QUI TRÌNH SẢN XUẤT PECTINASE VÀ ỨNG DỤNG TRONG CNTP (SẢN XUẤT NƯỚC QUẢ)

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP THỰC PHẨM TP.HỒ CHÍ M

ĐỀ TÀI:

QUI TRÌNH SẢN XUẤT PECTINASE VÀ
ỨNG DỤNG TRONG CNTP (SẢN XUẤT
NƯỚC QUẢ)

NHÓM: 11 (Thứ sáu, tiết 10-12)
GVHD: Liêu Mỹ Đông
1


DANH SÁCH SINH VIÊN
STT

Họ và

Tên

MSSV

Công việc

1

Trương Quang

Duy

2005130106

Phân công việc, tổng
hợp, soạn P.P

2

Văn Khánh

Duy

2005130091

Nuôi cấy bề sâu

3

Nguyễn Thái Huỳnh

Như

2005130030

Ứng dụng trong nước
quả

4

Nguyễn Vũ Anh

Tài

2005130118

Nuôi cấy bề mặt

5

Phạm Thị Thu

Thảo

2005130005

Ứng dụng trong nước
quả

6

Lê Vĩnh

Thuận

2005130004

Giới thiêu về pectin,
enzyme pectinase

7

Lý Lương Phương

Thảo

2005130024

Tinh sạch enzyme

8

Đặng Thủy

Tiên

2005130023

Phân loại enzyme
pectinase

Mục lục
2


3


A.Giới thiệu:[2]
Lịch sử nghiên cứu pectinase bắt đầu từ khi người ta hiểu biết về cấu trúc
pectin và cơ chế phân cắt pectin của những enzyme này.
Trong nhiều thập niên gần đây việc sản xuất pectinase từ vi sinh vật đã trở
nên phổ biến. Nhiều vi sinh vật như vi khuẩn, nấm men, nấm mốc đều có khả năng

sản xuất enzyme pectinase. Người ta cũng đã chứng minh rằng: pectinase là một
enzyme cảm ứng có thể được sản xuất từ nhiều nguồn cacbon khác nhau (Auguilar,
1987; Maldonado, 1989; Frieddrich, 1994; Nair, 1995; Nair, 1997).
Cùng với sự phát triển của sinh học phân tử người ta đã đẩy mạnh nghiên
cứu việc tạo dòng và biểu hiện gen của enzyme pectinase trong các tế bào chủ khác
nhau (Whitehead, 1995; Surgey, 1996; Dalbogre, 1997; Yakoby, 2000). Tuy nhiên,
tế bào chủ được sử dụng nhiều nhất vẫn là Saccharomyces (Gognies, 1999;
Gognies, 2001)
Enzyme pectinase là một nhóm enzyme thủy phân các chất pectin, sản phẩm
tạo thành là acid galacturonic, galactose, methanol,… Đây là nhóm enzyme thứ ba
được ứng dụng rộng rãi sau amylase và protease.
Enzyme pectinase được tìm thấy ở thực vật bậc cao và vi sinh vật. Ở thực
vật bậc cao, pectinase có nhiều trong lá, củ khoai tây, trong chanh, cà chua, cỏ ba
lá. Trong các loại cỏ khác thường chỉ có enzyme pectinesterase.
Nhiệt độ tối ưu của enzyme pectinase thường khoảng 45-55oC.
Việc ghiên cứu sinh tổng hợp cảm ứng enzyme pectinase được tiến hành
nhiều trên đối tượng khác nhau như Fusarium oxysporum (Guevara, 1997),
Aspergillus japonicus (Maria, 2000), Botrytis cinerea (Wubben, 2000), Rhizopus
stolonifer (Blandino, 2001), Aspergillus awamori (Blandino, 2001)…Tuy nhiên
4


đối tượng được nghiên cứu nhiều nhất vẫn là Aspergillus niger (Aguillar, 1987;
Maldonado, 1989; Solis-Percira, 1993; Taragano, 1997; Caltisho, 2000).
Ngày nay cùng với sự phát triển của sinh học phân tử và công nghệ gen, đa
số các chủng vi sinh vật dùng trong nuôi cấy thu nhận enzyme pectinase đều là
những chủng đột biến (Antier, 1993; Octavio, 1999; Bai, 2004). Nhiều công trình
nghiên cứu đã tiến hành nhằm làm tăng sinh tổng hợp enzyme pectinase của các
chủng vi sinh vật như: Couri và cộng sự (1995) đã nghiên cứu "Sự thao tác gen
trên chủng Aspergillus nhằm làm tăng sự sinh tổng hợp các enzyme phân giải

pectin "hay Solis (1997) đã "Cải thiện việc sản xuất pectinase dùng các thể lai giữa
các chủng Aspergillus".
Qua nghiên cứu tác giả đều nhận thấy nguồn cacbon bổ sung vào môi trường
nuôi cấy khác nhau sẽ gây ảnh hưởng khác nhau đến sự sinh tổng hợp enzyme
pectinase. Enzyme pectinase được tổng hợp cảm ứng mạnh trên môi trường bổ
sung pectin hay acid polygalacturonic và sự tổng hợp này bị hạn chế khi môi
trường giàu acid galacturonic hoặc glucose (Asguilar, 1987; Taragano, 1997;
Guevara, 1997)
Theo thời gian nguồn cacbon sử dụng trong nuôi cấy nghiên cứu sự tổng hợp
cảm ứng enzyme pectinase cũng thay đổi. Vào nhưng năm 90 các tác giả chủ yếu
sử dụng các nguồn cacbon tinh khiết và bổ sung riêng lẻ từng nguồn cacbon vào
môi trường nuôi cấy (Aguillar, 1987; Leone; 1987). Năm 2000, trong công trình
nghiên cứu "Ảnh hưởng các nguồn cacbon khác nhau đến sự sinh tổng hợp
pectinase của Aspergillus japonicus 586", Maria và cộng sự đã kết hợp nhiều
nguồn cacbon vào cùng một môi trường nuôi cấy như: pectin và glucose, pectin và
glycerol,…gần đây các nghiên cứu đều hướng tới sử dụng các phế liệu, các chất
thải công nông nghiệp để làm nguồn cơ chất sinh tổng hợp cảm ứng enzyme
5


pectinase (Castilho, 2000; Blandino, 2001; Denis, 2002).

B.Tổng quan:
I.

Cơ chất pectin [1]
Pectin có nhiều ở quả, củ hoặc thân cây. Pectin như một loại keo gắn chặt

các tế bào thực vật với nhau.

Pectin là hợp chất cao phân tử mạch thẳng có cấu tạo từ sự kết hợp của các
acid D-galacturonic và các este methyl của chúng qua các liên kết α–1,4 glucoside.
Tùy thuộc vào nguồn pectin mà pectin có khối lượng phân tử 80000 – 200000.
Pectin tan trong nước, ammoniac, dung dịch kiềm, carbonat natri và trong
glycerin nóng. Độ hòa tan của pectin trong nước tăng lên khi mức độ ester hóa
trong phân tử pectin tăng và khi khối lượng phân tử pectin giảm.
Pectin là tên chung được gọi cho các hợp chất chứa các thành phần rất khác,
trong đó pectinic acid là thành phẩn chủ yếu. Các pectin tự nhiên định vị trong
Cấu tạo Pectin
Trái cây chứa nhiều Pectin
Pectin trong thực vật
thành phần của tế bào có thể liên kết với cấu trúc polysaccharide và protein để tạo
thành các protopectin không tan. Có thể phân hủy làm tan protopectin trong nước
bằng cách nung nóng protopectin trong môi trường acid. Vì thế, các pectin tan thu
nhận được là kết quả của sự phân hủy protopectin không tan và chúng không đồng
dạng với nhau.
Trong thực vật, pectin tồn tại dưới ba dạng: pectin hoà tan, pectic acid và
protopectin.

6


Pectin hoà tan là ester methylic của acid polygalacturonic pectin (bị este hóa
ở mức độ cao) tạo gel đặc trong dung dịch acid và trong dung dịch đường có nồng
độ 65%.
Pectic acid là polygalacturonic acid có một phần nhỏ các nhóm carboxyl
được ester hoá bằng methanol.
Các pectin tự nhiên định vị trong thành phần của tế bào có thể liên kết với
các cấu trúc polyssacharide và protein để tạo thành các protopectin không tan.
Protopectin tạo độ cứng cho quả xanh, không tan trong nước và có cấu tạo hoá học

phức tạp. Trong protopectin có các phân tử pectin, các phân tử cellulose và các ion
Ca2+, Mg2+, các gốc phosphoric acid, acetic acid và đường. Protopectin khi bị thủy
phân bằng acid thì giải phóng pectin hoà tan.
Khi quả chín dần, dưới tác dụng enzyme protopectinase, protopectin sẽ
chuyển sang pectin hòa tan làm giảm sự liên kết giữa các tế bào, quả trở nên mềm
hơn. Quá trình này cũng xảy ra dưới tác dụng của acid và nhiệt độ trong quá trình
chần ở 60 – 850C.

II.

[1]

Pectinase [1], [2]
1. Giới thiệu
Enzyme pectinase là enzyme xúc tác sự phân hủy của các polymer pectin.

Sản phẩm của quá trình này là acid galacturonic, galactose, arabinose, methanol…
đây là một nhóm enzyme được ứng dụng rộng rãi trong công nghiệp chỉ đứng sau
amylase và protease. Sự phân hủy tự nhiên thường xảy ra khi trá cây chín nên
enzyme này có vai trò hết sức quan trọng trong quá trình bảo quản trái cây và rau
quả.
Việc kiểm soát hoạt động của enzyme pectinase cũng có thể kiểm soát được
độ nhớt của sản phẩm.
7


Enzyme này ban đầu được phát hiện trong các dịch chiết trái cây như cà rốt
(phát hiện của E.Fremi năm 1840), cà chua hay đại mạch, khoai tây, trong chanh,
dứa, cỏ ba lá.

[1]

2. Trung tâm hoạt động của pectinase [2]
Enzyme pectinase chứa vùng có 8 – 10 vòng xoắn kép về phía phải với 2 vòng
tạo thành khe liên kết với cơ chất.
Trung tâm hoạt động của enzyme này chứa axit amin Aspartate và Lysine. Có 1
Histidine nằm gần trung tâm hoạt động sẽ ảnh hưởng đến khả năng xúc tác của
enzyme
Nhiệt độ tối ưu của enzyme pectinase khoảng từ 45 – 550C.
3. Phân loại pectinase:
Cơ chế cắt của các loại pectinase
Enzyme pectinase có thể được phân loại theo cơ chế tác dụng của chúng:
a. Pectinesterase (PE):[1]
PE xúc tác sự thủy phân của các nhóm methyl ester. Enzyme thường tấn
công vào các nhóm ester methyl của đơn vị galaturonate nằm kề đơn vị không bị
Cấu trúc của enzyme Pectinase
ester hoá, phân cắt các nhóm methoxy (COOCH3) đứng cạnh các nhóm –COOH tự
do, tạo thành acid pectinic hoặc acid pectic và methanol.

8


Phương trình phản ứng:

Pectinesterase thu được từ các nguồn khác nhau có giá trị pH tối ưu khác
nhau. Nếu thu từ nguồn vi sinh vật thì pH tối ưu từ 4,5-5,5, còn nếu từ nguồn thực
vật thì có pH tối ưu từ 5,0-8,5. Pectinesterase từ nấm mốc có nhiệt độ tối ưu là 3040oC và bị vô hoạt ở 55-62oC. Pectinesterase thường được hoạt hoá bởi các ion
Ca2+ và Mg2+.
Đặc điểm của Pectineaterase thực vật
Bên cạnh các Pectineaterase (PE) vi sinh vật, hầu hết các loại trái cây đều

chứa enzyme PE. Enzyme này thường tồn tại dưới nhiều hình thức khác nhau, nằm
trong phần vỏ tế bào. PE ở thực vật nói chung có hoạt độ tối ưu trong khoảng pH
hơi kiềm. Các cation kim loại ở nồng độ thấp, như Ca 2+ chẳng hạn, có khuynh
hướng làm tăng nồng độ hoạt động của enzyme.
Cà chua chứa ít nhất 2 loại PE. Cả PE1 và PE2 đều tăng trong giai đoạn đầu
của quá trình chín. Khi bước vào giai đoạn chín, nồng độ enzyme PE1 giảm xuống,
nhưng PE2 tích lũy dần cho đến khi trái cây có màu đặc trưng của trái chín. PE2 có
khối lượng phân tử 23kD, pH tối ưu 7.6. Enzyme này bị bất hoạt 50% sau 5 phút

9


đun ở 670C. Các ion Ca2+ và Na+ làm tăng hoạt độ của enzyme lên tối đa ở các
nồng độ 0.005M và 0.05 M, theo thứ tự.33
PE của đậu nành là protein có khối lượng phân tử 33kD, hoạt động tối ưu tại
pH gần 8. Polygalacturonic acid, là sản phẩm được hình thành do quá trình để
methyl hoá các phân tử galacturonic acid.
Trong thịt quả chuối có hai isoenzyme PE. Cả hai có cùng khối lượng phân
tử là 30kD, nhưng có điểm đẳng điện khác nhau: 8,8 và 9,3. Các enzyme này hoạt
động ở pH tối đa là 7,5. Hoạt độ enzyme tăng lên khi thêm vào dung dịch NaCl ở
nồng độ 0,2M, và đưa pH của dung dịch về 6,0. Các enzyme này bị ức chế bởi
nhiều loại polyol có khối lượng phân tử thấp, như glycerol, sucrose, glucose,
maltose và galactose.
PE trong quả cam có hai loại: đó là hai isoenzyme PE1 và PE2 có khối
lượng phân tử 36 kD, nhưng có điểm đẳng điện khác nhau là 10,05 và 11,0, theo
thứ tự. pH tối ưu của PE1 là 7,6, còn của PE2 là 8,0.
Trong thành phần của nhiều thịt quả khác cũng chứa hai isoenzyem, một
trong hai enzyme này có tính bền nhiệt hơn, còn enzyme kia thì ít mẫn cảm hơn
khi bị tác động của protease. Độ ổn định của enzyme có thể liên quan đến mức độ
glycosyl hoá của các phân tử enzyme. Enzyme bền nhiệt hơn và enzyme còn lại có

Cấu trúc của pectinesterase từ carrot
khối lượng là 51kD và 36kD, theo thứ tự.
Cả táo và kiwi cũng chứa hai loại isoenzyme. Các isoenzyme của kiwi có
cùng khối lượng phân tử là 57kD và cùng điểm đẳng điện là 7,3. Tuy nhiên, chúng
khác nhau về mức độ bền nhiệt.
Trình tự amino acid
10


Cấu trúc bậc một của PE cà chua chứa 305 amino acid với khối lượng phân
tử là 33239. Enzyme này có chứa 2 đầu nối disulfide (Cys98-Cys125 và Cys166Cys200). Cys166 có mặt trong tất cả các enzyme pectinesterase. Trình tự amino
acid được suy luận trên cơ sở các nucleotide cDNA cho thấy sự không nhất quán,
18 trong 27 vị trí khác nhau, có thể làm thay đổi điện tích của protein. Mặt khác,
chỉ có khoảng 94% trình tự amino acid trong một phần chuỗi amino acid có tính
đồng dạng với toàn bộ trình tự của cDNA. Sự không nhất quán này có thể phản
ánh sự tồn tại của các isoenzyme, mặc dù chỉ có hai isoenzyme trong cà chua được
biết đến. Một số gen mã hoá cho các enzyme PE đã được tách dòng và nghiên cứu
đặc điểm. Gen tách dòng từ Pseudomonas mã hoá cho PE có chứa 396 amino acid
với khối lượng phân tử là 41004.
Cơ chế để methyl hóa
PE loại bỏ các nhóm methoxyl trong phân tử pectin bằng tương tác ái nhân
của enzyme lên ester, làm hình thành hợp chất trung gian acyl-enzyme và phóng
thích methanol. Tiếp theo sau là phản ứng deacyl hoá, là phản ứng thủy phân của
hợp chất trung gian acyl-enzyme, để giải phóng enzyme và carboxylic acid.

Cơ chế phản ứng của Pectinesterase

11

Các PE có nguồn gốc thực vật phản ứng theo kiểu làm hình thành các khối
pectin chứa các nhóm carboxylate dọc theo mạch pectin. Enzyme của Trichoderma
reesei là một protein cơ bản cho kiểu phản ứng tương tự. Enzyme của các loài
Asperillus với pH tối đa trong vùng acid, xúc tác phản ứng từ bên trong.
Ảnh hưởng của các ion kim loại khi kích hoạt enzyme pectinesterase có thể
có liên quan đến tương tác của nó với cơ chất. Polygalacturonic acid là một chất ức
chế cạnh tranh trong phản ứng thủy phân nhờ sự xúc tác của PE. Pectin chứa các
nhóm cacboxylate được sắp xếp như hình khối có thể tác dụng theo cách tương tự.
Sự liên kết của các ion kim loại vào các nhóm carboxylate trong trường hợp này có
khuynh hướng trung hoà ảnh hưởng ức chế của cơ chất pectin lên enzyme. Tuy
nhiên, lượng dư các ion này trên thực tế gây ra sự bất hoạt của PE vì các ion kim
loại bị vây quanh bởi các nhóm carboxylate nằm kế cận với các liên kết ester cần
thiết cho phản ứng thủy phân xảy ra.
b. Polygalacturonase:[1], [2]
Cấu tạo
Polygalacturonase: còn có tên gọi là poly-1,4-galacturoniglucanohydrolase,
xúc tác sự phân cắt các mối liên kết α–1,4-glycosid. Các exo-PG (exo-poly 1,4-αD-galacturonide) galacturonohydrolase, phân cắt từ các đầu không khử, và endoPG (endo-poly1,4-α-D-galacturonide) glycanohydrolase, tấn công ngẫu nhiên vào
giữa mạch cơ chất.
Đặc điểm
Polygalacturonase ít gặp trong thực vật nhưng có chủ yếu ở một số nấm mốc
và vi khuẩn. Polygalacturonase là một phức hệ enzyme gồm có nhiều cấu tử và
thường có tính đặc hiệu cao đối với cơ chất. Trên cơ sở tính đặc hiệu và cơ chế tác
dụng với cơ chất, enzym polygalacturonase được chia làm bốn loại:

12


Polymethylgalacturonase

hay

còn

gọi

là

α-1,4-galacturonite-

methylesglucanohydrolase, tác dụng trên polygalactorunic acid đã được methoxyl
hoá (tức là pectin). Enzyme này lại được phân thành hai nhóm nhỏ phụ thuộc vào
khả năng phân cắt ở trong hay cuối mạch trong phân tử pectin, đó là endoglucosidase-polymethyl

galacturonase

kiểu

I

và

exo-glucosidase-

polymethylgalaturonase kiểu III.
Polygalacturonase, enzyme tác dụng trên pectic acid hoặc pectinic, cũng
được chia thành hai nhóm nhỏ là endo-glucosidase-polygalacturonase kiểu II và
exo-glucosidase-polygalacturonase

kiểu

IV.

Enzyme

endo-glucosidase-

Polymethyl-galacturonase kiểu I là enzyme polymethylgalacturonase dịch hoá
pectin có mức độ methyl hoá càng cao thì bị thủy phân bởi enzyme này càng nhanh
và càng có hiệu quả. Trong dung dịch, khi có mặt của enzyme pectinesterase thì
hoạt độ của enzyme này thường bị giảm. Enzyme này rất phổ biến trong các VSV,
đặc biệt là A. niger, A. awamori.
Hầu hết các nghiên cứu về PG đều trên cơ sở các nguồn VSV. PG thường
được tìm thấy trong các phần tiết ngoại bào của các loài nấm và vi khuẩn gây bệnh,
chẳng hạn như Sacchromyces gragilis, Aspergillus niger, Lactobacillus plantarum,
Cochiliobolus carbonum, Neurospora crassa, các loài Ascomycete, Phizopus
arrchizus, và Fusarium osyporum. Tuy nhiên, trong thực tế, PG của thực vật bậc
cao được nghiên cứu rất nhiều ở cà chua chín. là nấm mốc A. niger, A. awamori.

•

Endo-PMG: phân cắt ngẫu nhiên liên kết α-1-4-glycosid của pectin.

13
Cơ chế hoạt động của Endo-polymethylgalacturonase (Endo-PMG)


•

Endo-PG: còn gọi là poly(1,4-α-D-galacturonide) glycanohydrolase, xúc tác
thuỷ phân ngẫu nhiên liên kết α-1-4-glycosid trong phân tử acid pectic

[2]

Các enzyme trong cà chua chín
Cơ chế hoạt động của Endo-polymethylgalacturonase (Endo-PMG)
Các enzyme PG trong cà chua chín tồn tại dưới hai dạng, và cả hai đều là
endo-enzyme. PG1 có khối lượng phân tử 84kD và có khoảng 50% bị bất hoạt ở
nhiệt độ 78oC. PG2 có khối lượng phân tử 44kD và có khoảng 50% bị bất hoạt ở
57oC. PG1 có độ ổn định tối đa ở pH 4,3, trái lại PG2 ổn định tối đa ở pH 5,6. Sự
phân tích sử dụng SDS-PAGE cho rằng PG1 là một dimer của PG2, tuy nhiên các
nghiên cứu khác lại cho rằng PG1 hình thành là do sự kết hợp của PG2 với một
subunit. Các chuỗi polypeptide của PG đều bị glycosyl hoá. PG2 chứa 4,6 đường
trung tính (D-mannose, L-gucose, D-xylose) liên kết với nhau thông qua cầu nối
N-acetylglucosaminylasparaginyl. Có sự khác nhau chút ít về khối lượng phân tử,
chẳng hạn các isoenzyme của PG2, PG2A va PG2B có khối lượng phân tử tương
ứng là 43 và 46kD. Sự khác nhau này có thể là do quá trình sửa sai hoặc quá trình
glycosyl hoá sau dịch mã. Trong thực tế, các nghiên cứu sau đó cũng đã chứng
minh được rằng PG2A và PG2B là các dạng glycosyl hoá khác nhau của cùng các
polypeptide.
Trình tự amino acid
Các trình tự amino acid được suy luận trên cơ sở các nucleotic của cDNA
phân lập không những từ trái cà chua mà còn từ phấn của các loài Pseudomonas
solanacearum, Oenothera organesis, phấn hoa bắp, và từ trái bơ. Gen của PG2 phân
14


lập từ trái cà chua mã hoá cho protein hoàn chỉnh có 373 amino acid, với khối
lượng phân tử là 40 279. Enzyme này được tổng hợp từ một tiền chất, sau đó đi
qua quá trình sửa chửa sau dịch mã, gồm cả các quá trình loại bỏ các peptide tín
hiệu, bị glycosyl hoá tại bốn điểm có khả năng glycosyl, và sửa chữa ở đầu C cuối.

Các gen PG đơn mã hoá cho các loại isoenzyme khác nhau, dẫn đến kết luận rằng
PG1 và PG2 đều xuất phát từ cùng một chuỗi polypeptide, và rằng PG1 được tạo
thành nhờ sự kết hợp của PG2 với β-subunit.
β-subunit. Sự chuyển đổi PG2 và PG1 trong quá trình chín của cà chua là
một vấn đề gây được nhiều chú ý. β-subunit, một yếu tố bền nhiệt, đầu tiên được
phân lập từ cà chua xanh, có khả năng chuyển đổi PG2 thành PG1 trong ống
nghiệm. Yếu tố này sau đó được xác minh là một glycoprotein rất đặc trưng với
polypeptide PG về mặt miễn dịch. Phân tử PG1 được tạo thành từ một phân tử PG2
và một phân tử β-subunit; tuy nhiên, chỉ có polypeptide PG có hoạt tính enzyme.
cDNA mã hoá cho β–subunit có trong cà chua là một tiền chất có kích thước
phân tử lớn (69kD, 630 amino acid). Trong phân tử này, thêm vào phân tử protein
hoàn chỉnh là một trình tự tín hiệu kị nước (30 amino acid), một polypeptide chứa
đầu cuối N-(78 amino acid), và một tiền peptide chứa đầu cuối C-(233 amino acid).
Protein hoàn chỉnh chứa glycosyl hoá là chứa 289 amino acid nặng 31,5 kD, điểm
đẳng điện 4,9. Protein này chứa lượng lớn amino acid gly, tyr, phe, và một motif
lặp có cấu trúc liên ứng FTNYGxxGNGGxxx, trong đó “x” phần lớn là các amino
acid phân cực. Chức năng của motif này trong protein vẫn chưa được biết rõ.
Vai trò của PG trong quá trình làm chín trái cây
Hoạt độ của enzyme trong giai đoạn đầu của quá trình làm chín chủ yếu là
nhờ PG1. PG1 tiếp tục tăng trong quá trình chín, và có mặt trong tất cả các giai
đoạn của quá trình chín. PG2 có khối lượng phân tử thấp hơn và ít bền nhiệt, PG2
xuất hiện trong giai đoạn cuối của quá trình, và chiếm lượng lớn trong giai đoạn
15


chín. Sự xuất hiện kế tiếp nhau của hai enzyme này là kết quả của hoạt động điều
hoà của β–subunit, yếu tố này được tìm thấy với lượng ít trong cà chua xanh, sau
đó tăng lên trong giai đoạn chín.
PG2 được coi như một endo-enzyme trong cà chua chín, PG1 được hình
thành trong suốt quá trình chín khi β–subunit được sinh ra để phản ứng với PG2.

Bằng cách điều chỉnh những thay đổi trong các phân tử PG trong các dịch chiết
khác nhau có các nồng độ khác nhau của NaCl và pH đệm khác nhau. Trên thực tế
gen mã hoá cho polypeptide PG trong một số nghiên cứu trước đây đã chứng minh
điều này. Gần đây, các nghiên cứu về các kiểu biểu hiện gen của β–subunit và các
phân tử PG cho thấy mRNA của β–subunit xuất hiện sớm trong quá trình phát triển
của trái cây(10 ngày sau khi thụ phấn) và tăng đến mức tối đa trong 30 ngày, cũng
là lúc trái cây chín. Sau đó, lượng mRNA của β-subunit giảm nhanh chóng, trong
khi lượng mRNA của PG tăng một cách đáng kể.
Vì tất cả các kết quả nghiên cứu đạt được ở trên, ta có thể cho rằng endoenzyme PG2 được hình thành trong các giai đoạn sớm của quá trình chín phải được
chuyển về PG1 do sự có mặt của β–subunit. Sự tích lũy của PG2 trong các giai
đoạn sau của quá trình chín là do β–subunit bị cạn kiệt. Vai trò của quá trình
chuyển đổi này là nhằm điều hoà hoạt động của PG trong các giai đoạn của quá
trình chín. β–subunit phản ứng và neo phân tử PG2 vào thành tế bào, tạo ra phân tử
PG1 dưới dạng hoạt động để phân hủy pectin. Một số nghiên cứu khác cũng chứng
minh được rằng PG1, chứ không phải PG2 có chức năng trong việc làm phân huỷ
và ổn định polyuronide, có nghĩa là sự phân hủy của polyuronide dưới tác động
của enzyme PG là nguyên nhân dẫn đến quá trình mềm của cà chua.Tuy nhiên, khi
nghiên cứu về sự xen đoạn và biểu hiện của gen PG trong cà chua chuyển gen thì
kết quả cho thấy polyuronide bị phân hủy nhưng không làm cho trái cà chua mềm
đi.
16


Cơ chế và kiểu tác dụng
Exo-PG thủy phân các đầu không khử của chuỗi polygalacturonic, tạo ra
galacturonic acid là sản phẩm thủy phân chiếm ưu thế. Sự thủy phân polymer này
bị gián đoạn của sự tồn tại của các mạch nhánh trong cơ chất. Mức độ thuỷ phân
tăng tỉ lệ với kích thước cơ chất, đạt tối đa với mức polymer hoá 20 đối với các
exo-PG ở cà rốt và đào. Hoạt động của các exo-enzyme làm tăng nhanh sự tạo
thành các nhóm khử và làm tăng chậm độ nhớt của dung dịch cơ chất. Sự phân hủy

polyuronide trong quá trình chín không gây ra sự tích lũy galacturonic acid, và chỉ
Tác động phân hủy của Polygalacturonase
có endo-enzyme PG là có liên quan.

Các endo-PG phân hủy pectic acid từ bên trong mạch, làm giảm nhanh độ
nhớt của dung dịch cơ chất. Tính đặc hiệu và kiểu tác dụng của endo-enzyme được
xác định bởi trạng thái của điểm hoạt động. Mức độ thủy phân của endo-PG ở nấm
men giảm cùng với sự giảm độ dài mạch cơ chất. Vị trí liên kết của endo-PG ở
Aspergillus niger được cấu thành từ 4 điểm và sự phân cắt xảy ra giữa các điểm 1
và 2. Một cơ chất tetramer chịu sự phân cắt (3+1) thành trigalacturonic acid
galacturonic. Một cơ chất pentamer cho ra hai sản phẩm phức tạp hơn, cả hai đều
đáp ứng sự chiếm giữ hoàn toàn của 4 điểm liên kết, tạo sự phân cắt (4+1) và
(3+2). Cũng tương tự, đối với cơ chất là hexagalacturonic acid, sản phẩm sẽ tạo
thành lối phân cắt (5+1), (4+2) và (3+3). Trigalacturonic acid bám vào điểm hoạt
động để tạo thành các phức hợp hữu ích hoặc không hữu ích. Liên kết hữu ích
trong trường hợp này làm sinh ra sự phân cắt (2+1). Liên kết không hữu ích được
tạo thành khi ba đơn vị đơn lẽ bám vào ba điểm 2, 3 và 4 là không hề tương tác với
các nhóm xúc tác định vị bên trong điểm 1 và 2. Cơ chất trong trường hợp này
đóng vai trò là một chất ức chế cạnh tranh (K = 0,67mM).

17


c. Pectate lyase (PEL):[1]
PEL xúc tác sự phân cắt các đơn vị galacturonate không bị ester hoá. Cả hai
enzyme exo-PEL (exo-Poly(1,4-α-D-galac turonide) lyase) và endo-PEL (endopoly(1,4-α-D-galacturonic lyase) đều tồn tại. Pectate và pectin có lượng methoxyl
thấp là các cơ chất thích hợp hơn cả cho các enzyme này. Nói chung, cả hai
enzyme này đều có khoảng pH tối đa nằm trong khoảng từ 8,0-11, đều cần ion Ca 2+
để hoạt động. Pectate lyase không được tìm thấy trong cây xanh, nhưng có ở vi
khuẩn và nấm. Các enzyme VSV ngoại bào này đóng một vai trò rất quan trọng

trong quá trình gây bệnh ở thực vật, gây ra sự phân hủy mô của thành tế bào, làm
mềm và làm mục mô thực vật.

Pectate lyase (PEL) là các enzyme VSV ngoại bào. Các enzyme của giống
Erwina và Bacillus được biết đến là tác nhân gây ra triệu chứng soft-rod ở thực vật.
Tuy nhiên, chúng cũng được tìm thấy phổ biến ở Aeromonas, Pseudomonas,
Xanthomonas, Aspergillus và Fusarium.
Erwinia chrysanthemi sinh ra các enzyme pectate lyase ở dạng isoenzyme có
thể được phân thành các nhóm trên cơ sở điểm đẳng điện của chúng: acid (pH 4-5),
trung hoà (pH 7-8,5) và kiềm (pH 9-10). Số lượng các isoenzyme trong mỗi nhóm
có thể thay đổi tùy theo loài. Đa số các loài được nghiên cứu cho năm hay ít nhất
bốn isoenzyme: một acid (PELA), hai trung hoà (PELA và C), hai kiềm (PELD và
E). Tất cả các isoenzyme này đều cần Ca2+ để làm tăng độ hoạt động và có pH tối
Cơ chế hoạt động của enzyme Lyase phân cắt pectin
ưu 8-10. Các nghiên cứu trên chủng EC16 cho thấy rằng tất cả 4 isoenzyme trên
đều là endo-enzyme (PELA(pI 4,2), PELA (pI 8,8), PELC (pI 9,0), và PELD (pI
10,0)). Các PEL kiềm rất đặc hiệu trong việc gây ra sự giầm nước của các mô thực

18


vật, tiếp theo là các isoenzyme trung hoà, trái lại các PEL acid không gây ảnh
hưởng gì.
Ở các chủng Erwinia carotovara, có ít nhất ba PEL được tiết ra, tất cả đều có
điểm đẳng điện ở pH kiềm: PELI (pI 9,7), PELII (pI 10,2), và PELIII (pI 10,35).
Cả ba isoenzyme này đều có pH tối ưu là 9,0. Nhiệt độ tối ưu cho hoạt động của
PELII và PELIII là 50 và 60oC, theo thứ tự. PELI có độ bền nhiệt thấp. Ở chủng
GIR726, có bốn loại endo-PEL isoenzyme với các điểm đẳng điện ở các pH rất
kiềm (10,0, 10,6, 10,3 và 10,9) và khối lượng phân tử nằm trong khoảng từ 28-33
kD. pH tối ưu cho hoạt động là 9,3 cho PELII 9,5 cho PELIV và 9,7 cho PEL I và

III. Cũng như với các PEL từ các nguồn khác, những isoenzyme này được kích
hoạt bởi Ca2+. Hoạt độ enzyme tăng 50-70% khi có mặt của Ca 2+ ồng độ 0,5mM.
Isoenzyme với pI>10 chứa 2,5-4.8% đường trung tính. Các PEL từ một số loài
Bacillus cũng có khả năng gây ra sự giảm nước ở mô thực vật.
d. Các loại khác:[1]
Pectin-transeliminase hay còn được gọi là poly α–1,4-galaturonite
methylesteglucanoliase, là enyme tác dụng trên pectin và pectinic acid.
Polygalactorunate-transeliminase còn được gọi là poly α-1,4D-galaturonite
–glucanoliase, là enzyme tác dụng trên pectic acid và pectinic acid.
Pectin lyase (PNL): xúc tác sự phân cắt các đơn vị galacturonate đã bị ester
hoá. Tất cả các PNL đều là endo-enzyme
4. Lợi ích khi sử dụng enzyme pectinase [2]
Từ khi phát hiện ra enzym và khả năng chuyển hóa của enzym loài người đã
tăng nhanh quá trình sản xuất và ứng dụng enzym trong công nghiệp. Số lượng
enzym phát hiện ngày càng nhiều và số lượng enzym được ứng dụng vào công
nghiệp cũng ngày càng nhiều.
19


Trong sản xuất thực phẩm, người ta thường sử dụng các chế phẩm pectinase
dưới dạng tinh khiết. Người ta không dùng chế phẩm dưới dạng canh trường nấm
mốc sấy khô. Tỉ lưởng chế phẩm pectinase cô đặc trên lượng nguyên liệu đem chế
biến vào khoảng từ 0.03 – 0.05 đến 0.10%.
Pectinase thường được sử dụng trong các ngành công nghiếp thực phẩm sau:
•
•
•
•
•

Sản xuất rượu vang.
Sản xuất nước quả và nước uống không có cồn;
Sản xuất các mặt hàng từ quả: nước quả cô đặc, mứt nhừ, mứt đông,..
Sản xuất nước giải khát.
Sản xuất cà phê và cà phê hòa tan.
Trong sản xuất rượu vang, cũng như trong sản xuất nước quả và các nước

uống không rượu, đều có thể sử dụng pectinase một cách rất hiệu quả. Nhờ tác
dụng của pectinase mà các quá trình ép, làm trong và lọc dịch quả rất dễ dàng, do
đó làm tăng hiệu suất sản phẩm. Chẳng hạn đưa pectinase vào khâu nghiền quả, sẽ
làm tăng hiệu suất nước quả sau khi ép lên tới 15 – 25%. Bởi lẽ khi có pectin thì
khối quả nghiền sẽ có trạng thái keo, do đó khi ép dịch quả không thoát ra được.
Nhờ pectinase phân giải các cơ chất pectin, làm các chất chiết trong dịch bào dễ
thoát ra ngoài hơn, làm tăng hiệu suất chất chiết, hơn nữa dịch quả trong suốt
không bị vẩn đục và lọc rất dễ dàng. Không những vậy, enzym pectinase còn góp
phần chiết rút được các chất màu, tanin và những chất hòa tan nữa, do đó làm tăng
thêm chất lượng của thành phẩm.

20


C.Qui trình sản xuất enzyme pectinase:
I

Nuôi cấy bề sâu

1 Khái niệm [3]
Lên men chìm là phương pháp được phổ biến nhất trong quy trình lên men
công nghiệp, vì có thể kiểm soát được toàn bộ các khâu trong quá trinh một cách
dễ dàng. Thường sử dụng môi trường lỏng thực hiện trong thùng lên men trong đó

có lắp đặt các hệ thống điều khiển cánh khuấy, hệ thống cung cấp oxy, điều chỉnh
pH, nồng độ chất dinh dưỡng.
Phương pháp này dùng được cho cả vi sinh vật hiếu khí và kị khí. Đối với
nuôi vi sinh vật kị khí trong quá trình nuôi không cần sục khí chỉ thỉnh thoảng
khuấy trộn còn với vi sinh vật iếu khí phải sục khí liên tục.
Ưu điểm:
Tốn ít mặt bằng trong xây dựng và lắp đặt dây chuyền.
Chi phí điện năng, nhân lực và các khoản phụ cho một đơn vị sản phẩm
thấp.
Dễ tổ chức được xí nghiệp có sản lượng lớn.
Các thiết bị lên men chìm đễ cơ khí, tự động hóa.
Lượng cơ chất sót thấp nhờ đó tiết kiệm chi phí sản xuất.
Ít sinh ra các enzyme tạp nên giảm bớt chi phí cho quá trình tinh sạch.
Nhược điểm:
Đời hỏi trang bị kĩ thuật cao, dễ nhiếm trùng toàn bộ.
Phải sục khí liên tục vì vi sinh vật chỉ sử dụng được oxy hòa tan trong môi
trường.
21


5. Phân loại
a Phương pháp hiếu khí [1]
Sự tích tụ enzyme trong môi trường được bắt đầu khi sự phát triển của vi
sinh vật gần đạt đến pha ổn định, khi môi trường bị acid hoá mạnh và khi lượng
phospho vô cơ được sử dụng hoàn toàn, pH của môi trường nuôi cấy thường đạt từ
6-7.2 là thích hợp.
Đối với nấm mốc, pH kìm hãm sự tổng hợp sinh khối và sự tích luỹ enzyme
pectinase. Khi pH dịch về phía acid, ngay cả khi pH nằm trong khoảng 4.5-5.0, tuy
sự tạo thành sinh khối không bị ảnh hưởng nhưng sự tạo thành enzyme pectinase bị
kìm hãm.

Vật liệu gieo cấy có thể là sợi nấm 24, 32 và 48h tuổi và với hàm lượng từ 210%. Đối với A.niger và A.awamori, vật liệu gieo cấy là sợi nấm được ủ sơ bộ
trong môi trường dinh dưỡng cho đến khi bắt đầu nứt nanh bào tử, thời gian ủ sơ
bộ thường là 38-42h. Lượng sợi nấm đem gieo cấy thường là 2%. Trong quá trình
nuôi cấy, hàm lượng các chất hoà tan trong môi trường giảm từ 6% xuống còn 1.51.8%
Để thu chế phẩm khô, cần tách sợi nấm ra khỏi canh trường lỏng. Cô đặc chân
không canh trường lỏng đến khi hàm lượng chất khô đạt 5-8% rồi sấy khô trên
thiết bị sấy phun. Điều kiện sấy phun là nhiệt độ chất tải nhiệt đi vào phải đạt 165180oC và đi ra đạt 60-70oC. Thời gian lưu của chế phẩm enzyme trong thiết bị sấy
phun phải không quá 7 giây và nhiệt độ chế phẩm sau khi sấy phải không quá
40oC. Chế phẩm thu được cần phải đóng gói kín để tránh hút ẩm.
Ngoài ra có thể thu bằng cách kết tủa enzyme trong dịch lọc canh trường
etanol theo tỉ lệ 4:1, với aceton theo tỉ lệ 2:1 và isopropanol theo tỉ lệ 1,3 :1 hoặc
với muối amoniumsulfate(50-80%). Nếu kết tủa bằng etanol thì hoạt độ pectinase
22


trong kết tủa sẻ khoảng 88-90% so với hoạt độ của dịch canh trường ban đầu, nếu
kết tủa bằng muối amoniumsulfate, cần tách muối ra khỏi enzyme bằng phương
pháp thẩm tích sau đó sấy khô. Khi độ bão hòa amoniumsulfate bằng 0.5 thì sẻ kết
tủa được đoạn có hoạt độ pectinase thấp( chiếm 0.25% trọng lượng khô) nhưng nếu
kết tủa bằng amoniumsulfate có độ bão hòa 0.1 sẻ kết tủa được đoạn chỉ chiếm
0.11% nhưng có hoạt độ pectinase cao.
e. Phương pháp yếm khí [1]
Môi trường: bã củ cải 2%; (NH4)2HPO4 0.75%; KH2PO4 0.1%; CaCO3 0.3%;
nước chiết ngô 0.5%.
Clostridium pectinofermentants 15 có khả năng tổng hợp pectinase một cách
mạnh mẽ ở pha tăng trưởng của quá trình sinh trưởng và tăng đồng thời với sự tích
luỹ sinh khối. Sự tích luỹ enzyme sẽ tối đa tương ứng với pha ổn định của sự sinh
trưởng qua 55-60h, pH ban đầu của môi trường dinh dưỡng là 6.5-7.0. Vật liệu
gieo cấy ban đầu được chuẩn bị ở trạng thái canh trường chứa bào tử và được cấy
với lượng 4% theo thể tích. Quá trình nuôi cấy được tiến hành ở nhiệt độ 35oC.

Cl.felsineum cũng có thể được nuôi cấy yếm khí để thu pectinase. Thành phần môi
trường gồm có: lactose 2%; pectin củ cải 1%; (NH4)2HPO4 0.4%; K2HPO4 0.7%;
KH2PO4 0.3%; NaCl 0.1%; MgSO4 0.025%; FeSO4 dạng vết; CaCO3 0.5%; dịch
nấm men tự phân 0.05%; ascorbic acid 0.5%.
Có thể tiến hành thu chế phẩm từ dịch lọc canh trường bằng cách kết tủa
enzyme với dung môi hữu cơ hoặc với muối ammonium sulfat. Nếu kết tủa bằng
dung môi hữu cơ, pH của dung dịch đã xử lý là 6.5-6.8. Nếu kết tủa bằng 2-2.5 thể
tích aceton thì hoạt độ enzyme trong kết tủa đạt 93-95% so với hoạt độ ban đầu.
Khi kết tủa ammonium sulfat có độ bão hoà bằng 0.2 thì sẽ thu được chế phẩm chỉ
chứa pectinesterase và pectintranseliminase, khi độ bão hoà là 0.9-1.0 thì sẽ thu
được chế phẩm chỉ chứa pectintrenseliminase và exopolygalacturonase.
23


f. Phương pháp hiện đại trong chuẩn bị chế phẩm enzyme: [1]
Khử muối bằng phương pháp lọc gel( Biogel P100).
Tách protein bằng phương pháp trao dổi anion(DAEA Biogel A) hoặc
cation( CM Biogel A).
Tách enzyme pectinase bằng alginate liên kết ngang. Alginate liên kết ngang
hoạt động bằng cách kết hợp ái lực, ảnh hưởng tỉnh điện và thay thế pectate bằng
liên kết ngang.
Tinh sạch bằng FPLC.
6. Các yếu tố ảnh hưởng:
a Thành phần môi trường
Trong nhiều môi trường nuôi cấy chìm, nguồn cacbon thường là tinh bột,
các loại bột khác nhau, đôi khi còn dùng một số nguyên liệu khác nữa. Các nguồn
nitơ hữu cơ thường dùng là cao ngô, nước chiết từ mầm mạ, dịch tự phân nấm
men… Nhưng khi cho thêm các chất này phải thận trọng, vì hỗn hợp các acid amin
sẽ có tác dụng nâng cao sinh tổng hợp amylase ở Asperrgillus, nhưng lại có tác
dụng xấu đối với các enzyme khác.

Thành phần môi trường có ảnh hưởng đến sự phát triển của vi sinh vật, từ đó
ảnh hưởng đến khả năng tổng hợp một enzyme nào đó. Không những vậy, thành
phần dinh dưỡng môi trường còn tác động đến chế phẩm enzyme thu nhận được.
Với chế phẩm enzyme Pectinase thu được khi nuôi cấy Aspergillus niger trên môi
trường dinh dưỡng khác nhau sẻ khác nhau về pH tối ưu trên cơ chất.
Ngoài ra nguồn C, N, P cũng có tác động rất quan trọng đến sự hình thành
emzyme này.

24


Khảo sát ảnh hửng của môi trường nuôi cấy đến khả năng sinh tổng hợp
enzyme Pectinase ta thu được kết quả tên môi trường 6 cám gạo/ 4 vỏ bưởi thì
enzyme có hiệu suất thu hồi cao nhất với hoạt lực chung là 0.9612 UI/ ml chế
phẩm.
g. Ảnh hưởng của chất cảm ứng và nguồn cacbon:
Nhóm enzyme pectinase một mặt là các enzyme bản thể, nhưng mặt khác
cũng là các enzyme cảm ứng. Do đó, một trong những yếu tố quan trọng của sự
sinh tổng hợp enzyme pectinase là phải có cơ chất đặc hiệu.Ví dụ pectine được
thêmvào môi trường sẽ cảm ứng để tổng hợp enzyme pectinase.
h. Ảnh hưởng của nguồn nitơ:
Nguồn nitơ cũng có vai trò rất quan trọng trong sự tăng tổng hợp enzyme
pectinase, người ta thêm nitơ vào môi trường dưới dạng muối nitrat và muối amôn.
Ngoài cacbon và nitơ, các yếu tố vô cơ cũng ảnh hưởng tới sự sinh tổng hợp các
enzyme pectinase của vi sinh vật. Trong đó phốt pho là cấu tử vô cơ cần thịết của
môi trường.Nói chung hàm lượng phốt pho trong môi trường phải không được ít
hơn 8- 10 mg (tính theo %).
i. Tỉ lệ giống cấy
Tỉ lệ giống cấy ảnh hưởng đến tốc độ sinh trưởng và lượng sinh khối trong
canh trường từ đó ảnh hưởng đến năng suất và hiệu suất sinh tổng hợp các sản

phẩm trao đổi chất.
Tỷ lệ giống nằm trong khoảng 2 – 5%, nhưng đối với một số chủng tỷ lệ này
còn giảm hơn nhiều, có khi tới 0,5 – 0,6%.
Cấy giống mốc bào tử theo phương pháp chìm sẽ kéo dài thời gian nảy mầm
và cũng kéo dài toàn bộ quá trình nuôi cấy.

25