Tách và xác định hàm lượng Cloramphenicol trong mẫu thức ăn nuôi tôm

1

bộ giáo dục và đào tạo
Trờng Đại học Vinh

---------***---------

trần thị thu huyền

Tỏch v xỏc nh hm lng
Cloramphenicol trong mu
thc n nuụi tụm
Chuyên ngành: hoá vô cơ
Mã số
:
60. 44. 25

Luận văn thạc sĩ hoá học


2

Mục lục
Trang
Lời cảm ơn.........................................................................................................
Danh mục các ký hiệu và chữ cái viết tắt......................................................2
Đặt vấn đề..........................................................................................................3
Chng 1. Tổng quan......................................................................................6
1.1. Phơng pháp sc ký lng cao áp...................................................................6
1.1.1.Nguyên lý..................................................................................................6
1.1.2.Các dạng sắc ký lỏng hiệu năng cao........................................................7

1.1.3.Máy sắc ký lỏng hiệu năng cao................................................................8
1.2.Cloramphenicol............................................................................................11
1.2.1. Cu to v tính cht.................................................................................11
1.2.2. iu ch v ng dng.............................................................................15
1.2.3. Tác động của Cloramphenicol đối với con ngời và thủy sản nuôi.........16
1.2.4. Cloramphenicol trong thc phm............................................................17
1.2.5. Các phng pháp phân tích Cloramphenicol..........................................18
Chng 2. K thut thc nghim..................................................................26
2.1. Hoá cht, thit b, dng c thí nghim.......................................................26
2.2. K thut sc ký lng cao áp vi thit b HPLC .........................................27
2.3. K thut chun b mu................................................................................28
Chng 3. Kt qu v tho lun....................................................................31
3.1. Các thí nghiệm nh tính ca Cloramphenicol..........................................31
3.2. Tách v xác nh hàm lợng Cloramphenicol trên thit b HPLC...........31
3.2.1. nh hng ca tc dòng....................................................................31
3.2.2. nh hng ca thnh phn dung dch pha ng...................................32
3.2.3. nh hng ca nhit ct tách............................................................32
3.2.4. nh hng ca phng pháp x lý mu.................................................33
3.2.5. Kt qu xác nh Cloramphenicol trong mu thc n nuôi tôm............33
Chơng 4: Kết luận và đề xuất.........................................................................37
Tài liệu tham khảo...........................................................................................38
Phụ lục...............................................................................................................42


3

danh mục Các ký hiệu và chữ cái viết tắt
CAP :Cloramphenicol
CAP-TMS :cloramphenicoltrimetylsilyl
CODEX : Uỷ ban tiêu chuẩn hoá thực phẩm quốc tế

FDA : Food and Drug Administrantion( Cục quản lý Thực phẩm và Dợc
phẩm Mỹ).
GC: Sắc ký khí
GC-MS: Sắc ký khí khối phổ
HPLC: Sắc ký lỏng hiệu năng cao
HSTH: Hiệu suất thu hồi
HSTHTB: Hiệu suất thu hồi trung bình
KTSVQN:Kỹ thuật sóng vuông quét nhanh
LOD: Giới hạn phát hiện
LOQ: Giới hạn định lợng / giới hạn xác định
MeOH: Metanol
MS: Sắc ký khối phổ
MSTFA: N-metyl-N(trimetyl silyl) trifluoro axetamit
tt/tt: thể tích/thể tích
kl/tt: khối lợng/thể tích


4

đặt vấn đề
Trớc đòi hỏi ngày càng cao về lơng thực và thực phẩm nhằm đáp ứng nhu
cầu tiêu dùng của con ngời trên thế giới ngày một gia tăng, con ngời đứng trớc
một thử thách lớn là phải bằng mọi cách tăng năng suất, sản lợng cây trồng và
vật nuôi nhng vẫn giữ đợc môi trờng trong sạch, cân bằng sinh thái. Để đạt đợc mục đích trên, con ngời phải tăng cờng áp dụng các tiến bộ khoa học kĩ
thuật vào sản xuất nh tạo ra giống cây trồng cho năng suất cao, ngắn ngày,
chống chịu đợc sâu bệnh; tạo ra giống vật nuôi có sức đề kháng cao, phát triển
nhanh.
Việc sử dụng thuốc kháng sinh cho thủy sản đợc coi là một vũ khí có
hiệu quả cao của con ngời trong việc phòng chống dịch hại bảo vệ vật nuôi trớc sự phát triển nhanh chóng của nhiều loại bệnh nguy hiểm với tốc độ lây lan
nghiêm trọng. Bên cạnh u điểm là bảo vệ vật nuôi trớc sự tấn công của dịch

bệnh, kháng sinh còn gây ra nhiều tác động khác nh gây ô nhiễm môi trờng,
gây độc cho ngời và sinh vật xung quanh hồ nuôi, làm tăng chi phí sản xuất,
và nhất là để lại tồn d trong thủy hải sản gây ảnh hởng đến chất lợng sản phẩm
cũng nh sức khỏe của ngời tiêu dùng. Tác động tiêu cực của thuốc kháng sinh
càng trở nên nghiêm trọng nếu con ngời sử dụng không đúng yêu cầu kĩ thuật
hay quá lạm dụng thuốc kháng sinh.
An toàn thực phẩm đóng vai trò quan trọng trong chiến lợc bảo vệ sức
khỏe con khỏe. Việc dảm bảo vệ sinh, an toàn thực phẩm không những làm
giảm bệnh tật, tăng cờng sức lao động mà còn góp phần phát triển kinh tế, văn
hóa xã hội, giữ uy tín thơng hiệu sản phẩm hàng hóa xuất khẩu, uy tín quốc
gia, thể hiện sự quan tâm của chính phủ đối với ngời dân. Thực phẩm an toàn
là những thực phẩm không chứa tồn d hóa chất, kháng sinh cấm sử dụng, với
các loại hóa chất đợc phép sử dụng thì lợng tồn d không đợc vợt quá mức cho
phép, không chứa nấm mốc, mầm bệnh, vi sinh vật, kim loại nặng gây ảnh h-


5

ởng đến sức khỏe con ngời.
Tồn d hóa chất, kháng sinh trong thực phẩm đã gây ra nhiều hậu quả xấu
cho sức khỏe con ngời, môi trờng sinh thái, gây thiệt hại kinh tế nghiêm trọng.
Theo tống kê của bộ y tế, từ năm 1997 đến 2000, riêng các vụ ngộ độc thực
phẩm phải đi cấp cứu là 1391 vụ, gây ngộ độc cấp tính 25.509 ngời trong đó
217 ngời chết. Năm 2001 đã xảy ra 227 vụ ngộ độc thực phẩm (có 30 vụ ngộ
độc hàng loạt, bình quân trên 30 ngời/vụ) với tổng số 3814 ngời bị ngộ độc
trong đó 63 ngời tử vong. Các vụ ngộ độc do hóa chất nguyên nhân chủ yếu là
do hóa chất bảo vệ thực vật, thuốc chuột trong rau còn d và kháng sinh tồn d
trong thủy hải sản.
Tôm là một loại vật nuôi có giá trị kinh tế cao và có giá trị xuất khẩu lớn
nhng d lợng kháng sinh có trong tôm là một yếu tố hạn chế giá trị của lọai

thủy sản này.Vấn đề d lợng kháng sinh đã ảnh hởng đến uy tín và chất lợng
của tôm xuất khẩu Việt Nam làm giảm thị phần xuất khẩu tôm Việt Nam sang
thị trờng các nớc nhất là các thị trờng khó tính va có sự kiểm định nghiêm
ngặt nh Châu Âu, Mỹ, Nhật Bản. Đã có những lô hàng xuất khẩu bị trả về do
tồn d kháng sinh cao hơn mức cho phép.
Hiện nay Việt Nam cha có chơng trình quốc gia kiểm soát d lợng kháng
sinh trên thủy sản nuôi, trong khi đó nhiều nớc trong khu vực và trên thế giới
đều đang áp dụng thành công chơng trình này.
Cloramphenicol là một loại kháng sinh có phổ kháng khuẩn rộng và khả
năng phân tán tốt vào mô cơ thể. Cloramphenicol bị lạm dụng cho vào thức ăn
gia súc, thức ăn thủy sản, thuốc thú y. Cloramphenicol đi vào cơ thể con ngời
bằng con đờng ăn uống. Việc sử dụng kháng sinh này bị giới hạn vì tiềm năng
gây thiếu máu bất sản. Chơng trình kiểm soát d lợng hóa chất độc hại trong
thủy sản nuôi khuyến cáo cloramphenicol ảnh hởng đến hệ thống miễn dịch
và ngộ độc, gây ung th. Vì thế FDA,CODEX khuyến nghị cloramphenicol
không đựơc phép tồn d trong thực phẩm.


6

Tồn d cloramphenicol trong tôm có nguyên nhân chủ yếu từ nguồn thức
ăn nuôi tôm đặc biệt là thức ăn của tôm con chứa lợng cloramphenicol tơng
đối lớn do tôm con là đối tợng dễ bị nhiễm bệnh.
Việc xác định hàm lợng cloramphenicol trong mẫu thức ăn thủy sản cụ
thể là thức ăn nuôi tôm đóng vai trò quan trong việc kiểm soát d lợng kháng
sinh này trong thực phẩm nhất là thực phẩm xuất khẩu.
Với lý do trên tôi chọn đề tài luận văn là: Nghiên cứu xác định hàm lợng cloramphenicol trong mẫu thức ăn nuôi tôm .
Nội dung chính của luận văn này nhằm giải quyết các nhiệm vụ sau:
-Nghiên cứu các tính chất hoá học, vật lý và phơng pháp định tính
cloramphenicol.

-Nghiên cứu quy trình chiết pha rắn để làm sạch và làm giàu
cloramphenicol trong mẫu thức ăn nuôi tôm.
-Nghiên cứu quy trình định lợng cloramphenicol bằng phơng pháp HPLC.


7

chơng 1: tổng quan

1.1 Phơng pháp sắc ký lỏnG
1.1.1 Nguyên lý:
Sắc kí lỏng hiệu năng cao là một phơng pháp phân tích dựa trên nguyên
tắc Hoá lí (hấp thụ và nhả hấp thụ liên tục chất hấp thụ) và dựa vào sự hỗ trợ
của các thiết bị dựa trên nguyên tắc quang điện để phát hiện ra nồng độ của
chất phân tích.
Hiện tại, ở Việt Nam, tính tới thời điểm này HPLC là một phơng pháp
phân tích phổ biến của các phòng thí nghiệm hoá, phòng thí nghiệm hoá cho
các chuyên ngành dợc phẩm và mỹ phẩm.
Sắc ký lỏng hiệu năng cao (High Performance Liquid ChromatographHLPC) phát triển rất nhanh từ những năm 1960. Việc sử dụng các chất nhồi
có kích thớc nhỏ (5-10àm) làm cho hiệu quả tách của phơng pháp này tốt hơn
so với phơng pháp lỏng cổ điển.
Có thể nói một cách đơn giản HPLC là một sắc ký cột (column
chromatograph) đi kèm với một máy dò tìm (detector) nhạy để có thể pháp
hiện đợc các chất tách ra trong quá trình chạy sắc ký. Với những tiến bộ kĩ
thuật về cột, máy dò tìm (detector) đã chuyển sắc ký cột thành phơng pháp
phân tích có tốc độ nhanh và hiệu suất cao. Loại này cần phải có hệ thống
bơm cao áp để đẩy pha động với áp suất cao lên khoảng 30Mpa (300 atm)
nhằm tạo dòng chảy với lu lợng vài mililit/phút qua cột tách. Lợng mẫu phân
tích bằng HPLC chỉ cần khoảng 20àl.
Sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) có khả năng tách các hợp chất đặc thù

nh:
- Các hợp chất cao phân tử và ion thuộc các đối tợng nghiên cứu y học,
sinh học


8

Các hợp chất tự nhiên không bền.
Các hợp chất kém bền nhiệt, các chất dễ nổ.
Các hợp chất trên gồm có: nucleotit, axit amin, đờng, polisacarit, sắc tố
thực vật, axit hữu cơ, lipit không phân cực và phân cực, chất màu, dợc phẩm,
chất hoạt động bề mặt, vitamin, kháng sinh,
Điều khác biệt giữa HPLC và GC là trong phơng pháp HPLC, mẫu chỉ cần
làm hoà tan mà không cần làm bay hơi, do đó HPLC có thể phân tích đợc các
chất mà không sợ gây ra sự phân hủy nhiệt trong quá trình phân tích.
1.1.2. Các dạng sắc ký lỏng hiệu năng cao:
a. Dạng trao đổi ion:
Pha tĩnh rắn (IEC) chứa các nhựa trao đổi ion dới dạng bột mịn thờng là
các chất hữu cơ mang các nhóm hoạt động khác nhau: cation để tách các kim
loại kiềm và kiềm thổ, amonium, các amin anion, để tách các anion vô cơ,
phosphate hữu cơ.pha động thờng là dung dịch nớc.
b. Dạng HPLC phân bố hiệu suất cao:
Sử dụng các pha tĩnh và pha động có độ phân cực khác nhau. Nếu pha tĩnh
không phân cực trong khi pha động phân cực thì đợc gọi là dạng sắc ký đảo
pha (Reverse Phase chromatography) và dạng này có thể tách đợc các thành
phần không phân cực nh các hydrocacbon có phân tử khối lớn hơn 1000, các
vitamin tan trong dầu, anthraquinon, Dạng sắc ký pha thuận có thể tách các
hợp chất có ancol, các amin,
Gồm hai loại: sắc kí lỏng-lỏng và sắc kí pha liên kết
-Sắc kí lỏng-lỏng(LLC): pha tĩnh là chất lỏng đợc bao trên bề mặt của các

hạt chất mang,tức là đựơc hấp phụ trên chất mang.
-Sắc kí pha liên kết(BPC): pha tĩnh đợc gắn hóa học với chất mang tạo ra
liên kết siloxan nối nhóm cơ silic với silicagen.


9

c. Sắc kí hấp phụ hiệu suất cao(sắc kí lỏng-rắn LSC)
Pha tĩnh là chất rắn mà trên bề mặt có chứa các nhóm hidroxyl phân cực
pha động là một dung môi không phân cực.
d.Sắc kí lỏng hiệu suất cao trên gel(sắc kí loại cỡ SEC)
Phơng pháp này đợc ứng dụng chủ yếu cho các chất có phân tử lợng lớn.
Chất nhồi cho SEC là những hạt xốp của silicagel hay các polime có kích thớc
nhỏ(khoảng 10àm). Pha tĩnh là dung môi nàm trong các lỗ xốp của hạt, pha
động là dung môi chảy giữa các hạt. Chỉ những phân tử nhỏ mới khuyếch tán
vào lớp xốp, khi rửa giải các phân tử sẽ lần lợt ra theo cỡ từ lớn đến nhỏ.
1.1.3.Máy sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC):
Máy HPLC gồm có các bộ phận chính nh sau:
Hệ thống cung cấp dung môi.
Bơm cao áp và bộ trộn dung môi.
Hệ thống đa mẫu vào cột.
Cột sắc ký.
Detectơ.
Hệ thống ghi nhận tín hiệu và xử lí kết quả.


10

- Sơ đồ nguyên tắc của một máy sắc ký lỏng hiệu năng cao nh sau:

1 - Bình chứa dung môi; 2 - Bơm cao áp; 3 - Bộ bơm mẫu;
4 - Cột sắc ký; 5 - Detector; 6 - máy ghi tín hiệu.
a. Hệ thống cung cấp dung môi và bơm cao áp:
+Bình chứa dung môi:
Bình chứa bằng thuỷ tinh, đôi khi làm bằng thép không gỉ, trong phơng
pháp rửa giải thông thờng chỉ cần một bình chứa dung môi, trong phơng pháp
rửa giải gradien thờng dùng 2,3,4 bình chứa các dung môi khác nhau và hệ
dung môi rửa giải là hỗn hợp của các loại dung môi trên trộn lẫn với nhau
theo tỉ lệ đã đợc xác định. Cần loại các hạt và các khí hoà tan trong dung môi.
+Hệ thống bơm:
Dung môi của pha động đợc bơm cao áp hút đẩy pha động vào cột với áp


11

suất khoảng 300 atm, lu lợng dới 4,0ml/phút. Lu lợng và áp lực bơm có ảnh hởng lớn đến các peak sắc ký.
Bơm dùng trong phơng pháp phải tạo đợc áp suất cao khoảng 250-500 atm
với lu lợng từ 0,1 đến 10ml/phút. Bơm phải trơ với dung môi và khi bơm pha
động qua cột áp suất cao thì không bị ngắt quãng hoặc tạo nhịp sóng có thể
làm sai lệch các pic thu đợc.
b. Hệ thống đa mẫu vào cột:
Mẫu đợc bơm vào cột nhờ hệ thống van mẫu là một màng cao su đặc biệt
có khả năng giữ áp suất trong hệ thống cố định. Lợng mẫu đợc đa vào cột với
thể tích nhỏ, khoảng 10-50àl bằng ống tiêm hay hệ thống nạp mẫu tự động.
c. Cột sắc ký:
Kiểu cột thờng phụ thuộc vào phơng pháp dùng để tách ,nhng thờng là
những cột bằng thép không gỉ, có cỡ lỗ chính xác đờng kính từ 3 đến 4 mm
và dài từ 10 đến 30 cm ( những cột dùng cho SEC thờng rộng hơn và dài đến
100 cm ). Loại cột này có hiệu lực rất cao, có số đĩa lí thuyết lên đến 100.000
đĩa cho 1m chiều dài cột.

Cột nhồi chất rắn mang thờng đợc chế tạo bằng hợp kim chịu đợc áp suất
cao đến 5000psi và có tốc độ dòng cỡ ml/phút.
Các loại cột thông dụng

Loại cột

Đờng kính
trong

Chiều dài

Tốc độ chảy

Cột quy ớc

4,0-4,6mm

15-30cm

1-2ml/phút

Cột phân tích nhanh

4,0-4,6mm

4-13cm

2-4ml/phút

Cột có đờng kính nhỏ

1,0-2,0mm

15-100cm

0,03-1ml/phút

Trong đó cột có đờng kính 4,6mm đợc dùng nhiều nhất, chiếm 44,5%;
cột đờng kính 4,0mm là 16,7%.


12

+

Cột phân tích nhanh có thời gian phân tích rất ngắn, đẽ thay đổi tốc

độ chảy từ cột quy ớc sang cột phân tích nhanh. Tuy nhiên có những bất tiện
là phải trang bị thể tích cột phụ rất thấp, thể tích cuvet của detector phải nhỏ,
việc nhận và xử lý tín hiệu phải nhanh.
+

Cột có đờng khính nhỏ tiết kiệm dung môi pha động.

d. Detector:
Một số detector thông dụng nhất:
-

Detector hấp thụ tử ngoại UV: dựa vào đặc tính hấp thụ quang học

của chất phân tích. Các detector UV DAD hiện nay đợc dùng phổ biến vì nó
thu thập dữ liệu phổ của chất phân tích một cách đầy đủ theo thời gian lu cho
phép hiển thị dữ liệu phổ và sắc đồ theo 3 chiều.
-

Detector chỉ số khúc xạ (RF): dựa vào tính chất khúc xạ ánh sáng

phân cực của chất phân tích.
-

Detector huỳnh quang FLD: dựa vào sự phát huỳnh quang của các

chất phân tích dới tác dụng của ánh sáng kích thích.
1.2.Cloramphenicol
1.2.1. Cấu tạo và tính chất
Kháng sinh là những chất có khả năng tiêu diệt vi khuẩn hay kìm hãm sự
phát triển của vi khuẩn một cách đặc hiệu. Nó có tác dụng lên vi khuẩn ở cấp
độ phân tử, thờng là một vị trí quan trọng của vi khuẩn hay một phản ứng
trong quá trình phát triển của vi khuẩn.
Cloramphenicol ( viết tắt là CAP) hay phenicol gồm 2 nhóm kháng sinh :
+Cloramphenicol : thờng đợc gọi là cloroxit có tác dụng điều trị bệnh thơng hàn và sốt phát ban do Kickettia ( là tác nhân truyền bệnh rận, chấy)
+Thiamphenicol: là dẫn xuất của cloramphenicol khi thay thế gốc nitro
bằng gốc metylsunfo.
Cloramphenicol lần đầu tiên đợc tách từ vi khuẩn Streptomyces


13

Venezuale, hiện nay đợc tổng hợp bằng con đờng hoá học. Nó bền trong
khoảng pH 2 - 7.

Cấu trúc phân tử của nó nh sau:

Nó có khả năng thẩm thấu vào tế bào tốt hơn đa số các kháng sinh khác
nhờ khoảng pH tồn tại của mình. Nó có tác dụng ức chế quá trình tổng hợp
protein và bằng cách nh vậy sẽ giết chết hoặc ngăn cản sự phát triển của các
vi sinh vật. Vì vậy CAP rất độc và không nên dùng nó trong trờng hợp có thể
dùng kháng sinh khác. Nguy hiểm nhất là tác dụng phụ của CAP làm suy
giảm quá trình sản xuất hồng cầu ở tuỷ xơng.
Trong nuôi trồng thuỷ sản, cloramphenicol đã chính thức bị cấm sử dụng
ở Việt Nam (QĐ số 07/2005/QĐ-BTS ngày 24 tháng 2 năm 20005 của Bộ trởng bộ Thuỷ sản) và ở nhiều quốc gia trên thế giới (Mỹ, Nhật, EU,).
D lợng cloramphenicol trong các sản phẩm thực phẩm là một thông số
kiểm soát nghiêm ngặt ở đa số các thị trơng. Đây cũng chính là vấn đề khá
nóng bóng đối với lĩnh vực xuất khẩu thuỷ sản của Việt Nam sang các thị trờng Quốc tế.
Hiện nay, phơng pháp tiêu chuẩn đợc chấp nhận ở nhiều quốc gia là phân
tích cloramphenicol bằng GC hoặc LC-MS. Tuy nhiên, kĩ thuật HPLC với
detector UV cũng có thể sử dụng để phát hiện và phân tích cloramphenicol với
độ nhạy vừa phải và độ chọn lọc tuỳ thuộc mạnh vào kĩ thuật chuẩn bị mẫu.


14

Cấu trúc không gian:

C11H12Cl2N2O5

ptl: 323,14g

Cấu tạo phân tử CAP gồm 3 phần:
(I): p-nitro benzen
(II): mạch-2-amino propandiot-1,3

(III): dicloaxetyl
Tên khoa học:
D(-) threo-2-dicloro acetamido-1-p-nitrophenyl-1,3-propandiol hoặc: 2,2dicloro-N-[2-hidroxy -1-hydroxy Metyl-2-(4-nitrophenyl) ethyl] acetamid.
a.Tính chất vật lí:
Bột kết tinh màu trắng hoặc hơi xám, không mùi, vị rất đắng.
Bền ngoài không khí nóng chảy ở 149-1530C.
Không tan trong ete; khó tan trong nớc; tan trong etanol 96% , etylaxetat,
propylen glycol (PEG).
Dung dịch trong etanol thì hữu tuyền và trong dung dịch etyl axetat thì tả
tuyền.
Phổ hồng ngoại của chế phẩm phải phù hợp với phổ hồng ngoại của
cloramphenicol chuẩn.


15

Góc quay cực riêng từ +18,5 đến 20,50.
Hấp thụ UV cho 1 cực đại hấp thụ ở 276-278 nm.
b.Tính chất hoá học:

- Trong phản ứng khử hoá trên, các nguyên tử clo hợp chất sẽ chuyển
thành Cl, cho kết tủa trắng xám với dung dịch AgNO3.
- Ancol bậc 1 ở cuối mạch thẳng tạo este với axit hữu cơ.
- Đun sôi hỗn hợp CAP trong dung dịch NaOH đặc cho màu chuyển từ
vàng ->da cam, cuối cùng là màu đỏ bền.
- Hoà tan khoảng 10 mg chế phẩm trong 1 ml ethanol 50% (tt/tt), thêm 3
ml dung dịch canxi clorua 1% và 50 mg bột kẽm, đun nóng trên cách thuỷ 10
phút. Lọc dung dịch nóng và để nguội. Thêm 01 ml benzoyl clorid và lắc 1
phút. Thêm 0,5 ml dung dịch sắt (III) clorid 10.5 % và 2 ml clorofom, lắc.
Lớp nớc có màu đỏ tím nhạt đến đỏ tía.

- Lấy 50 mg chế phẩm vào ché sứ, thêm 0,5 g natri cacbonat khan, đốt 10
phút, để nguội. Hoà tan cặn bằng 5 ml dung dịch acid nitric 2M, lọc. Lấy 1 ml
dịch lọc, thêm 1 ml nớc. Dung dịch này phải cho phản ứng A của ion clorid.
Este của CAP có công thức :


16

Các chế phẩm đợc sử dụng: CAP palmitat, CAP succinat
c.Liên quan đến cấu trúc - tác dụng:
CAP có 2 C*1,2 vì vậy sẽ tồn tại 4 đồng phân quang học. Cách gọi "threo
và "erythro" các đồng phân này xuất phát từ cách gọi các đồng phân đờng.
Hai cặp đồng phân D(-), L(+) - erythro và D(-), L(+) - threo biểu diễn nh dới
đây chỉ D(-) threo có đủ hoạt lực kháng sinh dùng trong điều trị.


17

1.2.2.Điều chế và ứng dụng
Từ mẫu đất vùng phụ cận Caracas (Thủ đô Venezuela) T.Erlich, Q.Bartr,
R.Smith, D.Joslyn và P.Bur Kholder (1947) phát triển trong môi trờng nuôi
cấy một chủng xạ khuẩn. Sau đó chủng xạ khuẩn này đợc đặt tên là
stretomyces venezuela.
Năm 1949, xác định xong cấu trúc cấu tạo và tổng hợp toàn phần CAP với
hiệu suất cao, từ đó kháng sinh này đợc sản xuất bằng phơng pháp tổng hợp
hoá học theo qui trình nh sau :
Brom hoá trực tiếp styren trong điều kiện bảo vệ đợc W- bromo styren (I);
ngng tụ với 2 phân tử formandehit trong axit đợc 5 - bromo- 4 - phenyldioxan1,3 (II) chuyển Br -> NH 2 bằng cách sục NH3 thuỷ phân giải phóng OH alcol.
Tách đồng phân bằng kết tinh phân đoạn, nitro hoá nhân thơm và amid hoá

amin bậc 1 ở mạch thẳng đợc đồng phân D(-) theo:


18

1.2.3.Tác động của cloramphenicol đối với con ngời và thủy sản nuôi
Cloramphenicol đợc phân lập từ môi trờng nuôi cấy Streptomyces
venezuelae năm1947, do phổ kháng khuẩn rộng và khả năng phân tán tốt vào
các mô cơ thể nên CAP bị lạm dụng cho vào thức ăn gia súc, thức ăn thủy
sản ,thuốc thú y. CAP đi vào cơ thể con ngời thông qua con đờng ăn uống.
Việc sử dụng kháng sinh này bị giới hạn vì tiềm năng gây thiếu máu bất sản.
Chơng trình kiểm soát d lợng hóa chất độc hại trong thủy sản nuôi khuyến cáo
CAP ảnh hởng đến hệ thống miễn dịch và ngộ độc, gây ung th. CAP làm chậm
trởng thành đối với hồng cầu non, gây ra sự tích lũy và thải trừ chậm chất dị
hóa ở gan, thận, có thể kết hợp với một số loại thuốc khác gây hại cho cơ thể.
CAP ức chế tổng hợp ADN trong tế bào tủy xơng ngời, gây suy tủy xơng. Uỷ
ban tiêu chuẩn hóa thực phẩm quốc tế (CODEX) đã khuyến nghị mức d lợng
đối với CAP là không đợc phép tồn d trong thực phẩm.
Sử dụng kháng sinh đề phòng và trị bệnh trong chăn nuôi thủy sản có thể
dẫn đến sự hình thành các mầm bệnh vi khuẩn kháng kháng sinh và gây tác
hại đến vật nuôi và con ngời. Theo nghiên cứu năm 2002 có 240 dòng vi
khuẩn kháng CAP và 50 dòng vi khuẩn nhạy với CAP đã đợc phân lập và lu
giữ trong hệ thống trữ khuẩn ở -700C. Trong số này có 10 chủng phat triển đợc
ở nồng độ 256 ppm CAP xếp vào nhóm kháng cao.
1.2.4.Cloramphenicol trong thực phẩm
Trong thời gian qua đã có những lô hàng mực, tôm, ghẹ ... của Việt Nam
xuất khẩu sang thị trờng Nhật Bản,Mỹ và Châu Âu bị trả về bởi lý do nhiễm
kháng sinh Cloramphenicol gây thiệt hại kinh tế rất lớn. Chẳng hạn một
container mực trị giá hơn 2,5 tỷ đồng.
Nguy cơ lây nhiễm Cloramphenicol có thể từ rất nhiều nguồn khác nhau:

- Từ thức ăn nuôi tôm có chứa Cloramphenicol
-Từ thuốc kháng sinh Cloramphenicol ngời chăn nuôi thả xuống hồ cho


19

tôm ăn khi tôm bị bệnh
-Một nguy cơ tởng chừng rất đơn giản là từ bàn tay ngời công nhân chế
biến thực phẩm.Nguy cơ lây nhiễm Cloramphenicol từ kem bôi tay của công
nhân chê biến để điều trị lở loét cũng rất cao, kết quả kiểm nghiệm cho thấy
100% mẫu nớc trong các thau tách đầu , lột da mực của công nhân sử dụng
kem Cortibiol (trong thành phần có cloramphenicol) tối hôm trớc nhng không
đeo găng tay làm việc vào ngày hôm sau đều có cloramphenicol.
Ngày 14/11/2006 Uỷ ban Châu Âu đã thông báo phát hiện thấy lợng chất
cloramphenicol bị cấm sử dụng có trong sữa ong chúa của Việt Nam xuất
khẩu sang Italia. Kết quả kiểm tra cho thấy hàm lợng cloramphenicol trong lô
hàng ở mức 1,38àg/kg . Lô hàng đã bị trả lại.
Cục quản lí Thực phẩm và Mỹ phẩm Mỹ ( FDA ) kiểm tra d lợng
cloramphenicol ở mức 0,3 phần tỷ trong khi đó ở Việt Nam tỉ lệ này là 1,5
phần tỉ.
1.2.5.Các phơng pháp phân tích định lợng cloramphenicol
a.Phơng pháp quang phổ hấp thụ tử ngoai và khả kiến
Phơng pháp này có thể dùng định lợng cloramphenicol trong thuốc.
Các bớc tiến hành:
Hòa loãng một thể tích chứa khoảng 25 mg cloramphenicol với nớc đến
250ml. Lấy 10ml dung dịch này cho vào bình định mức 100 ml, rồi cho thêm
nớc cho đủ. Lắc kĩ . Đo độ hấp thụ của dung dịch này ở bớc sóng cực đại
278nm, cuvet dày 1cm. Tính hàm lợng cloramphenicol C11H12Cl2N2O5 theo A(
1%,1cm). Lấy 297 là giá trị A(1%,1 cm) ở cực đại hấp thụ 278 nm.
Trong phơng pháp này ngời ta sử dụng biểu thức A(1%, 1 cm) là độ hấp

thụ riêng của một chất tan . Nó có thể đợc coi là độ hấp thụ của dung dịch
chất tan ở nồng độ 1%(kl/tt) hay 10g/l trong một cốc có chiều dày 1cm và đo
ở bớc sóng xác định.


20

Do vậy:
A(1%,1 cm)
Biết A, M ta tính đợc rồi từ đó
A= cd
với d=1cm ,

=

10 ì
M

tính nồng độ dựa vào phơng trình :

ì

tính đợc theo A(1%,1 cm) ở trên, A đo đợc ta sẽ

tính đợc nồng độ c
b.Nghiên cứu xác định d lợng cloramphenicol trong tôm bằng kỹ
thuật cực phổ sóng vuông quét nhanh trên cực giọt chậm
Chuẩn bị mẫu phân tích :
Là 3 mẫu tôm đã làm sạch vỏ, gạch tôm và đờng chỉ đen , chỉ còn lại thịt
tôm sạch.

Mẫu trắng đợc kiểm tra hàm lợng cloramphenicol bằng phơng pháp sắc ký
khí,giới hạn phát hiện 0,3 àg/kg,kết quả :không phát hiện đợc cloramphenicol
Thiết bị:
Máy sóng vuông quét nhanh ANALYZER MF-707e, SQF-505. Cực làm
việc: cực giọt thủy ngân chậm của Pháp; Cực so sánh: cực Ag/AgCl/KCl bão
hòa( Radiometer); Cực hỗ trợ: cực Platin(Radiometer)
Phơng pháp nghiên cứu:
-Dự đoán hoạt tính điện hóa của nhóm nitro:
Dựa vào công thức cấu tạo của cloramphenicol dự đoán hoạt tính điện hóa
của nhóm nitro có E1/2 trong khoảng -0,2 đến 1,0 V.Tùy ở các pH khác nhau
và các nhóm liên kết với nhóm NO2 thế bán sóng có thể dao động trong
khoảng này.
-Điều kiện định lợng :
Hòa tan cloramphenicol trong etyl axetat, thêm đệm amoni axetat 0,2 M ở
pH=10. Đo cực phổ SVQN.E1/2 = -505 mV.
V.start(thế bắt đầu quét): -200 mV.


21

V.stop(thế kết thúc): -800 mV.
Vstep(tốc độ quét ): 8 mV.
Vpulse(biên độ xung): 40 mV
T.Drop(thời điểm bắt đầu quét): 3000 ms.
-Quy trình xử lý mẫu:
Cho 5 g tôm mẫu trắng nghiền mịn, thêm 800 àl CAP chuẩn 0,1 mg/ml
vào, trộn đều, thêm 10 ml etyl axetat lắc 15 phút, gạn lấy dịch chiết, làm 3
lần. Dịch chiết đem cô quay ở 500C, thu cắn. Lấy cắn pha trong đệm
CH3COONH4 (pH=10) vừa đủ 25 ml, lọc và đem đo.
Hiệu suất chiết trung bình là : 86,16%.

Kết quả:
-Tính tuyến tính: xét trong khoảng 0,4-3,2àg/ml
phơng trình tuyến tính: y=0,1011x+0,0082
R2 =0,9999
-Độ đúng :

86,07%

-Độ chính xác:
LOD:

RSD= 3,30%

48 ng/ml

LOQ :

162 ng/ml

Kết luận:
Phơng pháp xác định d lợng CAP trong tôm bằng kỹ thuật cực phổ sóng
vuông quét nhanh trên cực giọt chậm có độ đúng và độ lặp lại trong thời gian
cho phép, qui trình xử lý mẫu tơng đối đơn giản không cần phải xử lý mẫu
tinh khiết nh mẫu sử dụng cho HPLC, GC...sử dụng các loại hóa chất thông
thờng, thời gian phân tích nhanh, thao tác trên máy dễ dàng,giá thành phân
tích thấp. Trong điều kiện của Việt Nam hiện nay việc trang bị đaị trà cho các
phòng thí nghiệm cơ sở tuyến dới thiết bị kỹ thuật cao nh: GC, GC/MS,
LC/MS/MS... là tơng đối khó khăn trong khi qui định xuất khẩu rất nghiêm

22

ngặt về d lợng CAP trong tôm.
c.Định lợng CAP bằng phơng pháp GC-MS
- Dụng cụ và hóa chất
Thiết bị phân tích là hệ thống GC-MS Agilent 6890N với detectơ MSD
5973N. Cột chiết SPE ODS-C18 Agilent 100 mg, 1 ml.
CAP chuẩn do Viện kiểm nghiệm Bộ Y tế cung cấp có độ tinh khiết
99,80%. Chất dùng silan hóa là MSTFA của hãng Sigma. Các dung môi và
hóa chất khác dùng trong nghiên cứu đều có độ tinh khiết HPLC.
-Khảo sát điều kiện làm việc trên GC-MS:
Cột sắc ký mao quản HP5-MS (30 ì m0,25 mm, độ dày pha tĩnh 0,25 àm).
Khí mang heli độ tinh khiết 99,999%, tốc độ dòng 1,2ml/phút. Mẫu đợc bơm
tự động với thể tích 1àl. Kỹ thuật bơm mẫu splitless, đóng van 0,5 phút. Chơng trình nhiệt độ: 600C giữ 1 phút, tăng 300C/phút đến 1800C, tăng 100C/phút
đến 2500C giữ 5 phút, tăng 300C/phút đến 3000C giữ 1 phút.
Chế độ SIM của detectơ đợc lựa chọn để xác định CAP-TMS.Các mảnh
phổ khối có m/e là 225, 242, 361, 451 đợc lựa chọn để xác định CAP-TMS.
Dới các điều kiện GC-MS đã chọn, CAP-TMS có thời gian lu trên phổ
khối là 14,7 phút.
Tỉ lệ độ cao các mảnh phổ khối của CAP-TMS đợc xác định tơng ứng
225:242:361:451 là 25:3:1,5 : 1. Với tỉ lệ đã xác định cho phép định tính
CAP-TMS. Để định lợng CAP-TMS sử dụng mảnh phổ khối có giá trị m/e là
225 và nh vậy giới hạn xác định CAP bằng GC-MS là 0,1 ppm.


23


24

-Kết quả và thảo luận:
Thể tích dung dịch CAP chuẩn lấy nghiên cứu là 1ml, nồng độ 0,01 ppm.
Ba yếu tố ảnh hởng chính đến hiệu suất của phản ứng silan hóa là thời gian
phản ứng, nhiệt độ phản ứng và lợng chất silan hóa đã đợc khảo sát.
Kết quả cho thấy với thời gian 60 phút thì phản ứng silan hóa cho sản
phẩm có tín hiệu detectơ cao nhất.
Phản ứng silan hóa giữa CAP với MSTFA đợc khảo sát trong khoảng nhiệt
độ từ 40-900C . Kết quả khảo sát ở nhiệt độ phản ứng là 70 0C thì sản phẩm
phản ứng giữa CAP-TMS cho đáp ứng tín hiệu detectơ của mảnh phổ khối 225
cao nhất.
Thể tích MSTFA cần sử dụng là từ 60 àl trở lên, nhng để phản ứng xảy ra
hoàn toàn là 100 àl.
Điều kiện chiết pha rắn
CAP đợc chiết từ các mẫu sinh học thờng lẫn nhiều tạp chất nh :chất béo
và các chất hữu cơ khác...do vậy trớc khi tiến hành silan hóa CAP đợc chiết từ
mẫu sinh học bằng MSTFA cần phải loại bỏ tạp chất. Có nhiều cách loại bỏ
tạp chất nhng phơng pháp chiết pha rắn chất nhồi ODS-C18 là tiện lợi
nhất.Kết quả khảo sát thu đợc khi dùng dung môi metanol/nớc là 4/6 thì có
khoảng gần 20% CAP đợc tách ra khỏi cột ODS-C18.
Rửa giải CAP ra khỏi cột bằng 3 ml metanol
Độ thu hồi CAP :
Độ thu hồi CAP trong mẫu sinh học đợc tính cho toàn bộ các bớc tách
chiết, tách loại bỏ tạp chất, silan hóa và phân tích. Tiến hành chuẩn bị mẫu
theo các bớc sau để xác định độ thu hồi CAP: Lấy 5 mẫu, mỗi mẫu 5 g
nghiền mịn trong đó 1mẫu trắng và 4 mẫu cho vào 1ml dung dịch CAP có
nồng độ khác nhau (1ppm, 0,1ppm,0,01ppm,0,001ppm) trộn đều cho vào ống
ly tâm, thêm vào 1 ml NaCl 4%, 20 ml etyl axetat, lắc trong 1 phút, ly tâm với


25

tốc độ 3600 vòng/phút trong 10 phút (lặp lại quá trình chiết 2 lần). Thu lớp
dung môi hữu cơ phía trên cho bay hơi ở nhiệt độ phòng dới dòng khí N2 đến
còn khoảng 0,5 ml, lọc và rửa bằng 0,5 ml metanol. Chuyển mẫu vào ống ly
tâm và cho thêm vào 10 ml n-hexan, lắc, ly tâm với tốc độ 3600 vòng/phút
trong 5 phút, loại bỏ lớp dung môi. Phần dung dịch còn lại đợc làm khô bằng
dòng khí N2 ở nhiệt độ phòng đến còn 0,5 ml. Chuyển toàn bộ mẫu vào cột
chiết ODS-C18(đã đợc hoạt hóa bằng 1 ml metanol và 1 ml nớc cất).Rửa cột
bằng 1 ml hỗn hợp metanol/nớc tỉ lệ 4,5/5,5, rửa giải CAP ra khỏi cột bằng 3
ml metanol, cô mẫu đến khô. Cho vào 100 àl MSTFA, lắc và để hỗn hợp
chuyển hóa ở 700C trong 60 phút, định mức bằng etyl axetat đến 1ml, lắc đều
sau đó tiến hành phân tích trên hệ thống GC-MS. Kết quả phân tích cho thấy
độ thu hồi tính cho các mẫu có giá trị trung bình khoảng 86%.
Các phơng pháp trên để định lợng CAP có tính chính xác rất cao đặc biệt
là phơng pháp GC-MS. Tuy nhiên các phơng pháp này cũng có những nhợc
điểm đáng kể nh sau:
-Đắt tiền: Thiết bị phát hiện(đọc kết quả) rất đắt tiền. Điển hình nh máy
sắc ký khí lên đến cả triệu USD, loại rẻ nhất cũng vào khoảng 30.000 USD,
hoặc các thiết bị cho Elisa cũng lên đến 15.000-20.000 USD.
-Vận hành: phức tạp, mất nhiều thời gian, quy trình nhiều bớc phức tạp và
cần nhân viên vận hành có trình độ và kỹ năng nhất định.
-Điều kiện môi trờng: do thiết bị máy móc tinh vi, việc xử lý mẫu thử rất
phức tạp, yêu cầu khắt khe về nhệt độ phòng, độ ẩm, thông khí, độ chiếu sáng,
hạn chế tối đa các chất tự do trong không khí có thể gây nhiễm môi trờng xét
nghiệm. Từ các yêu cầu đó cần phải trang bị phòng vô trùng, tủ đặc biệt thiết
kế riêng để đựng dụng cụ, máy xử lý rác và chất thải...và nhất thiết phải thực
hiện các xét nghiệm trong phòng thí nghiệm đầy đử các điều kiện này.
Vì vậy hiện nay để kiểm tra nhanh, sàng lọc trớc khi cần đánh giá
định lợng chính xác CAP ngời ta có thể dùng dụng cụ test nhanh CAP có bán