Đánh giá một số dòng lúa chọn lọc thế hệ r3, r4 có nguồn gốc từ mô sẹo chịu mất nước

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM
--------------------------------

VÕ VĂN NGỌC

ĐÁNH GIÁ MỘT SỐ DÕNG LÖA CHỌN
LỌC THẾ HỆ R3, R4 CÓ NGUỒN GỐC TỪ
MÔ SẸO CHỊU MẤT NƢỚC

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

THÁI NGUYÊN - 2009

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên




1

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM
-------------------------------------

VÕ VĂN NGỌC

ĐÁNH GIÁ MỘT SỐ DÕNG LÖA CHỌN
LỌC THỂ HỆ R3, R4 CÓ NGUỒN GỐC TỪ
MÔ SẸO CHỊU MẤT NƢỚC
Chuyên ngành : Di truyền học

Mã số: 60.42.70
LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

Người hướng dẫn khoa học: TS. Nguyễn Thị Tâm

Thái Nguyên – 2009

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên




2

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi. Các số liệu, kết
quả nghiên cứu trong luận văn là trung thực và chƣa đƣợc ai công bố.

Tác giả

Võ Văn Ngọc

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên




3

LỜI CẢM ƠN
Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS. Nguyễn Thị Tâm đã tận tình
hƣớng dẫn, chỉ bảo và tạo mọi điều kiện giúp đỡ tôi hoàn thành công trình nghiên
cứu này.
Tôi xin cảm ơn KTV. Đào Thu Thủy (phòng thí nghiệm Công nghệ tế bào),
CN. Nguyễn Ích Chiến, Ths. Phạm Thị Thanh Nhàn (phòng thí nghiệm Di truyền
học và Công nghệ gen, Khoa Sinh-KTNN, Trƣờng Đại học Sƣ phạm Thái Nguyên)
đã giúp đỡ tôi trong quá trình hoàn thành luận văn.
Tôi xin chân thành cảm ơn Lãnh đạo Trƣờng Đại học Sƣ phạm - Đại học
Thái Nguyên, Ban chủ nhiệm và các thầy cô giáo, cán bộ khoa Sinh - KTNN, Ban
giám hiệu trƣờng THPT Thạch Thành 2 - Tỉnh Thanh Hoá đã tạo điều kiện giúp đỡ
tôi trong quá trình học tập và hoàn thành luận văn.
Tôi xin cảm ơn sự động viên, khích lệ của gia đình, bạn bè và đồng nghiệp
trong suốt thời gian làm luận văn.
Tác giả luận văn

Võ Văn Ngọc

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên




4

MỤC LỤC
Trang
MỞ ĐẦU....................................................................................................................

9

Chƣơng 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU .......................................................................

11

1.1. Giới thiệu về cây lúa .........................................................................................

11

1.1.1. Nguồn gốc và phân loại....................................................................................

11

1.1.2. Đặc điểm nông sinh học của cây lúa................................................................

11

1.1.3. Giá trị kinh tế…………………………………………………………………

12

1.1.4. Tình hình sản xuất lúa trên thế giới và ở Việt Nam…………………………..

13

1.2. Hạn và cơ chế chịu hạn.....................................................................................

13

1.2.1. Khái niệm về hạn……………………………………………………………..

13

1.2.2. Tác hại của hạn đối với cây lúa……………………………………………….

14

1.2.3. Cơ sở sinh lý, sinh hoá và phân tử của tính chịu hạn ở cây lúa………………

14

1.3. Ứng dụng kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật trong chọn dòng tế bào.....

19

1.3.1. Cơ sở khoa học của chọn dòng tế bào thực vật……………………………….

19

1.3.2. Hệ thống nuôi cấy sử dụng trong chọn dòng tế bào soma……………………

19

1.3.3. Các phƣơng pháp chọn dòng tế bào…………………………………………..

20

1.3.4. Thành tựu nuôi cấy mô tế bào chọn dòng chống chịu ngoại cảnh bất lợi…….

21

1.3.5. Đánh giá các chỉ tiêu sinh lý, hóa sinh và sinh học phân tử các dòng đƣợc
hình thành qua nuôi cấy mô tế bào………………………………………………….

22

1.4. Một số nghiên cứu về gen ức chế sinh tổng hợp giberellin ở cây lúa ……...

23

Chƣơng 2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP...........................................................

26

2.1. Vật liệu, thiết bị, hóa chất và địa điểm nghiên cứu .......................................

26

2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu ................................................................................

27

2.2.1. Phƣơng pháp trồng và theo dõi ngoài đồng ruộng……………………...........

28

2.2.2. Phƣơng pháp hóa sinh………………………………………………………..

28

2.2.3. Phƣơng pháp nuôi cấy in vitro ……………………………………….............

30

2.2.4. Đánh giá nhanh khả năng chịu hạn ở giai đoạn cây mạ ……………………...

32

2.2.4. Phƣơng pháp sinh học phân tử………………………………………………..

33

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên




5

2.2.5. Phƣơng pháp xử lý kết quả và tính toán số liệu .............................................

37

Chƣơng 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN………………………………………….

38

3.1. Đặc điểm nông học các dòng lúa chọn lọc ở thế hệ R3, R4 và giống gốc có
nguồn gốc từ mô sẹo chịu mất nƣớc...............................................................

39

3.2. Phân tích hóa sinh các dòng chọn lọc...............................................................

45

3.2.1. Hàm lƣợng protein, lipit và đƣờng tan trong hạt các dòng chọn lọc ………..

45

3.2.2. Đánh giá phổ điện di protein dự trữ hạt ……………………………………..

46

3.2.3. Hàm lƣợng axit amin liên kết trong hạt………………………………………

47

3.3. Đánh giá khả năng chịu hạn của các dòng chọn lọc ở thế hệ R4..................

51

3.4. Phân lập và giải trình tự gen GA2ox1 ức chế sinh tổng hợp gibberellin......

60

3.4.1. Kết quả tách chiết ADN tổng số của dòng chọn lọc R4.05…………………..

60

3.4.2. Nhân gen GA2ox1 bằng kỹ thuật PCR……………………………………….

61

3.4.3. Biến nạp vector tái tổ hợp vào tế bào khả biến và chọn dòng plasmit tái tổ
hợp mang gen GA2ox1……………………………………………………………..

62

3.4.4. Tách chiết plasmit tái tổ hợp………………………………………………….

63

3.4.5. Kết quả đọc trình tự nucleotit đoạn gen GA2ox1…………………………….

66

3.4.6. So sánh trình tự nucleotit của gen GA2ox1 giữa dòng R4.05 với các giống
đã công bố…………………………………………………………………………...

66

3.4.7. So sánh trình tự axit amin giữa dòng R4.05 với các giống đã công bố..…….

68

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ……………………………………………………...

72

CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN VĂN…………………

74

TÀI LIỆU THAM KHẢO…………………………………………………………..

75

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên




6

DANH MỤC CÁC BẢNG
Trang
Bảng 2.1. Hạt các dòng chọn lọc thế hệ R2 và giống gốc …………………….

26

Bảng 3.1. Đặc điểm nông học và mức độ biến dị của các dòng lúa thế hệ R3....

43

Bảng 3.2. Đặc điểm nông học dòng R4.04, R4.05 và giống KD……….............

44

Bảng 3.3. Hàm lƣợng protein, lipit và đƣờng tan trong hạt của các dòng chọn

lọc và giống gốc…………………………………………………...
Bảng 3.4. Hàm lƣợng các axit amin liên kết trong hạt của một số dòng chọn
lọc thế hệ R4 và giống gốc…………………………………………
Bảng 3.5. Hàm lƣợng các axit amin liên kết trong protein hạt của các dòng
chọn lọc thế hệ R4 và giống gốc……………………...……………
Bảng 3.6. Thăm dò khả năng tạo mô sẹ o và tái sinh cây của các dòng chọn lọc
và giống gốc……………………………………………………….

45

48

49

52

Bảng 3.7. Tỷ lệ thiệt hại ở giai đoạn cây mạ trong điều kiện gây hạn nhân tạo..

56

Bảng 3.8. Chỉ số chịu hạn của các dòng chọn lọc thế hệ R4..............................

58

Bảng 3.9. Thống kê các nucleotit sai khác giữa dòng R4.05 với các giống đã
công bố trên Genbank……………………………………………...
Bảng 3.10. So sánh mức độ tƣơng đồng gen GA2ox1 của dòng R4.05 với các
giống đã công bố trên Genbank……………………………………
Bảng 3.11. So sánh sự sai khác về axit amin ở một số vị tri giữa dòng R4.05
với các giống đã công bố trên Genbank………………………..…..

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên



66

67

69


7

DANH MỤC CÁC HÌNH
Trang
Hình 2.1. Sơ đồ thí nghiệm tổng quát.....................................................................

27

Hình 3.1. Các dòng chọn lọc và giống gốc thế hệ R3 (vụ mùa 2008)……………

38

Hình 3.2. Các dòng R3.04, R3.05 và Khang dân gốc (vụ mùa 2008)……………. 39
Hình 3.3. Hình ảnh điện di protein dự trữ trong hạt dòng chọn lọc và giống gốc.
Hình 3.4. Biểu đồ so sánh hàm lƣợng 7 loại axit amin không thay thế trong hạt
các dòng chọn lọc, giống gốc và của FAO………….............................
Hình 3.5. Khả năng tạo mô sẹo và tái sinh cây của các dòng chọn lọc và giống
gốc…………………………………………………………………….

Hình 3.6. Tốc độ mất nƣớc của mô sẹo các dòng chọn lọc và giống gốc sau xử
lý thổi khô……………………………………………………………
Hình 3.7. Khả năng sống sót của mô sẹo sau khi xử lý thổi khô…………………

47
50

52

53
54

Hình 3.8. Khả năng tái sinh cây từ mô sẹo sau khi xử lý thổi khô……………….. 55
Hình 3.9. Biểu đồ biểu diễn tỷ lệ thiệt hại do hạn gây ra sau 3, 5, 7 ngày hạn…..

57

Hình 3.10. Đồ thị biểu diễn khả năng chịu hạn của các dòng chọn lọc thế hệ R4.. 59
Hình 3.11. Kết quả điện di kiểm tra ADN tổng số của dòng R4.05……………… 61
Hình 3.12. Kết quả PCR nhân gen GA2ox1 với cặp mồi EX2-3-F và EX2-3-R… 62
Hình 3.13. Sơ đồ vector pBT đƣợc cải biến từ vector pUC18…………………… 62
Hình 3.14. Kết quả biến nạp vector tái tổ hợp và tế bào khả biến E.coli

63

DH5α.....
Hình 3.15. Kết quả điện di sản phẩm colony-PCR……………………………….

64

Hình 3.16. Kết quả điện di plasmit tinh sạch chứa đoạn gen GA2ox1…………...

65

Hình 3.17. Điện di sản phẩm cắt plasmit tái tổ hợp bằng enzym BamHI………... 65
Hình 3.18. Trình tự nucleotit đoạn gen GA2ox1 tách dòng đƣợc của dòng R3.05
so với các giống đã công bố trên Genbank…………………………..
Hình 3.20. Trình tự nucleotit đoạn gen GA2ox1 và trình tự axit amin tƣơng ứng
của dòng R4.05 so với các giống đã công bố trên Genbank………….

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên



68

70


8

NHỮNG CHỮ VIẾT TẮT
2,4D

Axit 2,4 – Dichlorphenoxyacetic

ABA

Axit Abscisic

ATPase

Adenosin triphosphatase (Enzym phân giải ATP giải phóng năng lƣợng)

ADN

Axit Deoxyribose Nucleic

AFLP

Amplified Fragment Length Polymorphism

bp

base pair = cặp bazơ nitơ

Sn

Chỉ số chịu hạn tƣơng đối

EDTA

Axit Ethylene Diamin Tetraaxetic

FAO

Food Agriculture Orgnization (Tổ chức nông lƣơng thế giới)

GA

Axit Gibberellic

HSP

Heat shock protein (Protein sốc nhiệt)

IPTG

Isopropyl-  -D-thiogalactopyranoside

IRRI

International Rice Research Institute (Viện nghiên cứu lúa quốc tế)

Kb

Kilobase

LEA

Late Embryogenesis Abundant protein

MS

Murashige and Skoog (Môi trƣờng theo Murashige và Skoog)

NST

Nhiễm sắc thể

OsGA2ox1

Gen mã hoá cho enzym GA 2 oxidase-1 đăng ký trên Genbank

PCR

Polymerase Chain Reaction (Phản ứng chuỗi polymerase)

ARNase

Ribonuclease

SDS

Sodium Dodecyl Sulphat

SDS-PAGE Phƣơng pháp điện di trên gel polyacrylamid có chứa SDS
TAE

Tris - Acetate – EDTA

SSR

Simple Sequence Repeats (trình tự lặp lại đơn giản)

TE

Tris – EDTA

TELT

Tris – EDTA – LiCl – Triton X100

X-gal

5-brom-4-chloro-3-indolyl-  -D-galactosidase

Tris

Trioxymetylaminometan

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên




9

MỞ ĐẦU
1. Đặt vấn đề
Cây lúa (Oryza sativa L.) là cây lƣơng thực ngắn ngày thuộc họ hoà thảo có
giá trị kinh tế, giá trị dinh dƣỡng khá cao và giữ vai trò quan trọng trong cơ cấu cây
trồng của nƣớc ta hiện nay. Thống kê năm 1998 cho thấy, cả nƣớc có 7362400 ha
đất trồng lúa và sản lƣợng thóc đạt 29,14 triệu tấn, bình quân năng suất đạt 35,58
tạ/ha [18].
Tuy nhiên, cây lúa chịu ảnh hƣởng lớn của chế độ nƣớc, điều kiện nhiệt độ và
nhiều yếu tố bất lợi khác của môi trƣờng (mặn, phèn…). Trong những yếu tố bất
lợi, hạn hán đƣợc xem là nhân tố chính làm giảm năng suất lúa. Ở Việt Nam hàng
năm diện tích lúa nƣớc bị khô hạn lên tới 0,4 triệu ha [17]. Trong 130 triệu ha đất
trồng lúa trên thế giới thì có tới 26 triệu ha đất bị hạn nặng gây ảnh hƣởng đến năng

suất [3]. Để nâng cao và ổn định sản lƣợng lúa trong điều kiện khô hạn nhằm làm
giảm thiểu thiệt hại do hạn hán gây ra bằng việc xác định và chọn tạo ra những
giống lúa có khả năng chịu hạn đã trở thành một trong những vấn đề cấp thiết hiện
nay.
Để tạo đƣợc giống lúa có năng suất cao, phẩm chất tốt thích nghi với các
vùng sinh thái nông nghiệp khác nhau và đa dạng nguồn gen, nhiều nghiên cứu đã
đƣợc thực hiện để cải thiện giống thông qua phƣơng pháp chọn dòng biến dị soma.
Chọn dòng tế bào thực vật là một hƣớng mới cho cải tạo giống cây trồng, khắc phục
những hạn chế của phƣơng pháp truyền thống. Kỹ thuật nuôi cấy in vitro tạo ra
những biến đổi về kiểu gen và kiểu hình, vì vậy có thể chọn lọc đƣợc các dòng tế
bào khác nhau về đặc điểm sinh lý, sinh hóa… theo định hƣớng của ngƣời thực
nghiệm. Phƣơng pháp này cho phép thu đƣợc những dòng và giống có khả năng
chống chịu cao với các điều kiện bất lợi của môi trƣờng [3]; [7]; [14]; [18]; [20].
Sự ra đời và phát triển các kỹ thuật sinh học phân tử nhƣ PCR, RT-PCR,
RFLP, SSR, các kỹ thuật tách dòng và đọc trình tự gen... đã và đang đƣợc ứng dụng
trong phân tích genom ở thực vật. Các kỹ thuật sinh học phân tử hiện đại giúp các
nhà nghiên cứu chọn giống phân tích và đánh giá bộ gen của thực vật một cách
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên