Xây dựng quy trình sản xuất sinh khối sơi Ganoderma lucidum

1

Phần 1: MỞ ĐẦU
1.1 ĐẶT VẤN ĐỀ
Theo chúng ta đã biết thì Linh chi là một trong dược thảo thiên nhiên được xếp vào
loại thượng dược. Cách đây hàng ngàn năm, nấm Linh Chi đã được dùng để làm thuốc,
các sách dược thảo của nhiều triều đại ở Trung Quốc đều ghi nhận Linh Chi được sử dụng
làm thuốc từ lâu đời. Giá trị dược liệu của linh chi đã dược ghi chép trong các thư tịch cổ
của Trung Quốc, cách nay hơn 4000 năm (Zgao, J.D., 1994). Từ những kinh nghiệm lưu
truyền trong nhân gian, loài người đã biết sử dụng Linh chi theo nhiều cách khác nhau.
Đến nay khoa học kỹ thuật phát triển, nấm Linh chi còn được các nhà khoa học trên
thế giới chứng minh được tác dụng hữu ích trong việc điều trị bệnh: ung thư, cao huyết
áp, tiểu đường, tim mạch, HIV, viêm gan siêu vi, suy nhược thần kinh… [3, 9]
Hiện nay Linh chi không còn khan hiếm như lúc trước do con người có thể áp
dụng kỹ thuật để nuôi trồng Linh chi trong môi trường nhân tạo và ngày càng phát triển
mạnh trên thế giới và đạt đến quy mô công nghiệp. Trong hai thập niên gần đây, các nhà
khoa học ở nước Nhật Bản, Trung Quốc, Hàn Quốc, Singapore, Hongkong đã tăng cường
nghiên cứu sản xuất nấm Linh Chi và mở rộng hiệu quả sử dụng dược liệu này.
Tại thị trường Việt Nam, nhu cầu sử dụng nấm Linh chi làm thuốc chữa bệnh ở
trong nước cũng như xuất khẩu ngày càng tăng. Nhiều cơ sở đã tiến hành nghiên cứu nuôi
trồng, chế biến và thăm dò các hoạt chất sinh học có trong nấm Linh chi. Các thành phần
hóa học có trong nấm Linh chi rất phong phú bao gồm các nhóm: acid béo, steroid,
alcaloid, protein, polysaccharide… [19]. Trong đó thành phần có tác dụng dược lý quý
báu, đặc trưng cho nấm Linh chi phần lớn thuộc nhóm triterpenoid [2].
Việt Nam với khí hậu nhiệt đới gió mùa và nguồn nguyên liệu cellulose dồi dào, đã
tạo điều kiện cho nghề trồng nấm không ngừng phát triển. Hiện nay cả nước có 32/61 tỉnh
thành đã có cơ sở nuôi trồng nấm dược liệu (tháng 12/2001) [6].
Dựa vào tình hình ngày càng phát triển của ngành nấm ở Việt Nam và sự cho phép
của bộ môn công nghệ sinh học của Trường Cao đẳng Kinh tế – Công nghệ TP. Hồ Chí
Nguyễn Vũ Duy Khanh

2

Minh chúng tôi quyết định thực hiện đề tài “Xây dựng quy trình sản xuất sinh khối sơi
“Ganoderma lucidum”.
1.2 MỤC ĐÍCH
Xây dựng quy trình sản xuất sinh khối nấm Linh chi
1.3 YÊU CẦU
Xác định các yếu tố dinh dưỡng đến tốc độ phát triển của sợi nấm Linh chi
Xác định các yếu tố pH, xác định đường cong tăng trưởng của sợi nấm Linh chi
Tối ưu hóa điều kiện nuôi cấy sợi nấm theo quy trình thực nghiệm
Phân tích thành phần hoạt chất có trong sợi nấm
1.4 HẠN CHẾ ĐỀ TÀI
Chưa khảo sát hết các yếu tố dinh dưỡng ảnh hưởng đến môi trường nuôi cấy

Nguyễn Vũ Duy Khanh


3

Phần 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1 NẤM LINH CHI [2, 5, 6, 12]
2.1.1 Khái quát chung
Nấm Linh chi có tên khoa học là Ganoderma lucidum, người miền Bắc xưa còn
gọi là nấm lim. Trong thư tịch cổ nấm Linh chi còn được gọi với tên khác như Tiên thảo,
Nấm trường thọ, Vạn niên nhung…
Nấm Linh chi thường phân bố ở vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới, chúng thường
phát triển trên giá thể là gỗ mục hoặc các nguyên liệu có chất sơ
Hình thái quả thể nấm Linh chi được mô tả như sau: Tai nấm hóa gỗ, hình quạt
hoặc thận. Mặt trên mũ có vân đồng tâm và bóng loáng, màu vàng cam cho đến màu đỏ

đậm hoặc nâu đen. Mặt dưới phẳng, có nhiều lổ nhỏ li ti, là cơ quan sinh bào tử. Cuống
nấm đặc và cứng, sậm màu và bóng loáng.
Giá trị dược liệu của Linh chi đã dược ghi chép trong các thư tịch cổ của Trung
Quốc, cách nay hơn 4000 năm (Zgao, J.D., 1994). Trong sách “Thần nông bản thảo“ cách
đây khoảng 2000 năm thời nhà Châu và sau đó được nhà dược học nổi tiếng Trung Quốc
Lý Thời Trân phân ra thành “Lục Bảo Linh Chi“ thời nhà Minh với các khái quát công
dụng dược lý khác nhau, ứng theo từng màu (Lý Thời Trân, 1590).
Theo Lý Thời Trân thì nấm Linh chi có 6 màu khác nhau:


Xích chi (Linh chi đỏ còn gọi Hồng chi)



Hắc chi (Linh chi đen còn gọi Huyền chi)



Thanh chi (Linh chi xanh còn gọi Long chi)



Bạch chi (Linh chi trắng còn gọi Ngọc chi)



Hoàng chi (Linh chi vàng còn gọi Kim chi)



Tử chi (Linh chi tím)

Cho đến nay Linh chi không còn giới hạn trong phạm vi đất nước Trung Quốc, mà
mang tính toàn cầu. Hiện tại có khoảng 250 bài báo của các nhà khoa học liên quan đến
dược tính và lâm sàng của Linh chi đã được công bố.
Nguyễn Vũ Duy Khanh


4

Cấu trúc độc đáo của Linh chi chính là thành phần khoáng vi lượng đủ loại, trong
đó một số khoáng tố như germanium, vanadium, crôm... Chúng đã được sử dụng là nhân
tố quan trọng cho nhiều loại phản ứng chống ung thư, dị ứng, lão hóa, xơ vữa, đông máu
nội mạch, giúp điều chỉnh dẫn truyền thần kinh, bảo vệ cấu trúc của nhân tế bào với hàm
lượng rất thấp
Ở các nước Châu Á, đặc biệt là Trung Quốc, Nhật Bản, Hàn Quốc, Đài Loan…,
việc nghiên cứu phát triển và sử dụng Linh chi đang được công nghiệp hóa với quy mô
lớn về phân loại, nuôi trồng chủ động, chế biến và bào chế dược phẩm. Đồng thời nghiên
cứu hóa dược các hoạt chất có tác dụng dược lý và phương pháp điều trị lâm sàng.
Ở Việt Nam, trong các tài liệu lưu lại của Hải Thượng Lãn Ông, Lê Hữu Trác
(1720-1791) cũng thấy đề cập đếnllinh chi. Sau đó, Lê Quý Đôn còn khẳng định, đây là
nguồn sản vật quý hiếm của đất rừng Đại Nam. Trong quyển “Cây thuốc và vị thuốc Việt
Nam” (1991), giáo sư Đổ Tất Lợi còn mô tả chi tiết và trình bày về đặc tính trị liệu của
loài nấm này, đồng thời cho rằng đây là loại Siêu thượng dươc.
2.1.2 Vị trí phân loại [5, 7]
Nấm Linh chi có vị trí phân loại được thừa nhận rộng rãi hiện nay:
Ngành:

Eumycota

Ngành phụ:

Basidiomycotina

Lớp:

Hymenomycetes

Lớp phụ:

Hymenomycetidae

Bộ:

Aphyllophorales

Họ:

Ganodermataceae

Họ phụ:

Ganodermoidae

Giống:

Ganoderma

2.1.3 Đặc điểm hình thái và chu trình sống của nấm Linh chi
2.1.3.1 Đặc điểm hình thái nấm Linh chi (Ganoderma lucidum)

Linh chi thuộc nhóm nấm lớn và rất đa dạng về chủng loại. Từ khi xác lập thành
một chi riêng là Ganoderma Karst (1881), đến nay tính ra có hơn 200 loài được ghi nhận,
riêng Ganoderma lucidum đã có 45 loài. [3]
Nguyễn Vũ Duy Khanh


5

Nấm Linh chi là một trong những loại nấm phá gỗ, đặc biệt trên các cây thuộc bộ
Đậu (Fabales). Nấm xuất hiện nhiều vào mùa mưa, trên thân cây hoặc gốc cây. Ở Việt
Nam Nấm Linh chi được gọi là nấm Lim và được phát hiện ở miền Bắc bởi Patouillard
N.T (1890 đến 1928).

Hình 2.1: Nấm Linh chi
Nấm Linh chi (quả thể) cây nấm gồm 2 phần cuống nấm và mũ nấm (phần phiến
đối diện với mũ nấm). Cuống nấm dài hoặc ngắn, đính bên có hình trụ đường kính 0,53cm. Cuống nấm ít phân nhánh, đôi khi có uốn khúc cong queo. Lớp vỏ cuống màu đỏ,
nâu đỏ, nâu đen, bóng, không có lông, phủ suốt lên mặt tán nấm.
Mũ nấm khi non có hình trứng, lớn dần có hình quạt. Trên mặt mũ có vân gạch
đồng tâm màu sắc từ vàng chanh - vàng nghệ - vàng nâu - vàng cam - đỏ nâu - nâu tím
nhẵn bóng như láng vecni. Mũ nấm có đường kính 2 - 15cm, dày 0,8 - 1,2cm, phần đính
cuống thường gồ lên hoặc hơi lõm. Khi nấm đến tuổi trưởng thành thì phát tán bào tử từ
phiến có màu nâu sẫm.

Nguyễn Vũ Duy Khanh


6

2.1.3.2 Chu trình sống của nấm Linh chi

Quả thể
Đảm

Sợi nấm song nhân

Sợi nấm đơn nhân
Đảm và bào tử đảm

Phối nhân trong
đảm

Hình 2.2: Chu trình phát triển của nấm Linh chi [5]
2.2. THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ ĐẶC TÍNH DƯỢC LÝ CỦA NẤM LINH CHI
(GANODERMA LUCIDUM)
Các phân tích của G-Bing Lin đã chứng minh các thành phần hóa dược tổng
quát của nấm Linh chi như sau : [18]
Nước:

12 – 13%

Cellulose:

54 – 56%

Lignine:

13 – 14%

Lipid:

1.9 – 2.0%

Monosaccharide:

4.5 – 5.0%

Polysaccharide:

1.0 – 1.2% (chống hoạt động khối u, tăng
sức đề kháng và hệ miễn dịch cho cơ thể)

Sterol:

0.14 – 0.16%

Protein:

0.08 – 0.12%

Thành phần khác:

K, Zn, Ca, Mn, Na, khoáng thiết yếu,
nhiều vitamin, amino acid, enzyme và
hợp chất alcaloid.

Nguyễn Vũ Duy Khanh


7

Từ những năm 1980 đến nay, bằng các phương pháp hiện đại: phổ kế UV (tử
ngoại), IR (hồng ngoại), phổ kế khối lượng - sắc ký khí (GC – MS), phổ cộng hưởng từ
hạt nhân và đặc biệt là kỹ thuật sắc ký lỏng cao áp (HPLC) cùng phổ kế plasma (ICP), đã
xác định chính xác gần 100 hoạt chất và dẫn xuất trong nấm Linh chi. [2]
Bảng 2.1: Các hoạt chất sinh học và dẫn xuất trong nấm Linh chi (Ganoderma
lucidum) [19]
Thành phần hoạt
chất
ARN
**(Không xác
định)
**
Adenosine

Beta – D - glucans

Nhóm chất
Nucleic acid
Alkaloid
Glycoprotein
Nucleotide

Polysaccharide

Hoạt tính dược lý
Kích thích hệ miễn dịch
Chống virút

Loại mô
nấm

Bào tử

Bổ tim

Quả thể

Ức chế khối u

Quả thể

Tăng sự lưu thông máu
Thư giản cơ, giảm đau
Chống khối u
Kích thích hệ miễn dịch
Giảm lượng đường huyết

Quả thể

Quả thể

Bổ tim
Chống dị ứng
Ganoderic Acids

Triterpenoid

Bảo vệ gan
Ức chế tổng hợp

Quả thể

cholesterol
Ganodermadiol
Adenosine

Beta – D -glucans

Triterpenoid
Nucleotide

Giảm huyết áp
Ức chế ACE
Tăng sự lưu thông máu
Thư giản cơ, Giảm đau
Chống khối u

Polysaccharide Kích thích hệ miễn dịch
Tăng sản suất kháng thể

Nguyễn Vũ Duy Khanh

Quả thể
Hệ sợi nấm

Hệ sợi nấm


8

Uridine, Uracil

Nucleoside

Cyclooctasulpher

Phục hồi sự dẻo dai

Hệ sợi nấm

Chống dị ứng

Hệ sợi nấm

Chống dị ứng quang phổ

Ling Zhi – 8

Protein

Ganodosterone

Steroid

Bảo vệ gan

Hệ sợi nấm

Triterpenoid

Bảo vệ gan

Hệ sợi nấm

Ganoderic Acids
Ganodermic Acid T
–O
Oleic Acid

Triterpenoid
Acid béo

Điều hoà huyết áp

Ức chế tổng hợp
cholesterol
Chống dị ứng

Hệ sợi nấm

Hệ sợi nấm
Hệ sợi nấm

Năm 2001, Masao Hattori đã ly trích được 10 triterpene mới, bao gồm lucidumol
A và B, các ganoderic acid: A, B, E, F, H, K, Y và R. Trong đó kiểu Lanostane triterpene
có thành phần chính là lipophilic. Có khoảng 130 hợp chất được ly trích từ quả thể, hệ sợi
và bào tử nấm Linh chi. Thành phần và hàm lượng triterpene phụ thuộc vào nguồn giống,
yếu tố môi trường. Vai trò của triterpene có ý nghĩa quan trọng trong phòng chống căn
bệnh HIV. [22]
Hàng loạt các nghiên cứu của Shufeng Zhou chứng minh rằng polysaccharide và
triterpene của nấm Linh chi có khả năng chữa trị bệnh viêm gan mãn tính. Ganopoly ức

chế quá trình dịch mã của ADN polymerase của virút gây bệnh HBV, ngăn chặn sự hoạt
động của virút. Ngoài ra polysaccharide và triterpene tác động hữu hiệu trong việc điều trị
bệnh đái đường loại 2 (type II diabetes mellitus) cho các bệnh nhân. [14]
Năm 1994, Lin Zhibin và Lei Lin Sheng đã xác định được trọng lượng phân tử của
Polysaccharide từ G.lucidum là khoảng 7.100 – 9.300. Những tổng kết về vai trò sinh
dược học của nhóm polysaccharide ở các loài nấm Linh chi đã được giới thiệu tại Hội
thảo Bắc Kinh với các báo cáo của các tác giả Đài Loan, Trung Quốc, Hoa kỳ.

Nguyễn Vũ Duy Khanh


9

He, Y. et al (1992) đã khảo cứu các BN3B - gồm 4 polycaccharide đồng nhất có
hoạt tính tăng miễn dịch. Trong đó BN3B1 được xác định là glucan (chỉ chứa glucose) và
BN3B3 là một arabinogalactan mang các liên kết glycoside.
Hikino, H.et al từ 1985 đến 1989 chứng minh hoạt lực hạ đường huyết của nhiều
polysaccharide. Đó là các heteroglycan có cả hoạt tính chống ung thư. Các ganoderan B
có tác dụng làm tăng mức insuline trong huyết tương, giảm sinh tổng hợp glycogen và
giảm hàm lượng glycogen trong gan. Đây chính là cơ sở trị liệu trên các bệnh nhân đái
tháo đường.
Các phức hợp polysaccharide – protein có hoạt tính chống khối u và tăng tính miễn
dịch. Năm 1994, Byong Kak Kim tiến hành lai hệ sợi nấm bằng phương pháp dung hợp
Protoplast giữa chủng G.lucidum với G.applanatum, thậm chí với cả nấm hương
(Lentinus edodes), qua đó tăng cường hoạt tính chống khối u sarcom 180 của các phức
polysaccharide – protein lên đáng kể.
Lei L.S và Lin L.B (1993) đã chứng minh tác dụng tăng sinh tổng hợp IL – 2
(Interleukine-2) và hoạt tính ADN polymerase ở chuột già tuổi bởi polysaccharide, càng
soi sáng thêm khả năng trẻ hóa, tăng tuổi thọ của các nấm Linh chi.
Những nghiên cứu về polysaccharide không tan trong nước cũng chứng tỏ hiệu lực

chống khối u rất rõ, thậm chí làm tan khối u với tỷ lệ ¾ ở các loài G.lucidum và
G.applanatum (Takashi, 1985; Liu G.T, 1993). [2]
Có lẽ đa dạng nhất và có tác dụng dược lý mạnh nhất là nhóm Saponine,
triterpenoide và các acid ganoderic. Vai trò của các chất này chủ yếu là ức chế giải phóng
histamine, ức chế Angiotensine Conversino emzyme (ACE), ức chế sinh tổng hợp
Cholesterol và hạ huyết áp. [2, 3, 19]
2.3 KHẢ NĂNG CHỮA BỆNH CỦA NẤM LINH CHI
Linh chi được dùng như một thượng dược khoảng từ 4000 năm nay ở Trung Quốc
và người ta chưa thấy tác dụng xấu hay độc tính của Linh Chi. Chúng đã được khẳng định
là nhân tố quan trọng cho nhiều loại phản ứng chống ung thư, dị ứng, lão hóa, xơ vữa,
đông máu nội mạch, giúp điều chỉnh dẫn truyền thần kinh, bảo vệ cấu trúc của nhân tế
bào.
Nguyễn Vũ Duy Khanh


10

Tài liệu cổ nhất nói tương đối cụ thể về khả năng trị liệu của nấm Linh chi cũng
của Lý Thời Trân (1595). Theo tác giả trong 6 loại Linh chi thì mỗi loại có đặc tính riêng.
Bảng 2.2: Lục bảo Linh chi và tác dụng trị liệu (Lý Thời Trân, 1590)
Tên gọi

Màu sắc

Thanh chi

Xanh

Hồng chi

Đỏ

Hoàng chi

Vàng

Bạch chi

Trắng

Hắc chi

Đen

Đặc tính dược lý
Vị chua, tính bình, không độc chủ trị sáng mắt,
bồ gan khí an thần, tăng trí nhớ.
Vị đắng, tính bình, không độc, tăng trí nhớ,
dưỡng tim, bổ trung, chữa trị tức ngực.
Vị ngọt, tính bình, không độc, an thần ích tì khí.
Vị cay, tính bình, không độc, ích phổi, thông
mũi, an thần, chữa ho nghịch.
Vị mặn, tính bình, không độc, trị chứng bí tiểu

Theo cách diễn đạt truyền thống của người phương Đông, các tác dụng lớn của
nấm Linh chi như sau: [1, 7, 8]
-

Kiện não (làm sáng suốt, minh mẫn)

-

Bảo can (bảo vệ gan)

-

Cường tâm (thêm sức cho tim)

-

Kiện vị (củng cố dạ dày và hệ tiêu hoá)

-

Cường phế (thêm sức cho phổi, hệ hô hấp)

-

Giải độc (giải tỏa trạng thái dị cảm)

-

Trường sinh (tăng tuổi thọ)

Qua phân tích các hoạt chất về mặt dược lý và sử dụng nấm Linh chi, người ta thấy
Linh chi có tác dụng với một số bệnh:
Đối với các bệnh tim mạch: Nấm Linh chi có tác dụng điều hoà, ổn định huyết áp.
Khi dùng cho người huyết áp cao, nấm Linh chi không làm tăng mà làm giảm bớt, dùng
nhiều thì huyết áp ổn định. Đối với những người suy nhược cơ thể, huyết áp thấp thì nấm
Linh chi có tác dụng nâng huyết áp lên gần mức dễ chịu nhờ cải thiện, chuyển hoá dinh

dưỡng. Đối với bệnh nhiễm mỡ, xơ mạch, dùng nấm Linh Chi có tác dụng giảm
cholesterol toàn phần, làm tăng nhóm lipoprotein tỷ trọng cao trong máu, làm giảm hệ số
sinh bệnh. Nấm Linh chi làm giảm xu thế kết bờ của tiểu cầu, giảm nồng độ mỡ trong
Nguyễn Vũ Duy Khanh


11

máu, giảm co tắc mạch, giải tỏa cơn đau thắt tim. Nhiều nghiên cứu đã phát hiện ra vai trò
của các nguyên tố khoáng vết hiếm. Vanadium (V) có tác dụng chống tích đọng
cholesterol trên thành mạch. Germanium giúp lưu thông khí huyết, tăng cường vận
chuyển oxy vào mô. Hiện nay, chỉ số Ge trong các dược phẩm Linh chi được xem như là
một chỉ tiêu quan trọng, có giá trị trong điều trị tim mạch và giảm đau trong trị liệu ung
thư. [2, 3]
Đối với các bệnh về hô hấp: nấm Linh Chi đem lại kết quả tốt, nhất là với những
ca điều trị viêm phế quản dị ứng, hen phế quản tới 80% có tác dụng giảm và làm nhẹ bệnh
theo hướng khỏi hẳn.[7, 8]
Hiệu quả chống ung thư: Bằng việc kết hợp các phương pháp xạ trị, hoá trị, giải
phẫu với trị liệu nấm trên các bệnh nhân ung thư phổi, ung thư vú và ung thư dạ dày có
thể kéo dài thời gian sống trên 5 năm cao hơn nhóm không dùng nấm. Nhiều thông tin ở
Đài Loan cho biết nếu dùng nấm Linh chi trồng trên gỗ long não điều trị cho các bệnh
nhân ung thư cổ tử cung đạt kết quả tốt - khối u tiêu biến hoàn toàn. Các nhà khoa học ở
Đại học Haifa, Israel khẳng định nấm linh chi - một loài nấm dại thường dùng trong Đông
Y ở Trung Quốc (và Việt Nam) - có thể chữa ung thư tuyến tiền liệt. Ung thư tiền liệt
tuyến là một trong những dạng ung thư phổ biến nhất ở đàn ông, với hơn 543.000 người
được chẩn đoán mỗi năm trên toàn thế giới.
Khả năng kháng HIV: Để khảo sát khả năng kháng HIV của các hợp chất trong
nấm Ganoderma lucidum, người ta đã sử dụng dịch chiết từ quả thể trong thử nghiệm
kháng virút HIV – 1 trên các tế bào lympho T ở người. Sự nhân lên của virút được xác
định qua hoạt động phiên mã ngược trên bề mặt các tế bào lympho T đã được gây nhiễm

HIV – 1. Kết quả cho thấy có sự ức chế mạnh mẽ hoạt động sinh sản của loại virút này
(Gau J.P, 1990; Kim, 1996). Do đó, nhiều quốc gia đã đưa Linh chi vào phác đồ điều trị
tạm thời, nhằm tăng cường khả năng miễn dịch và nâng đỡ thể trạng cho các bệnh nhân
trong khi AZT, DDI, DDC, còn hiếm và rất đắt. Các nghiên cứu tại Nhật Bản đã chứng
minh các hoạt chất từ nấm Linh chi có tác dụng như sau: (Masao Hattori, 2001)
 Ganoderiol F và ganodermanontirol có hoạt tính chống HIV – 1

Nguyễn Vũ Duy Khanh


12
 Ganoderderic acid B và lucidumol B có tác động ức chế hữu hiệu protease

HIV – 1
 Ganodermanondiol và lucidumol A ức chế phát triển tế bào Meth – A

(mouse sarcoma) và LLC (mouse lung carcinoma).
Ngoài ra các ganoderma alcohol là lanostane triterpene với nhóm hydroxol (-OH)
ở vị trí C25 có khả năng chống HIV – 1, Meth – A và LLC ở chuột. [2, 22]
Khả năng antioxydant: Nhiều thực nghiệm chỉ ra vai trò của các saponine và
triterpenoid, mà trong đó Ganoderic acid được coi là hiệu quả nhất (Wang C.H, 1985).
Những nghiên cứu gần đây đang đẩy mạnh theo hướng làm giàu Selenium - một yếu tố
khoáng có hoạt tính antioxydant rất mạnh – vào nấm Linh chi. Chính vì vậy con người có
thể chờ đợi vào một dược phẩm tăng tuổi thọ, trẻ hoá từ nấm Linh chi nói chung và Linh
chi Việt Nam nói riêng. [2]
Các hoạt chất sinh học trong nấm Linh chi có khả năng khử một số gốc tự do trong
cơ chế chống não hóa, chống ung thư. Bảo vệ và chống ảnh hưởng của các tia chiếu xạ.
Linh chi cũng có tác dụng giúp cơ thể thải loại nhanh các chất độc, kể cả các kim loại
năng như: Chì, Germanium.
2.4 MỘT SỐ ỨNG DỤNG LÂM SÀN

Trị suy nhược thần kinh: Bệnh viện Hoa sơn thuộc Viện Y học số 1 Thượng hải
báo cáo: Dùng cả 2 loại Linh chi nhân tạo và Linh chi hoang dại chế thành viên ( mỗi viên
tương đương 1g thuốc sống), mỗi lần uống 3 viên, ngày 3 lần, một liệu trình từ 10 ngày
đến 2 tháng. Trị 225 ca, tỷ lệ kết quả 83,5 - 86,3%, nhận xét thuốc có tác dụng an thần,
điều tiết thần kinh thực vật và tăng cường thể lực ( theo báo Tân y học, số phụ chuyên đề
về bệnh hệ thống thần kinh 1976,3:140).
Trị chứng cholesterol máu cao: Báo cáo của Sở nghiên cứu kháng khuẩn tố công
nghiệp Tứ xuyên, dùng liên tục từ 1 đến 3 tháng cho 120 ca thuốc có tác dụng hạ
cholesterol huyết thanh rõ rệt, tỷ lệ kết quả 86% ( theo báo cáo đăng trên báo thông tin
Trung thảo dược 1973,1:31).
Trị viêm phế quản mạn tính: Tổ nghiên cứu Linh chi tỉnh Quảng đông báo cáo
dùng siro Linh chi và đường Linh chi, trị 1.110 ca có kết quả và có nhận xét là thuốc có
Nguyễn Vũ Duy Khanh


13

tác dụng đối với thể hen và thể hư hàn ( theo tờ báo cáo tư liệu Y dược Quảng đông
1979,1:1).
Trị viêm gan mạn tính: Tác giả dùng polysaccarit Linh chi chiết xuất từ Linh chi
hoang dại chế thành thuốc bột hòa nước uống, trị các loại bệnh viêm gan mạn hoạt động,
viêm gan mạn kéo dài và xơ gan gồm 367 ca, có nhận xét phần lớn triệu chứng chủ quan
được cải thiện, men SGOT, SGPT giảm tỷ lệ 67,7% ( Tạp chí Bệnh gan mật 1985,4:242).
Trị chứng giảm bạch cầu: dùng polysaccarit chế thành viên (mỗi viên có 250mg
thuốc sống) cho uống, theo dõi 165 ca, ghi nhận tỷ lệ có kết quả 72,57% ( Báo cáo của
Lưu chí Phương đăng trên tạp chí Trung hoa huyết dịch bệnh 1985,7:428).
Trị bệnh xơ cứng bì, viêm da cơ, bệnh liput ban đỏ, ban trọc: dùng Linh chi chế
thành dịch, tiêm bắp và viên uống. Trị xơ cứng bì 173 ca, tỷ lệ kết quả 79,1%, viêm da cơ
43 ca, có kết quả 95%, Liput ban đỏ 84 ca có kết quả 90%, ban trọc 232 ca, có kết quả
78,88% ( Thông tin nghiên cứu Y học 1984,12:22).

Theo sách Trung dược ứng dụng lâm sàng: thuốc có tác dụng đối với bệnh loét
bao tử, rối lọan tiêu hóa kéo dài, thường dùng phối hợp với Ngũ bội tử, Đảng sâm, Bạch
truật, Trần bì, Kê nội kim, Sa nhân, Sinh khương.
Trị xơ cứng mạch, cao huyết áp, tai biến mạch não: thường phối hợp với Kê
huyết đằng, Thạch xương bồ, Đơn bì, Cẩu tích, Đỗ trọng, Thỏ ty tử, Hoàng tinh. Thuốc
còn dùng chữa bệnh động mạch vành, đau thắt ngực.
Dùng giải độc các loại khuẩn: phối hợp với Cam thảo, Gừng, Táo.
Ngoài ra sách Những cây thuốc và vị thuốc Việt nam của Đỗ tất Lợi có ghi: Thuốc
chữa bệnh phụ nữ thời kỳ mãn kinh, giúp thông minh và trí nhớ, dùng lâu ngày giúp cho
nhẹ người, tăng tuổi thọ. Nhiều người mua nấm Linh chi về nấu canh, nấu súp làm món
ăn cao cấp.
2.5 GIỚI THIỆU SƠ LƯỢC VỀ HOẠT CHẤT CÓ TRONG NẤM LINH CHI
2.5.1 Ganoderma polysaccharide (GLPs) [15, 16]
Có trên 200 loại polysaccharide được ly trích và thu nhận từ nấm Linh chi nhưng
polysaccharid gồm 2 loại chính:
GL-A: Gal: Glu: Rham: Xyl (3,2: 2,7: 1,8; 1,0)
Nguyễn Vũ Duy Khanh

M= 23.000 Da


14

GL-B: Glu: Rham: Xyl (6,8: 2,0: 1,0)

M= 25.000 Da

GL-A có thành phần chính là Gal, nên gọi là Galactan, còn GL-B có thành phần
chính là Glu, nên gọi là Glucan.
b (1-3) -D-glucan, khi phức hợp với một protein, có tác dụng chống ung thư rõ rệt

(Kishida & al., 1988).
. Hầu hết các GLPs hình thành từ 3 chuỗi monosaccharide, có cấu trúc xoắn ốc 3
chiều, giống cấu trúc của ADN và ARN. Cấu trúc xoắn này tựa trên khung sườn cacbon,
lượng khung sườn từ 100,000 – 1000,000, đa số chúng tồn tại phía trong vách tế bào
(CWM). Một phần polysaccharide phân tử nhỏ không tan trong cồn cao độ, nhưng tan
trong nước nóng.
Ngoài polysaccharide từ quả thể, polysaccharide cũng được thu nhận từ quá trình nuôi
cấy trong môi trường dịch lỏng và rắn, chúng vẫn có hoạt tính sinh học trong việc chữa
trị.
Polysaccharid có nguồn gốc từ Linh chi dùng điều trị ung thư đã được công nhận
sáng chế (patent) ở Nhật. Năm 1976, Cty Kureha Chemical Industry sản xuất chế phẩm
trích từ Linh Chi có tác dụng kháng carcinogen. Năm 1982, Cty Teikoko Chemical
Industry sản xuất sản phẩm từ Linh Chi có gốc glucoprotein làm chất ức chế neoplasm.
Bằng sáng chế Mỹ 4051314, do Ohtsuka & al. (1977), sản xuất từ Linh Chi chất
mucopolysaccharid dùng chống ung thư.
2.5.2 Ganoderic Acid
Ganoderic acid được định hướng là một cyclopropene hoặc cyclopentene. Hàm
lượng G.acid thay đổi theo giống Linh chi, môi trường nuôi trồng, giai đoạn bào tử
ganodermal. Chính sự thay đổi này làm cho mức độ đắng bị ảnh hưởng. Hàm lượng
G.acid cao thì có nhiều vị đắng. [18, 19]
Triterpenoid là những hợp chất được tổng hợp từ 6 đơn vị isopren. Các triterpen có
bộ khung chính từ 27 – 30 nguyên tử carbon (C38H48) rất thường gặp trong thực vật. Các
triterpenoid tồn tại dưới dạng tự do (không có phần đường), có cấu trúc vòng, mang một
số nhóm chức như: -OH; -Oac; eter -O-; Carbanil C=O; nối đôi C=C. Đặc tính chung là
có tính thân dầu (tan tốt trong eter dầu hỏa, hexan, eter ethyl, cloroform), ít tan trong nước
ngoại trừ khi chúng kết hợp với đường để tạo thành glycosid. [10, 11]
Nguyễn Vũ Duy Khanh


15

Bảng 2.3: Các hoạt chất triterpenoid có tác dụng chữa bệnh trong nấm
Linh chi (Ganoderma lucidum) (Lê Xuân Thám, 1996)
Hoạt chất

Hoạt tính

Ganoderic acid R,S

Ức chế giải phóng histamin

Ganoderic acid B, D, F, H, K, S, Y

Hạ huyết áp

Ganodermaldiol

Hạ huyết áp

Ganodermic acid Mf

Ức chế tổng hợp cholesterol

Ganodermic acid T.O

Ức chế tổng hợp cholesterol

Ganodermic acid

Ức chế tổng hợp cholesterol

Triterpenoid đặc biệt là acid ganoderic có tác dụng chống dị ứng, ức chế sự giải
phóng histamin, tăng cường sử dụng oxy và cải thiện chức năng gan. Hiện nay, đã tìm
thấy trên 80 dẫn xuất từ acid ganoderic. Trong đó ganodosteron được xem là chất kích
thích hoạt động của gan và bảo vệ gan.
2.5.3 Ganoderma Adenosine [18, 19]
Adenosine thuộc nhóm purine và là thành phần chính trong cấu trúc nucleic acid.
Nấm Linh chi có nhiều dẫn xuất adenosine, tất cả chúng đều có hoạt tính dược liệu mạnh.
Chức năng của adenosine:
 Giảm độ nhớt máu
 Ức chế kết dính tiểu cầu
 Ngăn chặn hình thành cục nghẽn
 Tăng lượng lipoprotein 2 – 3 phosphricglycerin
 Gia tăng khả năng vận chuyển oxygen, tăng lượng máu cung cấp cho não

 Lọc máu và tăng tuần hoàn máu trong cơ thể
2.5.4 Alcaloid [10, 11]
Alcaloid là những hợp chất hữu cơ có chứa nitơ, đa số có nhân dị vòng, có phản
ứng kiềm, chúng có cấu trúc hóa học và hoạt tính sinh học rất đa dạng.
Nguyễn Vũ Duy Khanh


16

Các alcaloid ở dạng tự do hầu như không tan trong nước, thường tan trong dung
môi hữu cơ: cloroform, eter diethyl, alcol bậc thấp. Các muối của alcaloid thì tan trong
nước, alcol và hầu như không tan trong dung môi hữu cơ như: cloroform, eter, benzen.
Chính vì thế, tính hòa tan của các alcaloid đóng vai trò quan trọng trong việc ly trích
alcaloid ra khỏi nguyên liệu và trong kỹ nghệ dược phẩm điều chế dạng thuốc để uống.
Alcaloid là những chất có hoạt tính sinh học, nhiều ứng dụng trong ngành y dược

và nhiều chất rất độc. Các alcaloid có tác dụng rất khác nhau phụ thuộc vào cấu trúc của
alcaloid.
 Tác dụng lên hệ thần kinh
 Tác dụng lên huyết áp
 Tác dụng trị ung thư
2.5.5 Hợp chất Saponin [21, 23]
Saponin là một loại glycosid, có cấu trúc gồm hai phần: phần đường gọi là glycon
và phần không đường gọi là aglycon.
- Saponin triterpenoid: Phần aglycon của saponin triterpenoid có 30 cacbon, cấu
tạo bởi 6 đơn vị hemiterpen và chia làm 2 nhóm:
Saponin triterpenoid pentacyclic: phần aglycon của nhóm này có cấu trúc
gồm 5 vòng và phân ra thành các nhóm nhỏ: olean, ursan, lupan, hopan.
Phần lớn các saponin triterpenoid trong tự nhiên đều thuộc nhóm olean.
Saponin triterpenoid tetracyclic: phần aglycon có cấu trúc 4 vòng và phân
thành 3 nhóm chính: dammanran, lanostan, cucurbitan.
- Saponin steroid: Gồm các nhóm chính: spirostan, furostan, aminofurostan,
spiroalan, solanidan.
Hợp chất Saponin có nhiều công dụng trong y học như:
 Trị long đờm, chữa ho
 Là chất phụ gia trong một số vắc xin
 Tác dụng thông tiểu
 Tác dụng kháng viêm, chống khối u
2.5.6 Germanium hữu cơ [18, 19]
Nguyễn Vũ Duy Khanh


17

Gemanium là nguyên tố hiếm, do nhà khoa học người Đức khám phá vào năm
1885. Germanium có thể cung cấp một lượng lớn oxygen và thay thế chức năng của

oxygen. Nó kích thích khả năng vận chuyển oxygen tuần hoàn máu trong cơ thể lên đến
1,5 lần. Vì thế, làm tăng mức độ trao đổi chất và ngăn chặn quá trình lão hóa.
Cơ thể con người là thành phần của các electron. Khi mức năng lượng tăng hoặc
giảm thấp, dẫn đến sự xáo trộn cân bằng và biểu lộ tình trạng bệnh lý. Gemanium hữu cơ
sẽ duy trì mức năng lượng một cách bình thường trong cơ thể và bảo vệ sức khoẻ. Khi tế
bào ung thư xuất hiện, chúng làm xáo trộn quá trình trao đổi chất. Gemanium sẽ điều hoà
và kiểm soát quá trình này, từ đó ngăn chặn tế bào ung thư phát triển.
Chức năng của Germanium:
 Tăng cường khả năng mang oxygen và giảm nguy cơ xuất hiện ung thư
 Giảm nguy hiểm từ kết quả trị liệu phóng xạ
 Ngăn chặn bệnh thiếu máu cục bộ

Phần 3: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
THÍ NGHIỆM
3.1 THỜI GIAN VÀ ĐỊA ĐIỂM LÀM THÍ NGHIỆM
Nguyễn Vũ Duy Khanh


18

Đề tài được thực hiện từ 27/09/2008 đến 1/1/2009 tại Trường Cao đẳng Kinh tế –
Công nghệ TP. Hồ Chí Minh
3.2 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU
Nấm Linh chi (Ganoderma lucidum)
3.3 VẬT LIÊU THÍ NGHIỆM
3.3.1 Thiết bị
Cân phân tích
Kính hiển vi
Máy chụp ảnh kỹ thuật số
Tủ cấy vô trùng

Nồi hấp thanh trùng
Tủ sấy
3.3.2 Hóa chất
Các hóa chất bao gồm: MgSO4, KH2PO4, Glucose, Agar.
3.3.3 Môi trường sử dụng
3.3.3.1 Môi trường dinh dưỡng
Môi trường PGA (Potato glucose agar)
Khoai tây:
200 (g)
Glucose:
20 (g)
Agar:
20 (g)
Nước cất vừa đủ:
1000 (ml)
Các môi trường đều được khử trùng ở 1210C trong 15 phút.
3.3.3.2 Môi trường nhân giống
Chọn loại lúa gạo tốt, nấu cho lúa vừa nứt nanh, vớt ra để ráo, sau đó phối trộn với
cám bắp.
3.4 PHƯƠNG PHÁP THÍ NGHIỆM
3.4.1 Quan sát hình thái quả thể nấm Ganoderma lucidum
3.4.1.1 Hình thái quả thể
3.4.1.2 Phương pháp quan sát hệ sợi nấm [9]
 Lấy một ít sợi nấm dàn đều vào 1 giọt nước có trên lam kính

Nguyễn Vũ Duy Khanh


19
 Cố định sợi nấm trên lam kính bằng cách hơ nhẹ mặt dưới lam kính qua lại

trên ngọn lửa đèn cồn
 Nhuộm bằng dung dịch fuchsin trong 5 – 10 phút
 Rửa thuốc nhuộm bằng cồn 95%
 Rửa ngay với nước cất để chấm dứt công đoạn tẩy màu
 Quan sát mẫu vật dưới vật kính x100
3.4.1.3 Phương pháp quan sát bào tử nấm Linh chi [13, 17]


Lấy quả thể nấm Linh chi trong giai đoạn phóng thích bào tử, đặt lên

1 tờ giấy trắng để thu bào tử
 Dùng khuyên cấy lấy ít bào tử rồi dàn đều vào 1 giọt nước trên lam kính

 Cố định bào tử trên lam kính bằng cách hơ nhẹ mặt dưới của lam kính
qua ngọn lửa đèn cồn đến khô
 Quan sát bào tử nấm dưới vật kính x100

3.4.2 Khảo sát sinh trưởng hệ sợi nấm Linh chi trên các môi trường lỏng
Cách tiến hành thí nghiệm: Các môi trường đều được pha với nồng đô như sau, sau
đó môi trường đều hấp khử trùng ở 121oC/15 phút. Sau 9 ngày ta thu sinh khối và sấy ở
nhiệt độ 500C. Sau đó tiến hành cân trọng lượng khô
Tổng số chai cấy: 52 chai
3.4.2.1 Ảnh hưởng của hàm lượng MgSO 4 đến tốc độ tăng sinh khối trong môi
trường lỏng
Thí nghiệm được bố trí 4 nghiệm thức, mỗi nghiệm thức 4 chai, mỗi chai chứa
20ml môi trường
Nghiệm thức
Môi trường nuôi cấy
1

PG + 1 g/l MgSO4
2
PG + 2 g/l MgSO4
3
PG + 3 g/l MgSO4
4
PG + 4 g/l MgSO4
3.4.2.2 Ảnh hưởng của hàm lượng KH2PO4 đến tốc độ tăng sinh khối trong môi
trường lỏng
Thí nghiệm được bố trí 4 nghiệm thức, mỗi nghiệm thức 4 chai, mỗi chai chứa
20ml môi trường
Nguyễn Vũ Duy Khanh


20

Nghiệm thức
1
2
3
4

Môi trường nuôi cấy
PG + 0,5 g/l KH2PO4
PG + 1g /l KH2PO4
PG + 1,5 g/l KH2PO4
PG + 2 g/l KH2PO4

3.4.2.3 Ảnh hưởng của hàm lượng Glucose đến tốc độ tăng sinh khối trong môi
trường lỏng

Thí nghiệm được bố trí 5 nghiệm thức, mỗi nghiệm thức 4 chai, mỗi chai chứa
20ml môi trường
Nghiệm thức
1
2
3
4
5

Môi trường nuôi cấy
P + 10 g/l Glucose
P + 15 g/l Glucose
P + 20 g/l Glucose
P + 25 g/l Glucose
P + 30 g/l Glucose

3.4.3 Khảo sát sự ảnh hưởng của pH lên môi trường nuôi cấy
PH ảnh hưởng rất lớn đến tốc độ tăng trưởng của sợi nấm trong môi trường lỏng. Ở
các giá trị pH khác nhau thì tốc độ sinh trưởng của sợi nấm khác nhau. Điều này dẫn đến
lượng sinh khối thu được sẽ phụ thuộc vào giá trị pH. Do đó, trong thí nghiệm này chúng
tôi tiến hành khảo sát ảnh hưởng của pH đến tốc độ sinh trưởng và phát triển của sợi nấm
Linh chi để tìm được giá trị pH thích hơp cho moi trường lỏng
Cách tiến hành: pha môi trường lỏng PG (potato glucose) với nồng độ pH khác
nhau và đổ vào chai thuỷ tinh 100ml một lượng môi trường 20 ml. Môi trường được hấp
khử trùng ở 121oC/15 phút, để nguội và cấy một lượng giống nhất định vào (mỗi lần cấy
gắp 1 hạt lúa), ủ ở nhiệt độ phòng. Tiến hành thu nhận sinh khối sau 9 ngày. Sinh khối
được sấy đến khô ở nhiệt độ 50oC và tiến hành cân trọng lượng khô.
Thí nghiệm được thực hiện với 7 nghiệm thức, mỗi nghiệm thức 2 chai. Vậy tổng
số chai cấy là 14 chai
3.4.4 Nghiên cứu đường cong sinh trưởng của Ganoderma lucidum

Chúng tôi khảo sát sự tích lũy sinh khối sợi nấm Linh chi trên môi trường lỏng PG

Nguyễn Vũ Duy Khanh


21

Cách tiến hành: pha môi trường và đổ vào chai thuỷ tinh 0,5 lít một lượng môi trường 20
ml. Hấp khử trùng ở 121oC/15 phút, để nguội và cấy một lượng giống nhất định vào (mỗi
lần cấy gắp 1 hạt lúa), ủ ở nhiệt độ phòng. Tiến hành thu nhận sinh khối ở các ngày 3, 6,
9, 12, 15, 21. Sinh khối được sấy đến khô ở nhiệt độ 50 oC và tiến hành cân trọng lượng
khô.
Trong quá trình thí nghiệm, gồm 5 nghiệm thức, mỗi nghiệm thức gồm 2 chai.
Tổng số chai cấy là 10 chai.
3.5. PHƯƠNG PHÁP QUY HOẠCH THỰC NGHIỆM
3.5.1. Mục đích
Tìm điều kiện tối ưu để thực hiện các quá trình hoặc chọn lựa thành phần tối ưu
của nhiều phần tử trong quá trình nuôi cấy vi sinh vật. Phương pháp quy hoạch thực
nghiệm nhiều yếu tố cho phép thay đổi đồng thời nhiều yếu tố và xác định được tương tác
giữa các yếu tố, nhờ đó giảm bớt số thí nghiệm.
3.5.2. Phương pháp xử lý số liệu
Phương trình hồi quy được xây dựng từ các kết quả thực nghiệm. Các hệ số trong
phương trình hồi quy mô tả ảnh hưởng của các yếu tố nghiên cứu đến mật độ tế bào. Ảnh
hưởng của các yếu tố được đánh giá dựa trên xác xuất tin cậy hay mức ý nghĩa p của
chúng.
Ảnh hưởng được coi là rất lớn khi p ≤ 0,0001, ảnh hưởng là đáng kể khi 0,0001 <
p ≤ 0,05 và không đáng kể khi p > 0,05.
Chỉ có những hệ số biểu diễn ảnh hưởng rất lớn và đáng kể mới được giữ lại trong
phương trình hồi qui cuối cùng. Khi ảnh hưởng của các yếu tố hay ảnh hưởng tương hổ
giữa các yếu tố là đáng kể thì hệ số biểu diễn ảnh hưởng của các yếu tố đó luôn được giữ

lại trong phương trình.
Phương trình hồi quy
Yi = b0 +b1 x1 + b2 x2 + b3 x3 + b12 x1 x2 + b13 x1 x3 + b23 x2 x3 + b123 x1 x2 x3
Trong đó
 Yi: Sinh khối nấm thu được (g/l)

Nguyễn Vũ Duy Khanh


22
 xi (i= 1 – k): là các yếu tố ảnh hưởng, mỗi yếu tố có hai mức là hai giới hạn

biên của nó.
 bo, bi, bj, bij: là các hệ số trong phương trình hồi quy

Để đơn giản trong tính toán, chuyển từ hệ trục tự nhiên sang hệ trục không thứ
nguyên (hệ mã hoá). Xét yếu tố được kí hiệu là Zi
Zio = ( Zi max + Zimin)/2
+ Zimax: mức cao

Với:

+ Zimin: mức thấp
+ Zio: mức cơ sở
 Điểm có tọa độ (Z1o, Z2o, Z3o,…Zko) gọi là tâm của phương án

 Việc mã hoá được thực hiện dễ dàng nhờ chọn tâm của miền được nghiên cứu
làm gốc tọa độ.
 Phương pháp xử lý số liệu từ các kết quả thực nghiệm. Các hệ số trong phương

trình mô tả ảnh hưởng của các yếu tố nghiên cứu đến khả năng tăng sinh khối.
Phương trình hồi quy
Y = b0 +b1 x1 + b2 x2 + b3 x3 + b1b2 x1 x2 + b1b3 x1 x3 + b2b3 x2 x3 + b1b2b3 x1 x2 x3
Với
+ Y: sinh khối (g/l)
+ b0, b1, b2, b3, b12, b13, b23, b123 : các hệ số trong phương trình hồi quy
+ x1 : nồng độ MgSO4 (g/l)
+ x2 : nồng độ KH2PO4 (g/l)
+ x3 : nồng độ Glucose (g/l)
Bảng 3.1: Các yếu tố thí nghiệm
Các mức
Mức cơ sở
Khoảng biến thiên
Mức trên
Mức dưới
Nguyễn Vũ Duy Khanh

Các yếu tố (g/l)
x1

x2

x3


23

Bảng 3.2: Bố trí thí nghiệm
Số TN
1

2
3
4
5
6
7
8

x1

x2

x3

+
+
+
+
-

+
+
+
+
-

+
+
+
+

-

y1

y2

y3

Ytb

3.6 XÁC ĐỊNH DƯỢC CHẤT CÓ TRONG NÂM LINH CHI
3.6.1 Phương pháp định tính alcaloid [11]
3.6.1.1 Chuẩn bị dịch thử
Để phát hiện sự hiện diện của alcaloid trong dược liệu người ta thường áp dụng
nguyên tắc thử của Webb với cách thử gồm 2 phần như sau:
- Phần 1: Bột nấm Linh Chi xay nhuyễn (10 – 20 gam) và dung dịch nước 1%
H2SO4 được cho vào erlen, đun nhẹ trong 1 giờ. Lọc và lấy dịch lọc để thử nghiệm với cả
2 loại thuốc thử: Mayer, Dragendorff.
Quan sát kết tủa, nếu có kết tủa theo qui định là dương tính. Tuy nhiên, nếu không
có kết tủa, chưa thể kết luận là không có alcaloid mà phải tiếp tục thử nghiệm phần 2.
- Phần 2: Bột xay nhuyễn (10 – 20 gam) ngâm trong dung dịch prollius là hổn hợp
gồm: chloroform:ethanol 95o:NH4OH đậm đặc, theo tỷ lệ là 8:8:1 (môi trường phải có tính
baz). Ngâm nguội trong 24 giờ, ở nhiệt độ phòng, thỉnh thoảng lắc trộn. Lọc và đuổi dung
môi đến cạn, thu được cặn. Hòa tan cặn trong dung dịch HCl 1% đun ấm cho dễ tan. Lọc
và lấy dịch lọc để thử nghiệm với 2 loại thuốc thử: Mayer, Dragendorff.
3.6.1.2 Thuốc thử định tính alcaloid

- Thuốc thử Mayer: Hòa tan 1,36 gam HgCl2 trong 60 ml nước cất và 5 gam KI
trong 10 ml nước cất. Thu hỗn hợp 2 dung dịch này lại và thêm nước cất cho đủ 100 ml.

Nguyễn Vũ Duy Khanh


24

Nhỏ vài giọt thuốc thử Mayer vào dung dịch acid loãng có chứa alcaloid, nếu có
alcaloid sẽ xuất hiện tủa màu trắng hoặc vàng nhạt. Cần lưu ý vì tủa tạo thành có thể hòa
tan trở lại trong lượng thừa thuốc thử hoặc hòa tan bởi ethanol có sẵn trong dung dịch thử.
- Thuốc thử Dragendorff: Hòa tan 8 gam Nitrat bismuth Bi(NO3)3 trong 25 ml
HNO3 30% (D=1,18). Hòa tan 28 gam KI và 1 ml HCl 6N trong 5 ml nước cất. Hỗn hợp 2
dung dịch này lại để yên trong tủ lạnh 5oC sẽ thấy tủa màu sậm xuất hiện và tan trở lại,
lọc và thêm nước cho đủ 100 ml. Dung dịch màu cam – đỏ được chứa trong chai màu nâu
để che sáng, cất trong tủ lạnh, có thể giữ lâu vài tuần.
Nhỏ vài giọt thuốc thử Dragendorff vào dung dịch acid loãng có chứa alcaloid, nếu
có alcaloid sẽ xuất hiện tủa màu cam – nâu.
3.6.2 Phương pháp xác định hợp chất saponin [11]
Chiết 10 gam dược liệu với cồn 70% bằng cách ngâm trong 24 giờ rồi lọc. Cô dịch
lọc bốc hơi đến cắn khô. Dùng cắn để làm các phản ứng định tính.
3.6.2.1 Thử nghiệm tính tạo bọt
Một đặc tính quan trọng của saponin là tính tạo bọt, nên đây là một trong những
phương pháp chính xác để định tính sự hiện diện của saponin.
Cách tiến hành: Hòa tan một lượng cắn tương ứng với 1 gam dược liệu vào 5 ml
nước nóng. Lọc vào một ống nghiệm 1,6 – 16 cm và để nguội, thêm nước cho đủ 10 ml,
dùng ngón tay cái bịt miệng ống nghiệm và lắc mạnh theo chiều dọc ống nghiệm trong 1
phút (khoảng 30 lần lắc). Để yên ống nghiệm, quan sát lớp bọt và đánh giá kết quả:
Bọt bền trong 15 phút:

+

Bọt bền trong 30 phút:

++

Bọt bền trong 60 phút:

+++

3.6.1.2 Thử nghiệm Fontan – Kaudel
Lấy một lượng cắn tương ứng với 1 gam bột dược liệu, đun nóng nhẹ trên cách
thủy để hòa tan với 10 ml nước. Chia đều vào 2 ống nghiệm.
Ống 1: thêm 2 ml HCl 0.1N (pH =1)
Ống 2: thêm 2 ml NaOH 0.1N (pH =13)
Bịt miệng ống nghiệm và lắc mạnh theo chiều dọc cả 2 ống trong 1 phút và để yên,
quan sát các cột bong bóng trong cả 2 ống nghiệm.
Nguyễn Vũ Duy Khanh


25

 Nếu cột bọt trong cả 2 ống cao ngang nhau và bền như nhau, thì sơ bộ
xác định là có saponin triterpenoid.
 Nếu ống pH = 13 có cột bọt cao hơn nhiều so với ống pH = 1, sơ bộ xác

định là có saponin steroid.
3.6.3 Định tính triterpenoid (bằng phản ứng Liebermann – Burchard)
Chiết 10 – 20 gam bột dược liệu bằng diethylether lắc trong bình nón, trong 10 –
20 phút, chiết cho tới khi dịch ether sau khi bốc hơi không còn để lại lớp cắn mờ trên mặt
kính đồng hồ, gộp các dịch chiết, lọc và cô lại đến khi còn khoảng 50 ml dịch chiết ether.
Lấy 5 ml dịch chiết ether cho vào chén sứ, bốc hới tới cắn. Hòa tan cắn với 0,5 ml
anhydrid acetic, rồi thêm vào dung dịch 0,5 ml chloroform. Chuyển dung dịch vào 1 ống

nghiệm nhỏ khô, dùng pipet pasteur thêm cẩn thận 1 – 2 ml H2SO4 đậm đặc lên thành ống
nghiệm để nghiên cho acid chảy xuống đáy ống nghiệm. Nơi tiếp xúc giữa 2 lớp dung
dịch có màu đỏ nâu hay đỏ đến tím, lớp phía dung dịch trên dần dần chuyển thành màu
xanh lục hay tím. Kết luận có triterpenoid
3.6.4 Định tính acid hữu cơ
Lấy 2 ml dịch chiết nước cho vào một ống nghiệm. Thêm vào dung dịch một ít tinh
thể natri Na2CO3. Nếu có các bọt khí nhỏ sủi lên từ các tinh thể Na2CO3 thì kết luận là có
acid hữu cơ.
3.7 ĐỊNH LƯỢNG POLYSACCHARIDE (GLPs) [15, 16]
Polysaccharide có nhiều dạng và nhiều qui trình chiết khác nhau. Chiết GLPs ở
100oC trong 16 giờ, cho năng suất ly trích cao, nhưng làm biến đổi cấu trúc sinh học các
polysaccharides có trong nấm Linh chi. Một qui trình thứ hai được ứng dụng rộng rãi để
chiết các GLPs ở nhiệt độ thấp, nhằm ổn định cấu trúc sinh học của các GLPs.

Nguyễn Vũ Duy Khanh