ĐỀ CƯƠNG THỰC HÀNH VI SINH y học

Lao động là cha đẻ của hạnh phúc!

ĐỀ CƯƠNG THƯC HÀNH VI SINH Y HỌC
(ĐỐI TƯỢNG SV Y2 CHÍNH QUY)

Câu 1. Kể tên các loại hình thể vi khuẩn và cho ví dụ minh họa với các loại
vi khuẩn mà anh (chị) đã biết qua học thực hành?
Các loại hình thể vi khuẩn : cầu khuẩn, trực khuẩn, xoắn khuẩn.
Cầu khuẩn: là những vi khuẩn có hình cầu, ví dụ: tụ cầu vàng, liên cầu A,
lậu cầu, phế cầu…
Trực khuẩn: là những vi khuẩn có hình que, ví dụ: trực khuẩn lao, trực
khuẩn shigella gây bệnh lỵ, trực khuẩn salmonella gây bệnh thương hàn…
Xoắn khuẩn: là những vi khuẩn xoắn theo dạng lò xo, ví dụ: xoắn khuẩn
giang mai, leptospira…
Câu 2. Nêu các phương pháp chẩn đoán vi sinh vật, cho ví dụ minh họa?
Các phương pháp chẩn đoán vi sinh vật gồm: chẩn đoán trực tiếp và chẩn đoán
gián tiếp:
1.
Chẩn đoán trực tiếp: là phương pháp nhằm xác định sự có mặt của vi sinh
vật, thành phần cấu tạo của vi sinh vật (enzym, thành phần kháng nguyên: lông,
vỏ, vách), các sản phẩm do vi sinh vật tạo ta (độc tố, độc lực).
Bao gồm các kỹ thuật:
. Soi tươi: Soi trực tiếp vi khuẩn sống
. Nhuộm soi: Giết vi khuẩn rồi nhuộm màu
. Nuôi cấy: tạo môi trường dinh dưỡng cho vi sinh vật phát triển tồi cấy lên môi
trường để xác định tính chất, định danh.
. Gây bệnh trên thực nghiệm: lên các loài động vật
. Phát hiện kháng nguyên bằng các phản ứng miễn dịch bằng kháng thể mẫu.
. Kỹ thuật sinh học phân tử: phát hiện AND/ARN (quá trình tổng hợp AND
thực hiện bên ngoài phân tử sống)
VD: để chẩn đoán vi khuẩn lao:

. Nhuộm Ziel-Neelsen
. Nuôi cấy (từ 2 đến 8 tuần mới tạo được khuẩn lạc)
. Gây bệnh thực nghiệm trên chuột lang
. Phản ứng miễn dịch (nhuộm miễn dịch huỳnh quang)
. PCR để xác định DNA của vi khuẩn lao.
2.
Chẩn đoán gián tiếp:
Thuốc không phải luôn luôn cần thiết nhưng niềm tin khỏi bệnh là điều
luôn luôn cần!
Page 1


Lao động là cha đẻ của hạnh phúc!
Là phương pháp xác định sự có mặt của kháng thể đặc hiệu với kháng
nguyên của vi sinh vật trong huyết thanh của bệnh nhân.
Kháng thể này được tìm thấy trong huyết thanh của bệnh nhân nên phản
ứng này còn được gọi là phản ứng huyết thanh học.
Nguyên lý: dùng kháng nguyên mẫu để tìm kháng thể.
Tùy theo từng loại vi sinh vật có thể áp dụng các kỹ thuật hiệu quả nhất,
phù hợp nhất.
Câu 3. Tiệt trùng là gì? Nêu các phương pháp được sử dụng trong tiệt
trùng?
1.
Khái niệm: Tiệt trùng là tiêu diệt tất cả các vi sinh vật (kể cả nha bào) và
bất hoạt virus hoặc loại bỏ hoàn toàn ra khỏi vật cần tiệt trùng.
2.
Các biện pháp tiệt trùng
Nguyên tắc chung: tất cả các biện pháp đều phải tiêu diệt được vi sinh
vật và nha bào ở cả trong và ngoài vật cần tiệt trùng.
2.1. Khí nóng khô

Không khí được sấy nóng bằng tủ sấy 170-180 oC/1h
Áp dụng: để tiệt trùng các vật dụng chịu nhiệt như kim loại, thủy tinh, đồ
gốm. Không dùng để tiệt trùng các vật dễ cháy như nhựa, cao su…
2.2. Hơi nước ở áp suất cao (to cao)
Sử dụng lò hấp (nồi hấp) tạo hơi nước căng và bão hòa ở nhiệt độ >100oC
dùng để tiệt trùng.
Áp dụng: tiệt trùng các dụng cụ kim loại, thủy tinh, đồ vải, cao su, một số
chất dẻo, dung dịch lỏng, môi trường nuôi cấy vi khuẩn. Sử dụng thận trọng,
đảm bảo các quy tắc về an toàn.
2.3. Tia Gama
Là bức xạ ion hóa giàu năng lượng có thể tiêu diệt vi sinh vật
Áp dụng: tiệt trùng chỉ katgut và các vật dụng nhạy cảm với Ethylenoxid
hay nhiệt độ cao như catheter và các mảnh ghép.
Tiệt trùng các dụng cụ và bông băng trong những túi đóng sẵn.
2.4. Sử dụng hóa chất
Thường dùng là ethylenoxid và Formaldehyd
Hạn chế: ethylenoxid là chất độc, gây dị ứng, kích thích niêm mạc mạnh
và dễ gây cháy, ung thư. Vì vậy khi sử dụng phải cẩn thận, đề phòng cháy nổ.
2.5. Lọc vô trùng
Lọc bằng màng: dùng màng lọc với khe hở nhỏ đủ để giữ lại vi sinh vật

Thuốc không phải luôn luôn cần thiết nhưng niềm tin khỏi bệnh là điều
luôn luôn cần!
Page 2


Lao động là cha đẻ của hạnh phúc!
Lọc sâu: dòng chảy đi qua 1 lớp vật liệu có cấu tạo sợi, hạt và gắn những
vi sinh vật vào cấu trúc mạng.
Áp dụng: chỉ để lọc chất khí, lỏng, những sản phẩm sinh học không thể

áp dụng các biện pháp tiệt trùng khác.
Câu 4. Khử trùng là gì? Các phương pháp được sử dụng trong khử trùng ?
1.
Định nghĩa: khử trùng là làm cho vật được khử trùng không còn khả
năng gây nhiễm trùng (tiêu diệt mầm bệnh mà không phải là tất cả vi sinh vật)
Nguyên tắc: bất hoạt không phục hồi lại các mầm bệnh
Vai trò: Có vai trò quan trọng khi các tác nhân gây bệnh có thể tồn tại ở nhiều
nơi mà việc tiệt trùng vì nhiều lý do kinh tế và thực thế không thể áp dụng rộng
rãi được.
2.
Các biện pháp vật lý
2.1. Hơi nước nóng
Thường dùng luồng hơi nước nóng 80-100oC vì nó tiêu diệt tế bào sinh
trưởng ở trạng thái tự do trong vài phút.
Áp dụng: khử trùng chăn, màn, quần áo, các dụng cụ đã dùng của người
bệnh
2.2. Tia cực tím
Cơ chế: tia cực tím làm biến đổi cấu trúc các phân tử của vi sinh vật như
acid nucleic dẫn đến đột biến làm hỏng vật liệu di truyền và chết.
Áp dụng: khử trùng không khí hay nước sạch
Hạn chế: - diệt được hầu hết vi khuẩn nhưng không tiêu diệt được nha
bào và bào tử nấm, có thể gây viêm kết mạc và giác mạc
3.
Các biện pháp hóa học.
3.1. Cồn
Cơ chế: làm biến tính protein và phá hủy cấu trúc màng tế bào.
Áp dụng: khử trùng da, nhất là khử trùng bàn tay trong phẫu thuật và vệ
sinh phòng bệnh.
Hạn chế: không tiêu diệt được nha bào, tác dụng diệt virus có nhiều ý
kiến khác nhau. Cồn dễ cháy và dễ bay hơi. Khi sử dụng dùng cồn 70o để tránh

bỏng da.
3.2. Phenol và dẫn xuất phenol
Cơ chế: phá hủy màng tế bào, bất hoạt enzym và biến tính protein
Áp dụng: chỉ dùng để đánh giá tác dụng sát khuẩn của 1 hóa chất.
Chỉ số phenol là [P]min/[chất sát khuẩn]min cùng có tác dụng như nhau
lên 1 loài vi khuẩn trong một thời gian nhất định.
Thuốc không phải luôn luôn cần thiết nhưng niềm tin khỏi bệnh là điều
luôn luôn cần!
Page 3


Lao động là cha đẻ của hạnh phúc!
Hạn chế: không diệt được nha bào và virus, có thể ăn da, niêm mạc và
còn có thể gây độc với thần kinh.
3.3. Nhóm Halogen
Cơ chế: phá hủy màng tế bào, gây bất hoạt enzym
Một số halogen thường dùng: clo thường dùng trong thanh khuẩn nước ăn
và nước hồ bơi
Clorua vôi dùng để khử trùng chất nôn, chất thải và dụng cụ thô hoặc rắc
hố xí
3.4. Muối của kim loại nặng
Hoạt tính kháng khuẩn theo thứ tự Hg, Ag, Cu, Zn
Cơ chế: làm bất hoạt protein
Hạn chế: không diệt được nha bào, virus và khả năng tiêu diệt các vi
khuẩn kháng acid còn yếu.
Áp dụng: các hợp chất hữu cơ của Hg thường được dùng sát trùng vết
thương, da và niêm mạc hoặc dùng trong lưu trữ chế phẩm sinh học (vaccine,
kháng huyết thanh)
Nitrat bạc được pha chế dung dịch nhỏ mắt cho trẻ sơ sinh
Sulfat kẽm hoặc kem/mỡ oxid kẽm thường dùng để điều trị bệnh ngoài da

do da nhiễm vi khuẩn hoặc nấm.
3.5. Aldehyd
Dung dịch Formaldehyd: tiêu diệt cả vi khuẩn, nấm và virus, nếu đủ thời
gian và nhiệt độ cao nó còn tiêu diệt được cả nha bào
Áp dụng: dung dịch nước để lau chùi sàn nhà và đồ dùng, khi dùng để
khử trùng không khí và máy móc lớn
Hạn chế: gây kích thích da, niêm mạc, có thể dẫn tới dị ứng và nghi ngờ
có thể gây ung thư. Nó làm tủa protein nên không dùng để khử trùng chất thải.
3.6. Một số chất khác
Các chất oxi hóa (H2O2, KmnO4) và thuốc nhuộm (ví dụ: xanh methylen,
tím tinh thể) được pha chế thành dung dịch lỏng, thường dung làm chất sát
khuẩn, có tác dụng ức chế hoặc giết chế vi khuẩn
Acid và base có tác dụng diệt vi khuẩn vì tính điện phân thành H+ và
OH- mạnh
Câu 5. Trình bày các bước chuẩn bị một tiêu bản nhuộm?
Sau khi chuẩn bị đầy đủ vi khuẩn hoặc bệnh phẩm để nhuộm cùng các dụng cụ
khác như đèn cồn, que cấy, máy lửa, nước muối sinh lý, lam kính sạch… Để
đảm bảo có được một tiêu bản tốt sau khi nhuộm, quá trình làm tiêu bản để
Thuốc không phải luôn luôn cần thiết nhưng niềm tin khỏi bệnh là điều
luôn luôn cần!
Page 4


Lao động là cha đẻ của hạnh phúc!
nhuộm được chia ra 4 bước theo đúng trình tự sau: dàn phiến đồ, để khô, cố
định và nhuộm.
1.
Dàn phiến đồ: nhằm mục đính rải đều một lớp mỏng và đều vi khuẩn
hoặc bệnh phẩm lên lam kính, giúp cho việc quan sát vi khuẩn được rõ ràng.
Nếu dàn phiến đồ dày hoặc không đều thì vi khuẩn sẽ chồng đống hoặc chỗ

thưa chỗ dày, khó quan sát.
Với phương pháp nhuộm Gram: dàn hình tròn theo vòng xoáy trôn ốc, từ
trong ra ngoài, đường kính 1 cm
Với phương pháp nhuộm Ziehl-Neelsen: dàn theo hình elip, đường kính
2-3 cm
2.
Để khô phiến đồ: nhằm mục đích giúp cho vi khuẩn dính chặt vào lam
kính, chúng không bị rửa trôi đi khi rửa nước và khi cố định bằng hóa chất.
Ngoài ra để khô còn có tác dụng giữ cho hình thể vi khuẩn không bị biến dạng
khi cố định bởi nhiệt độ. Bởi vì, khi phiến đồ còn ướt nếu cố định bằng nhiệt độ
(thường dùng ngọn lửa đèn cồn) thì vi khuẩn sẽ bị mất nước đột ngột, gây biến
dạng hình thể vi khuẩn và tế bào có trong bệnh phẩm. Khi đó việc nhận định
hình thể vi khuẩn và các tế bào sẽ gặp khó khăn.
3.
Cố định: nhằm giết chế vi khuẩn trước khi nhuộm. Phải giết chết vi khuẩn
trước khi nhộm là vì: khả năng bắt màu thuốc nhuộm của vi khuẩn sẽ là tốt nhất
khi chúng đã bị chết, khi còn sống thì khả năng này của chúng là rất kém. Có
thể cố định bằng hóa chất hoặc bằng nhiệt độ.
4.
Nhuộm: nhằm mục đích cho vi khuẩn có màu sắc do sự bắt màu các
thuốc nhuộm của chúng.
Câu 6. Trình bày kỹ thuật nhuộm đơn (nhuộm xanh methylen) và cách
nhận định kết quả.
Có nhiều kỹ thuật nhuộm khác nhau, tuy nhiên, về cơ bản, người ta chia ra làm
hai phương pháo là nhuộm đơn và nhuộm kép:
Nhuộm đơn: là kỹ thuật nhuộm chỉ dùng một loại thuốc nhuộm trong quá
trình nhuộm. Ví dụ như nhuộm đơn bằng xanh methylen, đỏ fucxin, tím
gentian… Nhuộm đơn chỉ đơn giản cho biết được hình thể và cách sắp xếp của
vi khuẩn, không cho biết được khả năng bắt màu khác nhau giữa các vi khuẩn.
Vì vậy, nhuộm đơn ít có ý nghĩa trong việc phân loại và chẩn đoán vi khuẩn.

Kỹ thuật nhuộm đơn là rất đơn giản, sau khi cố định tiêu bản, nhỏ thuốc
nhuộm phủ kín phiến đồ, để 1 phút, rửa nước, để khô.
Nhận định vi khuẩn: các vi khuẩn có trong bệnh phẩm đều bắt màu xanh.
Câu 7. Trình bày kỹ thuật nhuộm Gram và cách nhận định kết quả?
Thuốc không phải luôn luôn cần thiết nhưng niềm tin khỏi bệnh là điều
luôn luôn cần!
Page 5


Lao động là cha đẻ của hạnh phúc!
1.
Các hóa chất và thuốc nhuộm:
Các hóa chất và thuốc nhuộm được dùng trong kỹ thuật nhuộm Gram gồm có:
Thuốc nhuộm gentian có màu tím
Dung dịch lugol: là hỗn hợp của iod và KI pha trong cồn, nó có tác dụng
tạo phức hợp màu tím với thuốc nhuộm gentian.
Dung dịch cồn – aceton (pha theo thể tích 1:1) dùng để tẩy màu của phức
hợp tím.
Thuốc nhuộm fucxin có màu đỏ
2.
Trình tự các bước tiến hành nhuộm Gram
Sau khi chuẩn bị xong tiêu bản nhuộm trình tự các bước được thực hiện như
sau:
Bước 1: nhuộm màu vi khuẩn bằng thuốc nhuộm gentian. (30s)
Bước 2: nhỏ dung dịch lugol (30s)
Bước 3: tẩy màu tím bằng nhỏ dung dịch cồn – aceton: khi thấy ánh tím
từ phiến đồ vừa hòa tan hết trong cồn aceton là được. (30s)
Bước 4: nhuộm màu vi khuẩn bằng thuốc nhuộm fucxin (30s)
Chú ý: sau mỗi bước trên đều phải rửa nhẹ phiến đồ bằng nước sạch. Sau khi
nhuộm xong, phải để khô tiêu bản rồi mới nhỏ dầu để soi.

3.
Nhận định kết quả nhuộm Gram
Các vi khuẩn có màu tím là vi khuẩn Gram (+)
Các vi khuẩn có màu đỏ là Gram (-)
Câu 8: Trình bày cơ chế bắt màu thuốc nhuộm của vi khuẩn trong kỹ thuật
nhuộm Gram.
Tùy theo cấu tạo hóa học của vách vi khuẩn, ở bước 2 đã tạo ra phức hợp tím
tạo vách tế bào vi khuẩn. Phức hợp tím này có khả năng là bền hay không bền
với cồn aceton.
Thuốc không phải luôn luôn cần thiết nhưng niềm tin khỏi bệnh là điều
luôn luôn cần!
Page 6


Lao động là cha đẻ của hạnh phúc!
Phức hợp tím bền với cồn aceton: khi tẩy bằng cồn ở bước 3, phức hợp
màu tím ở vách tế bào vi khuẩn không bị hòa tan trong cồn. Do đó khi nhuộm
tiếp bằng đỏ fucxin ở bước 4, vách không bắt màu đỏ của fucxin và vi khuẩn có
màu tím. Các vi khuẩn có khả năng này là vi khuẩn G (+) (do lớp peptidoglycan
ở thành tế bào của vi khuẩn G (+) dày hơn G(-).
Phức hợp tím không bền với cồn aceton: khi tẩy cồn ở bước 3, phức hợp
màu tím ở vách tế bào vi khuẩn bị hòa tan trong cồn, sẽ bị trôi đi khi rửa nước
và vách mất màu. Vì vậy, khi nhuộm tiếp bằng đỏ fucxin ở bước 4 thì vách vi
khuẩn sẽ bắt màu đỏ của fucxin. Các vi khuẩn bắt màu đỏ này được gọi là vi
khuẩn G (-)
Câu 9. Trình bày kỹ thuật nhuộm Ziehl-Neelsen và cách nhận định kết
quả?
1.
Các hóa chất và thuốc nhuộm

Thuốc nhuộm đỏ fucxin: nồng độ đặc hơn fucxin dùng trong kỹ thuật
nhuộm Gram.
Dung dịch cồn acid: cồn 90 độ pha loãng với H2SO4 4% theo tỷ lệ bằng
nhau: dùng để tẩy màu thuốc nhuộm từ vách vi khuẩn
Thuốc nhuộm xanh methylen có màu xanh
2.
Trình tự các bước nhuộm Ziehl-Neelsen
Sau khi chuẩn bị xong tiêu bản nhuộm, trình tự các bước được thực hiện như
sau:
Bước 1: Nhuộm màu vi khuẩn bằng thuốc nhuộm fucxin: sau đó dùng
ngọn đèn cồn hơ nóng ở phía dưới tiêu bản, khi thấy hơi bốc lên là được. Hơ
nóng là dùng nhiệt để làm giãn nở cấu trúc lớp sáp bao bọc ở ngoài vách của
các vi khuẩn kháng cồn kháng acid, tạo điều kiện cho thuốc nhuộm ngấm được
vào vách vi khuẩn.
Bước 2: Tẩy màu bằng cồn acid: tẩy đến khi thấy hết màu đỏ là được.
Bước 3: Nhuộm màu vi khuẩn bằng thuốc nhuộm methylen: giúp cho các
vi khuẩn bị mất màu đỏ khi tẩy cồn sẽ bắt màu xanh.

Nhận định kết quả:
Vi khuẩn bắt màu đỏ của fucxin là các vi khuẩn kháng cồn kháng acid
(viết tắt là AFB – acid fast bacilli) như vi khuẩn lao, vi khuẩn hủi…
Các vi khuẩn bắt màu xanh của methylen: bao gồm tất cả các loại vi
khuẩn không có tính kháng cồn kháng acid, tất nhiên là gồm cả các loại tế bào
nếu là nhuộm bệnh phẩm. Trên thực tế, nếu có trực khuẩn kháng cồn kháng acid
thì hình ảnh cơ bản của tiêu bản nhuộm Ziehl-Neelsen là: trên nền vi trường
Thuốc không phải luôn luôn cần thiết nhưng niềm tin khỏi bệnh là điều
luôn luôn cần!
Page 7

Lao động là cha đẻ của hạnh phúc!
màu xanh ( được tạo ra từ các tạp khuẩn và các tế bào…có trong bệnh phẩm),
có các trực khuẩn mảnh bắt màu đỏ nằm rải rác với số lượng khác nhau tùy theo
sự có mặt của chúng trong bệnh phẩm.
Câu 10. Giải thích tại sao trực khuẩn lao bắt màu đỏ Fucshin khi nhuộm
Ziehl-Neelsen?
Tùy theo vi khuẩn có khả năng kháng cồn kháng acid hay không mà vi khuẩn
bắt màu đỏ của fucxin hay màu xanh của methylen trong kỹ thuật nhuộm ZiehlNeelsen.
Ở bước 1, tất cả phiến đồ đều bắt màu đỏ fucxin
Khi tẩy cồn ở bước 2, các vi khuẩn kháng cồn kháng acid sẽ không bị
dung dịch cồn acid tẩy mất màu đỏ tại vách. Trong khi đó, các vi khuẩn khác
không có khả năng này sẽ bị dung dịch cồn acid hòa tan và bị nước rửa trôi hết
màu đỏ tại vách.
Khi nhuộm bằng xanh methylen ở bước 3, vách của những vi khuẩn
kháng cồn kháng acid vẫn giữ được màu đỏ nên không bắt màu thuốc nhuộm
nữa. Trong khi đó các vi khuẩn bị mất màu đỏ ở bước tẩy cồn acid sẽ bắt màu
của methylen và có màu xanh
 Trực khuẩn lao là vi khuẩn kháng cồn kháng acid nên bắt màu đỏ fucxin
khi nhuộm.
Câu 11. Kể tên các kỹ thuật xét nghiệm chẩn đoán vi sinh mà anh (chị) đã
nhận biết được trong quá trình học thực hành?
Các kỹ thuật xét nghiệm chẩn đoán vi sinh gồm:
1.
Chẩn đoán trực tiếp
Là phương pháp nhằm xác định sự có mặt của vi sinh vật, thành phần cấu
tạo của vi sinh vật ( enzym, thành phần kháng nguyên: lông, vỏ, vách), các sản
phẩm do vi sinh vật tạo ra (độc lực, độc tố).
Bao gồm các kỹ thuật
. Soi tươi: soi trực tiếp vi khuẩn sống
. Nhuộm soi: giết vi khuẩn rồi nhuộm màu (bao gồm nhuộm đơn (nhuộm xanh

methylen), và nhuộm kép (Nhuộm Gram và nhuộm Ziehl-Neelsen)
. Nuối cấy: tạo môi trường dinh dưỡng cho vi sinh vật phát triển rồi cấy lên môi
trường để xác định tính chất, định danh
. Gây bệnh thực nghiệm: lên các loài động vật
. Phát hiện kháng nguyên bằng các phản ứng miễn dịch bằng kháng thể mẫu
. Kỹ thuật sinh học phân tử: phát hiện AND/ARN (quá trình tổng hợp AND
thực hiện bên ngoài phân tử sống).
Thuốc không phải luôn luôn cần thiết nhưng niềm tin khỏi bệnh là điều
luôn luôn cần!
Page 8


Lao động là cha đẻ của hạnh phúc!
2.
Chẩn đoán gián tiếp
Là xác định sự có mặt của kháng thể đặc hiệu với kháng nguyên của vi
sinh vật trong huyết thanh của bệnh nhân
Kháng thể này được tìm thấy trong huyết thanh của bệnh nhân nên phản
ứng này còn được gọi là phản ứng huyết thanh học.
ASLO, RPR, ELISA, Sắc ký miễn dịch, MDHQ gián tiếp
Câu 12. Kể tên các loại bệnh phẩm thường được lấy từ các bệnh nhân để
nuôi cấy tìm vi khuẩn gây bệnh? Cho ví dụ minh họa?
Các loại bệnh phẩm thường được lấy từ các bệnh nhân để nuôi cấy tìm vi khuẩn
gây bệnh gồm
Bệnh phẩm phân: Sallmonela, Shigella, E. coli, V. cholera, S. aureus.
Bệnh phẩm máu: liên cầu A, HIV, HBC,…
Bệnh phẩm mủ dịch: dịch tiết, ổ áp xe vỡ, ổ áp xe kín, dịch trong khoang
cơ thể (dịch màng bụng, màng phổi, màng tim) như lao, lậu cầu, mủ xanh,…
Câu13. Trình bày cách lấy bệnh phẩm mủ dịch?
Để đảm bảo cho kết quả xét nghiệm chính xác, việc lấy bệnh phẩm là khâu đầu

tiên đóng vai trò rất quan trọng. Nguyên tắc của lấy bệnh phẩm mủ dịch giống
nguyên tắc chung là lấy bệnh phẩm càng sớm càng tốt, lấy trước khi dùng
kháng sinh, phải đảm bảo vô trùng và gửi ngay đến phòng xét nghiệm, chậm
nhất là 2 giờ sau khi lấy bệnh phẩm.
Ở phòng xét nghiệm nếu chưa xét nghiệm được ngay, phải bảo quản bệnh phẩm
trong ngăn mát của tủ lạnh. Một số bệnh phẩm ở quá xa phòng xét nghiệm phải
được giữ trong môi trường bảo quản riêng để giữ cho vi khuẩn không chết trong
thời gian vận chuyển. Riêng cấy mủ tìm lậu cầu phải tiến hàng ngay ở phòng thí
nghiệm vì vi khuẩn lậu chết rất nhanh khi ra ngoài môi trường.
Trường hợp bệnh nhân đang được điều trị bằng kháng sinh toàn thân hoặc tại
chỗ, phải ngừng kháng sinh ít nhất sau 48h trước khi lấy mủ và dịch để xét
nghiệm.
1.
Lấy bệnh phẩm từ các ổ áp xe kín và các dịch trong khoang vô trùng
Trong các trường hợp trên, việc lấy bệnh phẩm phải đảm bảo tuyệt đối vô trùng.
Bởi vì, nếu làm được nhưng vậy thì việc xác định căn nguyên gây nhiễm trùng
sẽ rất dễ dàng. Nếu để vi khuẩn bên ngoài nhiễm vào bệnh phẩm sẽ gây khó
khăn cho việc xác định căn nguyên vi khuẩn gây bệnh.
Để thực hiện vô trùng khi lấy bệnh phẩm, người ta thường dùng cồn iot 2% sát
khuẩn da trước khi chọc hút mủ hoặc dịch bằng bơm tiêm vô khuẩn. Ống
nghiệm chứa bệnh phẩm mủ hoặc dịch phải là ống vô trùng và có nút đậy kín.
Thuốc không phải luôn luôn cần thiết nhưng niềm tin khỏi bệnh là điều
luôn luôn cần!
Page 9


Lao động là cha đẻ của hạnh phúc!
Động tác bơm bệnh phẩm từ bơm tiêm vào ống nghiệm tốt nhất phải được thực
hiện ngay cạnh ngọn lửa đèn cồn để đảm bảo vô trùng. Trong trường hợp hút
được ít mủ hoặc dịch thì phả gửi cả bơm tiêm đến phòng xét nghiệm, không nên

bơm bệnh phẩm vào ống nghiệm.
2.
Lấy bệnh phẩm từ ổ áp xe đã vỡ và các tổn thương hở có tiết mủ hoặc
dịch
Trong những trường hợp này, khi lấy bệnh phẩm phải cố gắng thực hiện theo
nguyên tắc càng vô trùng được càng tốt.
Nếu thương tổn là ổ áp xe có vẩy khô bao phủ và có nhiều mủ thì phải dùng gạc
vô khuẩn làm bong vẩy rồi dùng bơm tiêm vô khuẩn chọc hút mủ ở vị trí sát đáy
hoặc ở giữa ổ áp xe hoặc dùng tăm bông chấm lấy mủ hoặc dịch tiết.
Nếu tổn thương không có vẩy khô bao phủ và có nhiều mủ hoặc dịch thì dùng
bơm tiêm vô khuẩn hút mủ ở vị trí sát đáy hoặc giữa ổ áp xe hoặc của các tổn
thương có chiều sâu. Nếu tổn thương nông và ít mủ hoặc dịch thì dùng tăm
bông vô khuẩn chấm vào chỗ có mủ.
Chú ý: tăm bông và ống nghiệm vô khuẩn do khoa Vi sinh vật cung cấp.
Câu 14. Trình bày cách lấy bệnh phẩm phân? Khi nào cần thiết lấy bệnh
phẩm này làm xét nghiệm?
Cách lấy bệnh phẩm phân:
1.
Nguyên tắc: giống như nguyên tắc chung. Để đảm bảo cho kết quả xét
nghiệm chính xác, việc lấy bệnh phẩm là khâu đầu tiên đóng vai trò rất quan
trọng. Nguyên tắc của lấy bệnh phẩm mủ dịch giống nguyên tắc chung là lấy
bệnh phẩm càng sớm càng tốt, lấy trước khi dùng kháng sinh, phải đảm bảo vô
trùng và gửi ngay đến phòng xét nghiệm, chậm nhất là 2 giờ sau khi lấy bệnh
phẩm.
Ở phòng xét nghiệm nếu chưa xét nghiệm được ngay, phải bảo quản
bệnh phẩm trong ngăn mát tủ lạnh. Một số bệnh phẩm ở quá xa phòng xét
nghiệm phải được giữ trong môi trường bảo quản riêng để giữ cho vi khuẩn
không chết trong thời gian vận chuyển
Trường hợp bệnh nhân đang được điều trị bằng kháng sinh toàn thân hoặc
tại chỗ, phải ngừng kháng sinh ít nhất sau 48h trước khi lấy mủ và dịch để xét

nghiệm.
2.
Dụng cụ:
Que tăm bông đóng trong typ thủy tinh đã được hấp vô trùng.
Sonde thủy tinh: gồm một typ thủy tinh nhỏ, đường kính khoảng 0.6 – 0.7
cm, có một lỗ hở hình ovan kích thước 0.4*0.6 cm cách phần đầu tròn kín
Thuốc không phải luôn luôn cần thiết nhưng niềm tin khỏi bệnh là điều
luôn luôn cần!
Page 10


Lao động là cha đẻ của hạnh phúc!
khoảng 0.7-0.8 cm. Typ thủy tinh nhỏ này được đựng trong typ thủy tinh lớn
đường kính 1.5 cm.
Chú ý: tăm bông vô trùng và dụng cụ lấy phân thủy tinh đều do khoa vi sinh của
bệnh viện cung cấp.
3.
Lấy bệnh phẩm
Có thể lấy phân sau khi bệnh nhân đã đi đại tiện, hoặc có thể lấy phân từ trực
tràng của người bệnh bằng dụng cụ thủy tinh.
3.1. Lấy phân sau khi bệnh nhân đi đại tiện
Cho bệnh nhân đi đại tiện vào bô đã được rửa sạch và tráng lại bằng nước sôi,
để nguội. Dùng que tăm bông thấm quệt vào phân, cho vào typ thủy tinh và
đóng chặt nút bông. Nếu trong phân có biểu hiện tổn thương bệnh lý, phải quệt
tăm bông nhiều lần vào những chỗ có nhày, máu
3.2. Lấy phân từ trực tràng
Dùng dụng cụ thủy tinh, chấm nhẹ phía đầu tròn kín của typ thủy tinh nhỏ vào
dầu parafin rồi đưa từ từ vào hậu môn bệnh nhân với chiều sâu khoảng 3-4 cm
(qua cơ thắt hậu môn), xoay tròn vài ba vòng để cho phân từ trực tràng vào
được bên trong typ thủy tinh nhỏ qua lỗ hình ovan, rút ra cho vào typ to và đóng

chặt nút bông.

Cần lấy bệnh phẩm phân để làm xét nghiệm trong các trường hợp bệnh
nhân bị rối loạn tiêu hóa, ra nhầy, ra nước, tiêu chảy
Câu 15. Tại sao môi trường phân lập bệnh phẩm phân lại phải có chất ức
chế? Nêu ý nghĩa của sự có mặt của bạch cầu trong phân của bệnh nhân
tiêu chảy?
Trong phân thường có rất nhiều loại vi khuẩn khác nhau: trực khuẩn Gram (+),
trực khuẩn Gram (-), các loại cầu khuẩn Gram (+),... vì vậy, người ta phải dùng
các môi trường phân lập có chất ức chế. Các chất này sẽ ức chế hầu hết các vi
khuẩn không thuộc họ vi khuẩn đường ruột, tạo điều kiện cho các vi khuẩn họ
đường ruột phát triển.
Ý nghĩa của sự có mặt của bạch cầu trong phân của bệnh nhân tiêu chảy:
Làm tiêu bản nhuộm Gram: Đồng thời với cấy bệnh phẩm vào môi trường phân
lập là làm tiêu bản nhuộm Gram trực tiếp từ phân để quan sát tế bào bạch cầu
(nếu có) và xem sơ bộ các loại vi khuẩn trong phân. Kết quả nhuộm Gram có ý
nghĩa định hướng phần nào nhóm căn nguyên gây tiêu chảy: theo cơ chế độc tố
hay theo cơ chế xâm nhập của vi khuẩn. Nếu trong phân có nhiều bạch cầu thì
hướng đến các vi khuẩn gây bệnh theo cơ chế xâm nhập, ví dụ như Shigella,
nếu trong phân không có bạch cầu thì nghĩ đến các vi khuẩn gây bệnh bằng
Thuốc không phải luôn luôn cần thiết nhưng niềm tin khỏi bệnh là điều
luôn luôn cần!
Page 11


Lao động là cha đẻ của hạnh phúc!
ngoại độc tố như V. cholerae, S. aureus…, nếu trong phân có rất nhiều cầu
khuẩn Gram (+) hoặc nấm men thì nguyên nhân là do loạn vi khuẩn đường ruột.
Câu 16. Nêu nguyên tắc cấy máu, thời gian theo dõi bình máu và trả kết
quả cấy máu?

Nguyên tắc cấy máu
Nhiễm trùng máu hay nhiễm trùng huyết là một bệnh lý thường gặp trên lâm
sàng. Căn nguyên gây nhiễm trùng máu có thể là vi khuẩn, virus, nấm, đơn bào
ký sinh trùng…
Bình thường máu là môi trường vô trùng. Khi nhiễm trùng huyết, cơ thể thường
có các triệu chứng nhiễm trùng toàn thân, sự hiện diện của vi sinh vật trong máu
lúc đó được coi là căn nguyên gây nhiễm trùng máu. Vì vậy, để xác định đúng
và sớm căn nguyên gây nhiễm trùng máu thì việc cấy máu phải tuân thủ nghiêm
ngặt các nguyên tắc cấy máu, cụ thể là phải đảm bảo vô trùng và đúng lúc.
1.
Vô trùng khi cấy máu
Vô trùng khi cấy máu nhằm để tránh các trường hợp các vi khuẩn từ trên da,
trong không khí hoặc từ dụng cụ lấy máu nhiễm vào bình máu…dẫn đến sai lạc
kết quả cấy máu.
Để đảm bảo vô trùng trong cấy máu, ngoài việc dùng bơm kim tiêm vô trùng,
các thao tác trong cấy máu đều phải đảm bảo vô trùng như: trước khi lấy máu
phải sát khuẩn kỹ nhiều lần bằng tăm bông tẩm cồn iod tại vùng da chỗ lấy
máu; động tác mở nắp bình canh thang và bơm máu vào bình luôn luôn được
tiến hành bên cạnh ngọn lửa đèn cồn; trước khi cấy máu phải rửa tay, đội mũ,
đeo khẩu trang, tắt quạt…
2.
Cấy máu đúng lúc
Muốn có kết quả nhanh, chính xác phải cấy máu vào thời điểm vi khuẩn có mặt
trong máu nhiều nhất. Vì vậy, chỉ cấy máu khi bệnh nhân đang bị sốt, nhất là
khi sốt cao (trừ bệnh Osler, phải cấy máu nhiều lần mới có thể tìm được vi
khuẩn gây bệnh). Trường hợp bệnh nhân đang dùng kháng sinh, phải ngừng
thuốc kháng sinh ít nhất 48h, sau đó mới tiến hành cấy máu.
Để tránh trường hợp nghi ngờ vi khuẩn phân lập được không rõ là căn nguyên
nhiễm trùng máu hay chỉ là vi khuẩn nhiễm vào, tốt nhất là nên cấy máu 2 lần
trở lên. Khi kết quả ở các lần cấy máu là giống nhau thì việc xác định vi khuẩn

gây bệnh sẽ dễ dàng và chính xác hơn.

Thời gian theo dõi bình máu và trả kết quả cấy máu:
Sau khi cấy máu, thực ra người xét nghiệm viên mới chỉ hoàn thành công việc
lấy bệnh phẩm máu cho vào môi trường nuôi cấy. Sau đó bình máu được để
Thuốc không phải luôn luôn cần thiết nhưng niềm tin khỏi bệnh là điều
luôn luôn cần!
Page 12


Lao động là cha đẻ của hạnh phúc!
vào tủ ấm 37 độ và được quan sát hằng ngày trong vòng 7 ngày (trừ bệnh Osler
phải theo dõi trong vòng 15 ngày). Mục đích chủ yếu là tạo điều kiện thuận lợi
cho vi khuẩn phát triển nếu trong máu có vi khuẩn. Thực chất đây chính là giai
đoạn đơn thuần chỉ là phong phú về mặt số lượng vi khuẩn có trong bình máu,
khẳng định rõ ràng về sự hiện diện của vi khuẩn trong bình máu, giúp cho việc
phân lập và xác định vi khuẩn được thực hiện chính xác chỉ với các mẫu máu có
vi khuẩn, các mẫu máu không có vi khuẩn sẽ được khẳng định qua thời gian
theo dõi và không phải phân lập, tránh gây lãng phí môi trường nuôi cấy.
1.
Nếu bình máu không lọc vi khuẩn.
Bình cấy máu hoàn toàn trong, tức là không có hiện tượng vi khuẩn phát triển
trong bình máu thì trả lời là kết quả cấy máu âm tính.
2.
Nếu bình cấy máu có mọc vi khuẩn
Trong bình máu có xuất hiện các hiện tượng như: có váng mỏng trên bề mặt
canh thang hoặc có váng vòng nhẫn quanh thành bình, phần canh thang hơi đục,
đục đều, đục có sắc tố xanh, đục nhanh hoặc vẫn trong nhưng có hạt nhỏ ở phần
nước trong hay ở phần tiếp xúc giữa hồng cầu lắng và canh thang…thì đều là
biểu hiện về sự phát triển của vi khuẩn trong bình máu, khi đó cần tiếp tục các

bước phân lập và xác định vi khuẩn để trả lời kết quả cho thầy thuốc lâm sàng.
Trên thực tế, nếu bình máu không mọc vi khuẩn sau 4 ngày sẽ được trả lời kết
quả sơ bộ là “âm tính sau 4 ngày”. Sau đó theo dõi tiếp, nếu đủ 7 ngày mà vẫn
không mọc vi khuẩn thì coi như chính thức là âm tính và không phải trả lời kết
quả âm tính lại lần nữa. Nếu có vi khuẩn mọc sau 4 ngày thì tiếp tục tiến hành
phân lập và xác định vi khuẩn, sau đó phải trả kết quả bổ sung cho bên lâm
sàng.
Câu 17. Kể tên các môi trường thường dùng để phân lập vi khuẩn mà anh
chị biết được qua học thực hành? Nêu ý nghĩa của bước cấy phân lập?
Các môi trường thường dùng để phân lập vi khuẩn
Thạch máu: phân lập các vi khuẩn của bệnh phẩm máu, mủ dịch
Thạch Socholate (có màu nâu)
MC, DC: có chất ức chế như đỏ fucxin (MC), muối mật (DC), phân lập vi
khuẩn bệnh phẩm phân, có đường lactose để xác định khả năng lên men lactose.
Khuẩn lạc lên men đường lactose có màu tím củ
TCBS, pepton kiềm: phân lập vi khuẩn tả.

Ý nghĩa của bước cấy phân lập: tạo khuẩn lạc riêng rẽ

Thuốc không phải luôn luôn cần thiết nhưng niềm tin khỏi bệnh là điều
luôn luôn cần!
Page 13


Lao động là cha đẻ của hạnh phúc!

Môi trường thạch máu

Thuốc không phải luôn luôn cần thiết nhưng niềm tin khỏi bệnh là điều
luôn luôn cần!

Page 14


Lao động là cha đẻ của hạnh phúc!

Môi trường TCBS

Thuốc không phải luôn luôn cần thiết nhưng niềm tin khỏi bệnh là điều
luôn luôn cần!
Page 15


Lao động là cha đẻ của hạnh phúc!

Môi trường MC, có lên men đường lactose.
Câu 18. Nêu trình tự các bước của quá trình nuôi cấy bệnh phẩm tìm vi
khuẩn gây bệnh? Ý nghĩa của từng bước?
1.
Phân lập vi khuẩn
Cấy bệnh phẩm vào môi trường phân lập (thường là đĩa thạch máu, có thể gồm
cả đĩa thạch Socholate). Khi cấy bệnh phẩm lên mặt thạch, yêu cầu phải cấy
phân vùng tốt để vi khuẩn đủ thưa và cho các khuẩn lạc riêng rẽ sau khi mọc.
Thực chất của việc cấy phân vùng là phải thực hiện đốt que cấy giữa chừng
trong quá trình ria cấy bệnh phẩm, làm sao để mật độ vi khuẩn trên đường ria
cấy ở các vùng sau ngày càng thưa. Như vậy, sau khi vi khuẩn mọc chắc chắn
sẽ có được khuẩn lạc riêng rẽ. Nếu trong bệnh phẩm không có vi khuẩn thì trên
tất cả các vùng cấy đều không có khuẩn lạc. Nếu trong bệnh phẩm có vi khuẩn
Thuốc không phải luôn luôn cần thiết nhưng niềm tin khỏi bệnh là điều
luôn luôn cần!
Page 16

Lao động là cha đẻ của hạnh phúc!
thì tùy theo số lượng vi khuẩn có trong bệnh phẩm ít hay nhiều mà khuẩn lạc
riêng rẽ sẽ được tạo ra ở vùng 1, vùng 2 hay vùng 3.
Sau khi cấy, để đĩa thạch ở tủ ấm 37 độ/18-24h (nghi dịch hạch thì để ở 28 độ).
Nếu mủ nghi do lậu cầu hay não mô cầu, H. inluenzae thì để đĩa thạch đã cấy
vào tủ ấm có thêm điều kiện khí trường 5-10% CO2
2.
Xác định vi khuẩn
Nếu có vi khuẩn mọc (tạo các khuẩn lạc riêng rẽ) ở trên các đĩa thạch trong
bước phân lập thì tiếp tục xác định tên của chúng bằng cách:
Cấy chuyển khuẩn lạc nghi ngờ cào các môi trường chẩn đoán
Môi trường chẩn đoán là các môi trường xác định tính chất sinh vật hóa học của
vi khuẩn, thường gọi tắt là bộ SINH VẬT HÓA HỌC. Việc chọn các môi
trường chẩn đoán để cấy chuyển vi khuẩn là tùy thuộc vào kết quả nhuộm Gram
và đặc điểm của khuẩn lạc trên đĩa thạch nuôi cấy ở bước phân lập
Ví dụ:
Nếu kết quả nhuộm soi là cầu khuẩn G (+) xếp đám , khuẩn lạc trên thạch
máu là dạng S, có sắc tố vàng thì phải hướng đến tụ cầu. Khi đó môi trường
chẩn đoán phải là Chapman, huyết tương thỏ tươi để kiểm tra tính chất lên men
đường manitol và khả năng gây đông huyết tương của vi khuẩn.
Trường hợp nhuộm soi là trực khuẩn Gram (-), khuẩn lạc ở bước phân lập
có oxidase (-) thì phải hướng tới các vi khuẩn thuộc họ đường ruột. Khi đó môi
trường chẩn đoán lại là bộ SINH VẬT HÓA HỌC của vi khuẩn đường ruột, cụ
thể gồm: ống thạch KIA, ure-indol, H2S, Clack-clubs, thạch mềm, Simon…để
kiểm tra các tính chất như lên men đường glucose và lactose, phân hủy
tryptophan thành indol, phân hủy ure thành amoniac, khả năng sinh khí H2S,
tính di động
3.

Xác định tên vi khuẩn
Tên của vi khuẩn được xác định chủ yếu dựa vào các tính chất sinh vật hóa học
được thể hiện trên các môi trường chẩn đoán. Ngoài ra, trong một số trường hợp
còn dựa thêm vào tính chất kháng nguyên để xác định tên của vi khuẩn tới
nhóm hoặc typ hoặc dưới typ huyết thanh. Tính chất kháng nguyên của vi khuẩn
được biết thông qua phản ứng ngưng kết giữa vi khuẩn phân lập được với kháng
thể mẫu.
Chú ý:
Trường hợp thấy có nhiều loại vi khuẩn mọc trên đĩa thạch ở bước phân
lập thì chọn loại vi khuẩn nào có số lượng chiếm đa số để cấy chuyển vào các

Thuốc không phải luôn luôn cần thiết nhưng niềm tin khỏi bệnh là điều
luôn luôn cần!
Page 17


Lao động là cha đẻ của hạnh phúc!
môi trường chẩn đoán ở bước xác định tên vi khuẩn, vì loại vi khuẩn chiếm đa
số đó được coi là thủ phạm gây bệnh.
Một số trường hợp vi khuẩn có thể mọc chậm (sau 24h). Vì vậy, ở bước
phân lập nếu sau 24h nuôi cấy mà vi khuẩn không mọc thì giữ tiếp mẫu bệnh
phẩm đó ở tủ ấm thêm 24h nữa. Chỉ trả lời kết quả không mọc vi khuẩn sau 48h
nuôi cấy. Say khi xác định được tên vi khuẩn, phải làm ngay kháng sinh đồ.
Câu 19. Kể tên một số môi trường dùng để nhận biết được các tính chất
sinh vật hóa học của vi khuẩn? Cho ví dụ minh họa từ các bài thực hành
mà anh chị đã học?
1. Môi trường KIA ( Kligler Iron Agar): Đây là môi trường tổng hợp gồm có 2
loại đường là lactose và glucose, trong đó tỷ lệ giữa lactose và glucose là 10/1.
Ngoài ra, chất chỉ thị pH là đỏ phenol cũng được đưa vào trong môi trường.
Nuôi cấy vi khuẩn vào môi trường, để nhiệt độ 37 độ C trong 24h, chúng ta thấy

- Nếu vi khuẩn có khả năng lên men đường glucose mà không lên men đường
lactose thì phần chân ống thạch chuyển từ màu đỏ sang màu vàng và phần thạch
nghiêng vẫn là màu đỏ. Do trong môi trường KIA, chuyển hóa đường yếm khí
chỉ thực sự xảy ra ở phần chân thạch, bởi vì ở đây không khí không xâm nhập
được vào. Do vậy, glucose sẽ lên men ở đây tạo ra các acid rất mạnh dẫn đến
pH tại vị tró đó trở thành acid và làm cho chất chỉ thị đỏ phenol chuyển sang
màu vàng.
Nếu vi khuần có khả năng lên men đường lactose thì toàn bộ môi trường chuyển
sang màu vàng. Cũng giống như lên men glucose, lên men lactose chỉ xảy ra ở
phần chân thạch và tạo ra rất nhiều acid ở đây. Khác với glucose, trong môi
trường KIA đường lactose gấp 10 lần glucose về số lượng nên lượng acid tạo ra
sẽ rất nhiều và nó ngấm cả lên phần nghiêng của ống thạch, làm cho phần
nghiêng của ống thạch cũng có pH acid. Kết quả là chất chỉ thị phenol sẽ
chuyển sang màu vàng trong toàn bộ môi trường (vì vậy, trong làm môi trường
KIA thì tỷ lệ đường phải rất được lưu ý)
Khả năng sinh H2S: nếu phần thạch có màu đen là dương tính
Khả năng sinh hơi: nếu có khoảng trống ở đáy ống thạch, thạch nứt hoặc
có bóng là dương tính.

Citrat: để phát hiện khả năng sử dụng citrate của vi khuẩn người ta nuôi
cấy vi khuẩn vào trong môi trường Simmons có natri citrate, đây là phân tử có
chứa một anion, cũng là nguồn carbon duy nhất. Nếu vi khuẩn có khả năng sửa
dụng citrate từ natri citrate thì sẽ kéo theo sự khử được nitro từ muối amoni với
Thuốc không phải luôn luôn cần thiết nhưng niềm tin khỏi bệnh là điều
luôn luôn cần!
Page 18


Lao động là cha đẻ của hạnh phúc!
sản phẩm tạo thành aminonium hydroxide (NH4OH) làm kiềm hóa môi trường,

do đó sẽ làm cho chất chỉ thị màu xanh bromthymol trong môi trường chuyển
sang màu xanh nước biển. (Từ xanh lá cây sang xanh nước biển + )

Thạch mềm: đánh giá khả năng di động của vi khuẩn: nuôi cấy vi khuẩn
vào môi trường thạch mềm bằng cách chọc que cấy đầu nhọn xuống 2/3 quãng
đường giữa ống. Nếu di động, vi khuẩn sẽ mọc xung quanh đường cấy, làm đục
môi trường và có thể lan cả trên bề mặt môi trường thì phản ứng là dương tính.
Còn nếu vi khuẩn chỉ mọc trên đường cấy thì âm tính.

Ure-indol: xác định 2 tính chất 1 là có enzym urease không. 2 là có khả
năng sinh indol không?
Urease là một enzyme có ở một số loài vi khuẩn, nó có khả năng thủy
phân ure sinh NH3. Để phát hiện khả năng này của vi khuẩn, người ta thường
nuôi cấy chúng vào môi trường có ure, nếu vi khuẩn có enzym urease thì sẽ xuất
hiện sản phẩm NH3 trong môi trường, những NH3 này phản ứng với dung dịch
tạo thành amonium carbonat [(NH4)2CO3] làm cho môi trường bị kiềm hóa. Do
vậy làm màu đỏ phenol của môi trường chuyển sang màu đỏ cánh sen.

Thuốc không phải luôn luôn cần thiết nhưng niềm tin khỏi bệnh là điều
luôn luôn cần!
Page 19


Lao động là cha đẻ của hạnh phúc!

Khả năng sinh indol: một số vi khuẩn có chứa enzyme tryptophanase,
enzyme này có khả năng phân hủy tryptophan tạo ra các sản phẩm là indol, acid
pyruvic và hợp chất amoni. Để xác định khả năng này, người ta nuôi cấy vi
khuẩn vào môi trường có tryptophan (ure-indol), nếu vi khuẩn có enzym này thì
trong môi trường sẽ xuất hiện indol và nó được phát hiện khi nhỏ thuốc thử

Kovac hoặc Erhlich. Nếu phản ứng dương tính, indol tan trong cồn isoamylic sẽ
bắt màu đỏ thẫm nổi lên thành một vòng tròn trên bề mặt môi trường.

Thuốc không phải luôn luôn cần thiết nhưng niềm tin khỏi bệnh là điều
luôn luôn cần!
Page 20


Lao động là cha đẻ của hạnh phúc!


Clacrk-lubs: xác định 2 phản ứng là RM và VP
Phản ứng RM (red methyl): một số loài vi khuẩn có khả năng sản sinh ra
các acid mạnh từ glucose qua con đường lên men. Điển hình là vi khuẩn đường
ruột với một số loài có thể sản xuất ra đủ một lượng acid mạnh làm cho môi
trường nuôi cấy luôn giữ ở pH ≤ 4,4. Để phát hiện khả năng này của vi khuẩn ta
chỉ cần nhỏ đỏ methyl (RM) vào môi trường nuôi cấy của vi khuẩn sau 48-72,
nếu phản ứng dương tính thì môi trường sẽ có màu đỏ, còn âm tính thì môi
trường có màu vàng.

Thuốc không phải luôn luôn cần thiết nhưng niềm tin khỏi bệnh là điều
luôn luôn cần!
Page 21


Lao động là cha đẻ của hạnh phúc!
Phản ứng Voges-Proskauer (VP): một số vi khuẩn trong quá trình lên
men đường có khả năng tạo ra một chất trung gian là Acetyl- Methyl- Carbinol
(Acetoin). Có thể phát hiện chất này dựa trên sự biến đổi của acetoni thành
diacetyl qua tác dụng của KOH và O2 trong không khí. Sau đó diacetyl bị biến

đổi thành một phức hợp màu đỏ dưới sự xúc tác của α-naphthol và creatine. Để
phát hiện khả năng này thì ta nuôi vi khuẩn vào môi trường Clark-lubs 24h rồi
nhỏ dung dịch thử VP gồm hai dung dịch:
+ Dung dịch A: α-naphthol 6% trong cồn 90 độ, để tủ lạnh trước khi dùng
+ Dung dịch B: NaOH 16% trong nước
Tỉ lệ A:B=1:3, 3 giọt dung dịch A : 9 giọt dung dịch B
Nếu phản ứng dương tính thì môi trường có màu đỏ, âm tính sẽ có màu vàng
nhạt


H2O2: nhằm xác định sự có mặt của enzym catalase (hiện tượng sủi bọt
khí)

Thuốc không phải luôn luôn cần thiết nhưng niềm tin khỏi bệnh là điều
luôn luôn cần!
Page 22


Lao động là cha đẻ của hạnh phúc!

Thạch chapman: chỉ gồm một phần thạch nghiêng chứa đường manitol và
đỏ phenol, nếu phản ứng dương tính thì môi trường chuyển từ đỏ (của phenol)
sang màu vàng. Vi khuẩn có khả năng lên men đường manitol.

Huyết tương thỏ: dùng để xác định sự có mặt của enzym làm đông huyết
tương Coagulase
+ Cho vào 3 ống nghiệm nhỏ mỗi ống 0,5 mL huyết tương thỏ đã pha loãng 1/2
trong nước muối sinh lý.
 Dùng que lấy vi khuẩn tụ cầu mẫu có coagulase (+) vào ống 1 , ống 2 để
nguyên, ống 3 cấy tụ cầu cần xác định .

 Để tủ ấm 37oC, đọc kết quả sau 2-8 giờ.
Nếu kết quả đọc quá muộn thì có thể trở thành âm tính giả, vì nhiều tụ cầu tiết
men fibrinolysin làm lỏng huyết tương trước đó đã đông.
Câu 20. Kể tên các vi khuẩn gây bệnh thường phân lập được từ các bệnh
phẩm máu, phân, mủ và dịch mà anh (chị) nhận biết được qua các bài thực
hành.
Bệnh phẩm máu: Trực khuẩn Salmonella, tụ cầu vàng,
Bệnh phẩm phân: Shigella, Salmonella, E. coli
Bệnh phẩm mủ dịch: lậu cầu, trực khuẩn lao,
Câu 21. Khuẩn lạc là gì? Trình bày các loại khuẩn lạc và các hình thức tan
máu khi tiến hành cấy vi khuẩn trên môi trường thạch máu? Ý nghĩa của
chúng trong chẩn đoán vi sinh?

Khuẩn lạc là dòng tế bào vi khuẩn xuất phát từ 1 tế bào ban đầu

Khuẩn lạc trong môi trường rắn gồm các dạng:
Dạng S: nhẵn bóng, hơi lồi, tròn đều
Dạng M: có nhày, dạng bò lan
Dạng R: xù xì, khô

Các hình thức tan máu khi tiến hành cấy vi khuẩn trên môi trường thạch
máu:

Thuốc không phải luôn luôn cần thiết nhưng niềm tin khỏi bệnh là điều
luôn luôn cần!
Page 23


Lao động là cha đẻ của hạnh phúc!
Tan máu β: tan máu hoàn toàn, vi khuẩn có khả năng gây tan máu hoàn

toàn xung quanh khuẩn lạc trong suốt
Tan máu α: tan máu không hoàn toàn, xung quanh khuẩn lạc có vòng màu
xanh
Tan máu gama: không nhìn thấy tan máu

Ý nghĩa: đánh giá xem vi khuẩn có khả năng gây tan máu hay không.
Câu 22. Kháng sinh đồ là gì? Trình bày nguyên lý của kỹ thuật kháng sinh
khuếch tán trong môi trường thạch (kỹ thuật kháng sinh đồ định tính, kỹ
thuật kháng sịnh đồ khoanh giấy) ?
1.
Kháng sinh đồ là các kỹ thuật thử nghiệm trên invitro để xác định độ
nhạy cảm với thuốc kháng sinh của vi khuẩn.
Mục đích của kháng sinh đồ là giúp cho các thầy thuốc lâm sàng chọn được
kháng sinh thích hợp và liều lượng kháng sinh thích hợp để điều trị cho các
bệnh nhân bị nhiễm trùng do vi khuẩn.
2.
Các phương pháp làm kháng sinh đồ
2.1. Kỹ thuật kháng sinh đồ định tính
Khái niệm: các kỹ thuật kháng sinh đồ mà kết quả của chúng chỉ xác định
được hiện tượng vi khuẩn còn nhạy cảm hay đã đề kháng lại các loại kháng sinh
được thử. Kết quả của kháng sinh đồ định tính sẽ giúp cho việc lựa chọn kháng
sinh thích hợp để điều trị
Nguyên lý: tất cả các kỹ thuật định tính đều được thực hiện dựa trên cơ sở
chung là các thuốc kháng sinh đều có khả năng khuếch tán tốt trên môi trường
thạch. Vì vậy, người ta gọi các kỹ thuật kháng sinh đồ định tính với cái tên
chung là “kỹ thuật kháng sinh khuếch tán trong thạch”.
Các kỹ thuật kháng sinh định tính đầu tiên là kỹ thuật rãnh thạch và kỹ
thuật đục lỗ thạch. Người ta khoét các rãnh hoặc đục các lỗ trên đĩa thạch đã
được phủ một lớp mỏng vi khuẩn thuần khiết ( một chủng thuần nhất). Sau đó
từng loại kháng sinh được thử sẽ được đưa vào các rãnh hoặc lỗ thạch đó.

Kháng sinh từ rãnh hoặc lỗ thạch sẽ khuếch tán ra xing quanh theo quy luật
càng xa bờ của rãnh hoặc lỗ thạch thì nồng độ kháng sinh càng giảm. Sau khi để
tủ ấm 37 độ/18-24h để vi khuẩn phát triển, nếu vi khuẩn còn nhạy cảm với
kháng sinh thì sẽ xuất hiện vùng ức chế vi khuẩn xung quanh lỗ hoặc rãnh
thạch. Tùy theo lượng kháng sinh cho vào lỗ thạch hoặc rãnh thạch nhiều hay ít
mà vùng ức chế vi khuẩn được tạo ra sẽ có kích thước lớn hay nhỏ.
2.2. Kỹ thuật kháng sinh đồ khoanh giấy

Các vật liệu sinh phẩm
Thuốc không phải luôn luôn cần thiết nhưng niềm tin khỏi bệnh là điều
luôn luôn cần!
Page 24


Lao động là cha đẻ của hạnh phúc!
Vi khuẩn: là các chủng vi khuẩn thuần khiết đã được xác định tên. Vi
khuẩn được hòa trong nước muối sinh lý thành dạng canh khuẩn có mật độ
khoảng 108 vi khuẩn/ml
Khoanh giấy kháng sinh các loại: mỗi loại được đựng trong các ống riêng
với nhãn ghi đầy đủ các thông tin cần thiết như: tên kháng sinh cùng ký hiệu
viết tắt, hàm lượng được tẩm vào khoanh giấy, ngày sản xuất, hạn sử dụng…
Môi trường thạch làm kháng sinh đồ: thạch Muller Hinton, là môi trường
nuôi cấy có đủ các yếu tố dinh dưỡng cần thiết giúp cho hầu hết các vi khuẩn
thông thường có thể phát triển được

Qui trình thực hiện
Sau khi chuẩn bị đủ các vật liệu, sinh phẩm và các dụng cụ cần thiết, thao tác
quan trọng nhất của kỹ thuật làm kháng sinh đồ khoanh giấy là:
Cấy vi khuẩn lên mặt đĩa thạch Muller Hinton nhằm mục đích phủ một
lớp vi khuẩn mỏng và đều lên bề mặt thạch

Đặt khoanh giấy kháng sinh các loại lên bề mặt đĩa thạch đã được cấy vi
khuẩn, khoảng cách giữa các khoanh giấy kháng sinh là 2 cm, khoanh giấy cách
thành đĩa thạch 1 cm. Nếu các khoanh giấy được đặt quá gần nhau hoặc sát
thành đĩa sẽ làm sai lệch kết quả kháng sinh đồ do khó xác định được đường
kính vùng ức chế vi khuẩn của từng loại kháng sinh vì chúng có thể lẫn vào
nhau. Trên thực tế, các kháng sinh được đặt cho từng loại vi khuẩn là không
giống nhau mà phải đặt theo khuyến cáo của chương trình giám sát quốc gia về
tính kháng thuốc kháng sinh của các loại vi khuẩn (ASTS) hoặc của WHO
Sau khi đặt xong các khoanh giấy kháng sinh 15 phút, cất đĩa thạch vào tủ
ấm 37 độ/18-24h.
Các thao tác làm kháng sinh đồ phải được thực hiện trong hốt vô trùng,
hoặc thực hiện sát ngay bên cạnh ngọn lửa đèn cồn trong các hốt tự tạo.
Câu 23. Nêu cách đọc kết quả và phân tích kết quả của kỹ thuật kháng sinh
đồ khoanh giấy?
Đọc kết quả chỉ đơn giản là dùng thước đo đường kính của vùng ức chế vi
khuẩn, đơn vị tính kích thước được đo là milimet.
Phân tích kết quả kháng sinh đồ là việc làm quan trọng và có ý nghĩa rất lớn
trong khuyến cáo kháng sinh điều trị. Trong đó, kích thước đường kính của
vùng ức chế vi khuẩn sẽ được so sánh với đường kính của chủng vi khuẩn
chuẩn trong bảng mẫu (do hãng sản xuất khoanh giấy cung cấp) để phân ra các
mức độ nhạy cảm: nhạy cảm (S), trung gian (I) và đề kháng (R ) của vi khuẩn

Thuốc không phải luôn luôn cần thiết nhưng niềm tin khỏi bệnh là điều
luôn luôn cần!
Page 25