Nghiên cứu thu nhận và xác định đặc tính của galactosidaza từ một số chủng nấm mốc aspergillus SP. và ứng dụng để sản xuất galactooligosaccarit

BỘ GI
Á
O DỤC V
À
Đ
À
O TẠO
ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI

**************************





BÙI THỊ HẢI HÒA





NGHIÊN CỨU THU NHẬN VÀ XÁC ĐỊNH ĐẶC TÍNH CỦA
β-GALACTOSIDAZA TỪ MỘT SỐ CHỦNG NẤM MỐC
ASPERGILLUS SP. VÀ ỨNG DỤNG ĐỂ SẢN XUẤT
GALACTOOLIGOSACCARIT


Chuyên ngành : Công nghệ sinh học thực phẩm
Mã số: 62 54 02 05

TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ KỸ THUẬT






Hà Nội – 2009

Công trình được hoàn thành tại Bộ môn Hóa sinh và sinh học phân tử,
phòng thí nghiệm Công nghệ sinh học, Viện Công nghệ sinh học và Công
nghệ thực phẩm, Trường Đại học Bách Khoa Hà Nội.

Phản biện 1: GS. TS. Nguyễn Đình Quyến
Phản biện 2: PGS. TS. Nguyễn Thị Hoài Trâm
Phản biện 3: GS. TS. Nguyễn Thành Đạt





Luận án sẽ được bảo vệ trước Hội đồng cấp nhà n
ước chấm luận án tiến
sĩ họp tại trường Đại học Bách Khoa vào hồi… , ngày… tháng… năm
2009








Có thể tìm hiểu luận án tại:
- Thư viện Quốc Gia Việt Nam
- Thư viện Đại học Bách Khoa Hà Nội


Người hướng dẫn khoa học:

GS. TS. ĐẶNG THỊ THU

PGS.TS. NGUYỄN VĂN CÁCH


NHỮNG CÔNG TRÌNH CỦA TÁC GIẢ ĐÃ CÔNG BỐ
LIÊN QUAN ĐẾN ĐỀ TÀI LUẬN ÁN

1) Đặng Thị Thu, Nguyễn Văn Cách, Bùi Thị Hải Hòa (2007). Tuyển chọn và
nghiên cứu điều kiện lên men sinh tổng hợp β-galactosidaza từ chủng nấm
mốc Aspergillus oryzae. Tạp chí Khoa học và Công nghệ. Tập 45, số 1, tr. 23
– 31.

2) Bùi Thị Hải Hòa, Đặng Thị Thu, Nguyễn Văn Cách (2008). Tách, tinh chế
và xác định đặc tính của β-galactosidaza từ chủng nấm mốc Aspergillus
oryzae 3. Báo cáo hội nghị khoa học toàn quốc lần thứ IV. Tr 298 – 300.

3) Đặng Thị Thu, Nguyễn Văn Cách, Lê Quang Hòa, Nguyễn Văn Cường,
Bùi Thị Hải Hòa (2008). Tách dòng và xác định trình tự gen lacA mã hóa
sinh tổng hợp β-galactosidaza từ nấm mốc Aspergillus oryzae 3. Tạp chí Di
truyền học và ứng dụng. Số 1-4, tr. 12 – 19.

4) Dang Thi,T.; Le Quang,H.; Nguyen Van,C.; Bui Hai,H. (2008). Cloning
and expression of the gene coding for beta-galactosidase from Aspergillus
oryzae BK03. EMBL Nucleotide Sequence Database, Accession Number
FM955406.

5) Bùi Thị Hải Hòa, Đặng Thị Thu, Nguyễn Văn Cách (2009). Khảo sát các
điều kiện thích hợp cho phản ứng transgalactozyl sử dụng β-galactosidaza từ
Aspergillus oryzae 3 để sản xuất galactooligosaccarit (GOS) từ lactoza. Tạp
chí Khoa học và Công nghệ. Tập 47, số 2, tr. 101 – 107.

1
MỞ ĐẦU
Đường chức năng là một bộ phận quan trọng trong nhóm thực phẩm
chức năng, được tập trung nghiên cứu nhiều trong những năm gần đây do
có nhiều đặc tính có lợi cho sức khỏe như chống sâu răng, chống bệnh tiểu
đường, không gây béo phì, có khả năng kích thích hoạt động của hệ tiêu
hóa
Galactooligosaccarit (GOS) là sản phẩm của phản ứng transgalatozyl
lactoza dưới sự xúc tác của
β-galactosidaza và thuộc nhóm đường chức
năng. GOS có tác dụng tốt cho sự phát triển của hệ vi sinh vật có lợi trong
đường ruột như Bifidobacterium, Lactobacillus và ức chế các vi sinh vật
gây bệnh. Vì vậy, nhu cầu về các loại đường chức năng có tác dụng tốt đối
với sức khỏe con người như GOS để ứng dụng trong công nghiệp thực
phẩm là rất lớn
β-galactosidaza là một tác nhân sinh học có tác dụng polyme hoá
lactoza tạo ra GOS. Trong tự nhiên β-galactosidaza được phân bố khá rộng
rãi trong các vi sinh vật, thực vật (lá bina, cà chua ) và các cơ thể động vật.
Đặc biệt β-galactosidaza được tìm thấy với hàm lượng và hoạt lực cao ở các
loài vi khuẩn như Bacillus cicurlans, nấm men Kluyveromyces fragilis, K.
lactis và các chủng nấm mốc A. oryzae, A. niger với ưu điểm β-
galactosidaza từ nấm mốc là enzym chịu nhiệt, hoạt động tối ưu ở pH th
ấp
và hoạt tính chuyển galactozyl cao nên rất phù hợp để sản xuất GOS từ
lactoza, chế biến sữa và các sản phẩm thực phẩm khác. Với những ưu điểm
đó β-galactosidaza là một trong những mối quan tâm lớn của các nhà khoa
học trên thế giới
Tại Việt Nam, mặc dù đã có một số nghiên cứu về β-galactosidaza và

ứng dụng vào công nghiệp chế biến sữa, nhưng cho tới nay vẫ
n chưa có
công bố nào về việc nghiên cứu thu nhận và sử dụng β-galactosidaza để
sản xuất đường chức năng galactooligosaccarit.
* Mục tiêu nghiên cứu
- Nghiên cứu thu nhận, tinh chế và xác định đặc tính β-galactosidaza từ nấm
mốc Aspergillus sp.
- Tách dòng gen mã hóa sinh tổng hợp β-galactosidaza từ nấm mốc
Aspergillus sp.
- Đề xuất được qui trình sản xuất galactooligosaccarit bằng việc sử dụng β-
galactosidaza.
* Nội dung nghiên cứ
u
1. Phân lập và tuyển chọn chủng nấm mốc Aspergillus sp có hoạt tính β-
galactosidaza cao.
2. Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng và động học của quá trình lên men sinh
tổng hợp β-galactosidaza từ Aspergillus sp.

2
3. Nghiên cứu các điều kiện thu nhận chế phẩm β-galactosidaza kỹ thuật và
tinh khiết.
4. Xác định một số đặc tính của β-galactosidaza từ Aspergillus sp .
5. Tách dòng, xác định và phân tích trình tự gen mã hóa sinh tổng hợp β-
galactosidaza từ nấm mốc Aspergillus sp.
6. Nghiên cứu các điều kiện thích hợp sản xuất GOS.
7. Phân tích đánh giá các chỉ tiêu kỹ thuật của sản phẩm GOS.
* Những đóng góp mới của luậ
n án
1. Là công trình đầu tiên ở Việt Nam đã nghiên cứu một cách có hệ thống
β-galactosidaza từ A. oryzae 3 làm nền tảng để khai thác các khả năng

ứng dụng của enzym này.
2. Đã thành công trong việc tách dòng và giải trình tự gen lacA mã hóa
cho β-galactosidaza của chủng A. oryzae 3, các phân tích về tương quan
phát sinh chủng loại cho thấy gen lacA của chủng A. oryzae 3 thuộc
nhóm gen mã hóa β-galactosidaza từ các chủng A. oryzae RIB 40 và A.
candidus.
3. Đã đề xuất đượ
c quy trình sản xuất Galactooligosaccarit (GOS) ở qui
mô phòng thí nghiệm sử dụng chế phẩm enzym β-galactosidaza từ A.
oryzae 3. Chế phẩm đạt chất lượng trên 50% GOS.

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN

1.1. β-GALACTOSIDAZA
β-D-galactosit galactohydrolaza (E.C. 3.2.1.23) còn gọi là lactaza
hay β- galactosidaza. β-galactosidaza thường được thu nhận từ nguồn tế
bào động vật, thực vật hoặc vi sinh vật, nhưng nguồn thu chủ yếu và kinh
tế vẫn là từ nguồn vi sinh vật như nấ
m men, nấm mốc, vi khuẩn. β-
galactosidaza thu được từ các nguồn khác nhau có đặc tính khác nhau.
β-galactosidaza được xác định là enzym thuộc nhóm glycosidaza,
xúc tác cho phản ứng thủy phân lactoza thành β-D-galactoza và α-D-
glucoza và phản ứng galactozyl chuyển hóa các gốc β-D-galactosit của
lactoza tạo ra galacto-oligosaccarit (GOS).
Mặc dù có tác dụng trong rất nhiều lĩnh vực khác nhau như di truyền
học, y học nhưng hiện nay β-galactosidaza được ứng dụng chủ yếu vào
lĩnh vực công nghiệp thực ph
ẩm, đặc biệt là sản xuất đường chức năng
GOS.
1.2. GALACTOOLIGOSACCARIT (GOS)

Trong những năm gần đây, các nghiên cứu thu nhận và sử dụng các
oligosaccarit còn gọi là prebiotic đang được triển khai mạnh mẽ ở một số
nước công nghiệp phát triển như Hoa Kỳ, Nhật Bản, Đức, Áo Các
oligosaccarit được ưa chuộng trong công nghiệp thực phẩm vì đem lại lợi
ích cho sức khỏe của con người, đó là không gây các b
ệnh răng miệng cho

3
người sử dụng do vi khuẩn răng miệng không phân giải được; có độ ngọt
thấp, phần lớn không được tiêu hóa trong ruột non nên thích hợp để sử
dụng làm chất tạo ngọt có hàm lượng calori thấp và rất phù hợp với những
người mắc bệnh tiểu đường, tim mạch…
Oligosaccarit được hình thành trong quá trình thủy phân lactoza nhờ
phản ứng transgalactozyl, còn gọi là galactooligosaccarit (GOS). Hiện nay
GOS đang là một trong các loại đường chức năng
được ưa chuộng trên thế
giới và được sử dụng làm phụ gia để chế biến các loại thực phẩm chức
năng có lợi cho sức khỏe.
Đường GOS được nghiên cứu và sản xuất trên qui mô công nghiệp ở
rất nhiều nước trên thế giới, đặc biệt tại các nước Nhật Bản, Trung Quốc
Tại Việt Nam việc nghiên cứu về vấn đề này mới bắt
đầu.

CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1. NGUYÊN VẬT LIỆU
2.1.1. Chủng vi sinh vật
- 29 chủng nấm mốc thuộc loài Aspergillus
- Chủng vi khuẩn E.coli DH5α (Invitrogen)
2.1.2. Hóa chất

Các hoá chất tinh khiết (oNPG, β-Mertacapton ethanol, EDTA, Tris-
HCl, Acrylamide, Bromophenol blue, methanol, đường chuẩn glucoza,
galactoza, lactoza, galactotetraoza), hóa chất thông dụng dùng trong
nghiên cứu sinh học phân tử (Tris-base, EDTA.Na
2
, agaroza, SDS, CTAB,
NaCl ) có nguồn gốc từ Sigma (Mỹ), Merk (Đức), Pharmacia và một số
hoá chất thông dụng khác của Trung Quốc.

2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.2.1. Phương pháp vi sinh
- Tuyển chọn chủng nấm mốc trên đĩa thạch theo phương pháp thủy phân
X-gal
- Phương pháp lên men dịch thể
- Xác định vi sinh vật tổng số theo TCVN 4882:2001; E. coli theo
TCVN 6846:2001; Cl. pefrigens theo TCVN 4991:2001; S. aureus theo
TCVN 4830:1989; Salmonella theo TCVN 4829:2001
2.2.2. Phương pháp hóa sinh
- Xác định hoạt độ β-galactosidaza dự
a trên sự thuỷ phân oNPG của β-
galactosidaza để sinh ra oNP. Một đơn vị hoạt độ β-galactosidaza được
xác định là lượng enzym xúc tác thuỷ phân 1 μmol oNPG trong 1 phút ở
55
o
C.
- Thu enzym β-galactosidaza bằng phương pháp kết tủa phân đoạn
(NH
4
)
2

SO
4
và kết tủa bằng axeton.

4
- Tinh chế enzym bằng phương pháp sắc ký trao đổi ion trên hệ thống
FPLC
- Điện di protein trên gel polyacrylamit
- Xác định thành phần GOS và aflatoxin bằng phương pháp sắc ký lớp
mỏng
- Phân tích thành phần GOS bằng phương pháp sắc ký lỏng cao áp
2.2.3. Phương pháp sinh học phân tử
- Phương pháp thiết kế mồi
- Tách chiết ARN tổng số
- Phương pháp thực hiện phản ứng RT-PCR
- Phương pháp ghép nối các
đoạn ADN
- Biến nạp ADN plasmit vào tế bào E. coli DH5α, phân tích trình tự gen
sử dụng một số phần mềm tin sinh học…

CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1. Tuyển chọn chủng nấm mốc có khả năng sinh tổng hợp β-
galactosidaza
Từ 29 chủng nấm mốc thuộc chi Aspergillus thu thập từ phòng thí
nghiệm Hóa sinh, Viện CNSH-CNTP, ĐH Bách khoa Hà nội, được khảo
sát khả
năng sinh β-galactosidaza trên môi trường có X-gal, đã chọn được
03 chủng bắt màu chỉ thị X-gal mạnh nhất. Đó là các chủng có ký hiệu
Aspergillus oryzae 1, Aspergillus oryzae 2, Aspergillus oryzae 3.

Hình 3.1. Khả năng thủy phân chỉ thị X-gal của nấm mốc A. oryzae
Chú thích:
- 1: Mẫu đối chứng, 2: A. oryzae 1, 3: A. oryzae 3, 4: A. oryzae 2

4
3
2
1

5
3.2. Khảo sát khả năng sinh tổng hợp β-galactosidaza của các chủng
nấm mốc Aspergillus oryzae bằng phương pháp xác định hoạt độ với
cơ chất oNPG
Ba chủng A. oryzae 1, 2 và 3 được nuôi cấy trên môi trường lactoza
cơ bản với tốc độ lắc 200 vòng/phút, 30
o
C, pH 7, 48 giờ. Sau đó thu và xác
định thu enzym nội bào, ngoại bào. So sánh kết quả chúng tôi thấy chủng
A. oryzae 3 có hoạt tính β-galactosidaza nội bào cao nhất , do vậy chủng
A. oryzae 3 được lựa chọn cho các nghiên cứu tiếp theo.
Bảng 3.1.Hoạt độ β-galactosidaza của 3 chủng A. oryzae
sau 48 giờ nuôi cấy
Hoạt độ tổng của β-galactosidaza
(MU)
Chủng VSV
Ngoại bào Nội bào
A. oryzae 1 788,48 1272,43
A. oryzae 2 865,92 1481,84

A. oryzae 3 1869,12 5529,55
3.3. Nghiên cứu điều kiện nuôi cấy sinh tổng hợp β-galactosidaza từ
chủng A. oryzae 3
3.3.1. Khảo sát khả năng sinh tổng hợp β-galactosidaza của A. oryzae 3
trên các môi trường nuôi cấy khác nhau
Sau khi khảo sát nuôi lắc chủng A. oryzae 3 trên các môi trường khác
nhau: MT1. MT2. MT3 và MT4 chúng tôi nhận thấy sau 72 giờ nuôi cấy,
hoạt tính β-galactosidaza trên MT1, MT2 và MT3 thấp còn trên MT4 cho
hoạt tính β-galactosidaza cao nhất (738,80 MU/g) nên môi trường MT4
được chọn làm môi trường nuôi cấy cho các thí nghiệm tiếp theo.
Bảng 3.2.
Kết quả đo pH dịch nuôi cấy và hoạt độ β-galactosidaza
của chủng A. oryzae 3 trên các môi trường dinh dưỡng khác nhau

pH dịch nuôi cấy và hoạt độ β-galactosidaza (MU/g)
24 36 48 60 72
T
(giờ)

Môi
trường
pH MU/g pH MU/g pH MU/g pH MU/g pH MU/g
MT1 6,76 0 7,62 111,61 8,22 367,01 8,20 529,47 8,45 128,58
MT2 6,15 0 6,01 120,88 6,17 194,44 5,72 285,34 5,98 169,02
MT3 6,79 0 6,88 45,32 7,05 165,00 6,76 180,01 6,88 277,40
MT4 6,20 43,57 6,53 264,13 6,79 398,61 6,78 507,00 6,78 738,80

6
3.3.2. Khảo sát ảnh hưởng của nguồn cacbon
Chủng A. oryzae 3 được nuôi cấy trên môi trường MT4 với nguồn

cacbon khác nhau: lactoza, saccaroza, maltoza, glucoza, galactoza với tốc
độ lắc 200 v/phút, 30
o
C, pH 7 và chọn được nguồn cacbon phù hợp là
lactoza .
Bảng 3.4. Ảnh hưởng của nồng độ lactoza
đến khả năng sinh tổng hợp β-galactosidaza của A. oryzae 3

Hoạt độ β-galactosidaza (MU/g)
T(giờ) (h)
Nồng độ
lactoza (g/l)
24 36 48 60 72
0-1
,
06 9
,
45 15
,
17 25
,
80
527
,
32 108
,
64 189
,
96 223
,

65 254
,
41
10 41
,
76 172
,
73 232
,
80 451
,
19 562
,
35
15 44
,
36 248
,
52 398
,
35 456
,
34 612
,
54
20 56
,
72 210
,
57 379

,
24 558
,
41 797
,
07
25 96
,
14 293
,
19 411
,
39 686
,
04 829
,
43
30 89
,
71 354
,
89 517
,
13 691
,
05 976
,
74
35 77
,

00 226
,
31 417
,
88 518
,
16 787
,
75
Kết quả khảo sát nồng độ lactoza cho thấy với nồng độ đường tăng
hoạt tính β-galactosidaza của A. oryzae 3 cũng tăng. Tại nồng độ là 30g/l
β-galactosidaza có hoạt tính cao nhất bằng 976,74 MU/g sau 72h nuôi cấy,
tuy nhiên nồng độ đường tăng đến 35g/l hoạt tính enzym giảm (đạt 787,75
MU/g sau 72 giờ). Do vậy chúng tôi chọn nồng độ đường lactoza bằng
30g/l để tiếp tục nghiên cứu.
3.3.3. Khảo sát ảnh hưở
ng của nguồn nitơ
Chủng A. oryzae 3 được nuôi cấy trên môi trường MT4 có hàm lượng
lactoza là 30g/l và thay đổi nguồn nitơ vô cơ và hữu cơ khác nhau và chọn
được nguồn nitơ phù hợp là pepton và NH
4
NO
3
cho hoạt độ enzym cao
nhất là 1017,6 MU/g ở 72 giờ. Sau khi khảo sát với các nồng độ pepton lần
lượt là (0,5; 1; 2; 3; 4; 5) g/l và NH
4
NO
3
(0; 0,5; 1; 1,5; 2; 2,5)g/l chúng

tôi nhận thấy hoạt tính enzym cao nhất trên môi trường có nồng độ 1g
pepton và 0.5g NH
4
NO
3
(1311.8 MU/g sau 72 giờ nuôi cấy). Vì vậy, nồng
độ nitơ thích hợp để A. oryzae 3 lên men sinh tổng hợp β-galactosidaza
được đề xuất áp dụng trong nội dung tiếp theo là pepton 1g/l, NH
4
NO
3
0.5
g/l.

7
Bảng 3.6. Ảnh hưởng của nồng độ nitơ đến khả năng sinh tổng hợp
β-galactosidaza của A. oryzae 3

Hoạt độ β-galactosidaza (MU/g)
Thời gian lên men (giờ)

Nồng độ nitơ (g/l)
24 36

48 60 72
0,5g Pepton + 0g NH
4
NO
3
67,02 136,73 332,01 451,74 674,61

1g Pepton + 0,5g NH
4
NO
3
182,02 481,26 627,96 994,83 1311,80
2g Pepton + 1g NH
4
NO
3
119,22 328,70 548,10 781,26 1008,71
3
g
Pe
p
ton + 1,5
g
NH
4
NO
3
103,33 304,66 490,68 692,08 969,25
4g Pepton + 2g NH
4
NO
3
90,62 176,24 390,42 683,93 828,38
5g Pepton + 2,5g NH
4
NO
3

73,90 129,12 262,58 462,74 597,00

3.3.4. Khảo sát ảnh hưởng của pH
Chủng nấm mốc A. oryzae 3 được lên men trên môi trường có nguồn
dinh dưỡng đã được chọn với các pH đầu: 5,0; 5,5; 6,0; 6,5; 7,0; 7,5 và 8,0.
Kết quả thí nghiệm trên đã cho thấy pH đầu của môi trường có ảnh hưởng
đáng kể tới hoạt độ enzym. Với pH đầu bằng 7,0 và 7,5 thì hoạt độ enzym
cao, đạt tối đa ở giờ thứ 72, cao nhất là 1237,40 MU/g với pH đầu là 7 và
1325,16 MU/g với pH
đầu bằng 7,5. Từ kết quả này đã cho phép lựa chọn
pH đầu là 7,5 làm pH thích hợp cho quá trình lên men sinh tổng hợp β-
galactosidaza từ nấm mốc A. oryzae 3 trên môi trường MT4.
Bảng 3.7. Ảnh hưởng của pH môi trường lên men đến khả năng sinh tổng
hợp β-galactosidaza của A. oryzae 3

Hoạt độ β-galactosidaza (MU/g)
Th
ờ
i gian lên men
(giờ)
pH
24 36 48 60 72
5
,
0
42,26 138,75 424,38 381,84 254,48
5
,
5
68,86 131,49 252,58 450,88 538,53

6
,
0
89,80 261,57 404,65 589,71 695,52
6
,
5
79, 99 253,72 415,40 643,13 781,41
7
,
0
206,71 438,36 786,33 958,38 1237,40
7
,
5
221,69 541,26 814,31 1011,45 1325,16
8
,
0
140,57 267,58 475,44 653,01 723,73

8
3.3.5. Kết quả khảo sát động thái của quá trình lên men sinh tổng hợp
β-galactosidaza từ chủng nấm mốc A. oryzae 3

Hình 3.3. Động thái quá trình sinh tổng hợp β-galactosidaza
từ chủng nấm mốc A. oryzae 3
Hoạt độ β-galactosidaza tăng mạnh từ 24 đến 72 giờ (pha tăng
trưởng), duy trì ổn định từ giờ 72 đến giờ 96 và bắt đầu giảm dần từ
khoả
ng sau 108 giờ lên men. Như vậy chúng tôi cho rằng ở giai đoạn này
lượng chất cảm ứng là lactoza đã không đủ cho nhu cầu của tế bào, bên
cạnh đó ở thời điểm này sự sinh trưởng của tế bào bắt đầu chậm lại nên
làm giảm hoạt độ β-galactosidaza. Trong kết quả khảo sát còn xuất hiện
một khoảng tăng nhẹ hoạt tính enzym trong khoảng từ 156 -168 giờ lên
men. Tuy nhiên vẫ
n chưa thể khẳng định được nguyên nhân và vấn đề trên
cần phải được khảo nghiệm thêm. Như vậy, năng lực tổng hợp và tích tụ
enzym tăng cùng với động thái phát triển của chủng A. orzyae 3 và thời
điểm thu enzym thích hợp nhất là từ 72-96 giờ.
3.4. Nghiên cứu tách tinh chế β-galactosidaza từ A. oryzae 3
3.4.1. Khảo sát các tác nhân kết tủa β-galactosidaza từ A. oryzae 3
Sau khi khảo sát thu ch
ế phẩm β-galactosidaza kỹ thuật trên các hệ
dung môi là axeton và (NH
4
)

2
SO
4
và so sánh kết quả, chúng tôi nhận thấy
khi kết tủa bằng dung môi axeton thu được β-galactosidaza kỹ thuật có
hoạt độ cao hơn so với kết tủa bằng (NH
4
)
2
SO
4
. Do vậy chúng tôi quyết
định lựa chọn dung môi kết tủa β-galactosidaza là axeton với tỉ lệ 1 : 1
(v/v).


pH dịch lên men
Sinh khối tế bào
(g
/l
)
Hoạt độ β-galactosidaza
Thời gian lên men

9
Bảng 3.8. Ảnh hưởng của nồng độ axeton
tới hiệu suất thu nhận β-galactosidaza

Nồng độ
axeton (%)

Hoạt độ β-
galactosidaza
(MU/g)
Hiệu suất
tương đối
(%)
0 1257,11 100
30 645,27 51,33
40 725,60 54,35
50 904,24 71,93
60 863,24 57,72

Bảng 3.9. Ảnh hưởng của nồng độ sunfat amôn bão hoà
đến hiệu suất thu nhận β-galactosidaza

3.4.2. Tinh chế β-galactosidaza bằng phương pháp sắc ký trao đổi ion
DEAE – Sepharose fast flow trên hệ thống FPLC
Trong nghiên cứu này, chúng tôi chọn phương pháp làm sạch β-
galactosidaza bằng phương pháp sắc ký trao đổi ion trên cột DEAE-
sepharose fast flow trên hệ thống FPLC.
Dịch enzym thu được sau 72 giờ lên men chủng A. oryzae 3 được
kết tủa bằng axeton ở nhiệt độ 0°C với nồ
ng độ là 50% (v/v), sau đó ly tâm
ở 4
o
C, tốc độ 10000 v/p, thu kết tủa và hòa tan trong đệm.
Tiến hành chạy sắc ký trao đổi ion DEAE – Sepharose fast flow trên
hệ thống FPLC. Cột được cân bằng với đệm Tris – HCl 20 mM pH 7,6, tốc
độ 0,5ml/phút, dung dịch đệm đẩy là gradient NaCl 0 – 500mM, tốc độ
đẩy enzym là 0,3ml/ phút, thu 2 ml/ phân đoạn

Nồng độ sunfat amôn
bão hòa (%)
Hoạt độ β-galactosidaza
(MU/g)
Hiệu suất
tương đối (%)
0 1257,11 100
30 198,62 15,80
40 502,34 39,96
50 390,71 31,08
60 236,58 18,82

10
Hình 3.5. Kết quả điện di SDS-PAGE
protein β-galactosidaza
Chú thích:
- M: Protein chuẩn (hãng Fermentas): β-
galactosidaza E.coli 116 kDa , Bovine serum
albumin 66,2 kDa, Ovalbumin 45 kDa,
Lactate dehydrogenaza 35 kDa, Rease bsp981
25 kDa, β-lactoglobulin 18,4 kDa, Lyzozym
14,4 kDa
- 1: Dịch enzym thô; 2: Dịch enzym kỹ thuật;
3, 4: Dịch enzym sau tinh sạch

Hình 3.4. Kết quả tinh sạch β-galactosidaza bằng phương pháp FPLC

Sản phẩm protein enzym thu được thể hiện ở 5 đỉnh (ký hiệu từ 1 –
5) trên sắc ký đồ, nhưng chỉ duy nhất sản ph
ẩm protein enzym thu tại đỉnh
số 2 (vị trí F2) có hoạt tính β-galactosidaza với hoạt độ là 5800 MU/ml.
Chúng tôi tiến hành chạy điện di trên gel polyacrylamit SDS – PAGE để
kiểm tra độ tinh sạch của protein enzym.












Xác định khối lượng phân tử và mức độ tinh sạch của protein β-

galactosidaza từ A. oryzae 3 chúng tôi thu được protein β-galactosidaza
của A. oryzae 3 có khối lượng là 109,2 kDa và sau khi tinh sạch trên cột
DEAE - sepharose fast flow đã thu được β-galactosidaza có mức
độ tinh
sạch gấp 18,12 lần so với dịch thô ban đầu và hoạt độ riêng đạt 2,714
U/mg protein, hiệu suất đạt 30,61%.
Beta galactosidaza Q sepharose004:10_UV Beta galactosidaza Q sepharose004:10_Conc Beta galactosidaza Q sepharose004:10_Fractions
Beta galactosidaza Q sepharose004:10_Logbook
0
20
40
60
80
100
mAU
0
20
40
60
80
%B
0 100 200 300 400 ml
X2 X3 X4 X5 A1 A5A9 B11 B6B2C3C7C12 D8D4 E1E5 E9 F11 F6 F2 G3G7G12 H8H4 I1 I4 I7 I11 J9 J5 J1 Waste
1
2
3
5
4
116
66,2

45
35
25
18,4
14,4
109 kDa
kDa
116116
66,266,2
4545
3535
18,418,4
14,414,4
109
kDa
116116
66,266,2
4545
3535
2525
18,418,4
14,414,4
109 kDa
kDa
116116
66,266,2
4545
3535
18,418,4
14,414,4

109
kDa

11
Bảng 3.10. Các bước tinh sạch
β
-galactosidaza từ A. oryzae 3

Từ các nghiên cứu trên, chúng tôi tóm tắt và đưa ra quy trình thu
nhận β-galactosidaza từ A. oryzae 3 như sau:

















Sơ đồ 1. Quy trình tách tinh sạch β-galactosidaza từ A. oryzae 3
TT
Các bước

tinh sạch
Hoạt độ
tổng
(MU)
Hàm
lượng
protein
tổng số
(mg)
Hoạt độ
riêng
(MU/mg
protein)
Hiệu suất
thu hồi
(%)
Mức độ
tinh s
ạch
(lần )
1
Tách chiết
enzym thô
363 600 24 270 14,98 100,00 1,00
2
Kết tủa enzym
bằng axeton
155 310 1 280 121,33 42,71 8,10
3
Sắc ký trao đổi

ion cột DEAE-
Sepharose
111 300 410 271,46 30,61 18,12
A. oryzae 3
Lên men ở điều kiện 30°C, 72 giờ, 300 v/p
Thu sinh khối
Phá vỡ tế bào,
tách chiêt enzym
Ly tâm loại bỏ
cặn, 10.000 v/p,
4 °C, 10 p
Enzym thô
Tủa bằng axeton
0°C, tỉ lệ 1:1 (v/v ), 2giờ
Ly tâm thu tủa , 10.000 v/p,
4 °C, 10 phút
Đông khô
-80°C
Enzym kỹ thuật
Sắc ký trao đổi ion cột DEAE
Sepharose Fast Flow
Enzym tinh sạch

12
3.5. Xác định một số đặc tính của β-galactosidaza từ A. oryzae 3
3.5.1. Xác định điểm đẳng điện (pI) của β-galactosidaza
Điểm đẳng điện của một protein (pI) là điểm pH mà ở đó điện tích
thực của nó bằng 0. Mỗi một protein có một pI riêng; nhưng nói chung, pI
của β-galactosidaza từ vi sinh vật thường có tính acid. Điểm đẳng điện của
β-galactosidaza được xác định bằng ethanol 96% và đo độ đục của dịch

trong các ống ở bước sóng 620 nm. pI của enzym có giá trị bằng pH của
dịch trong ố
ng nghiệm cho độ đục cao nhất. Độ đục của dịch lớn nhất ở pH
5,5. Như vậy cũng như các protein β-galactosidaza vi sinh vật khác, β-
galactosidaza A. oryzae 3 có pI mang tính axit với giá trị là 5,5.

Bảng 3.11. Khảo sát điểm đẳng điện của β-galactosidaza
từ A. oryzae 3

pH OD
620

4 0,257
4,5 0,318
5 0,363
5,5 0,471
6 0,289
6,5 0,234
7 0,183

3.5.2. Ảnh hưởng của pH tới hoạt tính của β-galactosidaza


pH tối ưu của β-galactosidaza được xác định bằng phản ứng với cơ
chất oNPG nồng độ 20μM ở các ngưỡng pH khác nhau từ 2 - 9 tại nhiệt độ
55°C, đo OD ở bước sóng 420nm. Kết quả thu được ở vùng pH từ 5,0 đến
7,0 hoạt tính enzym khá cao, cao nhất là ở pH 5 hoạt tính enym là 1562,40
MU/g. Như vậy, pH tối ưu cho β-galactosidaza của A. oryzae 3 là 5.

Tương tự, dịch enzym được giữ ở các pH khác nhau tại nhiệt độ là

4°C, sau 1 giờ lấy ra xác định hoạt độ và xác định được enzym bền trong
dải pH từ 5-7.

13
0
20
40
60
80
100
120
02468
Thời gian (giờ)
Hoạt độ enzym (%)
pH 2
pH 3
pH 4
pH 5
pH 6
pH 7
pH 8
pH 9

Hình 3.7. Ảnh hưởng của pH đến độ bền của β-galactosidaza
từ A. oryzae 3
3.5.3. Ảnh hưởng của nhiệt độ tới hoạt tính của β-galactosidaza

Dịch enzym được giữ ổn nhiệt tại các nhiệt độ 30
o
C, 40

o
C, 50
o
C,
60
o
C, 70
o
C ở pH 5 trong khoảng thời gian là 4 giờ, sau 30 phút lại lấy mẫu
xác định hoạt độ và xác định được hoạt tính β-galactosidaza cao ở dải nhiệt
độ từ 40 – 60
o
C, cao nhất là tại nhiệt độ 55
o
C (1596,40 MU/g).









Hình 3.9. Ảnh hưởng của nhiệt độ tới độ bền
của β-galactosidaza từ A. oryzae 3
Tuy nhiên, nhiệt độ càng cao enzym càng nhanh giảm hoạt độ. Ở
nhiệt độ 30°C, sau 4 giờ enzym chỉ còn giữ khoảng 40% hoạt độ. Ở 40-
60°C, sau 4 giờ, hoạt độ enzym chỉ còn khoảng 28-36%. Riêng ở 70°C chỉ
sau 2,5 giờ hoạt độ là 0%. Như vậy enzym này hoạt động tối ưu ở 55

o
C và
không bền nhiệt.


0.0
20.0
40.0
60.0
80.0
100.0
120.0
02468
Thời gian
Hoạt độ enzym (%)
30
o
40
o
50
o
60
o
70
o

14
3.5.4. Xác định ảnh hưởng ion kim loại tới hoạt tính β-galactosidaza từ
A. oryzae 3

Bảng 3.12. Kết quả xác định ảnh hưởng của ion kim loại đến hoạt tính
β-galactosidaza từ A. oryzae 3

Ion kim loại
(2.10
-3
M)
Hoạt độ β-galactosidaza
tương đối (%)
Đối chứng 100,00
Zn
2+
68,80
Fe
2+
72,68
Mg
2+
124,24
Ca
2+
127,59
Ba
2+
132,07
Mn
2+
139,40

Chúng tôi xác định hoạt tính β-galactosidaza bằng cách cho phản ứng

với cơ chất oNPG trong môi trường dung dịch đệm photphat có bổ sung
một số ion kim loại bao gồm: Zn
2+
, Mn
2+
, Mg
2+
, Ca
2+
, Fe
2+
, Ba
2+
.
Mỗi loại ion kim loại có ảnh hưởng khác nhau rõ rệt tới hoạt tính của
β-galactosidaza. Một số ion kim loại kích thích hoạt động β-galactosidaza
như Ba
2+
, Ca
2+
, Mg
2+
, Mn
2+
, còn ion ức chế enzym là Fe
2+
, Zn
2+
làm giảm
hoạt tính, sau 30 phút với nồng độ 2.10

-3
M ion kim loại, hoạt tính β-
galactosidaza chỉ còn khoảng 70%
3.5.5. Khảo sát động học β-galactosidaza từ A. oryzae 3 ( K
m
, V
max
)
Chúng tôi tiến hành khảo sát với các nồng độ oNPG khác nhau: 1mM,
2mM, 3mM, 4mM và 5mM và thu được vận tốc phản ứng ở bảng 3.13.
Bảng 3.13. Ảnh hưởng của nồng độ cơ chất oNPG
đến vận tốc phản ứng β-galactosidaza

Nồng độ cơ chất
oNPG (mM/ml)
Vận tốc phản ứng
( μmol/phút )
1 0,0192
2 0,0408
3 0,0616
4 0,0814
5 0,083


15
Lập hệ phương trình theo phương trình Michaelis – Menten tính K
m

và V
max

, kết quả thu được K
m
= 2,42.10
-2
(M), V
max
= 0,52 (μmol/phút).
Giá trị K
m
bằng 2,42.10
-2
(M) với cơ chất oNPG (nồng độ 1-5mM) của
chúng tôi thu được phù hợp với các kết quả nghiên cứu đã công bố trên thế
giới và chứng tỏ rằng β-galactosidaza A.oryzae 3 có ái lực cao với cơ chất
oNPG.
3.5.6. Xác định chất kìm hãm đặc hiệu trung tâm hoạt động của β-
galactosidaza từ A. oryzae 3









Những chất kìm hãm đặc hiệu các nhóm chức năng trong trung tâm
ho
ạt động của enzym thường là : Mercaptoethanol - kìm hãm nhóm -OH
(ser), EDTA - kìm hãm ion kim loại, DFP - kìm hãm nhóm -SH (cys),

Bromophenol bromit - kìm hãm nhóm -COOH (Asp). Dùng các chất kìm
hãm EDTA, DFP, β –mercaptoethanol với nồng độ 10
-2
M ủ với enzym
trong 30 phút ở nhiệt độ phòng, sau đó xác định hoạt tính của enzym. Kết
quả cho thấy với DFP, hoạt độ enzym giảm mạnh chỉ còn 23,5%, như vậy
có thể nhận thấy trong trung tâm hoạt động của β-galactosidaza có thể
chứa nhóm -OH.
Qua các kết quả nghiên cứu trên, chúng tôi kết luận đã xác định
được một số đặc tính quan trọng của β-galactosidaza từ A. oryzae 3 như
ảnh hưở
ng nhiệt độ, pH, pI, các chất ức chế và hoạt hóa… và đánh giá đó
là những đặc tính rất cần thiết khi ứng dụng β-galactosidaza trong lĩnh vực
công nghiệp thực phẩm, nhất là công nghệ chế biến các sản phẩm từ sữa.
Để có thể lưu giữ dòng gen mã hóa β-galactosidaza từ A. oryzae 3 và xác
định một số tính chất của β-galactosidaza từ A. oryzae 3 bằng phương pháp
tin sinh học, chúng tôi tiến hành nghiên cứ
u tách dòng và xác định trình tự
gen lacA mã hóa sinh tổng hợp β-galactosidaza từ nấm mốc A. oryzae 3


Bảng 3.14. Khảo sát tác nhân kìm hãm
đ
ặc hi
ệ
u
trung tâm hoạt động β-galactosidaza

Tác nhân
kìm hãm (10

-2
M)
Hoạt độ β-galactosidaza
tương đối (%)
Đối chứng 100
β-mercaptoethanol 92
DFP 23,5
EDTA 121

16
3.7. Tách dòng và giải trình tự gen mã hóa β-galactosidaza từ A. oryzae
3
3.7.1.Tách dòng gen mã hóa β-galactosidaza từ A. oryzae 3

3.7.2. Phân tích trình tự gen lacA A. oryzae 3
Gen lacA sau khi đã tách dòng thành công vào vec tơ pGEMT-Easy
được tiến hành xác định trình tự trên máy giải trình tự ABI 3100. Trình tự
sau khi xác định được xử lý với phần mềm Vector NTI Advance 10.3. Sau
khi bỏ đi các trình tự đã biết trên vertor pGEM T-Easy, chúng tôi thu được
Tách chiết ARN tổng số từ A. oryzae 3
Thiết kế các mồi đặc hiệu để nhân đoạn cDNA
mã hóa β-galactosidaza từ A. oryzae 3
Khuếch đại cDNA mã hóa
β
-gal
bằng kỹ thuật RT-PCR
Gắn sản phẩm PCR đặc hiệu vào

vector pGEM - Teasy và biến nạp
vào vi khu
ẩ
n
E.
coli DH5α
1 2 3 4 5 6 71 2 3 4 5 6 7
Hình 3.10. ARN tổng số tách chiết từ
A. oryzae 3
Kiểm tra ADN plasmit tái tổ hợp
tách chiết từ vi khuẩn E. coli DH5α
Kiểm tra plasmit tái tổ hợp
bằng kỹ thuật PCR
3kb
3 kb
4 kb
3kb
3 kb
4 kb

Hình 3.11. Kết quả điện di
sản phẩm PCR sử dụng
khuôn cDNA
Chú thích: 1: Thang ADN
chuẩn Abgen 1 kb. 2, 3:
sản phẩm PCR từ cDNA

3 kb
4 kb
3 kb

1
2
3
45 6
3 kb
4 kb
3 kb
1
2
3
45 6
4 kb4 kb
3 kb3 kb
1
2
3
45 6
Hình 3.14. Sản phẩm
PCR từ các plasmid
1,2,5,7,8
Chú thích:
- 1: Thang ADN chuẩn
Abgen 1kb
- 2, 3, 4, 5, 6: sản phẩm
PCR từ các plasmit
1,2,5,7,8

17
trình tự đoạn gen lacA mã hoá β-galactosidaza có chiều dài 3015 bp, có độ
tương đồng cao nhất với gen mã hóa sinh tổng hợp β-galactosidaza có ký

hiệu XM_001727409 của chủng Aspergillus oryzae RIB40 tới 99%.
Mối quan hệ giữa các trình tự axit amin của β-galactosidaza từ chủng
A .oryzae 3 và một số các β-galactosidaza từ các chủng Aspergillus spp
khác trên hình 3.17 cho thấy axit amin của β-galactosidaza từ chủng A.
oryzae 3 có độ tương đồng cao đạt 99% so với axit amin của β-
galactosidaza từ lacA A. oryzae RIB 40 và lacB A. candidus và khác xa so
với axit amin của β-galactosidaza từ A. clavatus NRRL 1 độ tương đồng
chỉ đạt 73%.








Hình 3.17. Cây phát sinh chủng loại ở mức độ axit amin cho
β-galactosidaza từ chi Aspergillus


Gen lacA A. oryzae 3 được xác định thuộc nhóm glycozyl
hydrolaza 42, glycozyl hydrolaza là những enzym phổ biến có khả năng
thủy phân liên kết glycosit giữa 2 hoặc nhiều hơn cacbon hydrat. Sự phân
loại glycozyl hydrolaza dựa trên trình tự axit amin bởi có những mối quan
hệ trực tiếp giữa trình tự và cấu trúc gấp nếp tương đồng. Cấu trúc không
gian của β-galactosidaza cũng được xác đinh nhờ phần mềm 3D-JIGSAW.
Kết quả thu được trình bày tại hình 3.19.

(a) (b)
Hình 3.19. Cấu trúc không gian dự đoán của
β-galactosidaza A. oryzae 3
a. Cấu trúc dạng dải băng b. Cấu trúc dạng bề mặt phân tử.

18
Kết quả xác định này phản ánh những đặc điểm cấu trúc của enzym
tốt hơn và giúp cho việc tìm hiểu những mối quan hệ tiến hóa giữa β-
galactosidaza A. oryzae 3 với các β-galactosidaza vi sinh vật khác.
3.8. Khảo sát các điều kiện thích hợp cho phản ứng transgalactozyl
lactoza tạo galactooligosaccarit (GOS)
3.8.1. Ảnh hưởng của nồng độ β-galactosidaza A. oryzae 3 đến khả
năng transgalactozyl lactoza tạo GOS
Sau khi tiến hành phản ứng transgalactozyl lactoza sử dụng β-
galactosidaza A. oryzae 3 với các nồng độ khác nhau, tiến hành sắc ký và
thu được kết quả tại hình 3.20. Căn cứ vào kết quả định tính, chúng tôi
nhận thấy ở nồng độ enzym là 7U/ ml cơ chất, sản phẩm GOS thu được
khá đậm màu và sản phẩm đường đơn không nhiều so với các sản phẩm
của nồng độ enzym cao hơn, do vậy nồng độ enzym là 7U/ml c
ơ chất được
lựa chọn trong các nghiên cứu tiếp theo.


3.8.2. Ảnh hưởng của nồng độ cơ chất lactoza đến khả năng thực hiện
phản ứng transgalactozyl của β-galactosidaza A. oryzae 3
Chúng tôi tiến hành phản ứng transgalactozyl lactoza ở các nồng độ
lactoza khác nhau là 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%. Dịch được bổ
sung β-galactosidaza với nồng độ là 7U/ml cơ chất, quá trình phản ứng
được thực hiện ở đ
iều kiện 55

o
C trong thời gian 4 giờ, kết thúc quá trình
thu dịch để phân tích bằng sắc ký bản mỏng. Kết quả thể hiện ở hình 3.21.
Hình 3.20. Ảnh hưởng của nồng độ β-
galactosidaza đến phản ứng
transgalactozyl tạo GOS
Chú thích:
- M: là các chất chuẩn theo thứ tự
lần lượt glucoza, galactoza,
lactoza, galactotetraoza
- 4; 7; 10; 13; 16: Nồng độ enzym
phản ứng (U/ml)

GOSGOS

19
Hình 3.21. Ảnh hưởng của nồng độ
cơ chất lactoza đến phản ứng
transgalactozyl tạo GOS
Chú thích:
- M: là các chất chuẩn theo thứ
tự lần lượt glucoza, galactoza,
lactoza, galactotetraoza
- 20 ; 30; 40; 50; 60; 70; 80:
Nồng độ cơ chất phản ứng (%
w/v)
Khi nồng độ cơ chất lactoza thấp (20
– 40%), hàm lượng đường đơn và
GOS tạo thành không nhiều, khi
nồng độ lactoza tăng, hàm lượng GOS tạo thành tăng thể hiện

ở những
băng màu đậm dần. Khi nồng độ cơ chất nằm trong khoàng từ 60 – 80 %,
các sản phẩm GOS thu được cho dải phân tích định tính đậm màu hơn hẳn
và hầu như không khác nhau nhiều, như vậy, nồng độ lactoza được chọn là
60% (w/v).
3.8.3. Khảo sát ảnh hưởng của pH tới khả năng transgalactozyl lactoza
tạo GOS của β-galactosidaza A. oryzae 3
Để đảm bảo hiệu suất transgalactozyl lactoza tạo GOS, chúng tôi
khả
o sát ảnh hưởng pH của dịch cơ chất đến khả năng transgalactozyl
lactoza của β-galactosidaza. Kết quả cho thấy tại pH từ 5-6, quá trình
transgalactozyl lactoza cho sản phẩm GOS khá đậm nét, tuy nhiên tốt nhất
tại pH là 5,5 (Hình 3.22). Chúng tôi quyết định chọn pH 5,5 là pH thích
hợp cho quá trình transgalactozyl lactoza tạo GOS.

Hình 3.22. Ảnh hưởng của pH
môi trường đến phản ứng
transgalactozyl tạo GOS
Chú thích:
- M: là các chất chuẩn theo thứ
tự lần lượt glucoza, galactoza,
lactoza, galactotetraoza
- 4,5 ; 5,0; 5,5; 6,0; 6,5; 7,5: pH
môi trường

Lac
Glu
Gal
G4
GOS

Lac
Glu
Gal
G4
GOS

GOSGOS

20
3.8.4. Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ tới khả năng transgalactozyl
lactoza tạo GOS của β-galactosidaza A. oryzae 3

Hình 3.23. Ảnh hưởng của nhiệt độ
đến phản ứng transgalactozyl tạo
GOS
Chú thích:
- M: là các chất chuẩn theo thứ
tự lần lượt glucoza,
galactoza, lactoza,
galactotetraoza
- 45 ; 50; 55; 60; 65: nhiệt độ
phản ứng (
o
C)
Phản ứng transgalactozyl lactoza
được thực hiện ở các điều kiện nhiệt độ khác nhau, sau đó kết thúc phản
ứng và phân tích định tính bằng sắc ký bản mỏng. Kết quả thể hiện ở hình
3.23 cho thấy tại dải nhiệt độ lớn hơn 50
o
C, hàm lượng GOS tạo thành

đậm nét hơn hẳn và thể hiện rõ nhất ở nhiệt độ 55
o
C. Như vậy, nhiệt độ
thích hợp cho phản ứng transgalactozyl lactoza thu GOS là 55
o
C.
3.8.5. Khảo sát thời gian transgalactozyl lactoza tạo GOS của β-
galactosidaza từ A. oryzae 3
Để xác định thời gian tối ưu cho quá trình transgalactozyl lactoza thu
GOS, chúng tôi tiến hành khảo sát phản ứng với các thời gian khác nhau:
3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 giờ. Kết quả cho thấy ở khoảng thời gian từ 3 – 5 giờ, sản
phẩm GOS tạo thành không nhiều so với khoảng thời gian từ 6 – 9 giờ, ở
thời điểm 8 giờ sản phẩm GOS thu được những bă
ng màu đậm và rõ nét
nhất (hình3.24), như vậy thời gian thích hợp cho phản ứng transgalactozyl
lactoza tạo GOS là 8 giờ.
Hình 3.24. Ảnh hưởng của thời gian
đến phản ứng transgalactozyl tạo GOS
Chú thích:
- M: là các chất chuẩn theo thứ
tự lần lượt glucoza, galactoza,
lactoza, galactotetraoza
- 9; 8; 7; 6; 5; 4; 3: thời gian
phản ứng (giờ)

GOSGOS
GOS
G4
GOS
G4

21
Chúng tôi đưa ra qui trình công nghệ sản xuất GOS với nguồn cơ
chất là lactoza và sử dụng chế phẩm β-galactosidaza A. oryzae 3.
SƠ ĐỒ CÔNG NGHỆ SẢN XUẤT GOS
Chế phẩmGOS
(dạng lỏng)
Độ Bx = 58 %
Dịch đường lactose (60 %)
Transgalactosyl lactose
E: 7U/ml cơ chất , 300 v/p, 55
o
C, 8 giờ
Thu dịch GOS
Lọc, pha loãng đến độ Bx = 15%
Chế phẩmGOS
(dạng bột)
Sấy phun
SẢN PHẨM GOS DẠNG
LỎNG VÀ BỘT


3.8.6. Phân tích đánh giá các chỉ tiêu kỹ thuật của sản phẩm GOS
* Phân tích thành phần và hàm lượng oligosaccarit trong sản phẩm
GOS

Sơ đ
ồ
2. Qui trình thu nhận Galactooligosaccari
t
t
ừ lactoza b
ằ
ng phương
pháp transgalactozyl lactoza nhờ β-galactosidaza từ A. oryzae 3.

Mi nut es
0 10 20 30 40 50 60
V
o
lt
s
0
5
10
galactose + glucose 5.675
lactose 9.592
12.250
17.400

21.200
23.317
Galactotetraose 27.950
31.692
39.183
RI D
lanhuong2008
1( 20L) ( 91108)1ml
Name
Ret enti on Ti me
1 2
7
3
5
4
8
9
6

22
Hình 3.26. Kết quả phân tích thành phần oligosaccarit
trong chế phẩm GOS bằng HPLC

Chú thích:
- 1: Glucoza và galactoza - 7: Galactotetraoza
- 2: Lactoza - 8, 9: Oligosaccarit
- 3, 4, 5, 6: oligosaccarit
Bảng 3.17. Định lượng thành phần galactooligosaccarit trong GOS
thành phẩm bằng HPLC
STT Tên chỉ tiêu

Đơn vị
tính
Kết
quả
Phương pháp xác
định
1 Hàm lượng lactoza % 20,12 HPLC
2 Hàm lượng galactoza % 8,50 HPLC
3
Hàm lượng
galactotetraoza
%
1,20 HPLC
Thí nghiệm phân tích định lượng bằng HPLC cho thành phần của các
loại đường trong sản phẩm GOS như sau: lactoza 20,12%; galactoza 8,5
%; galactotetraoza 1,20 %. Với hàm lượng cơ chất lactoza ban đầu của
phản ứng là 60%, sau phản ứng, hàm lượng lactoza còn lại được định
lượng là 20,12 % (bảng 3.17), như vậy, chúng tôi đánh giá hiệu suất
chuyển hóa của lactoza thành các đường đơn và oligosaccarit là hơn 70%.
Galactoza được định lượng là 8,5%, do trên cột NH
2
glucoza và galactoza
không phân tách nên chúng tôi dự kiến hàm lượng glucoza là xấp xỉ
galactoza, tổng sản phẩm glucoza, galactoza và lactoza sẽ chiếm 35 – 40%
trong chế phẩm GOS, còn lại khoảng 60% là các sản phẩm mới tạo thành
là galactobioza, galactotrioza, galactotetraoza, galactopentanoza và
galactohexanoza Như vậy, chế phẩm thu được có hàm lượng
oligosaccarit đạt trên 50%.
* Đánh giá độ an toàn vệ sinh thực phẩm của sản phẩm GOS
a) Kiểm tra các chỉ tiêu vi sinh vật gây bệnh

Chế phẩm GOS dạng bột được gửi phân tích các chỉ tiêu vi sinh vậ
t
tại Viện Dinh Dưỡng. Theo kết quả đánh giá từ Viện Dinh Dưỡng, sản
phẩm GOS đạt chỉ tiêu vi sinh đối với lương thực thực phẩm cho nhóm
thức ăn đặc biệt, thức ăn khô và thay thế đặc biệt, ban hành kèm theo quyết
định số 6014/2001/QĐ-BYT ngày 31/8/2001 của Bộ trưỏng Bộ Y tế , tất
cả chỉ tiêu đều có hàm lượng vi sinh vật nhỏ ở mức không phát hiện.
b)
Thử độc tính cấp của sản phẩm trên chuột
Kết quả thử nghiệm độc tính của sản phẩm GOS (dạng bột) trên