phản ứng thủy phân
chitosan bắng cách cắt đứt liên kết β–1,4–glucoside trừ liên kết giữa các
N–acetyl–D–glucosamine (GlcNAc–GlcNAc) và giải phóng ra các Chitosan
oligosaccharide.
Chitosanase

Chitosan + H2O

Các Chitosan Oligosaccharide chứa các
N–acetyl–D–glucosamine, D–glucosamine

Hoạt tính của chế phẩm enzyme đặc trưng cho khả năng xúc tác phân giải

chitosan thành các COS có phân tử thấp hơn. Hoạt tính chitosanase được biểu thị
bằng số đơn vị hoạt tính trong 1ml (hay 1g) chế phẩm [43].
2.1.2. Phân loại enzyme chitosanase
Dựa vào sự tương đồng của chuỗi amino acid và dựa vào sự phân cắt đặc
hiệu cơ chất của enzyme chitosanase, ta có thể phân loại enzyme chitosanase theo 2
cách dưới đây:
2.1.2.1. Dựa vào sự tương đồng của chuỗi amino acid
Dưới đây là một số vị trí tác dụng của enzym chitosanase đã tìm thấy được
chia theo họ:

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp

Page 3


Bảng 2.1: Các chủng vi sinh vật đại diện cho mỗi họ enzyme
Họ
chitosanase

Họ 5

Họ 8

Họ 46

Họ 75

Họ 80

Các chủng vi sinh vật sinh

chitosanase đặc trưng cho mỗi họ

Streptomyces griseus HUT 6037

Bacillus sp. No.7M
Bacillus circulans WL-12
Paenibacillus fukuinensis chủng D2
Streptomyces sp. chủng N174
Nocardioides sp. chủng N106
Amycolatopsis sp. chủng CsO–2
Streptomyces coelicolor A3
Streptomyces coelicolor A3 Bacillus
subtilis
Bacillus amyloliquefaciens
Bacillus KF
Bacillus KFB–C044, ( sinh
Chitosanase chịu nhiệt)
Bacillus sp. chủng CK4
Chlorella virus PBCV–1
Chlorella virus CVK2
Bacillus ehimensis
Bacillus coagulans
Burkholderia gladioli
Bacillus circulans MH–K1
Fusarium solani
Aspergillus oryzae
Aspergillus fumigatus
Metarhizium anisopliae

Những điều lưu ý

Các chitosanase của nhóm này còn có khả
năng xúc tác phản ứng vận chuyển nhóm
glycoside, ngoài ra còn thủy phân được cả
carboxymethylcellulose (CMC).
Ngoài việc thủy phân chitosan còn có
nhiều hoạt tính enzyme khác như:
cellulase, endo–xylanase
Hầu hết các enzyme nghiên cứu đều
thuộc họ 46

Tất cả các emzyme chitosanase thuộc họ 75
đều là những enzyme từ nấm. Nhìn chung
sự sinh tổng hợp chitosanase từ vi khuẩn cao
hơn của nấm mốc nhưng hoạt tính lại thấp
hơn.
Matsuebacter
chitosanotabidus Các enzyme này mới được tinh sạch và
Sphingobacterium multivorum
theo các kết quả phân tích trong phòng thí
nghiệm thì các vị trí cắt của enzyme
thuộc họ 80 này có những trình tự bảo thủ
như của enzyme chitosanase thuộc họ 40

Nguồn: [44]

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp

Page 4

2.1.2.2. Dựa vào sự phân cắt đặc hiệu cơ chất của enzyme chitosanase
Chitosanase có khả năng nhận dạng liên kết đặc trưng trong chuỗi chitosan để
tiến hành phân cắt. Vị trí đó là liên kết β–1,4 glucoside giữa các phân tử
D–Glucosamine hoặc giữa D–Glucosamine và N–acetyl–D–Glucosamine.
Tuy nhiên không phải bất kỳ enzyme chitosanase nào cũng tấn công vào bất
kỳ vị trí liên kết này, mà có một số chitosanase chỉ có khả năng tấn công vào vị trí
β–1,4 glucoside giữa hai D–Glucosamine, còn một số chitosanase lại có khả năng
tấn công vào liên kết này giữa hai D–Glucosamine và giữa D–Glucosamine với
phần N–acetyl–D–Glucosamine còn lại. Dưới đây là một số vị trí tác dụng của
enzym chitosanase đã tìm thấy được chia theo họ.
Các liên kết đặc hiệu cho nhận của các enzyme chitinolytic và chitosanolytic
đã được điều tra bằng cách sử dụng cơ chất thông thường là acetylated chitosan
20–30%.
Dựa theo sự phân cắt đặc hiệu của cơ chất chitosanase thì enzyme chitosanase
được phân thành ba loại khác biệt theo đề nghị của Fukamizo và CS [ 12].
Bảng 2.2: Phân loại Chitosanase dựa vào sự phân cắt đặc hiệu của cơ chất
Chitosanase

Kiểu phân cắt

Type I
– Bacillus pumilus BN–262
– Penicillium islandicum Streptomyces sp.
N174
Type II
– Bacillus sp. No 7–M
Type III
– Streptomyces griseus HUT 6037
–Bacillus circulans MH–K1

–Nocardia orientalis
– Bacillus circulans WL–12
: GlcNAc

: GlcN
Nguồn: [44]

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp

Page 5


Chitosanase loại I: Bao gồm các enzyme chitosanase cắt các liên kết
GlcNAc–GLcN và GlcN–GlcN.
Chitosanase loại II: Bao gồm các enzyme chitosanase cắt các liên kết
GlcN–GLcN
Chitosanase loại III: Bao gồm các enzyme chitosanase cắt các liên kết
GlcN–GLcNAc và GlcN–GlcN.
2.1.3. Cấu tạo và khối lượng phân tử enzyme chitosanase
Chitosanase hầu hết là các enzyme ngoại bào, có cấu tạo đơn phân tử, thủy
phân liên kết β–1,4 glucoside giữa gốc Glucosamine và N–acetyl–D–glucosamine
trong chuỗi N–acetylate Chitosan. Chitosanase có khả năng tấn công chitosan
nhưng không có khả năng tấn công chitin.

Hình 2.1: Cấu trúc protein 3D của enzyme chitosanase
thu được từ Bacillus circulans MH-K1
Chitosanase cũng giống như mọi enzyme khác đều có bản chất là protein.
Chúng có khối lượng phân tử khoảng từ 30–70kDa và kích thước mỗi loại enzyme
chitosanase thu được từ các nguồn khác nhau thì khác nhau. Khối lượng phân tử của
enzyme chitosanase thu được từ một số loài vi sinh vật khác nhau được trình bày ở

Bảng 2.3.

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp

Page 6


Bảng 2.3: Khối lượng phân tử của một số enzyme chitosanase

Chitosanase

Khối lượng phân tử

Bacillus cereus

47 kDa

Bacillus circulans

31 kDa

Bacillus megaterium P1

43 kDa

Bacillus sp.

41 kDa

Bacillus sp. KCTC 0377BP

45 kDa

Sphingomonas sp.CJ–5

45 kDa

Streptomyces griceus HUT 6037

34 kDa

B. subtilis TKU007.

25 kDa

Bacillus cereus D–11

20–50 kDa

Serratia marcescens TKU011

21 kDa

Pseudomonas sp. TKU015

68 kDa
Nguồn: [24, 14, 37]

2.1.4. Cơ chế xúc tác của enzyme chitosanase
Fukamizo và cs. (1999) đã xác định được các sản phẩm dị vòng thu được từ quá

trình thuỷ phân chitosan đều là dạng α, điều đó cho thấy rằng chitosanase là một
enzyme chuyển hoá.
Cùng với những kết quả thu được khi quan sát dạng tinh thể học và các vùng
biến đổi cho phép chúng ta kết luận rằng đầu Glu22 hoạt động như là nơi cho
proton, trong khi đầu Asp4 hoạt hoá 1 phân tử nước sau đó tấn công vào vị trí C–1
của phân tử đường khử tại vị trí xúc tác.
Cơ chế chuyển hoá này được duy trì liên tục trên thực tế là nhờ 2 đầu xúc tác có
khoảng cách 13.8Å, cao hơn những enzyme chuyển hoá khác gần 10Å [12].

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp

Page 7


Cơ chế xúc tác của chitosanase được thể hiện trong hình sau:

Hình 2.2: Cơ chế xúc tác của enzyme chitosanase
Sản phẩm phản ứng của enzyme chitosanase được nghiên cứu bằng cách sử
dụng dung dịch chitosan và một vài COS làm cơ chất. Phương pháp sắc kí lớp
mỏng (TLC) (thin–layer chromatography) cho thấy rằng enzyme chitosanase đã giải
phóng ra COS từ chitosan, phần lớn là các COS dài hơn (GlcN)2 bằng cách phân cắt
nội phân tử. Enzyme này không thể thuỷ phân được (GlcN)2 hoặc (GlcN)3. Còn
(GlcN)4 và (GlcN)5 thì bền với hoạt tính xúc tác của enzyme này. Tuy nhiên,
chitosan oligosaccharide (GlcN)6 và (GlcN)7 được thuỷ phân hoàn toàn sau 15h ủ.
(GlcN)6 chủ yếu được phân cắt thành (GlcN)3 + (GlcN)3 và (GlcN)2 + (GlcN)4
nhưng (GlcN)2 + (GlcN)4 thì ít hơn nhiều. [Rồi sau đó, (GlcN)4 → (GlcN)2 +
(GlcN)2]. Nó cũng cho thấy rằng (GlcN)7 được phân cắt thành (GlcN)3 + (GlcN)4.
Kết quả này chỉ ra rằng để phản ứng xảy ra nhanh, cơ chất chitosan nên có chiều dài
chuỗi phân tử bằng hoặc dài hơn (GlcN)6, sự phân cắt liên kết glycoside xảy ra tốt
nhất tại trung tâm của mối liên kết hexameric và sinh ra (GlcN)3 là sản phẩm chủ

yếu. Thực tế, enzyme chitosanase thể hiện hoạt tính đối với chitosan cao hơn so với
các oligosaccharide mạch ngắn hơn [43].
2.1.5. Tính đặc hiệu cơ chất của enzyme chitosanase
Trong số các cơ chất được thử nghiệm như: Chitosan, COS, dịch keo chitin,
carboxymethyl cellulose (CMC) và peptidoglucan thì enzyme chitosanase thường
thể hiện hoạt tính cao nhất đối với cơ chất chitosan hoà tan (Bảng 2.4).
Mặc dù đã kéo dài phản ứng enzyme qua đêm nhưng nó vẫn không thể thuỷ

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp

Page 8


phân được (GlcNAc)6, chitin tinh thể và peptidoglycan nhưng nó lại có khả năng
thuỷ phân được dung dịch keo chitin và CMC. Độ bền của (GlcNAc)6 đối với hoạt
động của enzyme chitosanase cho thấy rằng enzyme này không có hoạt tính
chitinase. Hoạt tính chitinase là khả năng phân cắt liên kết β–1,4 giữa GlcNAc –
GlcNAc. Hoạt tính nhỏ đối với cơ chất keo chitin có thể được giải thích là do
enzyme chitosanase phân cắt β–1,4 của GlcN – GlcN, GlcN – GlcNAc và GlcNAc
– GlcN, chúng được tìm thấy trong dung dịch keo chitin với DDA 10%.
Bảng 2.4: Cơ chất đặc hiệu của enzyme chitosanase
từ Bacillus sp. KCTC 0377BP
Cơ chất

Hoạt tính tương đối (%)

Chitosan oligosaccharide
Chitobiose………………………….

–

Chitotriose………………………….

–

Chitotetraose………………………..

15.0

Chitopentaose………………………

16.8

Chitohexaose……………………….

20.0

Chitoheptaose………………………

23.8

Chitosan hoà tan

100

Dịch keo chitin

2.8

CMC

2.5

Peptidoglycan

–

Tinh bột hoà tan

–
Nguồn: [38]

Như đã nói ở trên, chitosan có tính đa dạng hoá học trong DDA của chúng. Tính đa
dạng của chitosan có thể tác động đến tính nhạy cảm của enzyme chitosanase. Khi hoạt
tính tương đối của chitosanase đối với cơ chất chitosan được thử nghiệm với các mức độ
DDA khác nhau, người ta nhận thấy hoạt tính của chitosanase tăng lên cùng với sự tăng
của giá trị DDA của chitosan.

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp

Page 9


2.1.6. Ảnh hưởng của nhiệt độ và pH tới sự hoạt động của enzyme chitosanase
Nhìn chung, vận tốc phản ứng do enzyme xúc tác thường tăng lên theo nhiệt độ
nhưng chỉ tăng lên trong một giới hạn xác định mà ở đó phân tử enzyme vẫn còn bền và
chưa bị biến tính. Nhiệt độ thích hợp cho sự hoạt động của mỗi enzyme thường tương đối
rộng. Đối với chitosanase, người ta đã nghiên cứu và cho thấy rằng chúng có thể hoạt động
trong khoảng 30 – 700C và đa số đều hoạt động tốt nhất trong khoảng nhiệt độ 50 – 600C.
Nhưng nhiệt độ mà ứng với hoạt tính enzyme cao nhất thường chỉ tồn tại một điểm và

nhiệt độ đó là nhiệt độ tối ưu của enzyme (topt). Nhiệt độ tối ưu của chitosanase thu được từ
các nguồn khác nhau thì cũng khác nhau và topt thường không cố định mà có thể thay đổi
tuỳ theo cơ chất, pH môi trường, thời gian phản ứng…
– Độ bền pH và pH tối ưu cho sự hoạt động của enzyme chitosanase
Giá trị pH của môi trường ảnh hưởng rõ rệt đến phản ứng enzyme vì nó ảnh
hưởng đến mức độ ion hoá cơ chất, enzyme và độ bền của protein enzyme. Đa số các
enzyme bền trong giới hạn pH giữa 5 đến 9. Đối với enzyme chitosanase, pH thích hợp
cho hoạt động của chúng thường vào khoảng 4.0 – 8.0. Tuy nhiên, pH tối ưu (pHopt) cho
hoạt động của chitosanase thu được từ các nguồn khác nhau là khác nhau.
Bảng 2.5: Nhiệt độ và pH tối ưu cho hoạt động của chitosanase thu được
từ một số vi sinh vật khác nhau
pH tối ưu

Nhiệt độ tối ưu (0C)

Bacillus sp. KCTC 0377BP

5.0

60

Bacillus cereus

5.8

54

Bacillus licheniformis MB-2

7.0

37

Streptomyces griceus HUT 6037

5.7

60

Streptomyces N174

5.5

65

Sphingomonas sp. CJ–5

6.5

56

Vi sinh vật

Nguồn: [10, 32, 22, 14, 34]
Như vậy, enzyme chitosanase có thể được phân loại vào nhóm enzyme có tính acid và
tính chịu nhiệt.

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp

Page 10

2.1.7. Ảnh hưởng của ion kim loại và các chất phản ứng khác tới sự hoạt động
của enzyme chitosanase
Theo các tài liệu nghiên cứu về vấn đề này, các ion như Mg2+, Mn2+ có khả
năng làm tăng hoạt tính của enzyme chitosanase, trong khi đó các ion Hg2+, Cu2+,
Co2+, Zn2+ và Ag+ lại có thể ức chế hoạt tính của enzyme này. Fe3+ kích thích hoạt
tính chitinase nhưng lại ức chế mạnh hoạt tính chitosanase. Các ion kim loại khác
không gây ảnh hưởng đến hoạt động của enzyme này. Hoạt tính của enzyme
chitosanase giảm khoảng 50% nếu thêm KCl 0.4M hoặc NaCl 0.4M vào hỗn hợp
phản ứng.

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp

Page 11


Bảng 2.6: So sánh đặc tính của một số enzyme chitosanase được sản xuất từ vi sinh vật
Vi sinh vật
Bacillus sp. strain KCTC 0377BP
Aspergillus oryza IAM 2660
Nocardia orientalis IFO 12806
Acinetobacter sp. strain CHB101
Enterobacter sp. strain G-1
Myxobacter strain AL-1
Matsuebacter chitosanotabidus 3001
B. cereus S1
B. megaterium P1 chitosanase Acetyl
Bacillus sp. strain KFB – C108

Khối lượng
phân tử
(kDa)a

Kiểu
hoạt
động (b)

pHopt

Hoạt tính
riêng
(U/mg)

45

Endo

4.0-6.0

1,700

40
135
97
37
30
50
31
34

45
43
48

Endo
Exo
Exo
Endo
Endo
Exo
Endo
Endo
Endo
Endo
Endo

5.5
5.5
5.5
5-9
5-9
7.0
5.0
4.0
6.0
4.5-6.5
6.5

17.2
38.8

35.8
334
800
5.84
ND(d)
250
196
154.8
110

Cơ chất đặc hiệu
(%DDA)

Sản phẩm
cuối cùng(c)

Chitosan(40-100),
CMC G3 – G7
(2,5)
Chitosan (70-100)
Oligomer
Chitosan (90-100)
G1
Chitosan (100)
G1
Chitosan (70-90)
G2, G3
Glycol chitosan
Chitosan (80)
G2

CMC, Chitosan
ND
Chitosan (90)
G1-G3
Chitosan, CMC (21,6)
G2-G4
Chitosan (81), CMC (0,4)
Oligomer
Chitosan
G3-G5
Nguồn: [43]

Chú thích:
(a)

Được xác định bằng phương pháp điện di trên gel polyacrylamide (SDS – PAGE)
(Sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis) với enzyme tinh sạch
(b)
Exo: kiểu phân cắt ngoài; Endo: kiểu phân cắt trong
(c)
Sản phẩm cuối cùng khi sử dụng chitosan làm cơ chất
(d)
ND (not determined): không xác định được
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp

Page 12


2.1.8. Ứng dụng của enzyme chitosanase và chitosan oligosaccharide
2.1.8.1. Ứng dụng của enzyme chitosanase

Cho đến nay, ứng dụng lớn nhất và chủ yếu nhất của enzyme chitosanase là để sản
xuất COS từ chitosan. Sản xuất COS từ chitosan bằng phương pháp enzyme có những ưu
điểm vượt trội so với phương pháp hoá học. Phương pháp enzyme là phương pháp sản
xuất rất nhanh chóng, rẻ tiền, mang lại lợi ích kinh tế rất lớn, do enzyme chitosanase được
phân lập từ những nguồn vi sinh vật rất phong phú trong tự nhiên.
Hơn nữa, nếu kiểm soát được sự hoạt động của enzyme chitosanase (nhiệt độ, pH, thời
gian…) sẽ tạo ra được các chitosan oligosaccharide theo mong muốn. Điều này có ý nghĩa
quan trọng khi sản xuất COS ở quy mô công nghiệp. Từ đó, COS với những đặc tính ưu
việt được ứng dụng rất rộng rãi trong nhiều lĩnh vực như đã trình bày ở trên [20].
2.1.8.2. Ứng dụng của COS
Chitosan Oligosaccharide (COS) là sản phẩm thủy phân chitosan, nó có khả
năng tan được trong nước. Tên hóa học 2–amino–A–1,4–glucose polymer và công
thức phân tử (C6H11O4N)n£. COS là một loại Oligosaccharide thu được từ sản phẩm
thủy phân chitin hoặc chitosan bằng hóa chất hay enzyme. Phương pháp hóa học sử
dụng acid thủy phân cho năng suất thấp lại tốn kém nên phương pháp được sử dụng
chủ yếu là enzyme chitosanase. Enzyme chitosanase phân cắt liên kết
β–1,4–glycoside của chitosan tạo ra COS. Do đó cấu tạo của COS là một chuỗi
phân tử được cấu tạo bởi một số đơn vị D–glucosamine (GlcN) (thường là từ 2 đến
10 đơn vị GlcN). Chiều dài chuỗi phân tử và mức độ deacetyl (DDA) được coi là 2
yếu tố quan trọng nhất ảnh hưởng đến hoạt tính sinh học của COS. COS dài hơn
hexamer có khả năng ức chế vi sinh vật, chống ưng thư, tăng cường miễn dịch...tốt
hơn so với các COS ngắn. Sự tăng mức độ deacetyl làm tăng hoạt tính sinh học của
COS. Bởi vậy, kiểm soát chặt chẽ chiều dài chuỗi phân tử và DDA là điều kiện tiên
quyết để sản xuất COS có giá trị cao [18].
Ứng dụng COS trong y học
COS là chất có khả năng ngăn chặn sự tích lũy các chất béo bên trong các cơ
quan cỏ thể sinh vật, đặc biệt là ở trong thận của những người sau khi uống rượu.
Quan trọng hơn COS ngăn chặn những tác động xấu của rượu lên gan ngăn chặn
những ảnh hưởng xấu đến các bệnh về gan cho những người nghiện rượu.
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp

Page 12


Không giống với chitosan, COS dễ đồng hóa bên trong cỏ thể và bên cạnh đó nó
có thể làm tăng sự đồng hóa của một số nguyên tố vi lượng như sắt, Canxi,... Ứng dụng
của Oligosaccharide cho phép giải quyết một số vấn đề về dinh dưỡng liên quan đến
thiếu hụt một số nguyên tố vi lượng. Nó loại bỏ một cách hoàn toàn Cholesterol và
lipoprotein mật độ thấp từ mạch máu. Bởi vậy việc bổ sung COS vào cơ thể của các
bệnh nhân bị bệnh béo phì thì có kết quả tốt. COS là cation dương vì vậy nó có thể liên
kết với các ion Cl có trong mạch máu rồi thải ra ngoài làm giảm huyết áp.
COS có nhiều đặc điểm nổi bật hơn so với chitin và chitosan. Tỉ lệ hấp thụ
Chitosan Oligosaccharide trong cơ thể người là 100%, hoạt tính và chức năng sinh
học của nó cao hơn chitosan rất nhiều. Do vậy nên đưa vào cơ thể hàng ngày để duy
trì sức khỏe.
COS còn có thể sử dụng để ức chế sự tiêu hóa các chất béo và nó đóng vai trò
như một tác nhân vận chuyển và nó được sử dụng như là tác nhân làm giảm
Cholesterol. COS phá vỡ khối mỡ thể hiện là nó có thể cản trở sự hấp thụ chất béo
bằng cánh tạo keo với chất béo trong ruột non.
Có nhiều nghiên cứu đã chứng minh COS có chức năng tăng cường hệ thống
miễn dịch, ngăn cản sự phát triển của tế bào ung thư, tạo thành các kháng thể trong
gan và lá lách, kích thích sự tiêu hóa Canxi và các chất khoáng, kích thích sản sinh
ra các tế bào vi khuẩn có thể chữa bệnh như: Vi khuẩn lactic, làm giảm chất béo
trong máu, giảm huyết áp và lượng đường trong máu, điều chỉnh Cholesterol, giảm
cân và ngăn ngừa các bệnh ở người trưởng thành...Ngoài ra COS còn được ứng
dụng để cầm máu, chữa bỏng da, băng bó vết thương....[16].
Trong công nghệ thực phẩm
COS được dùng trong các quá trình xử lí sản phẩm, để bảo quản rau quả, một
số loại trái cây tươi (cà chua, dâu tây, cam, bưởi...). Tạo gel, tạo độ mịn, bề dày cho
sản phẩm, đặc biệt hơn COS có thể hút nước trong các sản phẩm nhằm tránh một số

quá trình lên men xảy ra trong khi bảo quản. Màng mỏng chitosan trên bề mặt có
tác dụng ức chế hô hấp, giữ lại khí cacbonic, giảm thiểu lượng ethylene, diệt được
một số loại nấm và kìm hãm quá trình biến màu của quả trong khi bảo quản, vận
chuyển tiêu thụ.
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp

Page 13


Nghiên cứu của Wenshui & Xia (2010) cũng sử dụng COS trong bảo quản
nước táo đã kéo dài thời gian bảo quản ở 370C từ 9 ngày đến 70 ngày với nồng độ
COS là 4g/l [22].
Chitosan tạo ra bột Chitofood thay thế hàn the độc hại nhưng đảm bảo sản
phẩm vẫn dai, ngon. Phụ gia này được dùng trong chế biến bảo quản các sản phẩm
từ nhóm thịt (giò, chả, thịt hộp, nem), thực phẩm tươi sống, thịt nguội, đồ uống,
nước giải khát, sản phẩm sữa...
COS là chất dinh dưỡng có lợi cho sức khỏe. những nghiên cứu đã cho thấy
rằng COS có khả năng liên kết với các chất béo và cholesterol, làm giảm cholesterol
trong máu có tác dụng tốt đối với những người bị cao huyết áp, những người béo. COS
có cấu trúc dạng sợi và có các thuộc tính giống như các cấu trúc dạng sợi như Cellulose
nên có thể dùng cho những người ăn kiêng, thay thế thức ăn chứa nhiều calo.
Trong nông nghiệp
COS được sản xuất dưới hai dạng rắn và lỏng. Trong thành phần của nó chứa
Cacbon và giàu Nitơ vì vậy nó trở thành nguồn cung cấp các chất này cho cây trồng.
Nó có thể được dùng như một chất kích thích sinh trưởng được bón cho cây trồng
để cải thiện lượng rau, hoa, quả và nó có thể ngăn chặn sự nhiễm sâu bệnh, sinh ra
các chất kháng khuẩn trong đất và làm phân bón sinh học. Sản xuất phân bón và
chất trừ sâu sinh học từ COS đang là lĩnh vực mới mẻ trong tương lai.
Trong công nghệ sinh học và xử lý rác thải
Những nghiên cứu gần đây cho thấy COS có thể sử dụng là tác nhân đông tụ

hiệu quả cho các hợp chất hữu cơ, nó đóng vai trò như một chiếc kìm liên kết các chất
độc kim loại nặng. Chitosan được dùng như một chất mang để tách và làm giàu các
kim loại nặng trong môi trường nước. Mức độ hấp thu của chitosan với các kim loại
nặng thủy ngân, cadimin (Hg, Cd) đạt bão hòa sau 90 phút khuấy. Hg hấp thụ trên
chitosan đạt cao nhất 90%, Cd đạt 41%. Khả năng hấp thụ của chitosan đối với các ion
trên đạt cực đại và ổn định ở pH 4 ÷ 6. Ngoài ra, nó có khả năng hấp thụ các chất
nhuộm cà nồng độ nhỏ của các phenol khác nhau trong công nghệ xử lý rác thải.

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp

Page 14