Ứng dụng kỹ thuật multiplex Pcr để phát hiện các gen độc lực của vi khuẩn escherichia coli phân lập từ phân bò, phân heo tiêu chảy và thịt bò

1
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC
************

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
ỨNG DỤNG KỸ THUẬT MULTIPLEX - PCR ĐỂ PHÁT HIỆN CÁC GEN ĐỘC LỰC
CỦA VI KHUẨN
ESCHERICHIA COLI PHÂN LẬP TỪ
PHÂN BÒ, PHÂN HEO TIÊU CHẢY
VÀ THỊT BÒ

Ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC
Niên khóa :
Sinh viên thực hiện : ĐOÀN THỊ TUYẾT LÊ

Thành phố Hồ Chí Minh
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC
************


2

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
ỨNG DỤNG KỸ THUẬT MULTIPLEX - PCR ĐỂ PHÁT HIỆN CÁC GEN ĐỘC LỰC
CỦA VI KHUẨN
ESCHERICHIA COLI PHÂN LẬP TỪ
PHÂN BÒ, PHÂN HEO TIÊU CHẢY

VÀ THỊT BÒ

Giáo viên hướng dẫn:
PGS. TS. NGUYỄN NGỌC TUÂN
BSTY. BÙI THỊ THU TRANG

Thành phố Hồ Chí Minh

Sinh viên thực hiện:
ĐOÀN THỊ TUYẾT LÊ


3

LỜI CẢM TẠ
Tôi xin chân thành gởi lời cảm tạ với tấm lòng biết ơn sâu sắc đến:
* Gia đình đã tạo cho tôi chỗ dựa vững chắc về vật chất lẫn tinh thần. Ba mẹ đã
luôn sát cánh bên tôi, nuôi dưỡng chăm sóc tôi nên người, động viên tôi học tập.
* Ban Giám hiệu trường Đại học Nông Lâm thành phố Hố Chí Minh, Ban chủ
nhiệm Bộ Môn Công Nghệ Sinh Học, cùng tất cả quý thầy cô đã truyền đạt kiết thức
cho tôi trong suốt quá trình học tại trường.
* PGS. TS. Nguyễn Ngọc Tuân đã hết lòng giúp đỡ, hướng dẫn cùng những hỗ
trợ rất thiết thực cho tôi trong suốt quá trình thực hiện đề tài, giúp tôi hoàn thành tốt
khóa luận tốt nghiệp cũng như nâng cao kiến thức.
* BSTY. Bùi Thị Thu Trang đã nhiệt tình hướng dẫn, động viên và giúp đỡ tôi
hoàn thành tốt khóa luận này.
* Quý thầy cô, cán bộ công chức tại Trung Tâm Phân Tích Thí Nghiệm Hóa
sinh Trường Đại học Nông Lâm TP. HCM.
* BSTY. Lê Hữu Ngọc, phòng thực hành Kiểm nghiệm Thú sản và Môi trường,
Khoa CNTY Trường Đại học Nông Lâm TP. HCM.

* Các bạn bè thân yêu của lớp CNSH K27 đã chia sẻ cùng tôi những vui buồn
trong thời gian học cũng như hết lòng hỗ trợ, giúp đỡ tôi trong thời gian thực tập.
Chân thành cảm ơn
Đoàn Thị Tuyết Lê


4

TÓM TẮT
ĐOÀN THỊ TUYẾT LÊ, Đại học Nông Lâm TP. Hồ Chí Minh, Tháng 8/2005. “ỨNG
DỤNG KỸ THUẬT MULTIPLEX – PCR ĐỂ PHÁT HIỆN CÁC GEN ĐỘC LỰC
CỦA VI KHUẨN ESCHERICHIA COLI PHÂN LẬP TỪ PHÂN BÒ, PHÂN HEO
TIÊU CHẢY VÀ THỊT BÒ”.
Hội đồng hướng dẫn:
PGS. TS. Nguyễn Ngọc Tuân
BSTY. Bùi Thị Thu Trang
Đề tài được thực hiện nhằm xác định các gen độc lực stx1, stx2, eae, hly, lt-I,
sta, stb, vt2e của vi khuẩn E. coli được phân lập từ 27 mẫu phân tiêu chảy của bò, heo,
bê và 9 mẫu bề mặt thịt bò bằng kỹ thuật multiplex – PCR. Ghi nhận được khuẩn lạc
hồng trên môi trường MAC; trên SMAC có 2 loại: khuẩn lạc hồng và khuẩn lạc trắng;
khuẩn lạc trắng trên CT-SMAC. Mỗi nhóm chọn khoảng 6 – 10 khuẩn lạc riêng lẻ. Ly
trích DNA theo nhóm khuẩn lạc và từng khuẩn lạc riêng lẻ theo phương pháp nhiệt.
Kết quả multiplex - PCR được ghi nhận như sau:
(1) Nhóm khuẩn lạc có mang gen độc lực thì chưa chắc từng khuẩn lạc riêng lẻ có
mang gen độc lực đó.
(2) Tần số phát hiện các gen độc lực của E. coli từ những mẫu phân tiêu chảy lần
lượt là: 25% trên phân bò tiêu chảy (stx2, hly), 30% trên phân bê tiêu chảy
(stx1, stx2, hly, eae), 88,89% trên phân heo tiêu chảy (stb, lt, vt2e, hly, stx1,
eae). Điều này chứng tỏ rằng trên cả 3 nhóm đối tượng trên, E. coli mang các
gen độc lực có thể là nguyên nhân quan trọng gây tiêu chảy.

(3) 9 mẫu bề mặt thịt bò chưa phát hiện được gen độc lực của E. coli.
(4) Chưa phát hiện được gen sta trong E. coli phân lập từ 27 mẫu phân tiêu chảy
của bò, bê và heo.


5

SUMMARY
“Apply multiplex – PCR to detect some virulence genes of Escherichia coli
isolated from diarrhea cattle and swine faeces, beef”
The study was carried out to detect stx1, stx2, eae, hly, lt-I, sta, stb, vt2e genes
of isolated E. coli from 27 diarrhea stools samples of cattles, calves, piglets, and 9
swabs of the beef surface by multiplex – PCR. Observation had one group of pink
colony on MAC, white colony on SMAC, pink colony on SMAC, white colony on
CT-SMAC. Each colony group was chosen about 6 – 10 separate colonies. DNA of the
colony groups and each separate colony were extracted by heat method. The results of
multiplex – PCR were showed that:
(1) The colony group has virulence genes, the separate colony does or doesn’t have
the genes.
(2) Frequency of virulence genes of isolated E. coli from diarrhea stools samples was
25% from cattles (stx2, hly), 30% from calves (stx1, stx2, eae, hly), 88,89% from
piglets (stb, lt-I, vt2e, hly, stx1, eae).
(3) 9 swabs of the beef surface were detected that non virulence genes of E. coli.
(4) Sta gene of E. coli isolated from 27 diarrhea cattle, calf, piglet stools samples
weren’t detected.


6

MỤC LỤC

CHƯƠNG

TRANG

Trang tựa
Lời cảm tạ...................................................................................................................iii
Tóm tắt........................................................................................................................iv
Summary......................................................................................................................v
Mục lục.......................................................................................................................vi
Danh sách các chữ viết tắt.......................................................................................viii
Danh sách các hình......................................................................................................x
Danh sách các bảng....................................................................................................xi
1. ĐẶT VẤN ĐỀ.....................................................................................................1
2. TỔNG QUAN.....................................................................................................3
2.1. Vi khuẩn E. coli..............................................................................................3
2.1.1. Định nghĩa.............................................................................................3
2.1.2. Nuôi cấy và đặc điểm sinh hóa.............................................................3
2.1.3. Yếu tố kháng nguyên............................................................................4
2.1.4. Cơ chế chung về khả năng gây tiêu chảy của E. coli...........................4
2.1.5. Phân loại E. coli....................................................................................4
2.1.5.1. Nhóm STEC/ VTEC/ EHEC.....................................................4
2.1.5.2. Nhóm EPEC...............................................................................7
2.1.53. Nhóm ETEC................................................................................8
2.2. Kỹ thuật PCR................................................................................................11
2.2.1. Nguyên tắc...........................................................................................11
2.2.2. Các giai đoạn của phản ứng PCR.......................................................12
2.2.3. Các thành phần của phản ứng PCR....................................................14
2.2.4. Phân tích kết quả PCR........................................................................15
2.2.5. Những ứng dụng của PCR..................................................................15
2.2.5.1. PCR được sử dụng để nghiên cứu lượng DNA nhỏ................15

2.2.5.2. PCR được sử dụng trong chẩn đoán lâm sàng........................16
2.2.5.3. PCR được dùng để khuếch đại RNA.......................................16


7
2.2.5.4. PCR được sử dụng để so sánh các genome khác nhau...........17
2.2.6. Các hạn chế của PCR..........................................................................17
3. NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU........................................19
3.1. Thời gian và địa điểm thực hiện..................................................................19
3.2. Nội dung.......................................................................................................19
3.3. Phương pháp nghiên cứu..............................................................................19
3.3.1. Lấy mẫu...............................................................................................19
3.3.2. Nuôi cấy, phân lập và ly trích DNA của vi khuẩn E. coli..................20
3.3.3. Xác định các gen stx1, stx2, eae, hly, stx2e, sta, stb, lt-I của
E. coli phân lập được..........................................................................
3.3.4. Điện di trên gel aragose và đọc kết quả điện di..................................25
4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN..........................................................................27
4.1. Kết quả phân nhóm khuẩn lạc và xác định E. coli từ các khuẩn lạc
phân lập được................................................................................................27
4.1.1. Các loại khuẩn lạc trên môi trường
thạch MAC, SMAC, và CT-SMAC....................................................27
4.1.2. Xác định E. coli cho các khuẩn lạc được chọn...................................27
4.2. Kết quả phát hiện các gen độc lực của E. coli
phân lập được từ phân bò tiêu chảy.............................................................28
4.3. Kết quả phát hiện gen độc lực của E. coli
phân lập được từ phân heo tiêu chảy...........................................................32
4.4. Kết quả phát hiện gen độc lực của E. coli
phân lập được từ phân bê tiêu chảy..............................................................36
4.5. Kết quả phát hiện các gen độc lực của E. coli
phân lập từ mẫu bề mặt thịt bò.....................................................................38

4.6. Tổng kết kết quả phát hiện các gen độc lực
của E. coli trên các mẫu khảo sát................................................................39
5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ...............................................................................41
5.1. Kết luận........................................................................................................41
5.2. Đề nghị.........................................................................................................41
6. TÀI LIỆU THAM KHẢO................................................................................42
7. PHỤ LỤC..........................................................................................................46


8

DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT
A/A

: Aggregative adhesion

A/E

: Attaching and effacing

CF

: Colonization factor

CFA

: Colonization factor antigen

CT

: Cholera toxin

CT-SMAC

:Cefixime Tellurite Sorbitol MacConkey agar

DNA

: Deoxyribonucleic acid

dNTP

: Deoxyribonucleotide triphosphate

eae

: E. coli attaching and effacing

EaggEC = EAEC : Enteroaggregative E. coli
EHEC

: Enterohaemorrhagic E. coli

EIEC

: Enteroinvasive E. coli

EMB

: Eosin methylen blue agar

EPEC

: Enterophathogenic E. coli

ETEC

: Enterotoxigenic E. coli

FAO

: Food and Agriculture Organization

HC

: Haemorrhagic colitis

Hly

: Haemolysin

HM

: Khuẩn lạc hồng trên môi trường MAC

HS

: Khuẩn lạc hồng trên môi trường SMAC

HUS

: Haemolytic uraemic syndrome

IMViC

: Indol, Methyl Red, Voges - Proskauer, Simmon Citrate

LEE

: Locus of enterocyte effacement

LT

: Heat labile toxin

MAC

: MacConkey agar

NA

: Nutrient agar

PCR

: Polymerase chain reaction

SMAC

: Sorbitol MacConkey agar

ST

: Heat stable toxin


9
STEC

: Shiga toxin-producing E. coli

Stx

: Shiga toxin

TBE

: Tris borate EDTA

TC

: Khuẩn lạc trắng trên môi trường CT-SMAC

TCVN

: Tiêu chuẩn Việt Nam

Tir

: Translocated intimin receptor

Tm

: Melting temperature

TS

: Khuẩn lạc trắng trên môi trường SMAC

UV

: Ultra violet

VT

: Verotoxin

VTEC

: Verotoxigenic E. coli


10

DANH SÁCH CÁC HÌNH, SƠ ĐỒ, BIỂU ĐỒ
HÌNH

TRANG

Hình 2.1. Nguyên lý của phản ứng PCR........................................................13

Hình 2.2. Chu kỳ nhiệt độ của phản ứng PCR...............................................14
Hình 3.1. Kết quả điện di sản phẩm multiplex - PCR1..................................26
Hình 3.2. Kết quả điện di sản phẩm multiplex - PCR2..................................26
SƠ ĐỒ
Sơ đồ 3.1. Phân lập, xác định E. coli và phát hiện gen độc lực...................22
BIỂU ĐỒ
Biểu đồ 4.1. Tổng kết kết quả phát hiện các gen độc lực
của E. coli trên các mẫu khảo sát.............................................40


11

DANH SÁCH CÁC BẢNG
BẢNG

TRANG

Bảng 3.1. Số lượng mẫu ...............................................................................20
Bảng 4.1. Kết quả phát hiện các gen độc lực của từng nhóm
khuẩn lạc đại diện cho E. coli trong phân bò tiêu chảy...............
Bảng 4.2. Kết quả phát hiện gen stx1, stx2, eae, hly của một số khuẩn
lạc E. coli riêng lẻ phân lập được từ phân bò tiêu chảy............
Bảng 4.3. Kết quả phát hiện các gen độc lực của từng nhóm khuẩn
lạc đại diện cho E. coli trong phân heo tiêu chảy........................
Bảng 4.4. Kết quả phát hiện các gen độc lực cho một số khuẩn lạc
E. coli riêng lẻ phân lập được từ
phân heo tiêu chảy.......................................................................
Bảng 4.5. Kết quả phát hiện các gen độc lực của từng nhóm khuẩn
lạc đại diện cho E. coli trong phân bê tiêu chảy..........................
Bảng 4.6. Kết quả phát hiện các gen độc lực của nhóm khuẩn lạc

đại diện cho E. coli trong mẫu bề mặt thịt bò..............................
Bảng 4.7. Tổng kết kết quả phát hiện các gen độc lực
của E. coli trên các mẫu khảo sát.................................................39


12

Phần 1
MỞ ĐẦU
1.1. Đặt vấn đề
Escherichia coli (E. coli) là vi khuẩn sống cộng sinh chiếm ưu thế trong hệ vi
sinh vật đường ruột của người và động vật. Tuy nhiên, khi có điều kiện thích hợp, một
số nhóm E. coli gây độc tăng sinh mạnh, trở thành nguyên nhân gây tiêu chảy nghiêm
trọng trên người và gia súc, đặc biệt là gia súc non. E. coli được xem là vi khuẩn chỉ
danh ô nhiễm thực phẩm và nước dựa vào số lượng của chúng. E. coli thải qua phân ra
môi trường bên ngoài. Nếu quá trình vệ sinh kém thì E. coli dễ vấy nhiễm vào thịt
tươi, nhất là trong quá trình giết mổ. Từ đó nếu việc bảo quản và chế biến thực phẩm
không thích hợp thì ngộ độc thực phẩm do E. coli hoàn toàn có thể xảy ra.
E. coli được chia thành nhiều nhóm như STEC, EPEC, ETEC, EAEC...Trong
đó, nhóm STEC (Shiga Toxin Producing E. coli) mang nhiều gen độc lực như gen eae
chịu trách nhiệm sản sinh intimin giúp vi khuẩn bám dính vào niêm mạc ruột; gen hly
sản sinh độc tố gây dung giải hồng cầu; gen stx1, stx2 sản sinh các độc tố shiga gây
hội chứng viêm kết tràng xuất huyết (HC = hemorrhagic colitis) và hội chứng huyết
niệu (HUS = hemolytic uraemic syndrome) ở người, gen stx2e sản sinh độc tố vero
gây bệnh phùng thủng và tiêu chảy ở heo cai sữa. Trong khi đó, nhóm ETEC
(Enterotoxigenic E. coli ) mang gen lt sản sinh độc tố ruột kém chịu nhiệt (heat labile
toxin = LT) và gen st sản sinh độc tố ruột chịu nhiệt (heat stable toxin = ST) gây tiêu
chảy trên người và vật nuôi. Nhóm EPEC (Enteropathogenic E. coli) mang gen eae
sản sinh protein intimin, …
Trước đây, để phát hiện E. coli, người ta sử dụng phương pháp nuôi cấy truyền

thống. Phương pháp này gặp khó khăn là tốn thời gian, dịch bệnh đã lây lan rồi thì mới
có kết quả. Hơn nữa, E. coli là vi khuẩn bình thường ở đường ruột và cũng thường có
mặt trong thực phẩm nên việc phân lập được vi khuẩn E. coli trong phân để tìm
nguyên nhân gây bệnh hay xác định số lượng vi khuẩn trong thực phẩm hoàn toàn
không phản ánh được khả năng gây độc của chúng. Do vậy, việc phát hiện các gen gây
độc của E. coli bằng kỹ thuật PCR là bước cần thiết góp phần đánh giá nguy cơ gây
bệnh trên vật nuôi và con người. PCR là phương pháp nhanh, đặc hiệu, cho kết quả
trong thời gian ngắn, kịp thời phát hiện mầm bệnh để góp phần ngăn chặn tác hại của


13
dịch bệnh.
Do đó, được sự đồng ý của Bộ môn Công Nghệ Sinh Học, trường đại học Nông
Lâm TP HCM, dưới sự hướng dẫn của PGS. TS Nguyễn Ngọc Tuân, BSTY Bùi Thị
Thu Trang, chúng tôi đã thực hiện đề tài:
“Ứng dụng kỹ thuật multiplex – PCR để phát hiện các gen độc lực của vi
khuẩn Escherichia coli phân lập từ phân bò, phân heo tiêu chảy và thịt bò”
1.2. Mục tiêu
- Phát hiện một số gen độc lực của E. coli bằng kỹ thuật multiplex – PCR từ
mẫu phân tiêu chảy của bò, bê, heo và mẫu bề mặt thịt bò.
1.3. Mục đích
- Góp phần chẩn đoán và kiểm soát bệnh do E. coli gây ra cho động vật và
người.


14

Phần 2
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1. Vi khuẩn E. coli

2.1.1. Định nghĩa
- Vi khuẩn Escherichia coli là tên được đặt theo tên của nhà bác sĩ nhi khoa

µ

người Đức Theodor Escherich (1857-1911), ông là người đầu tiên phân lập và mô tả vi
khuẩn này vào năm 1885.

- Vi khuẩn E. coli thuộc họ Enterobacteriaceae, giống Escherichia (Theo hệ
thống phân loại của Bergey).

- E. coli là
trực

khuẩn

Gram âm, hiếu
khí tùy nghi, di
động,

kích

thước

khoảng

1,5m x 0,5m,
không

hình

thành bào tử và
có

giáp

(Trần

mô

Thanh

Phong, 1996).
E. coli có mặt
thường

xuyên

và chiếm ưu thế trong ruột của người và động vật máu nóng, ở phần cuối của ruột non
và ruột già. Nó vừa là vi khuẩn cộng sinh thường trực ở đường tiêu hóa, vừa là vi
khuẩn gây ra rất nhiều bệnh đường ruột và ở các cơ quan khác.
2.1.2. Nuôi cấy và đặc điểm sinh hóa
- Nhiệt độ nuôi cấy thích hợp là 35 -37 oC, pH thích hợp 6,4 – 7,5 (tối ưu là 7,2
– 7,4).
- E. coli có thể được phục hồi dễ dàng từ những mẫu có nguồn gốc khác nhau
trên môi trường chọn lọc ở 37 oC trong điều kiện hiếu khí. E. coli thường được phân


15
lập bằng môi trường Mac Conkey (MAC) hoặc eosin methylene blue agar (EMB).

Trên môi trường thạch EMB, E. coli cho khuẩn lạc tím ánh kim; trên môi trường thạch
Mac Conkey, E. coli cho khuẩn lạc đỏ hồng. Ngoài ra, ta có thể sử dụng môi trường
SMAC (Sorbitol Mac Conkey) để phân biệt nhóm STEC không lên men đường
sorbitol. Trên môi trường SMAC, nhóm STEC cho khuẩn lạc điển hình màu trắng, hơi
nhầy, còn các nhóm E. coli lên men sorbitol cho khuẩn lạc màu hồng (FDA, 2002).
- E. coli mọc tốt trên môi trường thạch dinh dưỡng (NA: nutrient agar), sau 24
giờ hình thành những khuẩn lạc dạng S (smooth) màu xám trắng, tròn, ướt, bề mặt
bóng, kích thước khoảng 2 – 3mm.
- Trong môi trường lỏng, sau 4 – 5 giờ, E. coli làm đục nhẹ môi trường, càng để
lâu càng đục, có mùi hôi thối; sau vài ngày có thể có ván mỏng trên mặt môi trường.
- Để phân biệt E. coli và các vi khuẩn đường ruột khác, người ta dùng phản ứng
IMViC (Indol, Methyl Red, Voges Proskauer, Citrate). E. coli cho kết quả là + + - (biotype 1) hoặc - + - - (biotype 2) (FAO, 1992).
2.1.3. Yếu tố kháng nguyên
Phân loại huyết thanh học dựa vào kháng nguyên thân O (somatic), kháng
nguyên H (flagellar) và kháng nguyên bề mặt K (capsular). Có trên 700 loại serotype
của E. coli đã được công nhận dựa vào những kháng nguyên O, H, K. Theo Jay
(2000), E. coli có trên 200 type kháng nguyên đã được công nhận và tồn tại khoảng 30
type kháng nguyên H.
2.1.4. Cơ chế chung về khả năng gây tiêu chảy của E. coli
Có ba cơ chế chung về khả năng gây tiêu chảy của E. coli:
- Sản xuất độc tố: Gồm các nhóm như ETEC, EAEC, STEC
- Tấn công – xâm lấn: Gồm nhóm EIEC
- Bám dính, truyền tín hiệu qua màng: Gồm các nhóm như EPEC, EHEC
Tuy nhiên, tác động qua lại giữa cơ thể vật chủ và màng nhầy ruột thì đặc hiệu
cho mỗi loại (Nataro và Kaper, 1998).
2.1.5. Phân loại E. coli
Dựa trên đặc điểm gây bệnh (đặc tính độc lực, sự tác động khác nhau lên màng
nhày của ruột, hội chứng lâm sàng của bệnh và sự khác nhau về mặt dịch tễ của bệnh),
E. coli được chia thành 5 nhóm sau:
 STEC (Shiga toxin – producing E. coli) hoặc VTEC (Vero toxingenic E.

16
coli) và EHEC (Enterohaemorrhagic E. coli)
 EPEC (Enteropathogenic E. coli)
 EAEC (Enteroaggregative E. coli)
 ETEC (Enterotoxigenic E. coli)
 Những nhóm khác gây bệnh tiêu chảy:
- EIEC (Enteroinvasive E. coli)
- DAEC (Diffusely adherent E. coli)
2.1.5.1. Nhóm STEC/ VTEC/ EHEC
a. Danh pháp
Những hướng khác nhau trong nghiên cứu đã đưa ra những danh pháp khác
nhau để đặt tên cho nhóm E. coli này:
- Tên gọi Verotoxigenic E. coli hoặc Vero cytotoxin producing E. coli
(VTEC) được Konowalchuk và cộng sự đặt cho nhóm này khi phát hiện nhóm này sản
xuất độc tố gây độc cho dòng tế bào vero vào năm 1997. Tên gọi VTEC được sử dụng
rộng rãi ở Anh và nhiều tổ chức khoa học ở Châu Âu.
- Tên gọi Enterohaemorrhagic E. coli (EHEC) được đặt là do dòng này gây
viêm kết tràng xuất huyết (HC: haemorrhagic colitis) và hội chứng huyết niệu (HUS:
haemolytic uraemic syndrome) (Nataro và Kaper, 1998).
- Tên Shiga toxin - producing E. coli (STEC) (trước đây gọi là Shiga like
toxin - producing E. coli - SLTEC) chỉ rõ khả năng sinh độc tố gây độc tế bào giống
như độc tố Shiga (Calderwood và ctv, 1997). Tên gọi STEC được sử dụng nhiều trong
các tạp chí khoa học ở Mỹ.
STEC và VTEC là hai thuật ngữ tương đương nhau và cả hai đều chỉ ra rằng
nhóm E. coli sản sinh ra một hay nhiều loại độc tố gây độc tế bào. Mặc dù vậy, không
phải có gen sản sinh độc tố là có thể gây bệnh nếu không có các yếu tố độc lực khác.
Những dòng E. coli mang gen sản sinh độc tố cũng hiện diện trong ruột gia súc khỏe
mạnh với một số lượng rất ít, nhưng những dòng này thiếu một vài hay tất cả những

yếu tố độc lực khác nhau của STEC (Beutin và ctv, 1995). Do đó, không phải tất cả
STEC đều có khả năng gây bệnh (Nataro và Kaper, 1998).
b. Shiga toxin và những yếu tố khác ảnh hưởng đến đặc tính gây bệnh của STEC
* Shiga toxin
Những dòng STEC sản sinh độc tố Shiga toxin (Stx), hay còn được gọi là


17
Verotoxins (VT) hoặc Shiga – like toxins (Slt).
Họ độc tố Stx gồm hai nhóm chính không phản ứng chéo với nhau là Stx1 và
Stx2, được mã hóa bởi gen stx1 và stx2. Cả hai độc tố này được cấu tạo từ 5 tiểu đơn
vị B (được mã hóa bởi stxB) và 1 tiểu đơn vị A (được mã hóa bởi stxA). Cả hai gen
stxA và stxB được định vị trên bacteriophage ôn hòa được chèn vào trong nhiễm sắc
thể (NST) của STEC. Một dòng STEC chỉ sản xuất độc tố Stx1, hoặc Stx2, hoặc cả
hai, hoặc thậm chí nhiều dạng Stx2. Ba dạng Stx2 được xác định: Stx2, Stx2c, và
Stx2e (Pierard và ctv, 1998). Subtype Stx2e gây bệnh phù thủng ở heo hơn là gây bệnh
ở người. Nhưng thỉnh thoảng những dòng này cũng có thể được phân lập từ bệnh nhân
HUS (Thomas và ctv, 1994). Nhiều khi người ta có thể thay thế giữa thuật ngữ Stx và
VT (ví dụ: Stx1 = VT1 = Slt1, Stx2e = VT2e = Slt2e v.v…) (Caldervood và ctv,
1997). Hầu hết những phương pháp chẩn đoán phân tử đều có mục tiêu phát hiện gen
mã hóa Stx của nhóm STEC (Cocolin và ctv, 2000).
* Những yếu tố độc lực khác ảnh hưởng đến đặc tính gây bệnh của STEC
Những yếu tố độc lực khác của STEC là enterohaemolysin (Ehly) và có thể là
heat – stable enterotoxin (EAST1). Gen mã hóa Ehly nằm trên plasmid 60 – MDa mà
plasmid này được tìm thấy ở nhiều dòng O157:H7 và cũng hiện diện ở các dòng STEC
không phải O157. Ở Đức, gần 90% dòng STEC được phân lập từ bệnh nhân có gen mã
hóa Ehly (Beutin và ctv, 1994). Tuy nhiên, việc sản sinh Ehly như là một yếu tố độc
lực thì khó đánh giá, vì trong các nghiên cứu của tác giả này, E. coli có Stx âm tính và
Ehly dương tính là nguyên nhân làm hư hại tế bào vero, Hep-2 hoặc Hela in vitro
(Beutin và ctv, 1989). EAST1 đầu tiên được mô tả trong EAEC cũng được tìm thấy

trong nhiều dòng STEC. EAST1 trong mầm bệnh của STEC thì không được biết,
nhưng nó có thể liên quan đến một số bệnh tiêu chảy không có máu thường xuyên
được tìm thấy ở những người bị nhiễm STEC (Nataro và Kaper, 1998).
Yếu tố bám dính của STEC đóng vai trò quan trọng cho vi khuẩn định vị ở tế
bào ruột. Đó là intimin - một loại protein có trọng lượng phân tử 94 – 97 kDa. Protein
intimin được mã hóa bởi gen eae (E. coli attaching và effacing). Intimin gây tổn
thương dạng bám dính và phá hủy (attaching - and – effacing, A/E) ở ruột già do vi
khuẩn bám chặt vào tế bào biểu mô (Donnerberg và ctv, 1993). Gen eae này cũng
được tìm thấy ở nhóm EPEC. Gen eae là một trong số các gen nằm trong vùng gây
bệnh 35,5 kb (gọi là vùng gây hư hại tế bào ruột - locus of enterocyte effacement,


18
LEE). Vùng LEE của STEC chứa những gen mã hóa intimin, gen mã hóa thụ thể để
vận chuyển intimin là Tir (translocated intimin receptor) và một số gen khác. Vùng
LEE không chỉ là điều kiện cần mà là điều kiện đủ cho việc hình thành tổn thương
A/E. Tuy nhiên, không phải tất cả STEC đều có gen eae, nhưng tất cả EHEC đều có
gen eae (Nataro và Kaper, 1998). Bệnh tích A/E phụ thuộc vào tương tác giữa protein
màng ngoài vi khuẩn (protein intimin) và protein Tir. Protein Tir được tiết ra khỏi vi
khuẩn, chuyển vị vào màng của tế bào vật chủ (Kenny và ctv, 1997).
Hầu hết các ổ dịch do STEC gây ra β bởi những dòng O157:H7, nên người ta
cho rằng có thể serotype này độc hơn và dễ lây truyền hơn những serotype khác. Dấu
hiệu sinh hóa duy nhất cho những dòng STEC O157:H7 là không thể lên men sorbitol
hoặc không tạo ra- glucuronidase. Vì thế, ở nhiều quốc gia, chẩn đoán STEC chỉ dựa
vào việc phát hiện E. coli không lên men sorbitol. O157:H7 và các serotype không
phải O157 liên quan đến việc gây bệnh ở người gồm O26:H11, O103:H2, O111:H NM
và O113:H21 (WHO, 1994).
c. Nguồn lây nhiễm
STEC có thể được tìm thấy trong phân nhiều loài động vật như trâu, bò, cừu,
dê, heo, chó, mèo (Beutin và ctv, 1993; Chapman và ctv, 1997) và ngựa (Chalmers và

ctv, 1997) và ngay cả chim hải âu (Makino và ctv, 2000). Loài động vật quan trọng
nhất trong việc lây nhiễm cho người là bò. Đường lây nhiễm chủ yếu của STEC vào
chuỗi thực phẩm là việc vấy nhiễm những thành phần trong ruột và phân trong quá
trình giết mổ (Butler, 1996).
STEC thường lây truyền sang người qua thực phẩm, nước và từ người này sang
người khác. Hầu hết các trường hợp bệnh là do ăn thực phẩm đã bị nhiễm, đặc biệt là
thực phẩm có nguồn gốc động vật. Trong đó thịt bò là nguyên nhân chủ yếu
(Keskimaki, 2001).
2.1.5.2. Nhóm EPEC
Thuật ngữ enteropathogenic E. coli được gọi tên đầu tiên bởi Neter và ctv
(1955) để chỉ những dòng E. coli gây tiêu chảy ở trẻ em.
a. Đặc điểm
Cũng như STEC, EPEC có mang gen eae mã hóa protein intimin giúp vi khuẩn
bám dính vào niêm mạc ruột và gây hư hại (A/E); nhưng EPEC không sản xuất độc tố
Shiga.


19
b. Sự bám dính và phá hủy (AE) của những dòng EPEC
Dấu hiệu của sự nhiễm bệnh do EPEC là hình thành bệnh tích kiểu A/E, có thể
quan sát được trên mẫu sinh thiết ruột từ những bệnh nhân hay thú bị nhiễm và trong
nuôi cấy tế bào (Nataro và Kaper, 1998). Dạng tổn thương này được đặc trưng bởi sự
hư hại của các vi nhung mao và sự kết dính chặt giữa vi khuẩn và màng tế bào biểu
mô. Tổn thương này khác với dạng tổn thương do ETEC và Vibrio cholerae (ETEC và
V. cholerae bám theo kiểu không chặt, không gây bào mòn vi nhung mao). Gen cần
thiết cho việc tạo tổn thương A/E là gen eae mã hóa intimin. Protein này là yếu tố độc
lực cần thiết của EPEC (Donnerberg và ctv,1993). Theo Nataro và Kaper (1998), gen
eae hiện diện ở tất cả các chủng EPEC, EHEC, Clostridium rodentium và Hafnia
alvei, nhưng không hiện diện ở những dòng E. coli thuộc hệ vi khuẩn đường ruột
thông thường.

c. Dịch tễ của sự nhiễm EPEC
Cũng như những E. coli gây bệnh khác, sự truyền lây của EPEC qua đường
miệng, với sự vấy nhiễm qua tay, qua thực phẩm.
Điểm đáng chú ý nhất về mặt dịch tễ của bệnh do EPEC là sự phân bố lứa tuổi.
Bệnh thường biểu hiện cấp tính với tiêu chảy nghiêm trọng ở trẻ em. Người trưởng
thành và trẻ em lớn có phần đề kháng hơn với bệnh mà nguyên nhân có thể là do mất
các thụ thể đặc hiệu. Tuy nhiên, EPEC cũng có thể gây tiêu chảy ở người lớn nếu số
lượng vi khuẩn đủ cao.
2.1.5.3. Nhóm ETEC
a. Các yếu tố độc lực: ETEC có hai nhóm quyết định độc lực là độc tố ruột
(enterotoxin) và yếu tố định vị (colonization factor – CF)
 Độc tố ruột enterotoxin
Nhóm ETEC sản sinh độc tố ruột. Có hai loại: độc tố ruột chịu nhiệt (ST) và
độc tố ruột kém chịu nhiệt (LT).
(1) Độc tố kém chịu nhiệt (heat – labile toxin – LT):
Độc tố LT của E. coli là oligopeptide có liên hệ gần gũi về mặt cấu trúc và chức
năng với độc tố gây bệnh tả trên người (cholera toxin – CT) do Vibrio cholerae tiết ra.
LT và CT giống nhau nhiều đặc tính như cấu trúc, trình tự acid amin (giống nhau
khoảng 80%), tương đồng về thụ thể, hoạt tính enzyme, và kiểu tác động của nó trên
động vật hay trong nuôi cấy tế bào. LT có hai serogroup chính là LT-I và LT-II. LT-I


20
và LT-II không có phản ứng chéo về mặt miễn dịch.
- LT-I: Được tiết bởi những dòng E. coli gây bệnh trên người và thú. LT-I là
một oligopeptide khoảng 86 kDa, được cấu tạo bởi 1 tiểu đơn vị A 28 kDa và 5 tiểu
đơn vị B 11,5 kDa. Tiểu đơn vị A chịu trách nhiệm như một enzym, gồm peptide A 1
và peptide A2 liên kết nhau bởi cầu nối disulfur. Những tiểu đơn vị B sắp xếp thành
vòng nhẫn, liên kết chắc chắn với ganglioside GM 1 và liên kết lỏng lẻo với GD1b và
vài glycoprotein ruột (các thụ thể của LT). Hai loại LT-I có liên hệ gần nhau và phản

ứng chéo một phần với nhau là LTp (LTp-I) đầu tiên được phân lập từ heo và LTh
(LTh- I) được phân lập từ người. Gen mã hóa cho LT là elt hay lt-I nằm trên plasmid
mà plasmid này có thể chứa cả gen mã hóa ST và / hoặc gen mã hóa những kháng
nguyên của yếu tố định vị (colonization factor antigen – CFA).
Sau khi bám vào màng tế bào niêm mạc ruột của vật chủ, độc tố LT-I thâm
nhập qua màng trong tế bào, kích thích adenylate cyclase hoạt động dẫn đến làm tăng
mức AMP vòng (cAMP) trong tế bào. cAMP hoạt hóa protein kinase (A kinase) từ
dạng không hoạt động thành dạng hoạt động. Điều này dẫn đến sự phosphoryl những
kênh chloride hoạt động trên mức bình thường ở màng tế bào biểu mô. Kết quả là kích
thích những tế bào mào ruột tiết ra Cl - một cách tích cực, đồng thời ức chế sự hấp thu
NaCl bởi những tế bào nhung mao (villus). Đây chính là nguyên nhân dẫn đến tiêu
chảy dữ dội (Nataro và Kaper, 1998).
- LT – II: LT-II có cấu trúc giống với LT – I và CT khoảng 55 – 57% ở tiểu đơn
vị A, nhưng không giống với LT-I và CT ở tiểu đơn vị B. LT-II cũng làm gia tăng
cAMP trong tế bào qua cơ chế tương tự như LT-I, nhưng LT-II không liên quan đến
bệnh trên người và thú.
(2) Độc tố chịu nhiệt (heat – stable toxin – ST)
Ngược với LT, ST có trọng lượng phân tử nhỏ và những cầu nối disulfur của nó
giải thích cho khả năng chịu nhiệt của độc tố này. ST được chia thành hai nhóm là STa
và STb. Hai nhóm này khác nhau về cấu trúc và cơ chế hoạt động. Gen mã hóa cho cả
hai nhóm được tìm thấy chủ yếu trên plasmid và vài gen mã hóa ST cũng được tìm
thấy trên transposon. Độc tố STa (hay còn gọi là ST-I) do ETEC sản sinh và một vài vi
khuẩn Gram âm khác gồm Yersinia enterocolitica và V. cholerae không phải O1. ST
giống 50% trình tự acid amin với độc tố chịu nhiệt EAST1 của EAEC. Một số báo cáo
gần đây cho rằng một vài dòng thuộc nhóm ETEC ngoài việc sản sinh ra STa, còn có


21
thể sản sinh độc tố EAST1. Trong khi đó, STb chỉ được tìm thấy ở ETEC.
- STa: STa là một peptide gồm 18 – 19 acid amin với trọng lượng phân tử

khoảng 2 kDa. STa được chia thành hai loại là STp (ST porcine hoặc STIa) từ E. coli
phân lập được trên heo và STh (ST human hoặc STIb) của E. coli phân lập trên người.
Cả hai độc tố có thể được tìm thấy ở các dòng ETEC trên người.
Thụ thể chính của STa là enzyme xuyên màng guanylate cyclase C (GC-C).
STa kết hợp với thụ thể GC-C gây hoạt hóa GC, dẫn đến việc gia tăng lượng cGMP
nội bào. Hoạt động này cuối cùng dẫn đến sự gia tăng tiết Cl - và / hoặc ngăn cản sự
hấp thu NaCl, dẫn đến tăng lượng tiết chất lỏng trong ruột, gây tiêu chảy.
- STb: STb chủ yếu được tạo ra bởi những dòng ETEC được phân lập từ heo,
vài chủng ETEC được phân lập từ người cũng sản sinh STb. Không như STa, STb gây
ra những tổn thương về mặt mô học trên lớp biểu mô ruột như mất tế bào nhung mao
của lớp biểu mô ruột và teo nhung mao một phần. Thụ thể của STb chưa được biết rõ
mặc dù gần đây người ta cho rằng độc tố kết hợp không đặc hiệu với màng tế bào chất
trước khi vào bên trong tế bào. Không gây ra sự tiết Cl- nhưng STb kích thích tế bào
ruột tiết bicarbonat (HCO3-). STb không làm tăng cAMP hay cGMP nội bào mặc dù nó
kích thích tăng lượng calci nội bào từ ngoại bào. STb còn kích thích phóng thích PGE 2
và serotonin, từ đó người ta cho rằng hệ thần kinh ruột cũng có thể liên quan đến đáp
ứng tiết dịch gây ra bởi độc tố này (Hitotsubashi và ctv, 1992).
 Yếu tố định vị (colonization factor – CF)
Cơ chế mà ETEC kết dính và cư trú trên lớp màng nhầy ruột đã được nghiên
cứu kỹ. Để gây tiêu chảy, ETEC đầu tiên phải kết dính vào tế bào ruột non nhờ vào
lông trên bề mặt của vi khuẩn, gọi là yếu tố định vị (CF hay CFA - Colonization factor
antigens).
CFA có thể được phân loại dựa trên đặc tính hình thái. Có 3 loại chính gồm loại
lông hình que cứng, lông hình que mềm dạng bó, lông có cấu trúc mảnh mềm. Có ít
nhất 20 loại CF trong ETEC ở người. Hầu hết, chúng được mã hóa bởi gen nằm trên
plasmid, cũng là nơi mã hóa độc tố ST và/hoặc LT (Gaastra và Svennerholm, 1996).
Tiểu đơn vị cấu trúc lông thường tạo miễn dịch vượt trội do đó tiểu đơn vị có tính
kháng nguyên rất mạnh.
b. Dịch tễ
Dòng ETEC liên quan đến hai hội chứng lâm sàng chủ yếu: tiêu chảy trên trẻ

22
em thôi bú ở những nước đang phát triển và tiêu chảy ở khách du lịch. Dịch tễ của
bệnh do ETEC được quyết định bởi nhiều yếu tố: (1) miễn dịch tại màng nhầy khác
nhau của từng cá thể đối với sự nhiễm ETEC, (2) những người nhiễm không có biểu
hiện triệu chứng vẫn bài thải một lượng lớn vi khuẩn qua phân, (3) việc nhiễm chỉ đạt
được khi liều gây nhiễm khá cao. Ba đặc tính này tạo nên tình trạng ô nhiễm ETEC
trong môi trường ở những vùng có dịch và hầu hết trẻ em trong vùng này sẽ đương đầu
với ETEC trong thời kì thôi bú. Trẻ em đã ở tuổi đến trường và người lớn có nguy cơ
tiêu chảy do ETEC rất thấp. Dòng ETEC sản sinh ST là nguyên nhân của hầu hết các
trường hợp bệnh.
Các nghiên cứu dịch tễ học cho thấy rằng, thức ăn và nước bị ô nhiễm là những
phương tiện chủ yếu gây nhiễm ETEC (Black và ctv, 1981). Sự nhiễm ETEC, ở những
vùng dịch thường tập trung chủ yếu vào những tháng nóng và ẩm; khi đó, sự nhân lên
mạnh mẽ của ETEC trong thực phẩm và nước.
Mặc dù sự nhiễm ETEC xảy ra chủ yếu trên trẻ em, nhưng những người trưởng
thành chưa có miễn dịch cũng dễ bị nhiễm. Thật vậy, ETEC là nguyên nhân chính gây
tiêu chảy trên du khách trưởng thành từ những nước đã phát triển đến thăm những
vùng có dịch ETEC. Nhiều nghiên cứu cho rằng 20 - 60% số du khách này có triệu
chứng tiêu chảy và 20 - 40% các trường hợp là do ETEC. Tiêu chảy trên du khách
thường xảy ra ở những du khách lần đầu tiên đến thăm những nước đang phát triển.
Tiêu chảy trên du khách thường là do thức ăn và nước uống bị ô nhiễm.
c. Khía cạnh lâm sàng
Triệu chứng bệnh thường xảy ra đột ngột với thời gian nung bệnh ngắn (14 – 50
giờ). Bệnh nhân tiêu chảy toàn nước, thường không có máu; một vài bệnh nhân có
hiện tượng sốt và ói mửa. Tiêu chảy do ETEC có thể nhẹ, ngắn và tự bớt dần nhưng
cũng có thể gây ra tiêu chảy nghiêm trọng giống như nhiễm Vibrio cholerae.
Hầu hết các trường hợp nhiễm ETEC nguy hiểm đến tính mạng xảy ra trên trẻ
em thôi bú ở những nước đang phát triển. Mặc dù việc sử dụng kháng sinh nhạy cảm

cũng làm giảm mức độ tiêu chảy, nhưng những thuốc trị có hiệu quả thì không sẵn có
ở những vùng nguy cơ cao; ngoài ra sự đề kháng kháng sinh của dòng ETEC cũng là
vấn đề đáng quan tâm. Do đó cần phải lưu ý rằng cơ sở của việc chăm sóc bệnh nhân
nhiễm ETEC là duy trì đủ lượng nước trong cơ thể nếu có triệu chứng tiêu chảy.
d. Phát hiện và chẩn đoán


23
Việc phát hiện nhóm ETEC dựa vào sự phát hiện độc tố LT và/hoặc ST. Có
nhiều phương pháp phát hiện ETEC như: radioimmunoassay, enzyme linked
immunosorbent assay (ELISA), DNA-probe, PCR…
2.2. Kỹ thuật PCR
2.2.1. Nguyên tắc
PCR (polymerase chain reaction - phản ứng tổng hợp dây chuyền nhờ
polymerase) do Kary Mullis và cộng sự phát minh năm 1985. PCR là kỹ thuật in vitro
cho phép nhân nhanh một gen mong muốn lên hàng triệu lần trong một thời gian ngắn
(tạo dòng in vitro, không cần sự hiện diện của tế bào).
Sự khuếch đại những primer oligonucleotide. Primer là những phân tử DNA
đơn, ngắn, có khả năng bắt cặp bổ sung với một đầu của mạch khuôn (trình tự DNA
mẫu xét nghiệm) nhờ DNA polymerase, và dNTP (deoxyribonucleotide triphosphate)
trong điều kiện phản ứng thích hợp. Các primer này gồm có primer “xuôi” (forward
primer) và primer “ngược” (reverse primer). Kết quả là sẽ có những chuỗi DNA mới
bổ sung với sợi DNA mẫu. Những chuỗi này sẽ tồn tại dưới dạng DNA chuỗi đôi. Sự
tổng hợp này sẽ được lặp lại theo một số chu kỳ nhất định đã được thiết lập.
Multiplex – PCR là một cải tiến của kỹ thuật PCR mà trong đó có thể nhân lên
đồng thời nhiều đoạn DNA mong muốn bằng cách sử dụng nhiều cặp primer trong một
phản ứng. Multiplex – PCR đầu tiên được mô tả bởi Chamberlain năm 1988 và kể từ
đó multiplex – PCR được ứng dụng rất nhiều trong các lĩnh vực kiểm tra DNA
(Protocol online).
2.2.2. Các giai đoạn của phản ứng PCR

Phản ứng PCR là một chuỗi gồm nhiều chu kỳ nối tiếp nhau. Mỗi chu kỳ gồm
ba giai đoạn:
 Giai đoạn 1: Giai đoạn biến tính (denaturation)
Hai mạch của phân tử DNA tách rời nhau thành hai mạch đơn. Phân tử DNA
được biến tính ở nhiệt độ cao hơn nhiệt độ nóng chảy (Tm) của phân tử, thường là ở
94 -950C trong vòng 30 giây đến 1 phút.
 Giai đoạn 2: Giai đoạn ủ bắt cặp (anealing)
Nhiệt độ được hạ thấp (thấp hơn Tm của các primer) cho phép các primer bắt cặp
với khuôn, trong thực nghiệm nhiệt độ này dao động khoảng 40 – 60 0C tuỳ thuộc Tm
của các primer sử dụng và kéo dài từ 30 giây dến 1 phút.


24
 Giai đoạn 3: Giai đoạn kéo dài (elongation hay extension)
Nhiệt độ giai đoạn này được tăng lên 720C giúp DNA polymerase hoạt động tổng
hợp DNA tốt nhất với sự hiện diện của 4 deoxyribonucleotide triphosphate. Đoạn
DNA nằm giữa hai primer được tổng hợp tạo thành chuỗi DNA.
* Mỗi chu kỳ gồm 3 giai đoạn trên sẽ được lặp lại nhiều lần và mỗi lần làm tăng
đôi lượng DNA mẫu của lần trước. Tổng DNA khuếch đại được tính theo công thức:
Tổng DNA khuếch đại = m*2n
Với n: Số chu kỳ; m: Số bản sao của chuỗi mã hóa
* Sản phẩm kéo dài ở chu kỳ đầu tiên có chiều dài không xác định vì DNA
polymerase sẽ tiếp tục tổng hợp DNA mới đến khi nó dừng lại hoặc bị phá hủy bởi chu
kỳ tiếp theo.Sản phẩm kéo dài ở chu kỳ thứ hai cũng không xác định. Tuy nhiên, ở chu
kỳ thứ 3, đoạn DNA mong muốn (DNA đích) được tổng hợp có chiều dài xác định. Từ
chu kỳ thứ 4 trở đi, trình tự đoạn DNA đích được khuếch đại. Vì thế số copy cuối cùng
của trình tự đích được tính theo công thức:
Số copy cuối cùng của trình tự đích = (2n – 2n) * x
n : Số chu kỳ
2n: Sản phẩm có chiều dài không xác định sau chu kỳ 1 và 2

x : Số bản sao của chuỗi mã hóa
* Số chu kỳ của phản ứng PCR
- Trong thực tế, không vượt quá 40 chu kỳ trong 1 phản ứng, vì phản ứng
PCR diễn ra qua hai giai đoạn:
+ Giai đoạn đầu, số lượng bản sao tăng theo cấp số nhân, tỷ lệ với lượng mẫu
ban đầu.
+ Giai đoạn sau đó, hiệu quả khuếch đại giảm hẳn do:
 Phân hủy và cạn kiệt các thành phần của phản ứng.
 Xuất hiện các sản phẩm phụ ức chế lại phản ứng.
 Các bản sao vừa tổng hợp không kết hợp với primer mà lại bắt
cặp với nhau.

Giai đoạn biến tính
(denaturation)
Số chu kỳ của phản ứng tùy thuộc số lượng mẫu ban đầu. DNA
mẫu ban đầu là
105 thì cần khoảng 25 – 30 chu kỳ, còn DNA mẫu là 10 2 – 103 thì số chu kỳ phải là 35
Giai đoạn ủ bắt cặp
– 40.
(anealing)
Giai đoạn kéo dài
(elongation hay
extension)


25

Nhiệt độ (0C)

Hình 2.1 Ngun lý của phản ứng PCR

Biến tính

Lặp lại n lần

94-950C

Kéo dài

Ủ bắt cặp

720C

40-700C

Thời gian (phút)

Hình 2.2 Chu kỳ nhiệt độ của phản ứng PCR
2.2.3. Các thành phần của một phản ứng PCR
- DNA mẫu: là thành phần cần khuếch đại.
- Primer: Primer là những đoạn oligonucleotide mạch đơn, có trình tự bổ sung
với trình thự base của hai đầu mạch khn để khởi đầu q trình tổng hợp DNA. Việc
chọn primer là giai đoạn quyết định của phản ứng PCR. Các primer được chọn phải
đặc trưng cho trình tự DNA cần khuếch đại, khơng trùng với các trình tự lặp lại trên
gen, khơng có sự bắt cặp bổ sung giữa primer xi và primer ngược và cũng khơng có
những cấu trúc kẹp tóc do sự bắt cặp bổ sung trong cùng một primer. Chiều dài các